Demonstration af en multiresistent

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En forstærkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR-amplifikation og microarray hybridisering i et enkelt kammer, som i væsentlig grad effektiviserer microarray workflow for slutbrugeren. Forenkling microarray workflow er et nødvendigt første skridt for at skabe microarray-baseret diagnostik, som kan anvendes rutinemæssigt i lavere ressource-miljøer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forenkling microarray workflow er et nødvendigt første skridt for at skabe MDR-TB microarray-baseret diagnostik, som kan anvendes rutinemæssigt i lavere ressource-miljøer. En forstærkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR forstærkning, valg af mål størrelse, target mærkning og microarray hybridisering inden for en enkelt løsning, og i en enkelt mikrofluid kammer. Et parti forarbejdningsmetode demonstreres med en 9-plex asymmetrisk mester mix og low-density gel element microarray til genotypebestemmelse multiresistent Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). Den her beskrevne protokol kan være afsluttet i 6 timer og give korrekte genotypebestemmelse med mindst 1.000 celleækvivalenter af genomisk DNA. Integrering af on-chip vasketrin er muligt, hvilket vil resultere i en helt lukket amplikon fremgangsmåde og system. Omfanget af multiplexing med en forstærkning microarray sidste ende begrænset af antallet af primerpar, der kan kombineres i en enkelt master mix og stadig opnå den ønskede følsomhed og specificitet effektivitetsmålinger, snarere end antallet af prober, der er immobiliseret på array. Ligeledes kan den samlede analyse forkortes eller forlænges afhængigt af den specifikke tilsigtede anvendelse, forskning spørgsmål, og ønskede detektionsgrænser. Ikke desto mindre er den generelle tilgang betydeligt strømliner microarray workflow for slutbrugeren ved at reducere antallet af manuelt intensive og tidskrævende procestrin, og giver en forenklet biokemisk og mikrofluid vej for at omsætte microarray-baseret diagnostik i rutinemæssig klinisk praksis.

Introduction

Tidlig opsporing af tilfælde og hurtig behandling der betragtes som de mest effektive bekæmpelsesstrategier til at reducere Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmission 1, og der er nu bred enighed i TB samfund, et point of care (POC) eller i nærheden af POC test til samtidigt at diagnosticere TB og resistens (DR) er nødvendig. Teknologier såsom Cepheid s GeneXpert og andre nukleinsyreamplifikation test reducere tiden til diagnose for mange TB-patienter og tilvejebringe en hurtig udlæsning angiver resistens over for rifampin eller valgte mutationer, der giver resistens over for andre første eller anden linje lægemidler 2. Selv realtid og thermo nukleinsyreamplifikation tests er designet til at identificere drug resistente mutationer, der fører til MDR-TB, spektret af mutationer de opdager ofte er utilstrækkelig til at designe en individualiseret medicin regime svarende til resistens profil af patienten, og tekniske begrænsninger i forholdtil optisk cross-talk eller kompleksiteten af amplifikations og rapportering kemi 3-7 Maj begrænse antallet af loci eller mutationer, der opdages. Således er detektionsteknologier med højere multiplexing kapacitet, der kræves for at løse kendte huller i MDR-TB POC diagnostik.

Microarrays og WHO-godkendt Hain line probeassays kan løse "multiple gen, flere mutationer" udfordring at diagnosticere MDR-TB 8-29. Desværre er disse hybridisering-baserede, multiplexede detektion platforme benytter multistep, kompliceret, og open-amplicon protokoller, der kræver væsentlig uddannelse og erfaring på molekylære teknikker. Forstærkningen microarray 30 var designet til at løse nogle af disse microarray work-flow og operationelle bekymringer. De forenklede fluidstyrede principper er at uddybe, hybridisere, og opdage nukleinsyremål inden for en enkelt mikrofluid kammer. Brugeren indfører nukleinsyre-og amplifikationsprodukter master blandes i en strømningsteknisk kammer med en pipette og starter termisk cykling protokollen. Batch forarbejdningsmetode er vist her, er microarrays efterfølgende vasket i bulk-opløsning, tørret og afbildes. Denne undersøgelse viser funktionaliteten af en forstærkning microarray ved hjælp af en MDR-TB microarray test for rpoB (30 mutationer), katG (2 mutationer), inhA (4 mutationer), rpsL (2 mutationer), embB (1 mutation), IS1245, IS6110 , og en intern forstærkning og hybridisering kontrol. Mindst én matchede par af microarray sonder (vildtype (WT) og enkelt-nukleotid mutant (MU)) er medtaget for hver mutation af interesse. Rensede nukleinsyrer fra multiresistent M. tuberkulose er fra TDR Tuberkulose Strain Bank 31. Gel element microarrays fremstilles på glas substrater ved copolymerisation væsentlige som beskrevet andetsteds 32, bortset fra at vi bruger 4% monomer og 0,05 mM hver sonde i polymeriztion blanding. Arrays er omgivet med en 50 ml pakning før anvendelse. Efter termisk cykling, hybridisering og vasketrin er amplifikationsprodukter microarrays afbildet på en Akonni bærbar analysator. Baggrund-korrigeret, integrerede signalintensiteter fås fra rå. Tif billeder ved hjælp af en fast cirkel algoritme. Støj for hver gel element beregnes som tre gange standardafvigelsen af ​​de lokale spot baggrunde. Genmål opfattes typisk som påvises i signal-støjforholdet (SNR) værdier ≥ 3. For at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af en specifik mutation i hvert gen eller codon er en diskriminant beregnede forhold fra SNR værdier som (WT-MU) / (WT + MU). Diskriminant forhold <0 er indikative for et lægemiddel-resistens-mutation ved locuset, mens forhold> 0 er indikative for vildtypesekvensen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For laboratorier, der følger universelle PCR forholdsregler, er det driftsmæssigt mere effektiv til at omfatte flere amplifikationsprodukter microarrays og pakninger pr substrat og vaske alle forstærkningsmetoder microarrays samtidig i en bulk container, som beskrevet her. Forbrugsstoffer formater er tilgængelige for at udføre post-forstærkningsmetoder microarray vasketrin i en helt forseglet, lukket amplikon test, som rapporteret andetsteds 30,33.

1.. Opsætning

  1. Uddrag og oprense nukleinsyrer fra prøven under passende biosikkerhed betingelser med en metode til valg. Kravet er, at nukleinsyrer være af tilstrækkelig renhed til asymmetrisk multiplex-PCR-amplifikation.
  2. Forbered arbejdsområde ved at tørre overflader og udstyr med dekontaminerende løsninger.
  3. Placer amplificeringsreagenser på is eller kold blok.
  4. Mærk en steril 1,5 ml mikrofugeglas for forstærkning mester mix, og mærke en steril 0,2 ml mikrofugeglas tuvære for hver prøve.
  5. Efter reagenser optøs kortvarigt vortex og indsamle indhold til bunden af ​​røret med en puls-spin i en mini-centrifuge. Undlad at slynge Taq polymerase. Knips forsigtigt på røret for at blande og følge med en puls-spin i mini-centrifuge.
  6. Forbered en forstærkning mester mix ved hjælp af per-prøve reaktionen vist i tabel 1 bind. At tage højde for eventuelle pipettering unøjagtigheder, forberede mindst én mere reaktion volumen end det samlede antal prøver blive behandlet. Bemærk, at skibsføreren mix indeholder ekstra Taq-polymerase, ud over hvad der er fastsat med det Muliplex PCR-buffer. Kun tilføje forstærkning / hæmning kontrol til master mix efter alle andre reagenser kombineres, og bestanden reagensglas returneret til opbevaring.
Reagens Per-prøvevolumen (ul) <strong> Final []
Mulitplex PCR-buffer med HotStar Taq Plus 25 1x
Bovint serumalbumin (BSA) 0.55 0,6 mg / ml
Formamide 3.8 7,6%
Yderligere Taq-polymerase 0.8 enheder / ul (4 enheder i alt)
MDR-TB primerblanding 15.75 -
RNase-fri H2O 2.1 -
Amplifikation / Inhibering Kontrol 1 5,0 fg / ul
Samlet 49

Tabel 1.. MDR-TB forstærkning microarray mester mix sammensætning.

  1. Vortex stamblanding og indsamle indhold til bunden af ​​røret med en puls-spin i en mini-centrifuge.
  2. Kombiner 49 pi mester mix og 1 pi af M. tuberkulose DNA til hver af prøverørene fra trin 1.4, ovenfor. For en ekstern, ingen template-kontrol (NTC), anvende 1 ml af molekylærbiologisk kvalitet vand i stedet for M. tuberkulose DNA-prøve. Vortex og puls-spin røret (r) når du er færdig.

2.. Load Amplification Microarrays

  1. Tilføj 48 ul af hver master mix / prøve på midten af ​​deres respektive microarrays, være omhyggelig med ikke at røre ved microarray selv.
  2. Placer en tildækningsslip oven på microarray pakning og pakning, pas på ikke at fælde nogen luftbobler i microarray kammeret. Luftbobler kan have en negativ indflydelse på amplificeringseffektivitetog kan skabe artefakter eller støj i den efterfølgende microarray billedet.

3.. Thermal Cycling

  1. Når alle microarrays er fyldt med prøven, som anbringes substrater på den flade blok thermocycler. Sørg for, at den opvarmede låg er slået "Fra". Udstyr opnået fra Akonni Biosystems allerede vil være prækvalificeret til brug. Ellers er det meget vigtigt at kontrollere, at den flade blok termiske cycler (r) giver (e) uniform, ensartet opvarmning på tværs af alle microarray substrater.
  2. Åbn den termiske cycler software, skal du vælge det relevante program, skal du indtaste "50 ul" for reaktionen volumen, og indlede løb. Den termiske cyklus-beskrevet her består af:
    Termisk cykling Steps
    1 88 ° C 5 min
    2 88 ° C 30 sek
    3 55 ° C 1 min
    4. 65 ° C 30 sek
    5. Gentag trin (2-4) i 50 cykler
    6 65 ° C 3 min
    7 55 ° C 3 timer
  3. Det samlede antal varmecykler og 55 ° C efter forstærkning holdetid er uafhængige variable, som brugeren kan ændre efter behov eller egnet til den specifikke eksperiment. Fordi MDR-TB mester mix skaber asymmetriske (overvejende enkelt-strengede) amplikationsprodukter, er det normalt nyttigt at inkludere mere varmecykler end ellers kunne være anvendt til en konventionel, eksponentiel PCR-opformering protokol.
  4. Når den termiske cykling og hybridisering program er færdig, skal du afslutte programmet, skal du fjerne forstærkningsmetoder microarrays, lukke softwaren, og sluk den termiske cycler (r).

4.. Vask og tør

  1. Til vask op til 24 substrater samtidigt fremstilles mindst 250 ml 1x SSPE - 0,1% Triton X-100 vaskepuffer, og to beholdere med mindst 250 ml deioniseret eller Milli-Q-kvalitet vand hver. Den vaskebuffer kan tilberedes i forvejen.
  2. Fjern forsigtigt dækglasset og pakning fra hvert forstærkning microarray kammer ved hjælp af flad-end pincet. Dette trin er det punkt, hvor der er størst risiko for fysisk skadelige gel element arrays. Brug egnede PCR-kontroller forurening at forhindre spredning af amplificerede nukleinsyrer inden for arbejdsmiljø.
  3. Placer microarray substrater i en histologi diasholder og placere alle glider ind i vask bin indeholder den vaskebuffer. Dæk beholderen med et låg.
  4. Vask microarrays i 10 minutter ved stuetemperatur med forsigtig omrøring.
  5. Dyp microarrays tre gange hver i to på hinanden følgende skylninger deioniseret ellerMilli-Q-kvalitet vand og lufttørre.

5.. Imaging

Den asymmetriske MDR-TB primer mix genererer Cy3-mærkede amplikoner. Gel element microarrays kan filmede med enhver standard microarray imager stand imaging Cy3. Følgende imaging procedure er specifikt for MDR-TB mester mix, Dx2100 felt bærbare imager, og automatiseret analyse software, som Akonni.

  1. Sørg for, at Ethernet-kablet fra kamera er sluttet til computeren.
  2. Tænd imager. Afbryderen er placeret på bagsiden af ​​instrumentet. Blå lysdioder på forsiden af ​​billeddanneren lyser når imager er tændt.
  3. Tænd for computeren.
  4. På computerens skrivebord skal du dobbeltklikke på ikonet software til at starte den automatiske billede analyse software.
  5. Vent på software til at etablere en forbindelse med imager kamera. Når forbindelsen er etableret, bliver knappen Analyser tilgængelige, ogmeddelelsen "Tilslutning Vellykket" vises i nederste venstre hjørne af skærmen.
  6. Sæt den tørrede forstærkning microarray med microarray vender væk fra brugeren, og mod objektivlinsen. Hvis microarray er forkert orienteret i forhold til linsen og kameraet, vil automatiseret analyse software ikke at placere et gitter på fluorescensbillede.
  7. Luk dækslet. En forhåndsvisning billede vil være tilgængelig på computerskærmen.
  8. Vælg MDR-TB analyse script fra drop-down menuen og indtast den ønskede behandlingstid (i millisekunder). En typisk udgangspunkt for gel element amplifikationsprodukter microarrays er 100-500 msek.
  9. Mættede pixels vil blive vist på Skærmbillede i rødt. Juster eksponeringen tid til at minimere antallet af mættede pixels i de enkelte pletter.
  10. Klik på Analyser for at erhverve og analysere fluorescens billedet. Softwaren vil automatisk placere enMDR-TB assay-specifikke gitter på billedet, ekstrakt integrerede intensitet og baggrundsværdier, og rapportere lægemiddelresistens og genotypebestemmelserne resultater. Den automatiserede analyse vil typisk tage et par sekunder. For udfordrende billeder, der indeholder ridser, støv, fluorescerende artefakter eller fysiske skader på microarray funktioner, kan softwaren brug for op til 1 min at fuldføre analysen.
  11. Når analysen er færdig, klik på Gem, og vælg destinationsmappen, indtast et filnavn, og klik på OK. Underliggende microarray data gemmes som en. Xls-fil og kan eksporteres til off-line analyser, hvis det ønskes.
  12. Når analysen er færdig, skal du fjerne forstærkning microarray fra Imager og klik på Ny for at indlede den næste analyse.
  13. Når du er færdig indsamling af data, lukke softwaren, lukke computeren ned, og sluk for imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvalitativ billedanalyse kan give indsigt i kilder til eksperimentel støj eller variation, der er udfordrende at identificere i datatabeller genereret af automatiseret billedanalyse software. Således kan det være nyttigt at visuelt konstatere, at 1) alle gel elementer er intakte og ubeskadigede, 2) den globale baggrund er fri fra fluorescerende artefakter, der kan påvirke de enkelte signal støjforhold (SNR) værdier til, 3) der er ingen beviser for bobledannelse eller uensartet amplifikation / hybridisering på tværs af array, og 4) at softwaren præcist identificeret alle pletter på microarray billedet. Eksempel MDR-TB forstærkning microarray billeder er vist i figur 1, der illustrerer en høj kvalitet array og artefakter, der kan opstå som følge af fysisk beskadigelse eller bobler under termisk cykling. Standard microarray billede analyse software er som regel i stand til at placere et gitter og udtrække integreret intensitet og baggrund data selv fra fattige kvalitet billeder, såsom shegne i figur 1B, så det påhviler forskeren at fastlægge kriterier og målinger kvalitetskontrol for at acceptere eller afvise microarray billederne fra yderligere analyse. Probe redundans kan afhjælpe disse problemer. Imidlertid ville en fuldt automatiseret, diagnostisk MDR-TB forstærkning microarray rapportering algoritme ellers erklære testen fra figur 1B som "ugyldige".

Forstærkning microarray SNR værdier for en fortyndingsrække af vildtype H37Ra genomisk DNA er vist i tabel 2.. Ved 6.25 pg input genomisk DNA pr reaktion eller cirka 1,25 x 10 3 celle ækvivalenter, er alle vildtype-prober let påvises. SNR-værdier for hver af de interne amplifikationsprodukterne og hæmning kontrol varierede fra 98,48 (rpoB) til 967,24 (Akonni leveret intern positiv kontrol), hvilket indikerer, at alle mål gen i den asymmetriske multiplex amplifikationsreaktion amplificeres og detekteres. Nejskabelon kontroller var negative (SNR <3) for alle sonder i forstærkning microarray. Genotypebestemmelse nøgletal på 6,25 pg input DNA varierede fra 0,18 til 1,00 for alle WT / MU probepar, der viser korrekt adfærd af WT og MU sonder og passende genotypebestemmelse.

Repræsentative genotypebestemmelse data for et panel af World Health Organization referencenumre isolater af kendt genotype er vist i tabel 3. Hvis et enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) er repræsenteret på gelen element microarray, så forstærkning microarray test nøjagtigt detekterer den tilsvarende mutation i MDR tuberkulose genomet. Nogle af amplifikationsprodukterne microarray sonder er også følsomme over for nær-nabo-mutationer, der ikke eksplicit er repræsenteret på arrayet som en unik probe. For eksempel isolere TDR-0129 indeholder en S531E mutation i rpoB-genet, men der er ikke en specifik sonde på amplifikationen microarray for S531E. Alligevel fem andre SNP prober Targreting codon 531 viser, at en mutation er til stede ved codon 531 - forstærkning microarray indikerer derfor med rette, at dette isolat er rifampin resistent. Lignende følsomhed over for rpoB S513W mutationen er indlysende for isolat TDR-0148. På den anden side nogle SNP prober er ikke følsomme over nabo mutationer, som illustreret ved isolat TDR-0148 og rpoB S512G mutation og isolere TDR-0011 og katG S315R mutation. Vi formoder, at denne type af sonde adfærd er en konsekvens af sekundære og tertiære struktur i enkeltstrengede amplikon og / eller sonde 34, og er ikke noget, der kan forudsiges på forhånd. Ikke desto mindre sonde følsomhed over for nabo-mutationer er analog med brugen af sjusket molekylære beacons til at opdage multiple drug resistente mutationer med et minimalt sæt af real-time PCR-prober 35,36, og kan være diagnostisk fordelagtig forudsat at testen ikke genererer falske positiver relativ til den fænotypiske narkotika modtagelighed.

Figur 1
Fig. 1. (A) Eksempel forstærkning microarray billede for 100 pg vildtype M. tuberculosis H37Ra genomisk DNA og 100 msek eksponeringstid. Cy3 beacons (til automatiseret gridding og segmentering software) er på periferien af billedet. (B) Billede af en forstærkning microarray viser en fluorescerende halogen artefakt følge bobledannelse under termisk cykling, og beskadiget gel elementer / snavs. Automatiseret billede analyse software er stadig i stand til at placere et gitter og udtrække data fra dette billede. Klik her for at se en større version af dette tal.

<tr>
Firma Catalog Number
Akonni Biosystems Spørge
Qiagen # 206.143
Qiagen # 201207
Qiagen # 206.143
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP227-500
Sigma-Aldrich # 3B6917
Akonni Biosystems Spørge
Akonni Biosystems Spørge
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP1328-4
Thermo Fisher Scientific, Inc. # BP151-500
Aktuelle Technologies, Inc. # BRSPRAY128
Decon Labs, Inc. # 8416
Firma Catalog Number
Akonni Biosystems 100-20.011
100-10.021
ArrayIt HTW
Thermo Fisher Scientific, Inc. # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
Central Pneumatic # 95630

Tabel 2.. Nødvendige materialer og udstyr.

69. "> 329,09 <td class = "xl69"> 109,90 p: none "> 816,64
Codon Probe
ID
WT Probe SNR værdier 500 pg 100 pg 50 pg 25 pg 12,5 pg 6,25 pg
rpoB 507 1 900,22 644,46 523,17 431,08 364,49 287,47
3 1016,37 699,38 600,16 525,07 446,51 361,64
511 5. 867,67 611,97 529,90 451,73 403,76 307,68
512 8. 810,69 544,04 488,85 436,89 391,62 257,46 d>
513 11 824,36 547,04 496.00 472,01 408,96 242,25
515 15 715,48 536,59 416.96 335,81 267,48 189,10
516 17 723,83 496,44 402,95 270,10 201,98
522 27 674,37 413,33 360,40 316,75 236.19 153,40
524 29 269,46 153,69 117,71 118,02 110,13 51.22
526 31 136,37 82,63 76.76 53,61 37,76
531 44 219,92 136,31 109,16 96.18 80,58 26.44
533 51 130,54 83.60 76.03 63.47 61,35 41,54
rpsL = "Xl71"> 43 54 10.41 12.75 53,30 767,18 5.39 362,42
88 56 655,54 542,79 527,43 690,34 403,86 456,05
katG 315 58 1037,03 873,46 974,83 811,79 876,47
embB 306 66 940,81 781,13 788,75 837,65 787,05 696,69
inhA 8. 82 1069,43 934,38 862,58 936,88 809,85 682 .56
15 85 1111,66 931,88 918,22 957,87 795,72 723,16
17 87 1114,49 926,03 920,60 970,70 854,15 744,41

Tabel 3. Signal til støj-forhold for vildtype-prober og en fortyndingsrække af M. tuberculosis H37Ra genomisk DNA. SNR værdier> 3 betragtes påviselige.

ntent "fo: keep-together.within-side =" altid "> Tabel 4
Tabel 4. Repræsentative genotypebestemmelse data fra MDR-TB-isolater af kendt genotype på 25 pg pr forstærkning microarray reaktion. Stjerner identificere mutationer, der ikke er repræsenteret af en unik sonde på gelen element microarray. WT = vildtype nukleinsyresekvens. Negative værdier (fed og skyggefulde) er vejledende for en mutation, og derfor fænotypiske drug-resistens. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omfanget af multiplexing med en forstærkning microarray sidste ende dikteret af effektiviteten af ​​multiplex asymmetrisk PCR, ikke microarray. Det er vores erfaring, kan 10-12 unikke primerpar let multiplex i en forstærkning microarray-format. Konventionelle primer og probe design kriterier gælder derfor for nye assays, bortset fra at man også må overveje mulige interaktioner mellem opløsningsfase-nukleinsyrer og immobiliserede microarray prober, den termiske virkningsgrad af termiske cykler, og probehybridisering adfærd i en PCR-buffer, der også indeholder PCR-primere og lavmolekylære amplifikationsprodukter artefakter. Meget multiplekserede amplifikationssystemer tilgange såsom hele genomet forstærkning er ikke befordrende for en enkelt-kammer forstærkning microarray protokol for en række tekniske grunde, herunder interferens mellem vilkårlige hexamerer og immobiliserede sonder, og ineffektiv hybridisering af lange, dobbelt-strenget amplikationsprodukter. Derer også en indbyrdes sammenhæng mellem lethed-i-brug, samlet analyse tid, og detektionsgrænser, at de enkelte brugere skal overveje, når designe brugerdefinerede analyser eller ved hjælp af MDR-TB test beskrevet her. For eksempel vil reducere antallet af amplifikationscycler og helt fjerne post-forstærkning hybridisering trin reducere den samlede analyse tid, men på bekostning af testens følsomhed. På den anden side kan opnå en reproducerbar 10 gen detektionsgrænse kopi kræver flere amplifikationscycli eller hybridisering tid, hvilket forlænger den samlede analyse tid ud over et enkelt skift.

De gener, mutationer, imager, analyse software og rapportering algoritme beskrevet her illustrerer forstærkning microarray metode og system, snarere end en rapport om deres analytiske ydeevne og kliniske anvendelighed. For eksempel kan den begyndende prøve være spyt, dekontamineret sediment, fast-eller flydende kulturer - Kravettil amplifikation microarray er simpelthen, at de ekstraherede nukleinsyrer er amplificerbare ved asymmetrisk, multiplex PCR. Nogle forskere eller klinikere kan finde lidt at ingen kliniske værdi i at opdage rpsL eller embB mutationer, som giver resistens over for streptomycin og ethambutol henholdsvis kun modstand mod rifampin og isoniazid definere MDR-TB. Således kan disse PCR primere og microarray prober erstattet med primere og prober, der er målrettet mod gener og mutationer, der giver resistens over for andre første-eller anden-line antibiotika. Det er muligt at skrive en indberetning algoritme til at give brugeren med detaljerede oplysninger om de specifikke mutationer, der er fundet i en given prøve, snarere end en simpel "modstand opdaget" eller "modstand ikke opdaget" resultat. For de forskere, der er interesserede i at bruge denne specifik analyse til at analysere M. tuberkulose isolater, er det også muligt at tilvejebringe de genotypebestemmelse data, selvom IS6110 element ikke detected i prøven.

Uanset de mulige assay og rapportering permutationer, er forstærkning microarray og protokol beskrevet her udviklet til en betydelig forenkling af microarray workflow ved at kombinere flere molekylærbiologiske trin i en enkelt biokemisk reaktion og mikrofluid kammer. De repræsentative data påvise effekten af ​​tilgang ved at forstærke ni MDR-TB genomiske regioner og afsløre disse asymmetriske amplikoner med en lav massefylde gel element microarray. Den her beskrevne protokollen bruger en bulk vask procedure, der kræver, at brugeren fysisk fjerne pakningen og dækglasset fra forstærkning microarray før vask, og er derfor mere hensigtsmæssigt for forskningsbaseret brug-kun ansøgninger snarere end klinisk diagnostik. Som beskrevet andetsteds, men det er bestemt muligt at inkorporere et vasketrin on-chip bruger lateral flow fluidik 33 og dermed bibeholde en helt lukket amplikon forbrugsmaterialer, including en, der let kan inkorporeres i en prøve-i svar-out diagnostisk system, der er egnet til point-of-care applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) under tilskud RC3 AI089106.

MDR-TB nukleinsyrer blev leveret af De Forenede Nationers Børnefond / United Nations Development Programme / Verdensbanken / World Health Organization særlige program for forskning og uddannelse i tropesygdomme (TDR), Genève, Schweiz.

Vi takker Dr. Tom Shinnick af det amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse for vejledning om de specifikke gener og mutationer at medtage i prototypen analysen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics