Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

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Summary

Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.

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Mattozzi, M. D., Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C. Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun. J. Vis. Exp. (86), e51234, doi:10.3791/51234 (2014).

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Abstract

Um ein einzelnes Protein, mehrere subzelluläre Organellen Ziel, Pflanzen in der Regel duplizieren die relevanten Genen und Express jedes Gen einzeln mit Hilfe komplexer Regulierungsstrategien einschließlich Differentialpromotoren und / oder Signalsequenzen. Metabolische Ingenieure und synthetische Biologen interessiert Zielenzyme zu einer bestimmten Organelle mit einer Herausforderung: ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mehrfach klonen. Diese Arbeit stellt eine Lösung für diese Strategie: Nutzung alternatives Spleißen der mRNA. Diese Technologie nutzt die Vorteile der etablierten Chloroplasten und Peroxisomen-Targeting-Sequenzen und kombiniert sie zu einem einzigen mRNA, die alternativ gespleißt wird. Einige Splice-Varianten sind mit der Chloroplasten geschickt, um einige der Peroxisomen, und einige in das Cytosol. Hier wird das System für mehrere Targeting-Organellen mit alternativem Spleißen ausgebildet. In dieser Arbeit wurde GFP erwartet werden exprEssed in den Chloroplasten, Cytosol und Peroxisomen durch eine Reihe von rational entworfenen 5 'mRNA-Tags. Diese Tags haben das Potential, die Menge der Klonierung heterologer Gene erforderlich, wenn benötigt, in mehreren subzellulären Organellen ausgedrückt reduzieren. Die Konstrukte wurden in früheren Arbeiten 11 ausgelegt und wurden mit Gibson Anordnung, eine Ligation unabhängigen Klonen Methode, die nicht Restriktionsenzyme erfordert geklont. Die resultierenden Plasmide wurden in Nicotiana benthamiana epidermale Blattzellen mit einem modifizierten Gene Gun-Protokoll eingeführt. Schließlich wurden umgewandelte Blätter mit der konfokalen Mikroskopie beobachtet.

Introduction

Diese Arbeit ist eine Stoffwechseltechnik / synthetischen Biologie-Projekt, bei Pflanzenzellen werden ausgeführt, um ein Reporterprotein in mehreren Organellen ausdrücken, aber mit nur einem einzigen DNA-Konstrukt.

Ein Ansatz, um Proteine ​​an mehr als einem Ort gezielt beinhaltet Klonen mehrere genetische Kopien, die jeweils eine unterschiedliche Lokalisation Peptid. Jede Kopie muss durch sukzessive Rücktransformation eingeführt werden oder alternativ durch Rückkreuzung einzelnen Transformationen ein. Dies beinhaltet zusätzliche Klonen, und wird von einem Lokalisierungs Tag pro Terminus begrenzt.

Ein anderer Weg, um ein Protein zu mehreren Stellen lokalisiert ist, durch alternatives Splicing 2-5. RNA wird aus einem einzigen Gen transkribiert werden, aber verschiedene Kopien des Transkripts sind unterschiedlich in mehr als einen Weg pro Zelle verarbeitet wird, häufig. Dies kann in mehr als einer Boten-RNA in der Zelle von einem einzigen Gen transkribiert führen. Diese unterschiedlichen messenger RNAs können für verschiedene Isoformen des gleichen Proteins in dem Fall einer Leserahmen, einem anderen Protein vollständig zu kodieren, oder. Obwohl alternative Spleißen ist in der Literatur seit vielen Jahren beschrieben worden ist, die Wirkmechanismen und Donor-und Rezeptor konservierten Spleißstellen werden zur Zeit nur in jüngerer 6 erläutert. Da diese Standorte werden besser beschrieben, eröffnen sie Chancen für den Maschinenbau.

Pflanzenstoffwechsel Ingenieure mit einer Herausforderung bei der Expression eines Proteins in mehreren Organellen konfrontiert. Ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mit einer separaten Signalsequenz an die Organellen von Interesse zu klonieren mehrere Male, jedes. Für ein einzelnes Gen in drei Organellen, ist dies nur drei Gene. Aber für einen Sechs Gen Stoffwechselweg erweitert dies auf 18 Gene eine signifikante Klonen Aufwand. Die Kombination mehrerer Lokalisationssequenzen in einem einzigen, alternativ gespleißte Gen Zeichenificantly reduziert diese Anstrengung. Zum Beispiel, Re-Engineering Photorespiration 7,8 und 9,10 isoprenoiden Synthese betrifft sowohl die Chloroplasten und Peroxisomen. In unserem Fall nutzten wir Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis thaliana beobachtet zuvor beschriebenen 6. Wir rational gestaltete die mRNA-Sequenz, so dass die natürliche Spleißstellen allein, sondern platziert Sequenzen, die Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1) zu kodieren würde. Das exprimierte Protein kann oder kann nicht mit einem Tag, je nachdem, ob die prä-mRNA codiert, die es als ein Intron (Fig. 1g und 1h) ausgeschnitten. Für weitere Informationen über das Design der Konstrukte in dieser Arbeit vorgestellten, finden Sie im Artikel 11 Begleiter.

Da dies immer noch eine signifikante Anstrengung Klonen, Gibson Anordnung, ein neues Verfahren zur Klonierung von DNA-Konstrukten, uim Aufbau sed. Gibson Verfahren kann für jede Sequenz verwendet werden, unabhängig von Restriktionsstellen (Fig. 2) 12-14. Die spezifische Kombination von Enzymen erlaubt eine Ein-Schritt-, Isothermischer Zusammenbau. In diesem Verfahren werden mehrere doppelsträngige lineare DNA Teile ausgebildet sind, daß sie überlappende Sequenzen von ~ 50 bp. Die Gibson Montage Enzym-Mix teilweise verdaut die lineare DNA-Teile, Belichten Einzelstränge von homologen Sequenzen. Diese Teil einzelsträngigen Sequenzen erneut geglüht in der Reaktionsmischung, was zu einer schnellen, einem Schritt, sequenzunabhängige Ligation freien Subklonierung Reaktion.

Diese Arbeit beschreibt 1) rationale Design alternativ gespleißte Konstrukte für die Expression in Pflanzen Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol, 2), deren Klonierung mit dem neuen Ligation freie Methode von Gibson Montage, 3), deren Lieferung in Tabakblattzellen mit der Gene Gun und 4) Ergebnisse zeigen, Organellen-Targeting, als mit GFP beobachtetund konfokale Mikroskopie.

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Protocol

1. Entwurf von Alternativ-gespleißt Sequenzen für mehrere Organelle Targeting

  1. Bestimmen Sie die Standorte für die endgültige Protein-Expression. Für diese Arbeit ist das Interesse an der Ausrichtung der Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol.
  2. Verwenden Sie die Literatur, um Protein-und DNA-Sequenzen bekannt, dass Proteine, die Organellen von Interesse gezielt zu identifizieren. In diesem Fall wird ein Chloroplasten-Targeting-Sequenz aus Arabidopsis thaliana L-Methyltransferase isoaspartate 6,15 und eine Peroxisomen-Zielsequenz aus Arabidopsis thaliana-Transthyretin wie S-Synthase Allantoin 16,17 bestimmt.
  3. Identifizieren Sie eine alternative Spleißen-Regime, die die Proteine ​​von Interesse für die richtige Zielorganellen sollten. Für diese Arbeit Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis 6 beobachtet. Die mRNA-Sequenz wurde neu gestaltet Verlassen der natürlichen Spleißstellen, sondern Sequenzen wurden Kodierung Chloroplasten-oder peroxis platziertome-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1).

2. Gibson Versammlung der DNA-Teile

Siehe auch Abbildung 2.

Die Gibson Montageverfahren ist abhängig von der Wirkung mehrerer Enzyme in einem vorgefertigten Mischung zu 1) teilweise verdauen die Enden des doppelsträngigen DNA-Einzelstränge auf und 2) Glühen kostenlose Basenpaare der benachbarten DNA-Teile. Dies ermöglicht die Klonierung der DNA-Fragmente ohne die Einschränkungen von Restriktionsstellen.

  1. Wähle einen Auftrag für die Elemente in der DNA-Plasmid-Konstrukt. Als Beispiel TriTag-1 Elemente: a) einen Plasmidvektor (Poren, enthaltend ein GFP-Konstrukt bekannt, in Pflanzen, ein Kanamycin-Resistenz-Marker zu arbeiten, und Replikationsursprünge für E. coli und Agrobacterium tumefaciens Hosts), b) ein Promotor-Sequenz, (P ENTCUP2 gezeigt konstitutiv zu sein in Pflanzen), C) einem Chloroplasten-Targeting-Sequenz (CTS), c) eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS), und d) eine Reihe von Spleißstellen wie zuvor 6 beschrieben.
  2. Gestalten Sie das Konstrukt Basis-for-Basis mit in silico Design-Software. ApE ist ein Open-Source-Freeware-Paket, die für diese Arbeit.
    Hinweis: TriTag-1, hat die Reihenfolge: Plasmid-Vektor, einen Promotor, ATG, Splice-Donor-Stelle, Chloroplasten-Zielsequenz, Splice-Donor-Stelle, neutral, Spleiß-Akzeptor-Stelle, Peroxisomen-Zielsequenz, Splice-Akzeptor-Stelle, wie in GFP-Plasmid-Vektor enthalten ist .
    1. Entwerfen Sie die in silico DNA-Konstrukt, so dass eine 50-bp-Überlappung zwischen jedem Stück bei der Bestellung Primer für die PCR. Es ist möglich, die 50-bp-Überlappung als Primer verwendet: 25 bp in jeder Richtung.
      1. Achten Sie darauf, den Überblick über die Herkunft der einzelnen Stücke Reihenfolge halten. Ist es so: ein Plasmid gewachsen und miniprepped werden; eine lineare Sequenz, die als PCR-Matrize verwendet werden kann; oder eine Sequenz, die müssen seinkommerziell synthetisiert? Mehrere Firmen bieten Low-Cost-DNA-Synthese Dienstleistungen für Fragmente <500 bp. In diesem Fall wird die TriTag selbst ist 437 bp, so ist es vorteilhaft, sie kommerziell Ordnung.
      2. Die besten Ergebnisse werden kommen, wenn alle Fragmente mittels PCR amplifiziert und aus den Matrizen-DNA gereinigt. Die Resistenzmarker ist ein guter Ort, um dieses große DNA in zwei kleinere Vorlagen, die leichter sind PCR-amplifizierte teilen.
      3. Beschränkung Restriktionsenzym DpnI schneidet methylierte DNA. Wenn die PCR-Vorlage war ein Miniprep von E. coli, Dpnl Behandlung wird die Template-DNA kontaminiert entfernen.
  3. Reinige alle DNA-Sequenzen getrennt und Elution in Wasser, TE-oder EB-Puffer.
    1. Poren Vektor-Teil 1, ~ 3000 bp (grüne Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt.
    2. Poren Vektor-Teil 2, ~ 3000 bp (schwarze Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt.
    3. TriTag Einsatz, 437 bp (blaue Pfeile). Handel bestellt. Resuspend in ddH 2 O.
    4. P ENTCUP-Promotor, ~ 750 bp (orange Pfeile). PCR-amplifiziert und DpnI behandelt.
  4. Messung der Konzentrationen von jedem der DNA-Stücke. Ziel für 150 ng / ul der Vektor-Stücke.
  5. Einen aliquoten der Gibson Montage-Mix aus dem Gefrierfach und tauen auf Eis. Dies ist im Handel erhältlich, sondern auch einfach zu machen im Labor 14.12.
    1. Es gibt zwei Schritte, um dieses Rezept: eine viskose 5x Master-Mix und 15 ul Reaktions-Größe 1,33 x Aliquots. Der 5x Mastermix enthält: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 &mgr; l 1 M MgCl 2, 600 &mgr; l 10 mM von jedem dNTP, 300 &mgr; l 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD und ddH 2 O 6 ml. Planen 320 ul Aliquots (18) und gefrier alle außer einer bei -20 ° C Die Lösung wird sehr viskos sein. Beschriften Sie diese "5X Isotherme Puffer"
    2. Zum einen verbleibenden (320 ul), fügen Sie 1,2 ul T5 Exonuclease, 20 ul Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq-DNA-Ligase und 700 ul ddH 2 O. Bereiten Sie 15 ul Aliquots (~ 80) auf Eis in PCR-Röhrchen und bei -20 ° C
  6. Bestimmen Volumina für äquimolare Mengen von jedem der Fragmente. Es gibt ein paar Online-Rechner, einschließlich Gibthon.org. Es sollten insgesamt 5 ul aller DNA-Stücke sein. Fügen Sie sie zu den 15 ul Aliquot Gibson mischen. Wenn dies erfordert Volumen zu klein, um Pipette verdünnen, die DNA-Fragmente und / oder mehr als einen aliquoten.
    1. Vergessen Sie nicht, eine Kontrolle der Vektor-DNA allein vorzubereiten (zB der DNA-Teil des Antibiotikaresistenz-Marker enthalten) und bis zur Marke mit Wasser.
  7. Die Rohre in einem Thermocycler bei 50-55 ° C für 30-60 Minuten inkubiert. Ersetzen auf Eis und verwandeln sich in E. coli durch Hitzeschock chemisch kompetente Zellen. Verwenden Sie keine elektroZellen. Die hohe Salzkonzentration und der relativ niedrigen DNA-Konzentrationkann dazu führen, dass die Zellen Bogens.
    1. Wenden Sie alle 20 ul einer kommerziellen Herstellung von 200 ul Calciumchlorid-kompetenten E. coli.
      Inkubation auf Eis 30 min und 60 sec Hitzeschock bei 42 ° C
    2. Zurück zu Eis 2 min, gelten 750 ul SOC oder LB-Medium und erholen sich in einem Mikrozentrifugenröhrchen 30 min Schütteln bei 37 ° C Platte der Mischung und geeignete Verdünnungen auf LB + Kan (oder anderen geeigneten Antibiotikum). Dies kann zu höheren Hintergrund (und eine höhere Anzahl von Nicht-Ziel-Rekombination) als traditionelle Ligation-basierte Klonen führen, aber es lohnt sich, etwa 10 Kolonien zu screenen.
  8. Bestätigen Sie mit Klon-Sequenz und speichern ein Aliquot bei -80 ° C

3. Biolistic Transfektion von Tabak mit der Gene Gun

Dies ist eine Technik, die in JoVE 18,19 hergestellt wird. Schlüsselschritte und die Unterschiede werden unten beschrieben.

  1. Wachsen 50-100 ml E. coLi oder 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep die Kultur. Eine Konzentration von etwa 1.500 ng / &mgr; l erforderlich, um fortzufahren.
  2. Bereiten Gen Gewehrkugeln wie zuvor beschrieben. Legen Sie sie in die Gene Gun.
  3. Für die Transfektion von Nicotiana benthamiana Tabakblatt epidermale Gewebe, wählen Sie ein großes Blatt in der Nähe der Basis eines 3 Monate alten Anlage. Sorgfältig schneiden Sie es und legen Sie es Unterseite nach oben auf nassen Papierhandtücher in einer 15 cm Petrischale.
  4. Stellen Sie den Druck für die Er Gene Gun auf 200-250 psi.
  5. Sorgfältig Ziel der Genkanone zwischen den Rippen auf der Unterseite eines Blattes, etwa 3-5 cm darüber. Lassen Sie die Sicherheit und liefern die Teilchen auf dem Blatt. Jede Kugel kann zweimal an der gleichen Stelle auf dem Blatt verwendet werden. Wenn die Blatt explodiert, verwerfen und beginnen ein neues Blatt-es gibt einige Varianz in Blatt Zähigkeit durch Wachstumsbedingungen wie Alter, Feuchtigkeit, etc. Für eine 12-cm-Blatt, erwarten, dass etwa 6 Aufnahmen passen.
  6. Bewahren Sie die mit der Oberseite der eine überdachte Blatt,Petrischale für 2-3 Tage bei wenig Licht auf der Bank.
  7. Untersuchen Sie das Blatt in einem Binokular mit UV-Fluoreszenz ausgestattet, und die Suche nach einzelnen Zellen, die GFP. Dissect 5-10 mm Abschnitte Blatt.
  8. Tauchen Sie das Blatt in einem tiefen Brunnen Mikroskop-Objektträger unter ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Das Detergens verhindert Bildung von Luftblasen an der Oberfläche, und die Tiefbohrung Objektträger ermöglicht eine größere Gewebeabbildungsbereich.

4. Konfokale Mikroskopie transfizierter Tissue

Diese Anweisungen variieren für jedes Instrument, so ist es wichtig, gut ausgebildet zu werden.

  1. Für die Fluoreszenzdetektion Experimente, stellen Sie die Anregungslaser bis 489 nm, und stellen Sie die Photomultiplier-Detektoren 500-569 nm für GFP-Fluoreszenz und 630-700 nm für Chlorophyll-Autofluoreszenz. Bild Zellen unter Verwendung eines 40x Wasserimmersionsobjektiv.

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Representative Results

Der konstruktive Aufwand war eine Folge der erheblichen Planung. Neuartige an diesem Projekt ist der Einsatz von alternativen Spleißen, eine pre-mRNA, die in differentiell exprimierten Proteine ​​übersetzt wird, zu erstellen. Diese Proteine ​​werden in verschiedenen Organellen ausgedrückt, in diesem Fall die Chloroplasten, Peroxisomen und / oder Cytosol. Wir passten natürliche Arabidopsis-Gen, das alternativ gespleißte ist 6 und platziert bekannt Chloroplasten 6 und 17 Peroxisomen Targeting-Sequenzen in alternativen Exons (TriTag-1 und TriTag-2). TriTag-3 besteht aus einem Peroxisomen-Signal in einem Bereich mit niedriger Komplexität des Chloroplasten-Sequenz eingebettet. Diese wurden im Rahmen mit GFP (Fig. 1) angeordnet.

Die in dieser Studie verwendeten Plasmide enthielt also mehrere Elemente: das native alternatives Spleißen Schema vom PIMT2 Gen 6, Chloroplasten und Peroxisomen-Targeting-Sequenzen, GFP, und ein Plasmid-Rückgrat. Da jeder hat sehr specific erforderliche Sequenz ist eine Sequenz-unabhängige Methode erforderlich. Gibson Anordnung Protokoll 12,13 kann auf beliebigen Sequenzen, solange die Bestandteile mit Sequenz-Ähnlichkeit zueinander ausgebildet werden und nicht wiederholenden Sequenzen enthalten. Kurz gesagt, sind lineare DNA-Fragmente (entweder durch PCR-Amplifikation, kommerzielle Synthese oder Spaltung eines vorgefertigten Plasmid) aufgebaut, daß sie ~ 50 bp überlappenden homologen Sequenz (Fig. 2). Äquimolare Mengen von jedem der DNA-Fragmente in einem einzigen Rohr mit dem Gibson Anordnung Mischung bei 50 ° C für eine Stunde inkubiert kombiniert und transformiert in E. coli. Die aus der Anordnung Gibson Protokoll erhaltenen Plasmide wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt.

In dieser Studie wurden die drei verschiedenen Organellen-GFP-Targeting-Konstrukte ohne Kennung GFP und GFP-markierten Rubisco verglichen. Konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die GFP-Fluoreszenz in den si erkennenngle Zellen transient transformiert. In Kontrollexperimenten wurde die beobachtete vorübergehende Expression den Chloroplasten (rote Autofluoreszenz des Chlorophylls leicht erkennbar), die Kerne (große Organell, das nicht ein Chloroplast ist und nur eine pro Zelle) korreliert ist, und / oder kleinen Organellen angenommen, dass Peroxisomen. Green (GFP) und rot (Chlorophyll-Autofluoreszenz)-Kanäle wurden überlagert, um intrazelluläre Lokalisation (Abbildung 3) zu studieren. Für eine vollständige Diskussion dieser Ergebnisse finden Sie auf unserer Begleiter Artikel 11.

Wie vorhergesagt, in allen drei Dual-Targeting-Konstrukte, GFP wurde in den Chloroplasten (Fig. 4) in Überlagerung konfokalen Mikrophotographien beobachtet. TriTag-1 und-2 TriTag Ziel der GFP auch in das Cytosol und der kleinen Organellen vermutlich die Peroxisomen (4a und 4b) sein. TriTag-3 Ziele der GFP nur Chloroplasten und Peroxisom, aber nichtdas Cytosol (Fig. 4c). Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist schematisch (Abbildung 5).

Figur 1
Abbildung 1. Entwurf von alternativen Spleißen Konstrukte für Differenz Organell-Expression in Nicotiana benthamiana. Splice Diagramme von (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, und (c) TriTag-3, die nicht-Targeting-Sequenzen (grau), Chloroplasten Targeting-Sequenzen (hellgrün), Peroxisomen-Targeting-Sequenzen (orange) und die transiente Expression in Experimenten verwendet GFP kodierende Sequenz. TriTag-1-und-2 TriTag bestehen aus alternativem Spleißen Konstrukte; TriTag-3 besteht aus einem Peroxisomen-Signal in einem Bereich mit niedriger Komplexität des Chloroplasten-Sequenz eingebettet. Sequenzen von (e) TriTag-2, und (f) TriTag-3. Das ATG-Codon am Ende dieser Sequenzen entspricht der GFP-Startcodon. Alternativ gespleißte, auf Regionen sind unterstrichen. Donor-und Akzeptor-Dimere sind unterstrichen. Die hellgrünen DNA-Sequenzen stammen aus der PIMT2 5 'kodierenden Region 6 und sind Sequenzen, die die Chloroplasten-Targeting-Sequenz (grün) kodiert. Die Licht Orange DNA-Sequenzen stammen aus der TTL 5 'kodierenden Region 17 und sind Sequenzen, die Peroxisomen-Zielsequenz (orange) kodiert. TriTag-3 besteht aus einem Peroxisomen-Signal in einem Bereich mit niedriger Komplexität des Chloroplasten-Sequenz eingebettet. Schemata der endgültigen mRNAs vermutlich für (g) TriTag-1 und (h) TriTag-2 ausgedrückt werden. Nachdruck mit Genehmigung 11. Klicken Sie hier, um größere ima ansehenge.

Figur 2
Abbildung 2 Schema für Gibson Montage:.. Ein neues Verfahren für die Montage von überlappenden DNA-Fragmente Die Gibson Montageverfahren für Plasmid-Konstruktion 12,13 schnell Ersatz für traditionelle Beschränkung Ligation Klonen in vielen Labors. Im Wesentlichen kann man ein Konstrukt, das die in-silico-DNA von Interesse genau von PCR-Produkten aus verschiedenen Quellen zusammengesetzt verstärkt enthält entwerfen. Entwerfen von Primern, die komplementär zu einander sind, und PCR-Amplifikation jedes Fragment mit den Primern gefärbt. Fügen alle Teile in einer einzigen Röhre mit dem Enzymgemisch, und Transformation von E. zuständigen coli-Zellen. Klicken Sie hier, um zu sehen larger Bild.

Fig. 3
3. Kontrollbehandlungen in N. bombardiert benthamiana Blatt epidermalen Zellen. (ac) Nicht markierte GFP. (a) Grün-Kanal. Untagged GFP wird in den Kern und um die Zellperipherie ausgedrückt, entsprechend dem Cytosol, jedoch nicht die Vakuole. (B) zeigen Red Chloroplasten Autofluoreszenz des Chlorophylls. (C) Überlagerung. In diesem Konstrukt Fluoreszenz im Zellkern und Zytosol nur beobachtet, nicht aber die Chloroplasten. (Df) Chloroplast-GFP markiert Steuer. (D) Grün-Kanal. GFP wird in den großen Organellen mit einer Zelle wie beschrieben exprimiert. (E) Red Chloroplasten zeigen Autofluoreszenz Chlorophyll. (f) Überlagerung. In diesem Fall gelb Chloroplasten beobachtet, was anzeigt, dass das GFP (grün) mit der Chloroplasten. Nachdruck mit Genehmigung 11. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 4
Abbildung 4. Tri-Tag-1, 2, 3 zusammengeführt markiert GFP Bilder. (A) Tri-Tag1. In diesem Fall gelb Chloroplasten Peripherien beobachtet, was anzeigt, dass das GFP an den Chloroplasten. GFP wird auch im Zytosol als auch kleine punktförmige Organellen, die Peroxisomen sein kann beobachtet. (B) Tri-Tag2. In diesem Fall gelb Chloroplasten Peripherien beobachtet, was anzeigt, dass das GFP an den C gezielte hloroplast. GFP wird auch im Zytosol als auch kleine punktförmige Organellen, die Peroxisomen sein kann beobachtet. (C) Tri-Tag3. In diesem Fall gelb Chloroplasten beobachtet werden, sowie kleine punktförmige Organellen, die Peroxisomen sein können. GFP ist jedoch nicht in das Cytosol beobachtet. Nachdruck mit Genehmigung 11. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 5
5. Kompartimenten einer typischen Tabakblatt Epidermiszellen. Hier ihre relativen Größen und Positionen innerhalb der Zelle angezeigt werden, und die relativen Expressionsniveaus durch konfokale Mikroskopie beobachtet. Nachdruck mit Genehmigung 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

In dieser Studie werden einfache Strategien zur Lokalisierung eines einzelnen transgenen Proteins mehrere Zellkompartimente in Pflanzen beschrieben. Das Ziel war, ein Konstrukt, das Gen in mehr als einer Organelle in Nicotiana benthamiana ausdrücken würde entwerfen. Strategien sind rationale Design von GFP-basierten DNA-Konstrukte, Gibson Montage, Lieferung der Plasmide zu Blattzellen mit der Gene Gun und Beobachtung der Ergebnisse mit der konfokalen Mikroskopie.

Drei verschiedene kurz-, N-terminalen Tags wurden für die gleichzeitige Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol Targeting-11 ausgelegt. Diese "TriTags" wurden durch die Kombination von natürlich vorkommenden DNAs alternativ gespleißten mRNAs, die die kodierten Proteine ​​entweder den Chloroplasten und Zytoplasma 6 oder der Peroxisomen und Cytoplasma 17 Direct Encoding konzipiert. TriTag-3 nicht auf alternatives Spleißen verlassen und aus einem Chloroplasten-Targeting-Sequenz, in der ein Naturell unstrukturierten Teil wurde mit einem peroxisomalen Targeting-Sequenz 15,17 ersetzt. Die TriTags Funktion in vivo an GFP in Nicotiana benthamiana Blatt epidermalen Zellen (Fig. 5) zu erreichen.

Konfokalen Mikrophotographien zeigten, dass TriTag-1 und Ziel-2-TriTag GFP an die Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol effektiv, aber bevorzugt für die Chloroplasten-und Peroxisom-, bzw. (4a und 4b). TriTag-3-GFP-Ziele nur in dem Chloroplasten und Peroxisom, aber nicht das Cytosol (Fig. 4c). Insgesamt können diese Tags Zeit zu reduzieren und Ressourcen aufgewendet Klonen für Pflanzen Metabolic Engineering, speziell für diejenigen, spezifische Expression benötigen in den Chloroplasten und Peroxisomen.

Änderungen und Fehlersuche

Die TriTags wie sie derzeit aufgebaut sind relativ statisch. Jedoch die Sekundärmarkg-Technologie, alternative Spleißen Übersetzung von verschiedenen standortspezifische Tags zu ermöglichen, ist flexibel. Die bestehenden Chloroplasten und / oder Peroxisomen-spezifischen Tags könnten für andere Organellen verändert werden, sei es die Sekretionsweg, das Mitochondrium, ein ER-Tag Verweilzeit, die Vakuole. Dies könnte auch mit gewebespezifischen Promotoren, z. B. für den Samen, Blumen, Wurzeln, Blätter, Stengel, usw. kombiniert werden

Für ein Projekt wie dieses, die Gibson Montageverfahren zum Klonen von 12-14 Konstrukte ist ideal. Es ist ein einfaches, leistungsfähiges Werkzeug, um jede Sequenz ohne die Einschränkungen von Restriktionsstellen subklonieren. In Ein-Schritt-Reaktionen, Gibson Montage schnell erstellt die Konstrukte und Kontrollen mit minimalem Aufwand in Klonen. Gibson Montagetechnik ist nahezu unendlich veränderbare für jede gewünschte Sequenz, solange die Template-Sequenzen können PCR-amplifiziert werden. Obwohl in diesem Beispiel Gibson Anordnung wurde mit einem verdaute Plasmid gezeigtenPCR-Amplifikation der Vektor tendenziell besser als mit einem verdaut Miniprep zu arbeiten.

Der Genkanone ist ein schnelles, wirksames Verfahren für die transiente Transfektion von Zellen, wie sie von dieser Zeitschrift 18,19 festgelegt. Nicotiana benthamiana hat große, gelappte Blatt epidermalen Zellen, die sowohl ideal für die Transfektion mit der Genkanone, aber auch für Beobachtung mit der konfokalen Mikroskopie. Das Protokoll für die Herstellung von Kugeln ist gut etabliert. Gold wurde als Mikroträger in den meisten Experimenten in der Literatur bisher verwendet worden, aber Wolfram Mikroträger bei niedrigen Kosten kurzem verfügbar.

Einschränkungen der Techniken

Eine Hauptbegrenzung der Gibson Verfahren ist das Vorhandensein von wiederholten Sequenzen: Je länger die überlappenden Bereich ist weniger Nebenprodukten führen. Verdau der PCR-Produkte mit DpnI sollte kontaminierenden Plasmidmatrizen entfernen; in der Regel sind die Quelle von NebenProdukte. Die Enzyme verdauen die DNA-Fragmente aus Doppelstrang-DNA in Einzelstrang. Das Vorhandensein von wiederholten Sequenzen in der Nähe der Enden (~ 1 kb) der DNA-Fragmente die Möglichkeit unsachgemäßer Rekombination erhöht. Wie gut, wiederholt sich innerhalb der Sequenzen stellen auch eine Einschränkung: Es ist nicht bekannt, und schwer zu kontrollieren, wie weit die T5 Exonuklease kaut zurück Einzelstrang-DNA. Die rasche Aktivität des Exonuklease durch hohe Reaktionstemperatur (50-55 ° C) schließlich Denaturierung des Enzyms, und die Viskosität Verringerung der Gesamtbewegung in der Lösung temperiert. Für weitere Feinabstimmung der Reaktionsschritte, Sequenz-und Ligation unabhängigen Klonen (SLIC) bevorzugt 20.

Eine wesentliche Einschränkung der Genkanone Technik ist, dass es erzeugt nur in der Größenordnung von eins bis zehn transient transformierte Zellen pro Aufnahme Ereignis.

Bedeutung gegenüber den bestehenden Methoden

Die Gibson Montagetechnik genießt rasche Verabschiedung für seine Benutzerfreundlichkeit, Flexibilität und Anpassungsfähigkeit. Es ist ein schneller Protokoll als herkömmliche Restriktions / Ligation Klonen und nicht-spezifischen Sequenzen, wie sie für Restriktionsverdau erforderlich erforderlich. Es ist nicht auf zwei oder drei Fragmente rekombiniert werden begrenzt; die ursprünglichen Forscher haben erfolgreich bis zu 10 Teile gezeigt, wenn auch mit begrenzter Leistungsfähigkeit. Für viele Forscher Gibson Anordnung sorgt für eine größere Anzahl von positiven Klonen.

Mehr Transformanten mit Biolistische Techniken oder zur Herstellung von transformierten Kallusgewebe, sollte die Verwendung eines Gehäuses Stil biolistischen Vorrichtung (zB BioRad PDS-1000) verwendet werden. Eine alternative Methode ist Agrobacterium-Infiltration.

Zukünftige Anwendungen

Gibson Anordnung ermöglicht immer größere Cluster von DNA zusammengesetzt werden, umder Punkt, wo eine Höchstgrenze nicht eingehalten wurde. Die ursprünglichen Autoren haben es verwendet, um mehrere hundert Kilobasen zusammen DNA-13.

Die Fähigkeit, selektiv auf mehrere Organellen mit einem einzelnen genetischen Konstrukt hat das Potential, die Anzahl von Genen zu müssen transformiert verringern. Die Abgabe von immer größeren DNA-Fragmente (und damit größere Stoffwechselwege) ist eine kurzfristige Ziel. Isoprenoide Wege haben, den Chloroplasten durch biolistische Verfahren geliefert worden; anderen Gencluster, wie alternative Kohlenstoff-Fixierung Wege sind am Horizont.

Kritische Schritte Innerhalb des Protokolls.

In Gibson Montage darauf, dass die Template-Sequenzen haben keine Homologie zueinander, außer an den Ziel Rekombination Websites.

In biolistischer Transformation der Pflanzen Nicotiana, vorsichtig sein, um die Gen-Kanone etwa 10-15 cm über die Blätter halten einnd halten den Heliumdruck bei 200-250 psi. Näher als das, wird die fragile Blatt explodieren, und weiter, als dass sie nicht gut umgesetzt werden. Zwei Tage nach der Transfektion eine Prellung sollte auf dem Blatt erscheinen, wenn es richtig umgesetzt wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Jen Sheen von Massachusetts General Hospital für die großzügige Spende von Nicotiana benthamiana Sämlinge danken. Jen Bush hat uns sehr geholfen in der Beratung in den Anbau von Pflanzen und die Einrichtung einer Wachstumskammer Region. Tom Ferrante des Wyss Institute angeboten entscheidende Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren möchten besonders Don Ingber der Kinderklinik Boston und der Wyss-Institut für die großzügige Spende eines Gene Gun und die damit verbundenen Lieferungen danken. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde durch eine Kooperation mit dem Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E-Award # DE-000079) für PAS, JCW und MdM durch Chimerion Biotechnology, Inc. für MJV vorgesehen ist, und.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotide primers IDT (custom) Design specifically for construct
GeneBlocks IDT (custom) 500 bp oligonucleotides
ApE software U Utah (download) http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit Qiagen 28004 Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104 Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer NEB M0532S Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix NEB E2611L Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5 Teknova T1075 Gibson assembly mix
1 M MgCl2 G Biosiences 82023-086 Gibson assembly mix
dNTP mix Fermentas R0192 Gibson assembly mix
1 M DTT Fermentas R0861 Gibson assembly mix
PEG-8000 Affymetrix 19966 Gibson assembly mix
NAD Applichem A1124,0005 Gibson assembly mix
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K Gibson assembly mix
Phusion polymerase NEB F530S Gibson assembly mix
Taq DNA ligase NEB M0208L Gibson assembly mix
Gibthon.org Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit Qiagen 12963 Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system BioRad 165-2451 Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana (n/a) (n/a) Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope Leica SP5 X MP Imaging of resultant cells
Deep well slides Electron Microscopy Sciences 71561-01 Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

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References

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