Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

Bioengineering

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Davidoff, S. N., Miles, A. R., Romanov, V., Gale, B. K., Eckman, J. W., Brooks, B. D. The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter. J. Vis. Exp. (86), e51273, doi:10.3791/51273 (2014).

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Abstract

Introduction

Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem verstärkten Interesse im Umgang mit zellulären Mikroarrays in der Arzneimittelforschung für Wirkstoff-Screening und Analyse cytotoxicological 1,2,3 geführt. Die Entwicklung von in-vitro-Assays mit hohem Durchsatz und Screening-Methoden unter Verwendung von Zellmikroarrays würde die schnelle und kostengünstige Entwicklung von Wirkstoffkandidaten sowie Voraus die grundlegenden Verständnis der Zelle 1,4 erleichtern. Der traditionelle Ansatz für Screening mit Zellen verwendet herkömmliche Well-Platte-Plattformen; jedoch ist dieser Ansatz aufgrund der hohen Kosten, begrenzte Durchsatz und begrenzte Fähigkeit zur quantitativen Informationen über Zell-Funktion 1,5 begrenzt. Aufgrund dieser Einschränkungen ist die Forschung in der Zell-Microarray-Technologien aufkeimenden für molekularbiologische Charakterisierung, Tissue Engineering und Drug-Screening 1,6. Die Vorteile der zellulären Mikroarrays sind kleinere Proben Nutzung, minimale Effekte vonzellulären Phänotyps Heterogenität Maskierungsinformationen, und vor allem die Fähigkeit, mehr Tests für Anwendungen mit hohem Durchsatz 1,7,8 automatisieren.

Die Pharmaindustrie nutzt derzeit Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays mit 2D-Zellmonolayer-Kulturen für Wirkstoff-Screening in Mikrotitervertiefung Platten 9. Multiplex-Zellen in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten bietet das Potential für höhere Durch mit einzigartigen Experimentiermöglichkeiten. Ferner können die aktuellen Technologien für Mobilmicroarrays um die Zellen zu trocknen, die den Phänotyp der Zellen drastisch verändern können aus in vivo 10,11. Um diese Probleme zu überwinden, die MFCA wurde entwickelt und ist in Fig. 1 gezeigt. Das Design der Fluidik MFCA 3D ermöglicht die Druckkopfspitze in Fig. 1 in ein Bad abgesenkt und gegen die Oberfläche zusammengedrückt, um eine Dichtung zu bilden. Die weiche Silikonspitze des Druckkopfes verhält sich wie einDichtung und einen reversiblen Dichtung bildet. Die MFCA Technologie ist einzigartig geeignet, mit untergetauchten Oberflächen, die für beide Zellkulturen und Gewebeschnitt Systeme erforderlich Schnittstelle, und es ist schwierig oder unmöglich mit den meisten anderen Ansätzen. Pins oder Tintenstrahldruck wird nicht funktionieren, und 2D-Mikrofluid-Geräte sind nicht für die Abscheidung oder Schnittstellen mit großen Arrays von diskreten Stellen geeignet. Ferner werden durch die Miniaturisierung und die Lokalisierung des Experiments - der zellulären Mikroarray - der MFCA windet die große Probleme mit der Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays verbunden.

Die CFM verwendet 3D-Kanal-Netzwerke zu Zyklus kleines Volumen Flüssigkeitsproben über mikroskopische Ort Stellen auf einer Oberfläche 12,13. Durch das Drucken mit Durchfluss sind Biomoleküle, Zellen und anderen Reagenzien in einer flüssigen Umgebung während des gesamten Druckprozesses beibehalten, so dass der Druck von empfindlichen Biomoleküle und Zellen ohne Kontakt mit Luft, die die aktuelle Zelle Drucktechniken behindert. Es ist auch möglich, direkt aus rohem Material, wie Hybridom-Überständen oder sofern ein Erfassungsmechanismus auf der Array-Oberfläche zu drucken. Das Ziel dieser Handschrift ist es, im Detail die untergetauchten Druck von beiden Zelltypen auf eine Oberfläche zu erklären.

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Protocol

1. Zellkultur Vorbereitung

  1. Bewahren NIH/3T3 Zelle Aktien in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung.
  2. Vorbereitung komplette Medien NIH/3T3-Zellen mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, 10 mM HEPES-Puffer, 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 &mgr; g / ml Streptomycin ergänzt.
  3. Auftauen Zellen für 2-3 min in einem Schüttelwasserbad bei 37 ° C
  4. Die Zellen in 5 ml Vollmedium und Zentrifugation bei 1.500 × g für 3 min.
  5. Entfernen Sie den Zellüberstand, ohne das Zellpellet zu stören.
  6. Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium und zählen Zellen mit einer Zählkammer.
    1. Entfernen Sie 10 ul der Zellsuspension und in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Werden 10 ul Trypanblau zu der Zellsuspension zugegeben und mit der Spitze der Pipette.
    3. Je 10 ul der gefärbten Zellen in einer Zählkammer Kammer.
    4. Zählen von Zellen in Hämozytometers bei 10-facherVergrößerung.
      1. Zählen Sie die lebenden Zellen (kleine, weiße Kugeln) für 4 der 9 großen Quadraten. Nur zählen die lebenden Zellen, die dunkelblau von der Trypanblau-Färbung nicht angezeigt.
      2. Berechnen der Anzahl der Zellen pro Quadrat großen, was die Anzahl der Zellen x 10 4 Zellen / ml in der ursprünglichen Zellsuspension.
      3. Samenzellen in einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen / ml mit insgesamt 5 ml in jeden Kolben T25.
    5. Kulturzellen um 70% bis 80% Konfluenz vor Beginn der Experimente. Aktualisieren Medien alle 2-3 Tage oder nach Bedarf.

2. Printing Oberflächenvorbereitung

  1. Mark ein Rechteck mit Marker auf dem Boden einer Gewebekultur-behandelt Polystyrol (TCTPS) 12-Well-Platte die Größe der Druckkopf (7 mm x 19 mm).
  2. Je 50 ul fetales Rinderserum in die rechteckige Fläche und breitete sie über den gesamten Bereich mit der Spitze.
  3. Verlassen Sie die Petrischalein einem sterilen Biosicherheit Kapuze O / N, damit das Serum vor Ort vollständig trocknen. Diese Platten sollten bereit nicht mehr als 2 Tage vor benutzen können.

3. Tauchdruck

  1. Spülen Sie den Druckkopf mit destilliertem Wasser.
    1. Füllen Sie eine 60 mm Petrischale mit destilliertem Wasser und docken Sie den Druckkopf auf die Oberfläche.
    2. Fließen destilliertem Wasser durch jede der Leitungen für 2 min bei 150 ul / min unter Verwendung einer Luftpumpe.
    3. Entsorgen Sie das Wasser aus der Petrischale und füllen Sie es mit sauberem Wasser.
    4. Bewegen Sie den Druckkopf nach oben und unten im Wasser 3-mal.
  2. Docken Sie den Druckkopf über das Zentrum Serum beschichteten Stelle in der vorbereiteten 12-Well-Platte.
  3. Minister der Druckkopf mit vorgewärmter komplette Medien-, 300 ul pro Kanal.
  4. Druck suspendierten Zellen bei einer Konzentration von 50.000 Zellen / ml auf die Oberfläche und 60 &mgr; l / min, 100 &mgr; l pro Kanal.
  5. Setzen Sie den Druckkopf, links gegen die angedocktFläche und der Verteiler in einem Zellkulturbrutschrank mit 5% CO 2 und 37 ° C für 2 h eingestellt.
  6. Nach 2 h Inkubation, entfernen Sie den Druckkopf und legen Sie den Deckel auf der Kulturschale. Der Zeitpunkt, zu dem der Druckkopf entfernt wird als der Zeitpunkt 0 Stunden.

4. Standard-Zellkultur

  1. 1 ml vorgewärmtes Medium einem Serum-spotted TCTPS 12-Well-Platte in Schritt 2 hergestellt.
  2. Nehmen Sie 1 ml der restlichen Zellsuspension aus Schritt 2 und Pipette in einer einzigen Vertiefung einer 12-Well-Platte TCTPS. Dies wird eine Kultur, die 50.000 Zellen in der Schale zu produzieren.
  3. Platzieren der Zellkulturplatte in einem Inkubator bei 37 ° C für 2 Stunden.
  4. Nach dem 2-stündigen Inkubation beginnen Timing; Konsistenz zwischen gedruckten und Aussaat Proben, wird dies als der Zeitpunkt 0 Stunden.

5. Kultur Visualisierung

  1. Nach 0, 2, 24 und 48 h Aufnahmezellen von jeder der beiden Methoden doben und Bild escribed mit einem Standard-Umkehrmikroskop.
    1. Färben die Zellen mit Propidiumiodid, einen roten Fluoreszenzfarbstoff, der nur in den Zellkern von toten Zellen aufgenommen.
      1. Vorsichtig spülen die Zellen 3-mal mit 1 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (PBS + +), um alle Ablagerungen zu entfernen.
      2. 1 ml vorgewärmtes PBS + + jedem Kulturgefäß.
      3. 1 &mgr; l Propidiumjodid-Stammlösung (1 mg / ml) zu jeder Kulturgefäß.
      4. Inkubieren der Zellen mit Propidiumiodid gefärbt bei 37 ° C für 10 min.
    2. Bild die Zellen mit einem inversen Mikroskop mit 10-facher und 40-facher Vergrößerung.
  2. Entsorgen Sie die Zellen in einem geeigneten Behälter für biologischen.

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Representative Results

Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3-Zellen wurden gedruckt oder auf eine eingetauchte Oberfläche ausgesät. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen pro ml gezüchtet. Zellen wurden mit herkömmlichen Zellkulturtechniken angeimpft. Zellen wurden unter Verwendung eines großformatigen, zwölf Druckkopf-Durchflusszelle, wo die Kanäle sind größer (~ 500 &mgr; m) als die CFM für Proteine ​​und andere Biomoleküle gedruckt. Die Zellen wurden aufgedruckt oder auf eine beschichtete Oberfläche Serum ausgesät. Das Druckverfahren ist in Fig. 1 gezeigt.

Nach dem Druck und dem Aussäen wurden die Zellen sichtbar zu Dichte und Morphologie bei entsprechenden Zeitpunkten (0, 2, 24 und 48 h) zu bewerten. Die Zelldichte und die Morphologie der Zellen zu diesen Zeitpunkten wurde unter Verwendung von 10X und 40X Vergrößerung mikroskopisch beurteilt. Die Bilder zeigen, dass die Zellen besitzen nahezu identische Phänotypen zu jedem Zeitpunkt und bei jeder Vergrößerung Abbildung 2. Basierend auf diesen Zahlen, die Wirkung derDruck bestimmt minimal.

Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung eines PI-Färbung beurteilt. Wie in Fig. 3 gezeigt, ist die Lebensfähigkeit von Zellen der Zell gedruckt war nicht signifikant verschieden von den beimpften Zellen für jeden Zeitpunkt. Der wesentliche Unterschied zwischen den beiden Verfahren der Befestigung der Zellen an der Oberfläche ist die Dichte der Zellen gedruckt. Zelldichte nimmt an der 2 h Zeitpunkt um mehr als 50% in beiden Zellen ausgesät und gedruckt. Weitere Studien sind erforderlich, um die Ursache für diesen Rückgang zu bestimmen; jedoch insgesamt gedruckt Dichteverhältnisse im Vergleich zu ausgesät bleibt deutlich höher. Die gedruckte Zelldichte in der Durchflusszelle war etwa zehnmal so dicht zu jedem Zeitpunkt, wie die beimpften Zellen Berücksichtigung Zellen wurden bei der gleichen Dichte wie Aussaat gedruckt, aber in einem kleineren Bereich (0,6 cm 2 Fläche für eine Durchflusszelle, 3,8 cm 2 eine Vertiefung einer 24-Well-Platte). Bei der Abschlusszeitpunkt werden die Zellen mit der gleichen Dichte welche ist wahrscheinlich auf der Zellbeweglichkeit und Ressourcenverbrauch Einschränkungen.

Figur 1
Abbildung 1. (A) Bild von der CFM. (B) Schematische Darstellung einer Durchflusszelle. (C) REM-Bild des Druckkopfes, die einzelne Flusszellen. (D) Schematische Darstellung der untergetaucht, wo Druckkopf dockt an Gewebekultur kompatible Oberfläche. Bitte klicken hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
2. Bilder Vergleich Morphologie gegenüber gedruckten Zellen ausgesät. In (A) 3T3-Zellenmikrofluidisch BSA wurden auf gedruckt und bei 0, 2, 24 und 48 Stunden bewertet. In (B) 3T3-Zellen ausgesät wurden, anstatt gedruckt. Die Morphologie der Zellen ist ähnlich, wenn nicht identisch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
3. Vergleich der Zelldichte und Lebensfähigkeit von Zellen und Zellaussaat Druck zu verschiedenen Zeitpunkten mit 0, 2, 24 und 48 Stunden. In (A) wurde die Zelldichte in Zellen pro mm 2 beurteilt. In (B) die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses FIGU ansehenwieder.

Fig. 4
Abbildung 4. 10facher Vergrößerung Bild von vier Flusszellen der Zellmikroarray kontinuierlichen Fluss microspotter in denen NIH/3T3-Zellen wurden durchströmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die hier beschriebene 3D-Mikrofluid-Drucktechnologie ist einzigartig in der Lage, Druck mikrofluidisch Arrays von Zellen in einer Flüssigkeit gut gefüllt, dh ein unter Wasser Oberfläche. Durch Bedrucken untergetauchten Oberflächen können Zellmikroarrays erzeugt werden, die die physiologisch relevanten zellularen Phänotyps von Zellen als auch die Fähigkeit, Zellen in den Boden einer einzelnen Vertiefung 4 multiplexen aufrechtzuerhalten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass mikrofluidisch Druck Zellen führt Zellhaftung mit vergleichbaren Zellmorphologie und Lebensfähigkeit; jedoch können die Zellen dichter gedruckt in einer definierten Stelle was zu kürzeren Studienzeiten insgesamt angebracht werden. Kürzere Studienzeiten könnte zu erheblichen Kosteneinsparungen für die Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoff 14 führen.

Mikrofluidik zuvor für Mobilmicroarrays und Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening verwendet. Dutzende von Studien haben beschrieben, wie Flow basierte Assaysdie statischen Flow-Probleme zu beseitigen; leider diese Studien verwenden 2D Mikrofluidik (nicht mit 2D-und 3D-Gewebekulturen zu verwechseln), die Dichte, Multiplexing und Mikroskop-Integration für hochparallele Analysen 15 begrenzt - 19. Digitale Mikrofluidik und tröpfchenbasierte Mikrofluidik haben für diese Art von Anwendungen vorgeschlagen worden und kann in hochparallelen, Multiplex-Konfigurationen 15,17,18 arbeiten, aber sie werden, um einzelne oder kleine Zellgruppen beschränkt und verlieren alle 3-D-, Multi- Gewebestruktur Zelltyp bei der Probenvorbereitung. Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie für schnelle Zell-Screening verwendet worden; jedoch erfordert Durchflusszytometrie Zellen in Suspension bleiben, was nicht ideal ist für das Screening adhärenten Zelllinien, die in vivo an der extrazellulären Matrix 20 angebunden. Co-Kulturen auch aus Mangel an echter Gewebe Darstellung 19 leiden. Im Gegensatz dazu ist die 3D-Technologie ermöglicht MFCA vollautomatische dePosition von Biomolekülen und Lieferung von Reagenzien, Zell Flecken oder intakte Gewebeschnitten in einem dicht gepackten Anordnung. Das vorgeschlagene System würde nicht nur die Anordnungen zu erzeugen, sondern dies in einer "fließenden" Umgebung, die für die Untersuchung der Scherspannungen, die Lieferung der verschiedenen Verbindungen und Wachstumsbedingungen auf dieser Arrays können und zu mehr prädiktiven in vitro-Wirkstoff führen, Screening-Tools. Eine Vielzahl von Anwendungen kann sich vorstellen was Innovation auf unbestimmte Zeit fortzusetzen. Ein solches Werkzeug ermöglicht neuartige zelluläre Wirkstoffforschung und-cytotoxicological Assays in einer Vielzahl von kritischen Forschungsfelder wie Krebs, Diabetes, Entzündungen, Infektionen und Herz-Kreislauf-Krankheit.

Während die MFCA ist die bevorzugte Methode, um Zellen an eine eingetauchte Oberfläche liefern, bleibt die Herausforderung darin, die Zelle an die Oberfläche zu binden, insbesondere für nicht-adhärenten Zelllinien. Zukünftige Richtungen für diese Technologie wird auf Methoden zur Zellhaftung für Fokusdie Oberfläche. Techniken zur Zellstrukturierung auf künstlichen Oberflächen bestehen derzeit und beinhalten: Tintenstrahldruck, Mikroextrusion oder Filament Plotten, DNA-Hybridisierung und Laser Vorwärtstransfer 21. Dieser Techniken, die Anheftung von Zellen unter Verwendung von DNA-Hybridisierungstechnik besitzt mehrere einzigartige und wichtige Funktionen. Erstens ist das Verfahren der Zellbindung nicht abhängig von einzelnen Zellen Rezeptoren besitzen, so dass beide adhärenten und nicht-adhärenten Zellen in der Lage ist mit dieser Methode 22 strukturiert sind. Weiter erlaubt die zelluläre DNA Strukturierungsverfahren für die Erzeugung von komplexen zellulären Arrays aus vielen Zelltypen durch die Verwendung von mehreren oberflächengebundenen DNA-Sequenzen 23. Zukünftige Anwendungen oder Richtungen wird über die Verwendung der DNA-Hybridisierung-Technologie für Zellhaftung 19,24 konzentrieren

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Disclosures

Die Autoren sind Mitarbeiter und Aktionäre der Wasatch Mikrofluidik, die Reagenzien und / oder Instrumente in dieser Handschrift verwendet wird, erzeugt.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Chris Morrow, um technische Unterstützung zu bestätigen. Die Finanzierung wurde durch die NIH SBIR (R43) zu gewähren 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous flow microspotter Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11965-092 Base media for cells
HEPES buffer Invitrogen 15630-080 Cell media additive (control pH)
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070 Cell media additive
Penicillin-streptomycin  Invitrogen Cell media additive
Trypan blue Invitrogen 15250-061 Stain cell sfor counting
Hemocytometer Fisher 267110 Cell chamber to count cells
Nikon Eclipse TS100 Nikon Used to check on cells
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon Used for collecting images
Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) Invitrogen 14040-133 Rinsing cells before passaging and before staining with PI
TrypLE Express  Invitrogen A12177-01 Used to remove cells from surface

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References

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