Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

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Summary

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

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Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery. J. Vis. Exp. (86), e51329, doi:10.3791/51329 (2014).

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Abstract

Akuter oder chronischer Myokardinfarkt (MI) sind kardiovaskuläre Ereignisse zu hohen Morbidität und Mortalität. Die Festlegung der pathologischen Mechanismen bei der Arbeit während MI und die Entwicklung wirksamer Therapieansätze erfordert Methodik reproduzierbar simulieren die klinische Inzidenz und spiegeln die pathophysiologischen Veränderungen mit MI verbunden. Hier beschreiben wir eine chirurgische Methode, MI in Mausmodellen induzieren, die für Kurzzeit-Ischämie-Reperfusion (I / R)-Verletzungen sowie permanente Ligation verwendet werden kann. Der große Vorteil dieses Verfahrens ist, um den Standort des linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) zu erleichtern, um für eine genaue Ligation dieser Arterie zu ermöglichen, Ischämie im linken Ventrikel des Herzens Maus induzieren. Genaue Positionierung der Ligatur auf LAD erhöht die Reproduzierbarkeit der Infarktgröße und erzeugt somit zuverlässigere Ergebnisse. Mehr Präzision bei der Platzierung der Ligatur wird die Standard-Operationsverfahren zu verbessern, um in Mäusen MI simulieren, thus Verringerung der Zahl der Versuchstiere, die für statistisch relevante Studien und verbessern unser Verständnis der Mechanismen, die Herstellung kardiale Dysfunktion folgenden MI. Dieses Mausmodell der MI ist auch nützlich für die präklinische Prüfung von Behandlungen Targeting myokardialen Schäden nach MI.

Introduction

Tiermodelle von Myokardinfarkt (MI) in der Forschung der komplexen Pathophysiologie von ischämischen Herzkrankheiten 1 wichtig. Ischämie-Reperfusion (I / R) Verletzungen ist ein wesentlicher Faktor der myokardialen Schäden während MI generiert. Die durch Okklusion der Herz-Kreislauf hergestellt Anfangs Ischämie Verletzung kann in MI-Patienten durch den Einsatz der Angioplastie, um die Perfusion in einer zeitgemäßen Weise wiederherzustellen minimiert werden. Während dieser Intervention hat stark die Zahl der Todesfälle infolge akuter MI, Wiederherstellung der Blutfluss in den ischämischen Bereich Ergebnisse in I / R-Schaden, die zum Tod von Kardiomyozyten führt reduziert. Dieser Verlust der Herzmuskelmasse trägt zur verminderten Herzleistung und Entwicklung hin zu Herzversagen. So ist das Studium der Mechanismen, die in Kardiomyozyten Tod von I / R Verletzungen führen eine wichtige Linie der Untersuchung in der kardiovaskulären Forschung. Chirurgische Koronarligatur ist eine nützliche Technik, um Versuchsmodelle von MI in verschiedenen Tierarten zu induzieren, including der Ratte, Hund und Schwein. Veröffentlichungen in verschiedenen Labors sind verschiedene Verfahren zur Einrichtung der Mäuse Herzmodell von I / R-Schaden 2,3 eingeführt. Um einen Einblick in diese Mechanismen zu gewinnen, müssen wir Zugang zu zuverlässigen Tiermodellen, die mehrere Aspekte der MI Pathologie reproduzieren können. Entwicklung solcher Modelle ist auch wichtig für die Prüfung therapeutische Ansätze zur Behandlung von Myokardinfarkt und zugehörigen I / R-Schaden.

Die meisten der derzeit verfügbaren chirurgischen Techniken zu MI bei Versuchstieren zu simulieren damit chirurgische Dissektion in die Brusthöhle, um den linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), die dann durch eine Ligatur für definierten Zeitraum in der Zeit, die ischämischen Ereignis erzeugen verschlossen aussetzen. Dann Ligatur entfernt werden, um für Reperfusion des ischämischen Bereich und die Erzeugung von I / R-Schadens zu ermöglichen. Eine Haupteinschränkung dieser Ansätze, daß die Position der Literatur über die LAD ist nicht immer genau wiedergegeben werden, wobeikönnen, um Unterschiede in der Schwere der MI durch diesen Ansatz induziert führen. Die meisten verfügbaren Techniken nur allgemein beschrieben die ungefähre Position der LAD in der vorderen Wand des Herzens. Wie die Verzweigung und die Richtung der LAD kann bei einzelnen Tieren variieren die Lage nicht immer festgelegt und können leicht verwechselt werden 4,5, während der Operation 6 was zu möglichen Komplikationen. Die Folgen unsachgemäßer Platzierung der Ligatur von Variabilität in der Größe des Infarkts in der linken Herzkammer induziert, um die Spezifität des Modells vollständig Kompromisse laufen. Hier präsentieren wir eine modifizierte Methode für myokardiale I / R und permanente Ligation in Mäusen, die für eine verbesserte Genauigkeit der Platzierung der Ligatur auf der KOP ermöglicht. Durch die Anwendung spezifische Ansätze für die erste Inzision und Dissektion interne, als auch die Verwendung von Manipulationen, um die Atrien zu heben, um besseres Verständnis der LAD und der Stelle, wo es aus der Aorta tritt ermöglichen. Gründung derPosition auf der LAD und seine Herkunft bietet die Möglichkeit, die LAD reproduzierbar zu ligieren. Dieses Modell der myokardialen I / R und permanente Ligation verringert nicht nur die Variation der Infarktgröße nach der Operation, es kann auch das Auftreten von übermäßiger Blutung während der Operation zu verringern.

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Protocol

Dieses Tier Protokoll wurde zugelassen und ist in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Ohio State University eingestellt. Alle Richtlinien von der lokalen IACUC entwickelt werden, sind in Übereinstimmung mit dem Tierversuchs Guide von Office of Laboratory Animal Welfare an den National Institutes of Health entwickelt.

1. Anästhesie und Intubation

  1. Autoklav alle Instrumente und chirurgische Versorgung vor dem Gebrauch. Während des gesamten Verfahrens tragen sterile Einweg-OP-Handschuhe. Halten Sie einen sterilen Bereich während des gesamten Verfahrens. Verwendung einer sterilen Tuch vorgeschlagen, aber nicht in dem Video gezeigt, um eine bessere Visualisierung von anatomischen Landmarken auf der Maus zu ermöglichen.
  2. Platzieren jede Maus einzeln in einer Induktionskammer bereitzustellen Anästhesie unter Verwendung von 5% Isofluran und Sauerstoff mit einer Flussrate von 0,4 L / min bis Verlust des Stellreflexes, und dann halten the tierischen mit 2% Isofluran in 100% Sauerstoff mit einer Strömung von 0,4 l / min durch eine Röhre zu dem Nasenkonus Narkosegerät angeschlossen, bis der Trachealtubus eingesetzt ist. Das Isofluran Anästhesie-Maschine verwendet wird, sollte in geeigneter Weise entlüftet und mit Aktivkohlefiltern ausgerüstet, um die Exposition des Chirurgen zu Isofluran Dämpfe während des Verfahrens zu minimieren. Der Nasenkonus ist zu bemerken, aber nicht in dem Video gezeigt, zur Visualisierung der Manipulationen zu ermöglichen, um die Maus zu intubieren.
  3. Rasur der Brust des Tieres mit einem Tier-Haarschneidemaschine an einem anderen Ort als der Chirurgie Plattform, um eine Kontamination der Chirurgie Lage zu vermeiden.
  4. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf Chirurgie-Plattform für die anschließende Intubation. Eine einfache kleine Styropor-Plattform als Betriebsplattform zu dienen. Decken Sie die Plattform mit einem vorsterilisierten drapieren, um eine sterile Oberfläche bereitzustellen. Platzieren ein Heizkissen zwischen der Plattform und Abdecktuch um die Körpertemperatur der Mäuse in surgica haltenl Verfahren.
  5. Bringen Sie eine Länge von 2-0 Seidenfaden von mindestens 10 cm zu der Plattform mit Klebeband und dann die Schleife des Fadens um die vorderen oberen Schneidezähne. Positionieren des Kegels in unmittelbarer Nähe (2-3 cm) mit dem Rand der Plattform über der Nase der Maus. Ziehen Sie die Maus straff und befestigen Sie es an der Plattform durch den Schwanz mit einem Stück Klebeband.
  6. Sicherung der Beine bis zu den Seiten des Körpers mit Strängen des Bandes. Es ist wichtig, daß die vorderen Schenkel sind nicht überlastet, da dies die Atmung beeinträchtigen.
  7. Bereiten Sie die rasierte Operationsstellen mit Betadine und Alkohol vor den Hals und Brust Einschnitte vorgenommen werden.
  8. Legen Sie die Plattform mit der Maus den Kopf in die Richtung des Bedieners. Schneiden Sie ein 0,5 cm Median Gebärmutterhalskrebs Hautschnitt. Trennen Sie die Lappen der Schilddrüse an ihren Landenge, die sternohyoideus Muskel, wo die Luftröhre kann unter den Muskel zu sehen aussetzen.
  9. Entfernen Sie die innere Nadel einer 18-Gauge-Trokar, damit es als intub kann verwendet werden,ation Röhre. Die Nadelspitze kann als Halterung dienen und 1 cm des Außenrohres kann als Trachealtubus zu dienen.
  10. Halten Sie die Zunge der Maus mit einer gebogenen Pinzette in einer Hand und bewegen Sie es leicht nach oben. Sehen Sie sich die Luftröhre durch den Hals-Hautschnitt. Mit der anderen Hand sanft legen Sie die Intubationstubus, bis das Rohr innerhalb der Luftröhre gesehen.
  11. Sobald der Schlauch in der Luftröhre, verschieben Sie die gebogenen Pinzette in anderen Hand in Richtung der Röhre und entfernen Sie die innere Nadel schnell. Wenn das Rohr nicht in die Luftröhre eingeführt werden, sollte die Röhre herausgezogen werden, damit die Herstellung Atemwegserkrankungen. Es ist wichtig, die Spitze des Rohres bis zu zeigen, wenn es um nicht Einführen des Rohres in die Speiseröhre anstelle der Trachea nahe der Kehle.

2. Lüftung und Fixation

  1. Künstliche Beatmung mit Beatmungsgerät ein Tier Entlüftung 2% Isofluran in Sauerstoff mit einer Flussrate von 0,4 L / min. Verwenden Sie einen modifizierten Y-shaPE-Anschluss, um die Intubationstubus mit dem Beatmungsgerät zu verbinden. Die korrekte Positionierung des Trachealtubus kann durch Beurteilen der symmetrisch Thoraxexpansion bestätigt werden.
  2. Stellen Sie das Atemvolumen bei 260 ul / Hub-und Lüftungsrate beträgt 130 Schläge pro Minute, die auf das Körpergewicht einer bestimmten Maus bei Bedarf angepasst werden kann.
  3. Entfernen Sie das Band auf dem Schwanz, und schalten Sie die Maus vorsichtig, um es in einem richtigen Seitenlage für die nachfolgende Operation zu platzieren. Verwenden Sie Klebeband, um den Schwanz und die Beine auf die Plattform wieder zu sichern.
  4. Legen Sie die rektale Sonde, um die Körpertemperatur zu überwachen und stellen Sie die Erwärmung Pad, um die Temperatur um 37 ° C zu halten
  5. Befestigen Sie die Sonde auf die Plattform mit Klebeband. Spritzen subkutan Bupivacain an der Einschnittstelle, um den Bereich zu betäuben, bevor der Schnitt gemacht wird.

3. Thorakotomie

  1. Machen Sie einen Schrägschnitt, der etwa 1 cm lang ist an einem Standort 2 mm von der linkenSternalrand in der Richtung, wo der linke Vorderbein trifft der Körper (etwa 1-2 mm unter dem das Bein-und Körper verbinden). Die oberflächliche Brust Vene in der Nähe von dieser Website und der Schnitt ist so vorzunehmen, dass die seitlichen Ende des Einschnitts geht bis zu, aber nicht in die Vene geschnitten.
  2. Schneiden wenn die Brustmuskel, die Rippen unter aussetzen. Während dieses Schritts zu vermeiden versehentliche Verletzung des Gefäßes. Wenn die Blutung auftritt, verwenden Sie Wattestäbchen, um Blutungen zu stoppen, bevor Sie den nächsten Schritt 7.
  3. Visualisieren Sie die Rippen und Lunge Aufblasen durch die dünne und halbtransparente Brustwand. Öffnen Sie die Brusthöhle mit OP-Schere, eine 6-8 mm Schnitt in der dritten Zwischenrippenraum zu machen. Dieser Einschnitt sollte mindestens 2 mm von der Brustbeinrand, wo der Brustwandarterie befindet. Schäden an der Arterie wird schwere Blutungen, die nur schwer zu kontrollieren ist zu produzieren.
  4. Legen Sie die vorge sterilisiert hausgemachte Brust Retraktoren into der Schnitt und sanft nach hinten ziehen, um den Einschnitt zu öffnen, so dass es etwa 8-10 mm breit, während sie vorsichtig, um die Lunge zu vermeiden. Die Gurtstraffer sollte auf die chirurgische Plattform mit Stiften befestigt werden.
  5. An diesem Punkt sollte die Herz sichtbar sein, jedoch wird die Lunge immer noch einen Teil des Herzens abzudecken. Nehmen Sie den Herzbeutel vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette, ziehen Sie sie auseinander, und schieben Sie das Gewebe hinter den Wundhaken. Während dieser Manipulation wird die Lunge und vom Herzen weg zu heben.

4. Positioning LAD

  1. Suchen Sie die LAD auf der Oberfläche des Herzens durch eine Dissektionsmikroskop. Die LAD läuft in der Mitte der Herzwand von nahe der Herzspitze nach unten durch die linke Herzkammer. Die KOP erscheint leuchtend rot und wird stark werden pulsierende. Die Vene hier ist manchmal für die LAD falsch, aber die richtige Beleuchtung kann helfen, unterscheiden die beiden Schiffe. Wenn die Beleuchtung zu hell ist es schwierig sein kann, um die Farbe zu schätzen wissenUnterschiede zwischen den Gefäßen.
  2. Verwenden Sie eine sterile Wattebausch Fragment mit einem Durchmesser von etwa 1-2 mm, um die LAD für die Ligation vorzubereiten. Legen Sie die Baumwolle zwischen dem linken Vorhof und der linken Herzkammer, die den linken Vorhof zu heben und zu helfen setzen die KOP und klären ihre Position. Wenn die LAD kann nicht gefunden werden, kann das Fragment ferner so der linke Vorhof ist noch höher angehoben, um die Aorta, wo das LAD stammt offenbaren geschoben werden.

5. LAD-Ligation

  1. Die ideale Positionierung für die Ligatur ist ca. 2 mm niedriger als die Spitze des linken Ohrmuschel. Die Lungen Stamm kann als Marker zur Identifizierung der linken Ohrmuschel verwendet werden. Alternativ kann das Ligationsposition als Punkt 1-2 mm von der Verzweigung der linken Kranz visualisiert werden. Verwenden gebogenen Pinzette vorsichtig anwenden Druck an einem Ort unmittelbar unter dem Punkt Ligation bestimmt. Dadurch wird es einfacher, die Arterie zu sehen und wird auch helfen, halten das Herz in Ortund vereinfachen den Bund Ligatur. Drücken Sie nicht mit der Zange für mehr als 5 Sekunden gelten zu einer Zeit und Kompression des Herzens, die Pump verändern könnten.
  2. Verwenden Sie eine Nadel verjüngt, um ein 6-0 Seidenfaden unter der LAD passieren, während die Beobachtung mit einem Binokular. Legen Sie die Nadel unter die Arterie mit Präzision wie die Nadel des linken Ventrikels Kammer eintreten, wenn zu tief platziert oder beschädigen LAD, wenn die Nadel ist zu flach. Wenn der LAD ist verletzt entfernen Sie die Nadel und nähen die LAD um Blutungen zu kontrollieren, aber wenn die Blutung nicht kontrolliert werden kann ist es vorzuziehen, das Tier einschläfern.
  3. Machen Sie eine lockere Doppelknoten mit der Naht, so dass ein 2-3 mm Durchmesser Schleife, durch die ein 2-3 mm langes Stück des PE-10-Schlauch 8 platziert.
  4. Ziehen Sie die Schleife um die Arterie und Schläuche befestigen Sie dann die Schleife durch das Binden einer zusätzlichen slipknot, kümmert sich nicht um die Ventrikel Wand beschädigen. Für dauerhafte Ligation direkt binden die LAD mit einem9 Knoten. Bestätigen Sie den Verschluss der LAD, indem Sie für Aussehen einer helleren Farbe in der vorderen Wand des LV, die innerhalb von wenigen Sekunden nach der Ligation erscheinen soll.
  5. Entfernen Sie die Rückzieh und schließen die Wunde vorübergehend durch Kneifen der Haut zusammen mit einer Bulldogge Klemme. Die Länge der Zeit, dass Ischämie aufrechterhalten hängt von der Experimentdesign, ist aber häufig 20, 30, 45 oder 60 min. Die Maus bleibt auf dem Beatmungsgerät für die Dauer der LAD Okklusion.

6. Reperfusion

  1. Nach der Ischämie Zeitraum entfernen Sie die Bulldogge Clip und legen Sie die Brust-Haken, um die Ligatur aus. Lösen Sie den Knoten und die PE-10-Schlauch zu entfernen. Reperfusion Bestätigen durch Beobachtung einer Rückkehr der rosa-rote Farbe der vorderen Wand des LV nach 15-20 sek.
  2. Verlassen Sie die Naht an Ort und Stelle, wenn 2% Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) und Blau-Färbung wird nach der Reperfusion durchgeführt werden. Wenn Färbung ist nicht erforderlich, kann die Naht be entfernt.
  3. Die Reperfusion Zeit wird auf dem Versuchsplan abhängen, in der Regel überspannt von 1 Stunde bis 24 Stunden.

7. Brustverschluss und postoperative Pflege

  1. Schließen Sie den Brustraum durch Nähen schloss die Inzision in der 3. Zwischenrippenraum mit 4-0 Seidenfaden. Es ist wichtig, dass die Lungen sind der Naht und nach der 3. und 4. gefangen Rippen miteinander vernäht werden, nicht. Während das Binden der Nahtknoten ist es hilfreich, leichten Druck auf der Brust mit dem Nadelhalter gelten für jeden Raum, die Luft in den Brustraum eingefangen werden können, zu minimieren.
  2. Schließen Sie alle Muskelschichten mit kontinuierlicher Nähte mit 4-0 Seide. Verwenden Nylonnaht, die Haut mit einer fortlaufenden Naht schließen. Alternativ kann die Haut mit unterbrochener Naht geschlossen werden.
  3. Beim Nähen ist komplett nicht mehr der Fluss von Isofluran während Sauerstoff fließt weiter. Sobald die Maus bewegt seine Schnurrhaare oder Schwanz es, Schulterd beginnen, Versuche, spontan zu atmen. Entfernen Sie die Maus vom Beatmungsgerät mit Intubationstubus noch in der Luftröhre gehalten.
  4. Beobachten Sie das Tier vorsichtig, bis die Maus wieder eine normale Atmung und dann extubiert die Maus. Das Rohr sollte langsam entfernt werden, um Aspiration von Sekreten der Mundhöhle zu vermeiden.
  5. Bestätigen Sie die Maus nicht in jedem Atemnot beobachten, die für weitere 3-5 min vor der Rückgabe an einem Käfig. Wenn Anzeichen von Austrocknung sind nach der Operation beobachtet, bieten bis zu 0,5 ml steriler Kochsalzlösung durch intraperitoneale Injektion.
  6. Für die postoperative Analgesie, verwalten ein Opioid-Analgetikum (Buprenorphin, 0,1 mg / kg) subkutan (SC), bevor das Tier ist die ambulante und bieten eine zusätzliche Dosis alle 4-6 Stunden für die nächsten 24 Stunden danach. Überprüfen Sie die Tier Anzeichen von Leiden bei 12 Stunden nach der Operation. Simulation von Myokardinfarkt mit Überleben Operation erfordert eine Bewertung von Schmerzen und Leiden folgenden Erholung von der surgery. Die aktuelle geeignete Verfahren ist es, Analgesie für den ersten 24 Stunden nach einer invasiven Verfahren mit zusätzlichen Dosen gegeben als durch Gewichtsverlust oder Anzeichen von Schmerzen gerechtfertigt ist. Für dauerhafte Ligation sollte das Körpergewicht täglich verfolgt werden, um zu helfen, um die Erholung des Tieres zu messen.
  7. Ibuprofen (Motrin), ein nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAID) mit entzündungshemmenden, Analgesie und fiebersenkende Aktivität oder andere NSAIDs, im Trinkwasser der Tiere als 0,2 mg / ml-Lösung für zwei Tage vor der Operation gestellt werden und bis zu 7 Tage nach der Operation in zusammen mit der Buprenorphin, um zusätzliche Schmerz / Not verwalten.

8. Messung der Infarktgröße

  1. Anesthetize intubieren und die Maus am Ende der gewünschten Reperfusionszeit. Schneiden Sie die Brusthaut in der Mittellinie auf den Schwertfortsatz. Öffnen der Bauch und die Membran unter dem Brustkorb und von beiden Seiten des Medioklavikularlinie.
  2. <li> Expose das Herz und dann wieder ligieren die LAD in der gleichen Lage. Kanülieren die Aorta so 10% Phthaloblau langsam direkt in die Aorta, das Herz für die Abgrenzung des ischämischen Zone von der nicht-ischämischen Zone 10 Fleck eingespritzt werden.
  3. Schnell das Herz herausschneiden und waschen Sie es in 30 mM KCl (Kaliumchlorid-Lösung), um den Herzschlag einstellen und ermöglichen eine konsistente Schnitte. Frieren Sie das Herz für mindestens 4 Stunden bei -20 ° C und schneiden Sie das Herz in Scheiben von 1 mm unter Verwendung einer Herz-Matrix Trennvorrichtung 11.
  4. Inkubieren Herzscheiben mit 2% TTC bei 37 ° C für 40 min. Der Infarktbereich wird als ein weißer Bereich abgegrenzt, während lebensfähige Gewebe rot färbt.
  5. Fix die gefärbten Scheiben mit 10% Formaldehyd über Nacht, was dazu beitragen wird, den Kontrast zwischen dem Infarktbereich und dem normalen Gewebe zu erhöhen. Fotografieren Sie die Scheiben und berechnen Sie den Risikobereich (AAR), die nicht-ischämischen Zone und das Infarktgebiet mit ImageJ Software.
<p class = "jove_title"> 9. Die Messung der Herzenzyme

Messen kardialem Troponin I (cTnI) im Serum der Mäuse durch Blutentnahme von der Pfortader und dann Isolieren Serum durch Zentrifugation. Serum cTnI Ebenen werden dann mit einer schnellen quantitativen cTnI-Assay 12 bestimmt.

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Representative Results

Nach 24 Stunden Reperfusion, die Analyse der Infarktgröße und der Region-at-Risk (AAR), durch Phthaloblau Farbstoff und Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), Ligation der LAD kann durch Beobachtung Blanchieren von Herzgewebe distal der Naht bestätigt werden sowie Störungen der vorderen Wand. Reperfusion kann durch die Rückkehr der roten Farbe des Myokards und die Demonstration von einer gewissen Erholung der Vorderwand Bewegung überprüft werden.

Infarkt Bereiche (weiß) sollten in Gefahr (rot) zu unterscheiden sein von den Bereichen und die Fläche nicht in Gefahr (blau). Die Anwendung der Phthaloblau Farbstoff (Abbildung 1A) ermöglicht für die Auflösung der Bereich des Herzens, wo Okklusion der LAD, während Herzen, die nicht mit blauen Farbstoff angefärbt werden, können nur den Bereich der Infarkt (Abbildung 1B) zu zeigen. Die Infarktgrößen sind abhängig von der Dauer der Ischämie. Wichtig ist, Troponin I (cTnI) niedrig sind in scheinoperierten Tieren, die alle unterOperationsverfahren außer Ischämie und Reperfusion im Vergleich zu Tieren, die Myokardinfarkt (Fig. 2) unterzogen. Dies zeigt die Scheinoperation keine signifikanten Herzpathologie produzieren, während der Ischämie / Reperfusion war ausreichend, um Höhe dieser weit verbreiteten Biomarker für MI zu produzieren.

Figur 1
Abbildung 1:. Quantifizierung des Ausmaßes der Infarkt folgenden LAD Okklusion Chirurgie (A) Repräsentative Bild von Wildtyp-Maus Herz Abschnitte von Tieren bis 45 Minuten Ischämie und 24 Stunden Reperfusion unterzogen. Injektion von blauem Farbstoff ermöglicht die Beurteilung der nicht ischämischen Bereich des Herzens, die nicht in Gefahr bei einem Infarkt. (B) Eine repräsentative Bild von einem Herz, in dem blauen Farbstoff wird nicht gespritzt, um den Bereich-at-Risk (AAR), die rot angezeigt wird, und die Infarktbereich, der weiß erscheint betonen. Die Bereiche der jeweiligen Region werden in Prozent des Gesamt linken Ventrikels (LV) Fläche multipliziert mit dem Gesamtgewicht der Tranche berechnet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
Figur 2:. Verwendung von Troponin Ebenen als Maß für das Ausmaß des Herzinfarkts Ein Balkendiagramm des kardialen Troponin I (cTnI) Spiegel bei Mäusen 45 Minuten Ischämie und Reperfusion für 24 Stunden (I / R) oder Scheinoperation unterzogen, als Kontrolle. Blut aus der Pfortader bei 24 Stunden nach der Operation von drei Tieren pro Gruppe gesammelt. Die Niveaus von cTnI deutlich in erhöhtenTieren nach I / R-Schaden (9,195 ± 0,07146) im Vergleich zu den scheinKontrollTieren (1,195 ± 0,06651). Die Daten werden als Mittel ± SEM und zeigt an, *** p <0,0001 Vergleich Schein-Steuerung und I / R-Gruppen von T-Test. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

Maus myokardialen Ischämie-Reperfusion-Modelle sind eine effektive Methode für Herz-Kreislaufforschung in die klinische akuten oder chronischen Herzerkrankungen 13,14 simulieren. Erhebliche Anstrengungen wurden angewendet zu entwickeln und zu verfeinern, chirurgische Ansätze, die ischämische Ereignisse und Reperfusionsschäden in den Herzen der verschiedenen Tierarten zu produzieren. Zwar gibt es besondere Vorteile für die Verwendung von verschiedenen Tieren Systemen hat die Maus Merkmale, die großes Interesse in der Herstellung von myokardialen I / R in der Maus Herz geführt. Einer der Hauptgründe ist die genetische Lenkbarkeit des Maussystems. Die umfangreiche Auswahl an gentechnisch veränderten Tieren zur Verfügung, und die relative Leichtigkeit, mit der neue Modelle generiert werden können, um spezifische Fragen zu beantworten, haben kein Spiel in anderen Tiermodellsystemen. Ein weiterer Grund für die zunehmende Verwendung von Mäusen in der kardiovaskulären Studien ist die zunehmende Verfügbarkeit von chirurgischen Geräten und anderen spezifischen experimentellen WerkzeugeVerbündete für den Einsatz bei Mäusen entwickelt. Die relativ geringen Kosten von Maus-Modellen ist auch ein wichtiger Faktor für deren Einsatz in Studien. Der steigende Bedarf an Strenge in präklinischen Studien erfordert die Verwendung von weiteren Tieren, die mehr realistisch sein kann, wenn weniger Ressourcen sind notwendig, um die entsprechende Anzahl von Tieren enthalten. Während die Verwendung der Maus-Modell hat einige Vorteile gibt es auch Nachteile, vor allem, wenn man die unterschiedlichen Aspekte der Maus und des Menschen Herz-Kreislaufphysiologie. Viele größere Tiermodelle, wie der Hund und Schwein, mehr genau imitieren die meisten Aspekte des menschlichen Herz-Kreislauf Physiologie als mit der Maus. Ein weiterer Nachteil ist die Größe des Maus, Manipulation des kleineren Herzen in der Maus erfordert einen höheren Grad der chirurgischen Fähigkeiten, insbesondere bei der Lokalisierung der LAD und reproduzierbar Ligierung, um eine konsistente Infarktbereich in der linken Herzkammer zu erzeugen. Das hier vorgestellte Verfahren kann eine deutliche Verbesserung der Identifizierung ein bereitzustellennd Ligation der LAD. Unsere konsistente Ergebnisse in Höhe von cTnI-Freisetzung aus dem Herzen (Abb. 2) deuten darauf hin, dass wir reproduzierbar erzeugen Infarkt eine ähnliche Größe und Höhe der Kardiomyozyten Tod.

Ein wesentlicher Aspekt der Operationen, um experimentellen Herzinfarkt induziert ist die klare Identifizierung und Ligation der LAD. In unserem Ansatz haben wir hier ausführlich das Verfahren zur Ermittlung und Zugriff auf die LAD verbessert, so dass für weitere konsequente Positionierung des Ligations auf dem Schiff. Während der Operation, nutzen wir ein kleines Stück sterilen Watte in den linken Vorhof und vollständig heben setzen die LAD, die die Position der LAD klärt und erleichtert die Ligation der LAD. Dies ist ein entscheidender Schritt für die Technik und eine Differenzierung Punkt von anderen Ansätzen. Die Einführung dieser Änderungen für LAD-Ligation sollte für mehr reproduzierbare Ergebnisse bei der Simulation von MI in Maus-Modellen zu ermöglichen. Während verbesserte Präzision im Ortment der Ligatur verbessern sollte Konsistenz in der Größe des Infarkt erzeugt es ist immer noch wichtig, die Risikozone messen mit Perfusion Phthaloblau Farbstoff. Dies ist bei der Verwendung von genetischen Veränderung Mauslinien, wo die Manipulation der Genexpression kann in Veränderungen in der Reaktion der Blutgefäße des Herzens, um die Ligation führen besonders wahr.

Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Ligation in die bestätigen, dass Ischämie wurde effektiv durch die Ligation der LAD erzeugt. Beobachtung einer deutlichen, schnellen Farbwechsel im Bereich der Risiko ist wichtig sicher zu sein, dass ischämische Bedingungen in dem Zielabschnitt des Myokards hergestellt. Die Farbänderung des Myokards innerhalb weniger Sekunden zu sehen ist, wenn die LAD wirksam okkludiert wird. Weitere wichtige Schritte in dem Verfahren beinhalten die Dauer der ischämischen Periode und die Zeit für die Reperfusion erlaubt, bevor experimentelle Endpunkte gemessen werden. Wie in der genannten protocol, kann die Länge der ischämischen Periode variiert werden, um unterschiedliche Grade der ischämischen Schädigung des Herzens zu erzeugen. Im Allgemeinen eine längere Ischämie wird im umfangreichen myocyte Tod in der gesamten Risikozone führen. Die Länge der Reperfusion kann Auswirkungen auf die Entwicklung der Herzpathologie, einschließlich des Auftretens von fibrotischen Läsionen im Herzen als auch die Stabilisierung der Herzleistung und elektrophysiologische Veränderungen. Somit muss die spezifische Länge dieser experimentellen Schritte zugeschnitten werden, um die in der Studie untersuchten spezifische Fragen anzugehen. Die experimentellen Endpunkte werden, beruhend auf der Länge der Ischämie und Reperfusion Zeit verwendet und spezifische Fragen in dem Experiment angegangen werden, ausgewählt werden. Wir präsentieren die Verwendung von TTC-Färbung auf die Infarktgröße und ELISA-Messungen der Serumspiegel zu messen cTnI als Endpunkte das Ausmaß der Herzschädigung zu beurteilen. Diese Endpunkte können für längere Reperfusion verwendet werden, jedoch sind sie besonders useful. für kürzere Zeiträume Reperfusion (24 Stunden), wo funktionale Mängel können noch nicht stabilisiert zu haben. Während wir nicht ins Detail auf die funktionelle Messungen der Herzleistung, wie Doppler-Echokardiographie und 15 Mikrokugel Messungen der koronaren Blutflusses 16 gehen hier Diese Ansätze sind sinnvoll, um die Änderungen in der Herzfunktion während längerfristige Experimente, wie chronische Okklusion verstehen KOP.

Während die Verwendung von Maus-Modellen der MI haben große Vorteile für die Untersuchung der I / R-Schaden im Herzen sind noch Beschränkungen dieser Ansätze. Seit größeren chirurgischen Einschnitte in die Brusthöhle gemacht werden die daraus resultierenden Gewebestörungen und die damit verbundenen Entzündung kann die Reaktion des Herzens auf die MI-Effekte beeinflussen. Diese Bedenken können teilweise durch die Verwendung von operativen Scheinkontrollmäusen, denen alle Operationsschritte sind mit Ausnahme der Festziehen der Ligatur um den geführt richtenLAD. Ein weiteres Problem, das durch die invasive Art der Operation hergestellt wird, ist die Notwendigkeit, den Schmerz und das Leiden, die während und nach dem Eingriff auftritt verwalten. Schmerz-Management-Ansätze, die derzeit besten Praktiken entsprechen, werden in diesem Verfahren beschrieben und sind notwendig, um das Leiden der Versuchstiere zu verhindern. Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung von vielen verschiedenen Arten von Anästhetika und Analgetika kardioprotektive Wirkungen nach ihrer Anwendung haben. Daher ist es angebracht, diese Mittel zu den Kontrollmäusen, auch alle Kontrollmäuse, die nicht für Schein-Operationen verwendet werden, gelten, um etwaige Komplikationen Interpretation der experimentellen Ergebnisse zu vermeiden. Eine weitere Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass es nicht eine perfekte Simulation der Pathologie, die mit menschlichen MI verbunden. Häufig werden die Mausmodelle für solche Experimente verwendet werden, nicht von Komorbiditäten, die die MI beim Menschen zugrunde liegen, wie beispielsweise Herzkranzgefäßerkrankung, Diabetes und Bluthochdruck leiden. SoKomplikationen, die nicht in der Maus-Modell vorhanden sind, könnte Auswirkungen auf die Wege, die in einem bestimmten Experiment untersucht und sollte daher bei der Interpretation Ergebnisse werden müssen. In diesen Fällen kann die Verwendung von gentechnisch veränderten Mäusen, die einige dieser Grunderkrankungen Anzeige angebracht, effektiver zu modellieren, die Krankheit, wie es in menschlichen Patienten. In Zukunft könnten andere Aspekte dieses Ansatzes modifiziert werden, um weitere Aspekte der menschlichen MI Pathologie genauer zu simulieren.

Trotz dieser Einschränkungen, die hier beschriebenen Methoden stellen einen effektiven Ansatz zur lokalisierten I / R-Schaden in der Maus, die viel von den pathologischen Auswirkungen von MI bei menschlichen Patienten simuliert produzieren. Unsere Technik ermöglicht eine leichtere Manipulation der LAD, die zu besser reproduzierbaren Ergebnissen führen und Vereinfachung der Operation kann. Doch die Beherrschung dieser Technik erfordert noch erhebliche chirurgische Fertigkeit, die nur durch die Praxis der gewonnen werden könnendas Verfahren. Unter ausreichender Sorgfalt bei der Durchführung der Operation, vor allem an Stellen, wo dies im Protokoll vermerkt, wird die Überlebensrate der Tiere so gut und die Reproduzierbarkeit der Versuchsergebnisse zu verbessern. Sobald der chirurgischen Ansatz beherrscht wird, wird dieses Protokoll sich als sehr nützlich, um die Ermittler die Untersuchung der Wirkung von MI auf Herz-Kreislaufphysiologie sowie die Interessenten in die Prüfung der Wirksamkeit von therapeutischen Interventionen auf einem Maus-Modell.

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Disclosures

Dr. Noah Weisleder ist ein Gründer und Chief Scientific Officer bei der TRIM-edizin, Inc.

Acknowledgments

Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde von der National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett-und Hautkrankheiten, Teil der National Institutes of Health, unter Verleihungsnummer R01-AR063084 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming Kent Scientific Corp PS-RT
Light source Zeiss KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix Zivic Miller HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) Fine Science Tools 6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma Aldrich T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable) Reckitt Benkiser Healthcare NDC 12496-0757-1
bupivacaine Hospira NDC 0409-1163-01
Isoflurane Abbott NDC 5260-04-05
Betadine Soultion  Purdue Pharma 25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA Kamiya Biomedical Company KT-58997
Fine Scissors Fine Science Tools 14040-10
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Slim Elongated Needle Holder Fine Science Tools 12005-15
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