Çok ilaca dirençli Demonstrating

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bir amplifikasyon mikrodizi önemli ölçüde son kullanıcı için mikro-dizi iş akışını tek bir oda içine asimetrik PCR amplifikasyonu ve mikrodizi hibridizasyon birleştirir. Mikrodizi iş akışı basitleştirilmesi rutin alt-kaynak ortamlarda kullanılabilir mikroarray tabanlı tanı oluşturmak için gerekli bir ilk adımdır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikrodizi iş akışı basitleştirilmesi rutin alt-kaynak ortamlarda kullanılabilir ÇİD-TB mikroarray tabanlı tanı oluşturmak için gerekli bir ilk adımdır. Bir amplifikasyon mikroarray tek bir çözüm içinde ve tek bir mikroakışkan odasına asimetrik PCR, hedef boyutu seçimi, hedef etiketleme ve mikroarray hibridizasyon birleştirir. Bir toplu işleme yöntemi çoklu ilaca dirençli Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) genotiplemeye 9-karmaşık asimetrik ana karışımı ve düşük yoğunluklu jel elemanı mikrotertipte ile gösterilmiştir. Burada açıklanan protokol 6 saat içinde tamamlanmış ve genomik DNA'sının en az 1000 hücre eşdeğer doğru genotipleme temin edilebilir. Çip üzerinde yıkama adımları birleştirilerek tamamen kapalı bir amplikon, yöntem ve sistem ile sonuçlanır ki, mümkündür. Bir amplifikasyon mikroarray ile çoğullama ölçüde sonuçta tek bir ana m birleştirilebilir primer çiftlerinin sayısı ile kısıtlanırix ve hala oldukça dizide hareketsiz olan probların sayısından daha istenen duyarlılık ve özgüllük performans ölçümleri, başarmak. Aynı şekilde, toplam analiz süresi belirli bir kullanım amacı, araştırma sorusu ve tespiti istenen sınırları bağlı olarak kısaltılabilir veya uzatılabilir. Bununla birlikte, genel bir yaklaşım önemli ölçüde elle yoğun ve zaman alıcı bir işlem adımlarının sayısını azaltarak son kullanıcı için mikroarray iş akışını düzenler, ve rutin klinik uygulamaya mikroarray tabanlı tanı çeviri için basitleştirilmiş bir biyokimyasal ve mikroakışkan yolu sağlar.

Introduction

Erken vaka tespiti ve hızlı tedavi Mycobacterium tuberculosis (MTB) iletim 1 azaltmak için en etkin kontrol stratejileri kabul ve bakım (POC) veya POC testinde yakın bir noktadan aynı anda TB teşhis TB toplumda geniş bir mutabakat bulunmaktadır vardır ve ilaç direnci (DR) gereklidir. Böyle Sefeid en GeneXpert ve diğer nükleik asit amplifikasyon testleri gibi teknolojiler birçok TBC hastaları için tanı süresini azaltmak, ve rifampin veya diğer birinci veya ikinci basamak ilaçlara 2 direnç kazandıran seçilen mutasyonlara karşı direnç gösteren bir hızlı okuma-çıkış sağlamak. Gerçek zamanlı ve izotermal nükleik asit amplifikasyon testleri MDR-TB yol açan ilaç direnç mutasyonları tanımlamak için tasarlanmış olsa da, bunlar tespit mutasyonların spektrumu, hastanın ilaç direnci profiline karşılık gelen kişiselleştirilmiş bir ilaç rejimi tasarımı genellikle yetersizdir ve ilgili teknik kısıtlarıoptik çapraz konuşma veya amplifikasyon ve raporlama kimyaları karmaşıklığına 3-7 loci veya tespit edildiği mutasyonların sayısını sınırlandırabilir. Böylece, yüksek çoklayıcı kapasiteli algılama teknolojileri ÇİD-TB POC teşhis bilinen boşlukları gidermek için gereklidir.

Mikroarray'ler ve WHO onaylı Hain hat prob deneyleri ÇİD-TB 8-29 teşhis "birden fazla gen, multipl mutasyonlar" aşabilirsiniz. Ne yazık ki, bu hibridizasyon temelli, mültipleksli algılama platformları çok adımlı, karmaşık ve moleküler teknikler önemli eğitim ve uzmanlık gerektiren açık Amplikon protokollerini kullanır. Amplifikasyon Mikrodizi 30 bu mikroarray iş akışı ve operasyonel bazı endişelerini gidermek için tasarlanmıştır. Basitleştirilmesi akışkan ilkeleri, yükseltmek hibridize olan ve tek bir mikroakışkan odası içinde nükleik asit hedefleri tespit etmek için bulunmaktadır. Kullanıcı, nükleik asit amplifikasyonu ve mas getirmektedirter bir pipet ile bir akışkan odasına karıştırın ve termal döngü protokolü başlar. Burada gösterilen toplu işlem yöntemi için, mikro sıraları, daha sonra, yığın solüsyonu ile yıkanır, kurutulur ve görüntülü. Bu çalışma rpoB için bir ÇİD-TB mikroarray test (30 mutasyon), katG (2 mutasyonları), Inha (4 mutasyonlar), rpsL (2 mutasyonları), embB (1 mutasyon), IS1245, IS6110 kullanarak bir amplifikasyon mikrotertibin işlevselliğini gösteriyor ve bir iç amplifikasyon ve hibridizasyon kontrolü. Mikrodizi sondalar (vahşi tip (WT) ve tek nükleotid mutant (MU)) en az bir çift eşleşen ilgi her mutasyon için dahil edilir. Çoklu ilaç dirençli M. saflaştırılmış nükleik asitleri tüberküloz TDR Verem Zorlanma Bankası 31 vardır. Başka bir yerde tarif edildiği gibi 32 Gel elemanı mikroarrayleri biz polymeriz her sonda% 4 monomer ve 0.05 mM kullanmak dışında, esas olarak kopolimerizasyonu ile, cam alt-tabakalar üzerinde üretilmektediration karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Diziler, kullanımdan önce, 50 ml conta ile çevrilidir. Termal bisiklet, melezleme ve yıkama aşamalarından sonra, amplifikasyon mikroarray'ler bir Akonni taşınabilir analizörü ile görüntülenmiş. Background-düzeltilmiş, entegre sinyal yoğunlukları ham elde edilir. Sabit bir daire algoritma kullanarak tif görüntüler. Her jel elemanı için Gürültü yerel nokta kökenden üç kat standart sapma olarak hesaplanmıştır. Gürültü oranı (SNR) sinyal için ≥ 3 değerleri gen hedefleri tipik bir şekilde saptanabilir kabul edilir. Her bir gen ya da kodon belirgin bir mutasyonun varlığını veya yokluğunu belirlemek için, ayırt edici bir oranı (WT-MU) / (WT + MU) halinde SNR değerlerinden hesaplanır. Discriminant oranları 0, vahşi tip dizisinin göstergesidir <oranları ise 0, lokusuna bir ilaç-dirençli mutasyon göstergesidir>.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Evrensel PCR önlemleri takip laboratuarları için, birkaç amplifikasyon mikrodizinleri ve substrat başına contalar bulunmaktadır ve burada anlatıldığı gibi, bir toplu kapta aynı anda tüm büyütme mikrodizinleri yıkamak için operasyonel daha etkilidir. Başka yerde 30,33 bildirildiği gibi sarf biçimleri, tamamen kapalı, kapalı Amplikon testinde post-amplifikasyon mikroarray yıkama adımları gerçekleştirmek için kullanılabilir.

1.. Kurulum

  1. Özü ve tercih edilen bir yöntem ile, uygun koşullar altında biyo-güvenlik numuneden nükleik asitleri saflaştırmak. Gereksinimi nükleik asitler asimetrik, multipleks PCR amplifikasyonu için yeterli saflıkta olmasıdır.
  2. Dekontaminasyon çözümleri ile yüzeyleri ve ekipmanı silerek çalışma alanını hazırlayın.
  3. Buz veya soğuk blokta güçlendirme reaktifleri yerleştirin.
  4. Amplifikasyon ana karışımı için bir steril 1.5 ml mikrofuge'de tüp etiketleyin ve bir steril 0.2 ml mikrofuge'de tu etiketHer bir numune için olabilir.
  5. Reaktifler, kısa bir süre girdap çözülmüş ve mini santrifüjünde bir darbe spin tüpün dibine içeriğini toplamak sonra. Taq polimeraz vorteks etmeyin. Hafifçe karıştırın ve mini-santrifüj bir darbe spin ile takip tüp fiske.
  6. Tablo 1'de gösterilen başına örnek reaksiyon hacimleri kullanılarak amplifikasyon master karışımı hazırlayın. Olası pipetleme yanlışlıklar için hesap için, işlenen örneklerin toplam sayısından en az bir fazla reaksiyon hacmini hazırlamak. Ana karışım ilave Taq polimeraz, üzerinde ve muliplex PCR tampon maddesi ile sağlanmaktadır ne yukarıda içerdiğini unutmayın. Sadece diğer tüm maddeleri birleştirildikten sonra ana karıştırmak için amplifikasyon / inhibisyon denetimi ekleyin ve stok reaktif tüpler depolama döndü.
Reaktif Per-Numune Hacmi (ul) <strong> Final []
HotStar Taq Plus ile Mulitplex PCR Tampon 25 1x
Sığır serum albümini (BSA) 0.55 0.6 mg / ml
Formamide 3.8 7.6%
Ek Taq polimeraz 0.8 birim / ul (4 adet toplam)
MDR-TB primer karışımı 15.75 -
RNase içermeyen H2O 2.1 -
Amplifikasyon / önlenmesi, kontrol 1 5,0 fg / ul
Toplam 49

Tablo 1. ÇİD-TB amplifikasyon mikroarray master miks bileşimi.

  1. Vortex ana karışımı ve mini santrifüjünde bir darbe spin tüpün dibine içeriğini toplamak.
  2. Ana karışımı 49 ul ve M. 1 ul birleştirin yukarıdaki aşama 1.4 'den örnek tüplerinin her birine tüberküloz DNA. Bir dış, hiç şablon kontrol (NTC), M. yerine moleküler biyoloji dereceli su 1 ul kullanımı tüberküloz DNA örneği. Vortex ve darbe-spin bitmiş tüp (ler).

2.. Amplifikasyon mikrodizileri yükleyin

  1. Mikrotertibi kendisi dokunmayın dikkatli olmak, kendi microarrays merkezi üzerine her ana mix / numunenin 48 ul ekleyin.
  2. Mikroarray odasında herhangi bir hava kabarcığı değil tuzak için dikkatli olmak, mikroarray conta ve mühür üstüne bir kapak kayma yerleştirin. Hava kabarcıkları olumsuz amplifikasyon verimliliğini etkileyebilirve eserler veya sonraki mikroarray görüntüde gürültü yaratabilir.

3.. Termal Bisiklete binme

  1. Bir kez tüm mikroarray'ler düz blok termal döngü örnek, yer yüzeylerde yüklenir. Isıtmalı kapak seçeneği "Kapalı" açık olduğundan emin olun. Akonni Biyosistem elde Ekipmanları zaten kullanıma ölçütlere olacaktır. Aksi takdirde, düz blok termal döngü (ler) tüm mikrotertip yüzeyler üzerinde (ler) üniforma, tutarlı ısıtma sağlamak doğrulamak için çok önemlidir.
  2. , Termal döngü yazılımı açın uygun programı seçin, reaksiyon hacmi için "50 ul" girin ve Çalışmayı başlatmak. Burada anlatılan Termal döngü protokol oluşur:
    Termal Bisiklet Adımlar
    1 88 ° C 5 dakika
    2 88 ° C 30 sn
    3 55 ° C 1 dakika
    4 65 ° C 30 sn
    5 50 devir için adımlar (2-4) tekrarlayın
    6 65 ° C 3 dakika
    7 55 ° C 3 saat
  3. Toplam termal döngü sayısı ve 55 ° C amplifikasyon sonrası bekleme süresi gerekli ya da belirli bir deney için uygun kullanıcı, değiştirebilir ki bağımsız değişkenler. MDR-TB ana karışım, asimetrik (ağırlıklı olarak tek şeritli) amplikonları oluşturduğu için, başka türlü bir geleneksel, üslü PCR protokolü için kullanılan olabilir daha fazla ısı döngüsü dahil etmek genellikle yararlıdır.
  4. Termal bisiklet ve melezleme programı tamamlandığında, programını sona amplifikasyon mikrodizinleri kaldırmak, yazılımı kapatın ve termal döngü (ler) kapatın.

4.. Yıkama ve Kuru

  1. % 0.1 Triton X-100 yıkama tamponu, ve en az 250 ml deiyonize veya Milli-Q dereceli su her iki konteyner - aynı anda 24 alt tabakalara kadar yıkanması için, en az 250 ml 1x SSPE hazırlamak. Yıkama tamponu önceden hazırlanabilir.
  2. Dikkatle düz uç forseps kullanarak her amplifikasyon mikroarray odasından kapak kayma ve contayı çıkarın. Bu adım, fiziksel olarak zarar jel eleman dizilerin büyük risk var olduğu noktadır. Çoğaltılan nükleik asitlerin yayılmasını önlemek için uygun PCR kontaminasyonu denetimlerini kullanın çalışma ortamında.
  3. Bir histoloji slayt tutucu mikroküme yüzeylerde yerleştirin ve yıkama tamponu içeren yıkama kutusu içine tüm slaytlar yerleştirin. Bir kapak ile konteyner örtün.
  4. Yavaşça sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca mikrodizileri yıkayın.
  5. Microarrays üç deiyonize iki ardışık yıkar kez her veya DipMilli-Q kaliteli su ve hava kuru.

5.. Görüntüleme

Asimetrik MDR-TB primer karışımı Cy3-etiketli amplikonları oluşturur. Jel eleman mikroarrayler görüntüleme Cy3 yeteneğine sahip herhangi bir standart mikroarray görüntüleyicisi ile görüntülü olabilir. Aşağıdaki görüntüleme yöntemidir Akonni tarafından sağlanan ÇİD-TB ana karışımı, Dx2100 alan taşınabilir görüntüleme cihazı ve otomatik analiz yazılımı için özeldir.

  1. Görüntüleyici gelen ethernet kablosunun bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.
  2. Görüntüleyici açın. Güç anahtarı cihazın arka panelinde yer almaktadır. Kamera açıkken görüntüleyici önündeki mavi LED yanacaktır.
  3. Bilgisayarı açın.
  4. Bilgisayar masaüstünde, çift otomatik görüntü analiz yazılımı başlatmak için yazılım simgesini tıklatın.
  5. Kamera kamera ile bağlantı kurmak için yazılım için bekleyin. Bağlantı kurulduktan sonra, analiz düğmesi kullanılabilir hale gelir, vemesajı "Başarılı Connection" ekranın sol alt köşesinde görünecektir.
  6. Mikrodizi kullanıcıdan uzağa bakan ve objektif lens doğru ile kurutuldu, amplifikasyon mikrodizisinin yerleştirin. Mikrodizi yanlış lens ve kamera ile ilgili yönde ise, otomatik analiz yazılımı floresan görüntü üzerinde bir ızgara yer başarısız olur.
  7. Erişim kapağını kapatın. Bir önizleme görüntüsü bilgisayar ekranında mevcut olacaktır.
  8. Açılır menüden ÇİD-TB analiz komut dosyası seçin ve (milisaniye) istenilen pozlama süresini girin. Jel eleman güçlendirme mikrodizilerde tipik bir başlangıç ​​noktası 100-500 msn.
  9. Doymuş piksel kırmızı Preview Image görüntülenir. Bireysel noktalar içinde doymuş piksel sayısını en aza indirmek için pozlama süresini ayarlayın.
  10. Floresan görüntü elde etmek ve analiz etmek için analiz tıklayın. Yazılım otomatik olarak yerleştirecektirGörüntü üzerine ÇİD-TB tahlil özgü ızgara, entegre yoğunluğu ve arka plan değerleri ayıklamak ve ilaç direnci ve genotip sonuçları rapor. Otomatik analizi, genellikle birkaç saniye sürer. Çizik, toz, floresan eserler veya mikroarray özellikleri fiziksel zarar içeren zorlu görüntülerde, yazılım analizi tamamlamak için 1 dakika kadar gerekebilir.
  11. Analiz tamamlandıktan sonra, Kaydet üzerine tıklayın bir dosya adı hedef klasör, türünü seçin ve Tamam 'ı tıklatın. İsterseniz yatan mikroarray veri bir. Xls dosyası olarak kaydedilir ve off-line için ihraç edilebilir, analiz eder.
  12. Analiz tamamlandıktan sonra, görüntüleyici gelen büyütme mikrotertibi kaldırmak ve sonraki analizi başlatmak için Yeni tıklayın.
  13. Veri toplama bittiğinde, yazılımı kapatın bilgisayarı kapatın ve görüntüleyici kapatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nitel görüntü analizi otomatik görüntü analiz yazılımı tarafından oluşturulan veri tabloları tanımlamak için zorlu deneysel gürültü veya değişkenlik kaynaklarını içgörü sağlayabilir. Böylece, 1) Tüm jel elemanları sağlam ve hasarsız olduğu, 2) Küresel plan gürültü oranı (SNR) değerleri tek bir sinyalin etkileyebilecek floresan eserler ücretsiz olduğunu tespit görsel olarak yararlı olabilir, 3) hiçbir kanıt yoktur kabarcık oluşumu ya da kuralsız amplifikasyon / melezleme dizi boyunca ve 4) yazılımı doğru mikroarray görüntü üzerinde tüm noktalar tanımladı. Örnek MDR-TB amplifikasyon mikroarray görüntüleri, yüksek kaliteli bir dizi ve termal devir esnasında fiziksel hasar veya kabarcıklar ortaya çıkabilecek eserler gösteren, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Standart mikroarray görüntü analizi yazılımı genellikle bir ızgara koyun ve hatta sh gibi düşük kaliteli görüntüleri ayrılmaz yoğunluğu ve arka plan veri ayıklamak için yapabiliyorKendi Şekil 1B, bu kabul veya daha fazla analiz mikroarray görüntüleri reddedilmesi için kalite kontrol kriterleri ve ölçütleri kurmak için araştırmacı görevidir yani. Probe fazlalık bu konuları iyileştirmek yardımcı olabilir. Ancak, tam otomatik, tanı ÇİD-TB amplifikasyon mikroarray raporlama algoritması aksi takdirde "geçersiz" olarak Şekil 1B gelen testini beyan ederim.

Vahşi tipli H37Ra genomik DNA, bir seyreltme serisi için çoğaltma mikro-SNR değerleri Tablo 2 de gösterilmiştir. Reaksiyon başına 6,25 pg giriş, genomik DNA ya da yaklaşık olarak 1.25 x 10 hücre 3 eşdeğer, tüm vahşi tip problar kolayca tespit edilir. Iç amplifikasyonu ve inhibisyon kontrollerin her biri için SNR değerleri asimetrik multipleks amplifikasyon reaksiyonunda tüm gen hedefler yükseltilir ve tespit belirten, (dahili pozitif kontrol Akonni tarafından sağlanan) 98,48 (rpoB) için 967,24 arasında değişmektedir. Hayırşablon kontroller (SNR <3) negatif olan amplifikasyon mikrotertipte tüm problar için. 6.25 pg giriş DNA'ya Genotiplendirme oranları WT ve MU prob ve uygun genotiplemede doğru davranışı gösteren tüm WT / MU prob çiftleri için 0,18-1,00 arasında değişmektedir.

Bilinen genotip Dünya Sağlık Örgütü referans izolatlarının bir panel için Örnek genotipleme veriler Tablo 3'te gösterilmiştir. Bir tek nükleotid polimorfizm (SNP) jel element mikrodizi üzerindeki temsil edilir, daha sonra, amplifikasyon mikro-deney doğru MDR karşılık gelen mutasyon tespit -TB genom. Amplifikasyon mikrodizi sensörlerinden bazıları açıkça özel bir prob olarak dizisinde temsil edilmez yakın komşu mutasyonlar duyarlıdır. Örneğin, TDR-0129 rpoB geninde bir mutasyon ihtiva eden, izole S531E, ancak belirli bir prob için S531E amplifikasyon mikrodizi üzerindeki yok. Bununla birlikte, diğer beş SNP probları targetIng kodon 531 bir mutasyonu 531 mevcut olduğunu göstermektedir - amplifikasyon mikro-dizi, bu nedenle bu doğru, izole rifampin dirençli olduğunu gösterir. RpoB S513W mutasyon benzer duyarlılık izole TDR-0148 için açıktır. Öte yandan, bir SNP-prob izolat TDR 0148 ve rpoB S512G mutasyonu ile gösterildiği üzere, yakın komşu mutasyonlara duyarlı değildir ve TDR-0011 ve katG S315R mutasyonu izole eder. Biz sonda davranış bu tür tek iplikli amplikonunu ve / veya sonda 34 ikincil ve üçüncül yapısının bir sonucudur, ve a priori olarak tahmin edilebilir bir şey olmadığını sanıyorum. Bununla birlikte, yakın komşu mutasyonlara prob duyarlılık PCR 35,36 probes gerçek zamanlı en az sayıda olan, çoklu ilaç direnç mutasyonları tespit etmek için özensiz moleküler işaretleri kullanımına benzer ve test yanlış pozitif üretmez Resim tanısal avantajlı olabilir görecelifenotipik ilaç duyarlılık göstermeyen primer.

Şekil 1
100 pg vahşi tip M. Şekil 1. (A) Örnek büyütme mikro-dizi görüntü tuberculosis H37Ra genomik DNA ve bir 100 msn maruz kalma süresi. Cy3 işaretleri (otomatik gridding ve bölme yazılımı için) görüntünün çevresi üzerinde bulunmaktadır. termal dalgalanmaları sırasında kabarcık oluşumundan kaynaklanan bir floresan halo eser gösteren bir amplifikasyon mikrodizisinin (B) Görüntü, ve jel elemanları / enkaz hasarlı. Otomatik görüntü analiz yazılımı hala bu görüntüden bir ızgara ve özü veri yerleştirmek mümkün. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

<tr>
Şirket Katalog Numarası
Akonni Biyosistem Sormak
Oiagen # 206143
Oiagen # 201207
Oiagen # 206143
Thermo Fisher Scientific, Inc # BP227-500
Sigma-Aldrich # 3B6917
Akonni Biyosistem Sormak
Akonni Biyosistem Sormak
Thermo Fisher Scientific, Inc # BP1328-4
Thermo Fisher Scientific, Inc # BP151-500
Cari Technologies, Inc # BRSPRAY128
Decon Labs, Inc # 8416
Şirket Katalog Numarası
Akonni Biyosistem 100-20011
100-10021
ArrayIt HTW
Thermo Fisher Scientific, Inc # 10-300
VWR # 3365040
VWR # 93000-196
Merkez Pnömatik # 95630

Tablo 2.. Gerekli Malzemeler ve Ekipmanları.

69 "> 329.09 <> 109.90 td class = "xl69" p: none "> 816,64
Kodon Sonda
Kimlik
WT Probe SNR Değerleri 500 pg 100 pg 50 pg 25 pg 12.5 pg 6.25 pg
rpoB 507 1 900,22 644,46 523,17 431.08 364.49 287.47
3 1.016,37 699,38 600,16 525.07 446,51 361,64
511 5 867,67 611,97 529,90 451,73 403,76 307.68
512 8 810,69 544,04 488,85 436,89 391,62 257,46 d>
513 11 824,36 547,04 496,00 472,01 408.96 242.25
515 15 715,48 536,59 416,96 335,81 267.48 189,10
516 17 723,83 496,44 402.95 270,10 201.98
522 27 674,37 413,33 360.40 316,75 236,19 153.40
524 29 269,46 153,69 117.71 118,02 110.13 51.22
526 31 136.37 82.63 76.76 53.61 37.76
531 44 219,92 136.31 109.16 96.18 80.58 26.44
533 51 130.54 83.60 76.03 63.47 61.35 41.54
rpsL = "Xl71"> 43 54 10.41 12.75 53.30 767,18 5.39 362,42
88 56 655,54 542,79 527,43 690.34 403.86 456,05
katG 315 58 1.037,03 873,46 974,83 811,79 876,47
embB 306 66 940,81 781,13 788,75 837,65 787,05 696,69
Inha 8 82 1.069,43 934,38 862,58 936,88 809,85 682 .56
15 85 1.111,66 931,88 918,22 957,87 795,72 723,16
17 87 1.114,49 926,03 920,60 970,70 854,15 744,41

Tablo 3. Sinyali vahşi tipli prob ve M bir seyreltme serisi için gürültü oranlarında tuberculosis H37Ra genomik DNA. SNR değeri> 3 tespit edilebilir olarak kabul edilir.

ntent "fo: keep-together.within-page =" always "> Tablo 4
Tablo 4. MDR-TB Temsilcisi genotiplendirme veriler amplifikasyon mikroarray reaksiyon başına 25 ug de bilinen genotip ayırır. Yıldız jel elemanı mikrotertipte benzersiz bir sonda ile temsil edilmemektedir mutasyonları tespit. WT = yabani tip nükleik asit sekansı. Negatif değerler (kalın ve gölgeli) bir mutasyon, dolayısıyla fenotipik ilaç direncinin göstergesidir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir amplifikasyon mikroarray ile çoğullama ölçüde sonuçta katlı asimetrik PCR verimi değil, mikrodizi tarafından belirlenir. Bizim tecrübelerimize göre, 10-12 benzersiz primer çiftleri kolaylıkla bir amplifikasyon mikroarray formatında çoğaltılmış olabilir. Geleneksel primer ve prob tasarım kriterleri, bu nedenle, bu çözelti, bir de-faz nükleik asitler ve hareketsiz mikrodizi prob, bir PCR tamponu içinde termal termal döngü verimliliği ve prob hibridizasyon davranış arasındaki olası etkileşimleri dikkate almak gerekir dışında, yeni deneyleri için geçerli olduğu, aynı zamanda PCR primerler ve düşük molekül ağırlıklı bir yükseltme eserler içerir. Böyle tüm genom amplifikasyonu gibi son derece çoğullanmış amplifikasyon yaklaşımlar rastgele heksamerlerinin ve hareketsiz problar arasındaki etkileşim, ve uzun, çift sarmallı amplikonlarının verimsiz melezleme dahil olmak üzere teknik nedenlerle bir dizi için bir tek odacıklı amplifikasyon mikroarray protokol için elverişli değildir. OradaAyrıca bireysel kullanıcıların özel tahliller tasarımı veya burada açıklanan ÇİD-TB testi kullanırken dikkate almak gerekir ki algılama kolaylığı kullanımı, toplam analiz süresinin ve sınırlar arasında bir ara-ilişkidir. Örneğin, amplifikasyon döngüsü sayısını azaltmak ve hatta amplifikasyon sonrası hibridizasyon aşamasını ortadan kaldırarak önemli ölçüde toplam analiz süresini azaltır, ancak deney hassasiyet pahasına olacaktır. Öte yandan, bir yeniden üretilebilir 10 gen kopyası algılama sınırı elde etmek, böylece tek bir vardiyada ötesinde toplam analiz süresinin uzatılması, daha fazla amplifikasyon döngüleri veya melezleştirme zaman gerektirebilir.

Genler, mutasyonlar, kamera, analiz yazılımı, ve burada açıklanan bir algoritma bildirdiği yerine analitik performans ve klinik kullanımı ile ilgili bir rapor göre, amplifikasyon mikrodizi yöntem ve sistemi görüntülemektedir. Gereksinimi - Örneğin, başlangıç ​​örnek balgam, dekontamine sediment, katı veya sıvı kültürler olabilirAmplifikasyon mikrodizi için ekstre edilmiş nükleik asitlerin asimetrik, birden fazla mesaj göndermiş PCR ile amplifiye olduğu basitçe. Bazı araştırmacılar veya klinisyenler rpsL veya streptomisin ve etambutole direnç kazandıran embB mutasyonları tespit hiçbir klinik değeri çok az bulabilirsiniz, sırasıyla, rifampin ve izoniazid sadece direnç ÇİD-TB tanımlar. Bu nedenle, bu PCR primerleri ve probları mikrodizi genler ve diğer birinci veya ikinci basamak antibiyotiklere direnç kazandıran mutasyonlar hedef primerleri ve probları ile değiştirilebilir. Bu oldukça basit bir "tespit direniş" veya "direniş tespit edilemedi" sonucu daha belirli bir örnekte tespit edilir spesifik mutasyonlar hakkında ayrıntılı bilgi, ile kullanıcıya sunmak için bir raporlama algoritma yazmak mümkündür. M. analiz etmek için bu özel tahlil kullanılarak ilgilenenler araştırmacılar için tuberculosis bu elemanı IS6110 detecte olmasa bile genotipleme veri sağlamak da mümkündür, izoleÖrnekte d.

Ne olursa olsun olası tahlil ve raporlama permütasyon, burada açıklanan amplifikasyon mikroarray ve protokol ölçüde tek bir biyokimyasal reaksiyon ve mikrosıvı odasına birden fazla moleküler biyoloji adımlarını birleştirerek mikroarray iş akışını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Temsili veriler dokuz MDR-TB genomik bölge yükseltilmesi ve düşük yoğunluklu jel element mikrodizi olan asimetrik amplikonları algılayarak yaklaşımın etkisini göstermektedir. Burada açıklanan protokol fiziksel yıkamadan önce amplifikasyon mikrotertibin gelen conta ve kapak kayma kaldırmak için kullanıcı gerektiren bir yığın yıkama prosedürü kullanır ve bu nedenle oldukça klinik teşhis çok araştırma-kullanımı-sadece uygulamalar için daha uygundur. Başka yerlerde açıklandığı gibi, ancak yanal-akış Fluidics 33 kullanılarak on-chip çamaşır adım birleştirmek ve bu nedenle tamamen kapalı Amplikon sarf, dahil korumak için kesinlikle mümkünkolayca nokta-bakım uygulamaları için uygun bir cevap-out numune-tanı sistemi içine dahil edilebilir bir uding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma hibe RC3 AI089106 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir.

MDR-TB nükleik asitler Tropikal Hastalıklar (TDR), Cenevre, İsviçre Araştırma ve Eğitim için Birleşmiş Milletler Çocuk Fonu / Birleşmiş Milletler Kalkınma Programı / Dünya Bankası / Dünya Sağlık Örgütü Özel Programı tarafından sağlanmıştır.

Biz prototip tahlilde dahil spesifik genlerin ve mutasyonların rehberlik için Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri ABD Dr Tom Shinnick teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics