Den nedsänkta Tryckning av celler på en modifierad yta med hjälp av en kontinuerligt flöde Microspotter

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Nya framsteg inom läkemedelsindustrin har lett till ökat intresse för att använda cellulära microarrays i testning av läkemedel för drogscreening och cytotoxicological analys 1,2,3. Utvecklingen av in vitro-high-throughput analyser och screeningmetoder som använder cellarrayer skulle underlätta en snabb och kostnadseffektiv utveckling av läkemedelskandidater samt god grundläggande kunskap om cellen 1,4. Den traditionella metoden för screening med celler använder konventionell väl-plattan plattformar; emellertid denna metod är begränsad på grund av den höga kostnaden, begränsad genomströmning, och begränsad förmåga för kvantitativ information om cellfunktion 1,5. På grund av dessa begränsningar, är forskning i cell-microarrayteknik spirande för molekylärbiologisk karakterisering, vävnadsteknik, och drogscreening 1,6. Fördelarna med cellulära microarrays inkluderar mindre prov används, minimala effekter avcellulär fenotyp heterogenitet maskerings information och viktigast möjligheten att automatisera analyser för mer high-throughput applikationer 1,7,8.

Läkemedelsindustrin använder idag hög genomströmning cellbaserade screeninganalyser med 2D-cell monolagerkulturer för drogscreening i mikrotiterplattor brunnar 9. Multiplexing celler i brunnarna på mikrotiterplattor ger potential för högre genomströmning med unika experiment alternativ. Vidare, med nuvarande teknik för cellulära microarrays tillåta cellerna att torka som dramatiskt kan förändra fenotypen av cellerna från in vivo 10,11. För att övervinna dessa problem, var MFCA engineered och visas i Figur 1. Utformningen av MFCA 3D fluidics möjliggör skrivhuvudet spetsen i fig. 1 för att sänkas ned i ett bad och pressades mot en yta för att bilda en tätning. Den mjuka silikonspetsen hos skrivhuvudet beter sig som enpackning och bildar en reversibel tätning. Den MFCA teknologi är unikt lämpad att samverka med nedsänkta ytor, vilka krävs för både cellkulturer och vävnads slice system och är svårt eller omöjligt med de flesta andra metoder. Stift eller bläckstråletryck kommer inte att fungera, och 2D mikrofluidikanordningar är inte lämpliga för avsättning och gränssnitt med stora matriser av diskreta fläckar. Vidare, genom att miniaturizing och lokalisera experimentet - cellmicroarray - det MFCA vinner de stora problemen med hög genomströmning cellbaserade screeninganalyser.

Den CFM använder 3D-kanal nätverk för att cykel små volymvätskeprover över mikroskopiska punkt platser på en yta 12,13. Genom att skriva ut med flödet är biomolekyler, celler och andra reagens som finns i ett flytande miljö under hela tryckprocessen, som möjliggör tryckning av känsliga biomolekyler och celler utan exponering för luft, vilket hindrar den aktuella cellen trycktekniker. Det är också möjligt att skriva ut direkt från råmaterial såsom hybridom eller supernatanter som det finns en capture mekanism på matrisen ytan. Syftet med detta manuskript är att i detalj förklara den nedsänkta tryckning av två celltyper på en yta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Culture Förberedelse

  1. Förvara NIH/3T3 cellslager i flytande kväve tills produkten ska användas.
  2. Förbered komplett media för NIH/3T3-celler använder Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 10 mM HEPES-buffert, 50 enheter / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin.
  3. Tina cellerna under 2-3 min i ett skakande vattenbad vid 37 ° C.
  4. Återsuspendera cellerna i 5 ml av komplett medium och centrifugera vid 1500 xg under 3 min.
  5. Avlägsna cell supernatanten utan att störa cellpelleten.
  6. Resuspendera cellerna i 5 ml av media och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
    1. Avlägsna 10 pl av cellsuspensionen och plats i en 0,5 ml mikrocentrifugrör.
    2. Tillsätt 10 ^ il trypanblått till cellsuspensionen och omrördes med spetsen av pipetten.
    3. Pipettera 10 | il av de färgade cellerna i en hemocytometer kammaren.
    4. Räkna celler i hemocytometer på 10xförstoring.
      1. Räkna levande celler (små, vita bollar) för 4 av de 9 stora torg. Endast räkna de levande celler som inte verkar mörkblå från trypanblått fläcken.
      2. Beräkna det genomsnittliga antalet celler per stor fyrkant, vilket resulterar i antalet celler x 10 4 celler / ml i den ursprungliga celler suspensionen.
      3. Seed-celler vid en densitet av 1 x 10 5 celler / ml med totalt 5 ml i varje T25-kolv.
    5. Kultur celler till mellan 70% och 80% samman innan börjar experiment. Refresh media var 2-3 dagar eller vid behov.

2. Utskrifter Förbehandling

  1. Markera en rektangel med markör på botten av en vävnadsodlingsbehandlad polystyren (TCTPS) 12-brunnsplatta av storleken av skrivhuvudet (7 mm x 19 mm).
  2. Tillsätt 50 l av fetalt bovint serum i det rektangulära området och sprida den över hela området med spetsen.
  3. Lämna petriskålensi en steril biosäkerhet huva O / N så att serum plats för att torka helt. Dessa skyltar ska vara beredd inte mer än 2 dagar före användning.

3. Nedsänkt utskrift

  1. Skölj skrivhuvudet ut med destillerat vatten.
    1. Fyll en 60 mm petriskål med destillerat vatten och docka skrivarhuvudet på ytan.
    2. Flödes destillerat vatten genom var och en av linjerna i 2 min vid 150 | il / min med användning av en pneumatisk pump.
    3. Kasta bort vatten från petriskålen och fylla den med rent vatten.
    4. Flytta skrivhuvudet upp och ned i vattnet tre gånger.
  2. Docka skrivarhuvudet centrum över serumbelagda plats i förväg förberedda 12 brunnar.
  3. Prime skrivarhuvudet med förvärmda komplett medium, 300 | il per kanal.
  4. Tryck suspenderades celler vid en koncentration av 50000 celler / ml på ytan och 60 | il / min, 100 | il per kanal.
  5. Placera skrivhuvudet, lämnade dockad motyta, och förgreningsröret i en cellkultur inkubator inställd på 5% CO2 och 37 ° C under 2 timmar.
  6. Efter 2 timmar inkubation, ta bort skrivhuvudet och lägg locket på kulturen skålen. Den tidpunkt vid vilken skrivhuvudet avlägsnas anses vara den 0 h tidpunkten.

4. Standard Cell Culture

  1. Tillsätt 1 ml förvärmda media till en av serum-spotted TCTPS 12-brunnars platta som framställts i steg 2.
  2. Ta 1 ml av den återstående cellsuspensionen från steg 2 och pipettera i en enda brunn i en 12-brunnars TCTPS platta. Detta kommer att producera en kultur innehållande 50000 celler i skålen.
  3. Placera cellodlingsplatta i en inkubator vid 37 ° C under 2 timmar.
  4. Efter 2 h inkubation börjar timing; för överensstämmelse mellan tryckta och sådd prover, anses detta vara den 0 tim tidpunkt.

5. Kultur Visualisering

  1. Efter 0, 2, 24 och 48 tim-körning-celler från var och en av de två metoderna dovan och bilden escribed användning av en standard inverterat mikroskop.
    1. Färga cellerna med användning av propidiumjodid, en röd fluorescerande färg som endast är införlivat i kärnan av döda celler.
      1. Försiktigt skölja cellerna tre gånger med 1 ml av fosfatbuffrad saltlösning med kalcium och magnesium (PBS + +) för att avlägsna eventuella rester.
      2. Tillsätt 1 ml förvärmd PBS + + till varje odlingskärlet.
      3. Lägg ett pl av propidiumjodid stamlösning (1 mg / ml) till varje odlingskärlet.
      4. Inkubera cellerna färgade med propidiumjodid vid 37 ° C under 10 min.
    2. Bild cellerna med hjälp av ett inverterat mikroskop vid 10x och 40x förstoring.
  2. Kasta de celler i en lämplig behållare för riskavfall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De fibroblastcellinje NIH/3T3-celler trycktes eller ympas på en nedsänkt yta. Cellerna odlades till en täthet av 5 x 10 4 celler per ml. Celler såddes med traditionella cellodlingstekniker. Celler skrivas ut med en stor-format, tolv-flödescell skrivhuvud där kanalerna är större (~ 500 nm) än CFM används för proteiner och andra biomolekyler. Cellerna tryckt eller ympas på ett serumbelagda ytan. Tryckprocessen visas i figur 1.

Efter tryckning och ympning cellerna visualiserades att bedöma densitet och morfologi vid relevanta tidpunkter (0, 2, 24 och 48 h). Den celltäthet och morfologi av cellerna vid dessa tidpunkter utvärderades med hjälp av 10X och 40X förstoring mikroskopiskt. Bilderna visar att cellerna har nästan identiska fenotyper vid varje tidpunkt och vid varje förstoring Figur 2. På grundval av dessa siffror, effekten avutskrift bestämdes att vara minimal.

Cellviabiliteten bedömdes genom att använda en Pl-färgning. Såsom visas i figur 3, cellviabiliteten för den tryckta cellen var inte signifikant annorlunda än de sådda celler för varje tidpunkt. Den stora skillnaden mellan de två metoder för att fästa cellerna till ytan är densiteten av cellerna utskrivna. Celltäthet minskar vid 2 tim tidpunkt med över 50% i båda seedade och tryckta celler. Ytterligare studier är motiverat att fastställa orsaken till denna minskning, Men totalt sett utskrivna densitetsförhållanden jämfört med seedade fortfarande betydligt högre. Den tryckta celltäthet i flödescellen var ungefär tio gånger så tätt vid varje tidpunkt som de sådda cellerna överväger celler skrivs ut med samma täthet som sådd, men i ett mindre område (0,6 cm 2 område för en flödescell, 3,8 cm 2 en brunn i en 24-brunnars platta). Vid den avslutande tidpunkt cellerna är vid samma densitet which är sannolikt på cellmotilitet och resursbegränsningar konsumtion.

Figur 1
Figur 1. (A) Bild på CFM. (B) Schematisk bild av en flödescell. (C) SEM-bild av skrivhuvudet som visar enskilda flowcells (D) Schematisk bild av nedsänkt utskrift där skrivhuvud bryggor till vävnadsodling kompatibel yta.. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Bilder som jämför morfologin hos ympades kontra tryckta celler. I (A) 3T3-cellervar microfluidically tryckt på BSA och bedömas vid 0, 2, 24 och 48 tim. I (B) 3T3-celler såddes ut i stället för att skrivas ut. Cell morfologi är liknande om inte identiska. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Jämförelse av celltäthet och livsduglighet mellan cell tryckning och cellsådd vid olika tidpunkter, inklusive 0, 2, 24 och 48 timmar. I (A) bestämdes celltätheten i celler per mm 2. I (B) livskraften hos cellerna bestämdes. Klicka här för att se en större version av denna figure.

Figur 4
Figur 4. 10x förstoring bild av fyra flödesceller i cellmicroarray kontinuerligt flöde microspotter där NIH/3T3-celler ades strömmade igenom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D mikroflödestryckteknik som beskrivs här är unikt kan microfluidically utskrift kedjor av celler i en vätska fylld väl, det vill säga en nedsänkt yta. Genom tryckning på nedsänkta ytor, kan cellarrayer ställas att bibehålla fysiologiskt relevanta cellulära fenotypen av celler såväl som förmågan att multiplexa cellerna i botten av en enda väl Figur 4. Resultaten av denna studie visar att microfluidically tryckerier celler resulterar i cellbindning med jämförbar cellmorfologi och livskraft; Men, kan de utskrivna cellerna tätare fästas på en och samma plats vilket resulterar i kortare total studietider. Kortare studietider kan leda till betydande kostnadsbesparingar för hög genomströmning drog screening 14.

Mikrofluidik har tidigare använts för cellulära microarrays och hög genomströmning drogscreening. Dussintals studier har detaljerade hur flödesbaserade analysereliminera statiska flödesfrågor; Tyvärr är dessa studier använder 2D mikrofluidik (inte att förväxla med 2D-och 3D-vävnadskulturer), vilket begränsar täthet, multiplexering, och mikroskop integration för mycket parallella analyser 15 - 19. Digitala microfluidics och droppbaserade mikrofluidik har föreslagits för dessa typer av applikationer och kan användas i mycket parallella, multiplexerade konfigurationer 15,17,18, men de är begränsade till enstaka eller små cellgrupper och förlora alla 3-D, multi- celltyp vävnadsstruktur under beredningen av proverna. Hög genomströmning flödescytometri har använts för snabb cellscreening; emellertid, flödescytometri kräver celler att bli kvar i suspension, som inte är idealisk för screening av adherenta cellinjer som, in vivo, är bundna till den extracellulära matrisen 20. Co-kulturer lider också av brist på verklig vävnad representation 19. Däremot möjliggör helautomatiserad de 3D MFCA teknikställning av biomolekyler och avgivning av reagens till cellfläckar eller intakta vävnadsskivor i en tätt packad array. Det föreslagna systemet skulle inte bara kunna generera matriser, men skulle göra det i en "strömmande" miljö som möjliggör studier av skjuvspänningar, leverans av olika föreningar, och tillväxtvillkor för dessa matriser och kommer att leda till mer predictive in vitro drog screening verktyg. En mängd olika tillämpningar kan tänkas låta innovation för att fortsätta på obestämd tid. Ett sådant verktyg möjliggör ny cell läkemedelsutveckling och cytotoxicological analyser inom en mängd viktiga forskningsområden som cancer, diabetes, inflammation, infektioner och hjärt-kärlsjukdom.

Medan MFCA är den föredragna metoden för att leverera celler till en nedsänkt yta, återstår den att fästa cellen till ytan, särskilt för icke-adherenta cellinjer. Framtida riktningar för denna teknik kommer att fokusera på metoder för cellbindning förytan. Tekniker för cell mönstring på artificiella ytor existerar idag och inkluderar: bläckstråleskrivare, microextrusion eller glödritning, DNA-hybridisering, och laser framåt överföring 21. Av dessa tekniker, fastsättning av celler med användning av DNA-hybridiserings-tekniken har många unika och viktiga funktioner. För det första är metoden för cellvidhäftning inte beroende av receptorer som uppvisas av enskilda celler så både vidhäftande och icke vidhäftande celler är kapabla att mönstras med hjälp av denna metod 22. Därefter tillåter DNA cellulära mönstring metod för generering av komplexa cellulära matriser innefattande många celltyper genom användning av multipla ytbundna DNA-sekvenser 23. Framtida tillämpningar eller riktningar kommer att fokusera på att använda DNA-hybridisering teknik för cellbindning 19,24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna är anställda och aktieägare i Wasatch Mikrofluidik som producerar reagens och / eller instrument som används i detta manuskript.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för Chris Morrow för tekniskt stöd. Finansieringen kom från NIH SBIR (R43) ger 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
  3. Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
  4. Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
  5. Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
  6. Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
  7. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
  8. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  9. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. (2013).
  10. Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
  11. Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. Springer. (2008).
  12. Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
  13. Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
  14. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
  15. Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
  16. Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
  17. Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
  18. Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
  19. Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
  20. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
  21. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
  22. Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
  23. Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics