הוכחת סמים רבים עמידים

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray MDR-TB שיכול לשמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים. Microarray הגברה משלב הגברה סימטרית PCR, בחירת גודל היעד, תיוג היעד, וכלת microarray בתוך פתרון אחד ולתוך תא microfluidic אחת. שיטת עיבוד אצווה באה לידי ביטוי עם שילוב 9-Plex סימטרי אב וmicroarray אלמנט ג'ל בצפיפות נמוכה לgenotyping חפת סמים רב Mycobacterium עמיד (MDR-TB). הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשלים ב6 שעות ולספק גנוטיפ נכון עם לפחות 1,000 שווה תא של הדנ"א הגנומי. שילוב על גבי שבב צעדים לשטוף אינו ריאלי, אשר יגרמו לשיטת amplicon סגורה לגמרי ומערכת. עם microarray הגברה ההיקף של ריבוב מוגבל סופו של דבר במספר זוגות פריימר שניתן לשלב מ 'אדון יחידix ועדיין להשיג רגישות רצויה ומדדי ביצועים ספציפיים, במקום מספר הבדיקות שהם משותקים במערך. כמו כן, בסך הכל בפעם הניתוח יכול להתקצר או התארכה בהתאם לשימוש הספציפי המיועד, שאלת מחקר, ומגבלות רצויות של זיהוי. עם זאת, הגישה הכללית מייעלת באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה על ידי צמצום מספר שלבי עיבוד ידני אינטנסיביים וזמן רב, ומספקת נתיב ביוכימי וmicrofluidic פשוט עבור תרגום אבחון מבוסס microarray לתוך פרקטיקה קלינית שגרתית.

Introduction

מקרה גילוי מוקדם וטיפול מהיר נחשבים שליטת האסטרטגיות היעילות ביותר להפחית חפת Mycobacterium הילוכים (MTB) 1, ועכשיו יש הסכמה רחבה בקהילת שחפת שנקודת הטיפול (POC) או בסמוך לבדיקת POC לאבחון שחפת בו זמנית ויש צורך בעמידות לתרופות (DR). טכנולוגיות כגון GeneXpert של קפאידים ובדיקות הגברה אחרות חומצות גרעין לצמצם את הזמן לאבחון לחולי שחפת רבות, ולספק קריאה מתוך מהירה מצביע על עמידות לריפאמפין או מוטציות שנבחרו מקנות עמידות לתרופות הראשונות או שנייה אחרות קו 2. למרות בדיקות הגברה בזמן אמת וחומצות גרעין בידוד תרמיות נועדו לזהות את מוטציות עמידות לתרופה שתוביל לMDR-TB, הספקטרום של מוטציות הם מזהים הוא לעתים קרובות מספיק כדי לעצב משטר תרופה אישי המתאים לפרופיל העמידות לתרופות של החולה, ואילוצים טכניים הקשורותכדי לדבר לחצות אופטי או את המורכבות של תהליכים כימיים הגברה ודיווח מאי 3-7 להגביל את מספר הלוקוסים או מוטציות שאותרו. לכן, טכנולוגיות זיהוי עם יכולת ריבוב גבוהה יותר נדרשות כדי לטפל בפערים ידועים באבחון POC MDR-TB.

Microarrays ומבחני הבדיקה השורה אישרו-WHO Hain יכולים לתת מענה "גן מרובה, מוטציות רבות" האתגר של אבחון MDR-TB 8-29. למרבה הצער,, פלטפורמות גילוי אלה המבוססים על הכלאת ריבוב משתמשות רב שלבי, מסובכים, ופרוטוקולים הפתוח amplicon הדורשים הכשרה משמעותית ומיומנות בטכניקות מולקולריות. Microarray ההגברה 30 נועד לטפל בכמה microarray זרימת העבודה אלה ודאגות תפעוליות. עקרונות fluidic פישוט הם כדי להגביר, להכליא, ולזהות מטרות חומצות גרעין בתוך תא microfluidic אחת. המשתמש מציג mas החומצה והגברת הגרעיןter לערבב לתוך תא fluidic עם טפטפת ומתחיל פרוטוקול הרכיבה התרמי. לשיטת העיבוד אצווה שמוצגת כאן, microarrays נשטפים לאחר מכן בפתרון בתפזורת, מיובש, וצלם. מחקר זה מדגים את הפונקציונליות של microarray הגברה באמצעות בדיקת MDR-TB microarray לrpoB (30 מוטציות), katG (2 מוטציות), Inha (4 מוטציות), rpsL (2 מוטציות), embB (מוטציה 1), IS1245, IS6110 , והגברה פנימית ושליטה הכלאה. זוג תואם לפחות אחד מבדיקות microarray (wildtype (WT) ומוטציה של נוקלאוטיד יחיד (MU)) כלול בכל אחד מוטציה של עניין. חומצות גרעין מזוקקים ממ 'עמיד סמים רב שחפת הן מזני שחפת TDR הבנק ביום 31. microarrays אלמנט ג'ל מיוצרים על מצעי זכוכית על ידי copolymerization בעצם כפי שתואר במקומות אחרים 32, פרט לכך שאנו משתמשים מונומר 4% ו0.05 מ"מ כל אחד בדיקה בpolymerizתערובת ation. מערכים מוקפים באטם 50 מיליליטר לפני השימוש. לאחר שלבי רכיבה התרמית, הכלאה, ולשטוף, microarrays ההגברה הם צילמו על מנתח נייד Akonni. , עוצמות אות משולבות מתוקן רקע מתקבלות הגלם. תמונות tif באמצעות אלגוריתם מעגל קבוע. רעש עבור כל רכיב ג'ל מחושב כשלוש פעמים סטיית התקן של רקעי נקודה המקומיים. מטרות גן נחשבות בדרך כלל לגילוי עבור יחס אות לרעש (SNR) ערכי ≥ 3. על מנת לקבוע את קיומו או היעדריו של מוטציה ספציפית בכל גן או קודון, יחס מבחין מחושב מערכי יחס האות לרעש כ( WT-MU) / (WT + MU). יחסי מבחין <0 מעידים על מוטציה סמים התנגדות במוקד, ואילו יחסים> 0 מעידים על רצף wild-type.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

למעבדות שפעלו באמצעי זהירות PCR אוניברסלי, זה מבצעי יעיל יותר כדי לכלול כמה microarrays הגברה ואטמים לכל מצע ולשטוף את כל microarrays ההגברה בו זמנית במכל בתפזורת, כפי שמתואר כאן. פורמטים מתכלים זמינים לביצוע שלבי כביסה microarray לאחר הגברה ב, מבחן amplicon סגור אטום לחלוטין, כפי שדווחו במקומות אחרים 30,33.

1. התקנה

  1. לחלץ ולטהר חומצות גרעין מהדגימה בתנאי בטיחות ביולוגיות מתאימים עם שיטה של ​​בחירה. הדרישה היא שחומצות גרעין תהיה של טוהר מספיק להגברה סימטרית, זמנית ה-PCR.
  2. הכן את סביבת עבודה על ידי ניגוב משטחים וציוד עם פתרונות decontaminating.
  3. הנח ריאגנטים הגברה על קרח או בלוק קר.
  4. תווית צינור microfuge 1.5 מיליליטר סטרילי לתערובת ההורים ההגברה, ולתייג microfuge 0.2 מיליליטר סטרילי tuלהיות עבור כל דגימה.
  5. לאחר ריאגנטים מופשרים, בקצרה מערבולת ולאסוף תוכן לחלק התחתון של הצינור עם דופק ספין במיני צנטריפוגות. לא מערבולת פולימראז תקי. בעדינות קפיצית הצינור לערבב ופעל עם דופק ספין במיני צנטריפוגות.
  6. הכן תערובת אב הגברה שימוש בכמויות התגובה לכל מדגם מוצגות בטבלה 1. כדי להסביר את אי דיוקים pipetting אפשריים, להכין נפח תגובה אחת לפחות יותר מאשר המספר הכולל של דגימות בטיפול. שים לב שתערובת ההורים מכילה פולימראז תקי נוסף, מעל ומעבר למה שמסופק עם חיץ PCR muliplex. הוסף רק את שליטת הגברה / עיכוב לתערובת האמן אחרי כל ריאגנטים האחרים משולבים, והצינורות מגיב המניה חזרו לאחסון.
מגיב נפח לכל מדגם (μl) <strong> סופי []
Mulitplex PCR הצפת עם HotStar תקי פלוס 25 1x
אלבומין בסרום שור (BSA) 0.55 0.6 מ"ג / מיליליטר
פוראמיד 3.8 .7.6%
פולימראז תקי נוסף 0.8 יחידות / μl (סה"כ 4 יחידות)
תמהיל פריימר MDR-TB 15.75 -
H-RNase ללא 2 O 2.1 -
הגברה / עיכוב בקרה 1 5.0 FG / μl
סך הכל 49

טבלת 1. הרכב MDR-TB microarray ההגברה מיקס מאסטר.

  1. מערבולת תערובת ההורים ולאסוף תוכן לחלק התחתון של הצינור עם דופק ספין במיני צנטריפוגות.
  2. שלב 49 μl של תערובת הורים ו1 μl של מ ' ה-DNA שחפת לכל אחד מצינורות המדגם משלב 1.4, לעיל. לחיצוני, אין שליטת תבנית (NTC), השתמש 1 μl מים כיתה ביולוגיה מולקולרית במקום של מ ' דגימת DNA שחפת. ורטקס ודופק ספין הצינור (ות) בסיום.

2. טען Microarrays ההגברה

  1. הוספת 48 μl של כל ערבוב / מדגם הורים על מרכז microarrays המיוחסים להם, נזהרה שלא לגעת בmicroarray עצמו.
  2. במקום להחליק על גבי עטיפה של אטם microarray וחותם, נזהרות שלא מלכודת כל בועות אוויר בתא microarray. בועות האוויר עלולות להשפיע לרעה על יעילות הגברהועלול ליצור חפצים או רעש בתמונה microarray שלאחר מכן.

3. רכיבה על אופניים תרמיים

  1. ברגע שכל microarrays נטען עם מדגם, מצעי מקום בCycler התרמי הבלוק השטוח. ודא כי אפשרות המכסה המחוממת מופעלת "כבויה". ציוד המתקבל מAkonni Biosystems כבר יהיה prequalified לשימוש. אחרת, זה מאוד חשוב לוודא כי את Cycler הבלוק השטוח התרמית (ים) מספקת אחידה (ים), חימום עקבי בכל מצעי microarray.
  2. פתח את תוכנת Cycler התרמית, בחר את התכנית המתאימה, הזן "μl 50" לעוצמת התגובה, וליזום במנוסה. פרוטוקול הרכיבה התרמית שתואר כאן מורכב:
    צעדים רכיבה על אופניים תרמיים
    1 88 ° C 5 דקות
    2 88 ° C 30 שניות
    3 55 ° C 1 דקות
    4 65 מעלות צלזיוס 30 שניות
    5 חזור על שלבים (2-4) ל50 מחזורים
    6 65 מעלות צלזיוס 3 דקות
    7 55 ° C 3 שעות
  3. המספר הכולל של מחזורים תרמיים ו55 C ° זמן המתנה לאחר הגברה הוא משתנה בלתי תלוי שהמשתמש רשאי לשנות, במידת צורך או מתאים לניסוי הספציפי. בגלל תערובת ההורים MDR-TB יוצרת amplicons סימטרית (בעיקר חד גדילים), זה בדרך כלל מועיל לכלול מחזורים תרמיים יותר אחר עלולים להיות מנוצל לפרוטוקול קונבנציונלי, מעריכי PCR הגברה.
  4. כאשר תכנית רכיבה על אופניים וכלת התרמית היא מלאה, בסופו של התכנית, להסיר את microarrays ההגברה, לסגור את התוכנה, ולכבות את Cycler התרמית (ים).

4. שטפי ויבשים

  1. לשטיפת עד 24 מצעים בו זמנית, להכין לפחות 250 מיליליטר 1x SSPE - 0.1% חיץ לשטוף X-100 טריטון, ושתי מכולות עם לפחות 250 מיליליטר deionized או מים כיתה מילי-Q כל אחד. לשטוף החיץ יכול להיות מוכן מראש.
  2. להסיר להחליק את המכסה ואטם מתא microarray הגברה באמצעות מלקחיים שטוח סוף בזהירות. שלב זה הוא הנקודה שבה יש את הסיכון הגדול ביותר של מערכי יסוד ג'ל מזיקים מבחינה פיזית. השתמש בבקרת זיהום PCR המתאימה כדי למנוע את ההתפשטות של חומצות גרעין מוגברות בתוך סביבת העבודה.
  3. הנח מצעי microarray בהחזיק שקופיות היסטולוגיה, ולמקם את כל השקופיות לפח לשטוף המכיל חיץ לשטוף. כסה את המכל עם מכסה.
  4. שטוף microarrays ל10 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה.
  5. טובלים את microarrays פעמים בכל שלוש בשתי כביסות רצופות של deionized אומים מילי-Q כיתה, ואוויר יבש.

5. הדמיה

תמהיל פריימר MDR-TB סימטרי יוצר amplicons כותרת Cy3. ניתן הדמיה microarrays אלמנט ג'ל עם כל תרמי microarray סטנדרטי מסוגל Cy3 הדמיה. הליך ההדמיה הבאה הוא ספציפי לתמהיל MDR-TB מאסטר, תרמי נייד שדה Dx2100, ותוכנה לניתוח אוטומטי הניתן על ידי Akonni.

  1. ודא שכבל Ethernet מהתרמי מחובר למחשב.
  2. הפעל את תרמי. מתג ההפעלה ממוקם בלוח האחורי של המכשיר. נוריות כחולים בחזית תרמי תאיר כאשר תרמי הוא מופעל על.
  3. הפעל את המחשב.
  4. בשולחן העבודה של המחשב, לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה כדי להפעיל את תוכנת ניתוח תמונה האוטומטית.
  5. חכה לתוכנה כדי ליצור חיבור עם המצלמה תרמי. ברגע שנוצר החיבור, הכפתור Analyze הופך להיות זמין, והודעה "חיבור מוצלח" יופיע בפינה השמאלית התחתונה של המסך.
  6. הכנס את microarray ההגברה המיובש עם microarray מול מן המשתמש, וכיוון העדשה האובייקטיבית. אם microarray מכוון בצורה לא נכונה ביחס לעדשה והמצלמה, תוכנה לניתוח האוטומטי תיכשל למקם רשת על תמונת הקרינה.
  7. סגור את דלת הגישה. תצוגה מקדימה של תמונה תהיה זמינה על מסך המחשב.
  8. בחר את תסריט ניתוח MDR-TB מהתפריט הנפתח והזן את הזמן רצוי חשיפה (באלפיות שני). נקודת התחלה טיפוסית עבור microarrays ההגברה אלמנט ג'ל היא 100-500 אלפיות שנייה.
  9. פיקסלים רוויים יוצגו בתצוגה מקדימה באדום. התאם את זמן החשיפה כדי למזער את מספר הפיקסלים רוויים במקומות מסוימים.
  10. לחץ על נתח לרכוש ולנתח את תמונת הקרינה. התוכנה באופן אוטומטי למקםרשת assay הספציפי MDR-TB על גבי התמונה, לחלץ עוצמה משולבת וערכי רקע, ולדווח על תוצאות עמידות לתרופות וגנוטיפ. הניתוח האוטומטי ייקח בדרך כלל כמה שניות. עבור תמונות מאתגרות המכילות סריטות, אבק, לכלוכי ניאון, או נזק פיזי לתכונות microarray, ייתכן שהתוכנה צריכה עד 1 דקות כדי להשלים את הניתוח.
  11. ברגע שהניתוח הסתיים, לחץ על שמור, בחר את תיקיית יעד, הסוג בשם קובץ, ולחץ על אישור. נתוני microarray הבסיסיים נשמרים כקובץ xls. וניתן לייצא לoff-line מנתח, אם תרצה בכך.
  12. ברגע שהניתוח הושלם, להסיר את microarray ההגברה מתרמי, ולחץ על New כדי ליזום את הניתוח הבא.
  13. בסיום איסוף הנתונים, סגור את התוכנה, לכבות את המחשב, ולכבות את תרמי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח תמונה איכותי יכול לספק תובנות לגבי מקורות רעש ניסיוני או השתנות שמאתגרים לזהות בטבלאות נתונים שנוצרו על ידי תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית. לכן, זה יכול להיות שימושי כדי לבדוק חזותי ש1) כל אלמנטי ג'ל הם שלמות וללא ניזק, 2) הרקע הגלובלי הוא חופשי מחפצי ניאון שעשוי להשפיע על אות בודדת יחס רעש (SNR ערכים), 3) אין ראיות ל היווצרות בועה או הגברה / הכלאה לא אחידה על פני המערך, ו4) שהתוכנה זיהתה את כל הנקודות בצורה מדויקת על תמונת microarray. תמונות microarray ההגברה הדוגמא MDR-TB מוצגות באיור 1, הממחישות את מגוון איכותי וחפצים שעלולים להתעורר בשל נזק או בועות פיזיים במהלך רכיבה על אופניים תרמיים. תוכנת ניתוח תמונת microarray סטנדרטית היא בדרך כלל מסוגלת למקם את רשת ולחלץ עוצמה נפרד ונתוני רקע אפילו מתמונות באיכות ירודה כגון shשלו באיור 1, ולכן חובה על החוקר לקבוע קריטריוני בקרת איכות ומדדים לקבלה או דחייה של תמונות microarray מניתוח נוסף. יתירות בדיקה עשויה לעזור לשפר את הבעיות הללו. עם זאת,, אלגוריתם דיווח microarray ההגברה אוטומטי לחלוטין אבחון MDR-TB אחרת להכריז על הבדיקה מאיור 1 כ" לא חוקי ".

ערכי SNR microarray הגברה לסדרת דילול של הדנ"א הגנומי H37Ra wildtype מוצגים בטבלה 2. ב6.25 PG-DNA קלט גנומי לכל תגובה או כ 1.25 x 10 3 שווה תא, כל בדיקות wildtype מזוהות בקלות. ערכי יחס אות לרעש עבור כל אחד מפקדי ההגברה ועיכוב הפנימיים נעו בין 98.48 (rpoB) ל967.24 (Akonni-סיפק שליטה פנימית חיובית), המציין כי כל מטרות הגן בתגובת ההגברה זמנית סימטרית הם מוגברות וזיהוי. לאפקדי תבנית היו שליליים (SNR <3) לכל הבדיקות בmicroarray ההגברה. יחסי Genotyping ב6.25 DNA קלט pg נעו .18-1.00 לכל זוגות חללית WT / MU, אשר מדגים התנהגות נכונה של בדיקות WT וMU וגנוטיפ מתאים.

נתונים גנוטיפ נציג לפנל של מבודד התייחסות ארגון הבריאות העולמית של גנוטיפ הידוע מוצגים בלוח 3. אם פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד (SNP) מיוצג על microarray אלמנט ג'ל, ולאחר מכן בדיקת microarray ההגברה במדויק מזהה את המוטציה המקבילה בMDR שחפת הגנום. חלק מבדיקות microarray ההגברה רגישות גם למוטציות קרוב השכן שאינם מיוצגים באופן מפורש על המערך כמו בדיקה ייחודית. לדוגמא, לבודד TDR-0129 מכילים מוטציה S531E בגן rpoB, אבל אין בדיקה ספציפית על microarray ההגברה לS531E. עם זאת, חמש חלליות SNP אחרות targetinגרם קודון 531 מצביעים על כך שמוטציה קיימת בקודון 531 - microarray ההגברה לכן כראוי מציין כי בודד זה ריפאמפין עמיד. רגישות דומה למוטצית rpoB S513W ניכרה לTDR-0148 בודד. מצד השני, כמה בדיקות SNP אינן רגישות למוטציות השכן קרובים, כפי שמודגמים על ידי TDR-0148 בודד ומוטצית rpoB S512G, ולבודד TDR-0011 ומוטצית katG S315R. אנו חושדים כי סוג זה של בדיקה התנהגות הוא תוצאה של מבנה שניוני ושלישוניים בamplicon ו / או הבדיקה 34 חד גדילים, וזה לא משהו שניתן לחזות מראש. עם זאת, רגישות בדיקה למוטציות השכן קרובה היא מקבילה לשימוש באלומות מולקולריות מרושלות כדי לזהות מוטציות עמידות לתרופות מרובות עם מספר מינימלי של PCR בזמן אמת בדיקות 35,36, ויכולה להיות אבחנת יתרון בתנאים שהמבחן אינו מייצר תוצאות חיוביות שגויות רלהמופרז לרגישות הסמים פנוטיפי.

איור 1
תמונת microarray הגברה דוגמא איור 1. (א) לwildtype pg 100 מ ' הדנ"א הגנומי החפת H37Ra וזמן 100 חשיפה אלפיות שנייה. משואות Cy3 (לgridding האוטומטי ותוכנת פילוח) נמצא בשולי התמונה. תמונה (B) של microarray הגברה מראה חפץ הילת ניאון כתוצאה מהיווצרות הבועה במהלך רכיבה על אופניים תרמיים, וניזוקו אלמנטי ג'ל / פסולת. תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית היא עדיין מסוגלת למקם את רשת ולשלוף נתונים מתמונה זו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

<TR>
חברה מס 'קטלוגי
Biosystems Akonni לשאול
Qiagen # 206,143
Qiagen # 201,207
Qiagen # 206,143
תרמו פישר סיינטיפיק, Inc # BP227-500
סיגמה אולדריץ # 3B6917
Biosystems Akonni לשאול
Biosystems Akonni לשאול
תרמו פישר סיינטיפיק, Inc # BP1328-4
תרמו פישר סיינטיפיק, Inc # BP151-500
טכנולוגיות הנוכחיות, Inc # BRSPRAY128
Decon Labs, Inc # 8416
חברה מס 'קטלוגי
Biosystems Akonni 100-20,011
100-10,021
ArrayIt HTW
תרמו פישר סיינטיפיק, Inc # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
פניאומטיים מרכזי # 95630

טבלה 2. נדרש חומרים וציוד.

69 "> 329.09 <כיתת TD = "xl69"> 109.90 p: none "> 816.64
קודון בדיקה
תעודת זהות
ערכי WT בדיקה יחס אות לרעש 500 pg 100 pg 50 pg 25 pg 12.5 pg 6.25 pg
rpoB 507 1 900.22 644.46 523.17 431.08 364.49 287.47
3 1016.37 699.38 600.16 525.07 446.51 361.64
511 5 867.67 611.97 529.90 451.73 403.76 307.68
512 8 810.69 544.04 488.85 436.89 391.62 257.46 ד>
513 11 824.36 547.04 496.00 472.01 408.96 242.25
515 15 715.48 536.59 416.96 335.81 267.48 189.10
516 17 723.83 496.44 402.95 270.10 201.98
522 27 674.37 413.33 360.40 316.75 236.19 153.40
524 29 269.46 153.69 117.71 118.02 110.13 51.22
526 ביום 31 136.37 82.63 -76.76 53.61 37.76
531 44 219.92 136.31 109.16 96.18 80.58 26.44
533 51 130.54 83.60 76.03 63.47 61.35 41.54
rpsL = "Xl71"> 43 54 10.41 12.75 53.30 767.18 5.39 362.42
88 56 655.54 542.79 527.43 690.34 403.86 456.05
katG 315 58 1037.03 873.46 974.83 811.79 876.47
embB 306 66 940.81 781.13 788.75 837.65 787.05 696.69
Inha 8 82 1069.43 934.38 862.58 936.88 809.85 682 .56
15 85 1111.66 931.88 918.22 957.87 795.72 723.16
17 87 1114.49 926.03 920.60 970.70 854.15 744.41

לוח 3. אות יחס רעש לבדיקות wildtype וסדרת דילול של מ ' שחפת H37Ra הדנ"א הגנומי. ערכי SNR> 3 נחשבים לזיהוי.

"עבור: לשמור-together.within-page =" ntent תמיד "> טבלה 4
לוח 4. נתונים גנוטיפ נציג מMDR-TB המבודד של גנוטיפ הידוע ב25 pg לכל תגובת microarray הגברה. כוכביות לזהות מוטציות שאינם מיוצגות על ידי בדיקה ייחודית על microarray אלמנט ג'ל. WT = רצף חומצות גרעין wildtype. ערכים שליליים (מודגשים ומוצלים) מעידים על מוטציה, סמים ומכאן התנגדות פנוטיפי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עם microarray הגברה היקף הריבוב מוכתב סופו של דבר על ידי היעילות של PCR אסימטרי זמנית, לא microarray. מניסיוננו, 10-12 זוגות פריימר ייחודיים ניתן multiplexed בקלות בפורמט microarray הגברה. קריטריוני פריימר ועיצוב חללית קונבנציונליים ולכן חלים על מבחני חדשים, חוץ מזה שצריך גם להביא בחשבון את האינטראקציות אפשריות בין חומצות גרעין פתרון שלב ובדיקות microarray משותקים, יעילות התרמית של Cycler התרמית, והכלאת בדיקה ההתנהגות במאגר PCR שגם מכיל primers PCR וחפצי הגברה משקל מולקולריים נמוכים. גישות הגברה מאוד מרובבות כגון הגברה הגנום כולו הם לא תורמים לפרוטוקול microarray ההגברה חדר יחיד עבור מספר הסיבות טכניות, כולל הפרעה בין hexamers האקראי ובדיקות משותקים, והכלאה לא יעילה של amplicons הארוכה, פעמיים תקועים. שםגם יחסי גומלין ביניהם, זמן ניתוח כולל, וגבולות קלות שימוש בזיהוי שמשתמשים בודד יצטרך לשקול בעת עיצוב מבחני מותאמים אישית או באמצעות בדיקת MDR-TB שתוארה כאן. לדוגמא, צמצום מספר מחזורי הגברה ואפילו ביטול שלב ההכלאה לאחר ההגברה יפחית באופן משמעותי את זמן ניתוח כולל, אך על חשבון רגישות בדיקה. מצד השני, השיג גבול עותק זיהוי 10 גן שחזור עשוי לדרוש יותר מחזורי הגברה או זמן הכלאה, ובכך להאריך את משך הניתוח מעבר למשמרת אחת.

גנים, מוטציות, תרמי, תוכנת ניתוח, ודיווח אלגוריתם שתואר כאן הם המחשה של שיטת microarray ההגברה והמערכת, ולא דיווח על הביצועים אנליטיים שלהם ותועלת קלינית. לדוגמא, המדגם מתחיל יכול להיות כיח, משקעים לחטא תרבויות, מוצקה או נוזלי - הדרישהלmicroarray ההגברה הוא פשוט כי חומצות גרעין שחולצו הן amplifiable ידי סימטרי PCR, מרובב. חוקרים או רופאים חלקם עשויים למצוא לא מעט ערך קליני באיתור rpsL או מוטציות embB שמקנות עמידות לסטרפטומיצין וethambutol, בהתאמה, רק התנגדות לריפאמפין ואיזוניאזיד להגדיר MDR-TB. לפיכך, ניתן להחליף primers PCR אלה ובדיקות microarray עם פריימרים ובדיקות המתמקדים גנים ומוטציות המקנות עמידות לאנטיביוטיקה ראשונה או קו שני אחרת. אפשר לכתוב אלגוריתם דיווח כדי לספק למשתמש מידע מפורט על המוטציות הספציפיות שאותרו בדגימה שניתנה, ולא "התנגדות זוהתה" פשוטה או תוצאה של "התנגדות לא זוהתה". לאלו חוקרים מעוניינים להשתמש assay הספציפי זה כדי לנתח מ ' שחפת מבודדת, אפשר גם כדי לספק נתונים גנוטיפ גם אם אלמנט IS6110 אינו detecteד בדגימה.

ללא קשר לתמורות assay ודיווח האפשריים, microarray ההגברה והפרוטוקול מתואר כאן נועד לפשט את זרימת העבודה microarray באופן משמעותי על ידי שילוב של צעדי ביולוגיה מולקולריים מרובים לתגובה ביוכימית אחת ותא microfluidic. נתוני הנציג להוכיח את היעילות של גישה על ידי הגברת תשעה אזורים גנומית MDR-TB ואיתור amplicons סימטרית אלה עם microarray אלמנט ג'ל בצפיפות נמוכה. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהליך כביסה בכמות גדולה שמחייב את המשתמש להסיר פיזית את האטם ולכסות להחליק מmicroarray ההגברה לפני הכביסה, ולכן הוא מתאים יותר ליישומי מחקר שימוש בלבד ולא לאבחון קליני. כפי שתואר במקומות אחרים, עם זאת, זה בהחלט אפשרי לשלב את שלב כביסה על שבב באמצעות זרימה לרוחב fluidics 33 ולכן לשמר מתכלה amplicon סגור לחלוטין, כולליםuding אחד שניתן לשלב בקלות לתוך מדגם בתשובה-out מערכת אבחון מתאים ליישומי נקודה של הטיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) בAI089106 RC3 המענק.

חומצות גרעין MDR-TB סופקו על ידי תכנית הפיתוח של הקרן / האו"ם / בנק העולמי / ארגון הבריאות העולמית מיוחדת תכנית הילדים של האו"ם למחקר והדרכה במחלות טרופיות (TDR), ג'נבה, שוויץ.

אנו מודים לד"ר טום Shinnick של המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן להדרכה בגנים ומוטציות הספציפיים שתיכלל בassay אב הטיפוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics