En mus modell av ischemi-reperfusion skada genom Ligation i vänstra främre nedåt Artery

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi inför en kirurgisk metod att inducera experimentell ischemi / reperfusion (I / R) skada att simulera hjärtinfarkt (MI) i musmodeller som möjliggör mer klarhet i positioneringen av ligation på vänster främre nedstigande artär (LAD) för att öka reproducerbarheten av MI experiment på möss.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery. J. Vis. Exp. (86), e51329, doi:10.3791/51329 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Akut eller kronisk hjärtinfarkt (MI) är kardiovaskulära händelser som resulterar i hög morbiditet och mortalitet. Upprätta de patologiska mekanismerna vid arbete under MI och utveckla effektiva behandlingsmetoder kräver metoden att reproducerbart simulera kliniska incidensen och återspeglar de patofysiologiska förändringar i samband med MI. Här beskriver vi en kirurgisk metod att framkalla MI i musmodeller som kan användas för korttids ischemi-reperfusion (I / R) skada och permanent ligation. Den stora fördelen med denna metod är att underlätta placeringen av den vänstra främre nedåtgående artären (LAD) för att medge korrekt ligering av denna artär att inducera ischemi i den vänstra ventrikeln av musen hjärta. Noggrann positionering av ligatur på LAD ökar reproducerbarheten infarktstorlek och således producerar mer tillförlitliga resultat. Ökad precision i placeringen av ligatur kommer att förbättra de vanliga kirurgiska metoder för att simulera MI i möss, thus att minska antalet försöksdjur som behövs för statistiskt relevanta studier och förbättra vår förståelse av de mekanismer som producerar hjärtdysfunktion efter hjärtinfarkt. Denna musmodell av MI är också användbar för preklinisk testning av behandlingar riktade myokardiell skada efter MI.

Introduction

Djurmodeller av hjärtinfarkt (MI) är viktiga i forskning av komplexa patofysiologi av ischemisk hjärtsjukdom 1. Ischemi-reperfusion (I / R) skada är en viktig bidragsgivare till myokardskada genereras under MI. Den initiala ischemi skada producerad av ocklusion av koronarcirkulation kan minimeras i MI patienter med hjälp av angioplastik att återställa perfusion i tid. Samtidigt som detta ingripande har kraftigt minskat antalet dödsfall på grund av akut hjärtinfarkt, återställande av blodflödet i ischemiska resultaten området i I / R skada som leder till döden av hjärtmuskelceller. Denna förlust av hjärtmuskelmassan bidrar till minskad hjärtminutvolym och utveckling mot hjärtsvikt. Därför är studier av de mekanismer som leder till cardiomyocyte död från I / R skada en viktig linje undersökningskommitté i kardiovaskulär forskning. Kirurgisk koronarligation är en användbar experimentell teknik för att framkalla modeller av MI i olika djurtyper, including råtta, hund och gris. Publikationer i olika laboratorier har infört olika metoder för upprättandet av mössen hjärtat modell av I / R skada 2,3. För att få insikt i dessa mekanismer måste vi ha tillgång till tillförlitliga djurmodeller som kan återge flera aspekter av MI patologi. Utveckling av dessa modeller är också viktigt för att testa terapeutiska metoder för behandling av hjärtinfarkt och tillhörande I / R skada.

De flesta av de tillgängliga kirurgiska tekniker för att simulera MI i försöksdjur innebär kirurgisk dissektion i brösthålan för att exponera vänster främre nedstigande artär (LAD) som sedan tilltäppt av en ligatur för definierad period i tid för att producera den ischemiska händelsen. Då det ligatur kan tas bort för att tillåta reperfusion av det ischemiska området och generering av I / R skada. En allvarlig begränsning med dessa tillvägagångssätt av att läget av litteraturen om LAD inte alltid exakt reproduceras, vilketkan leda till en variation i svårighetsgrad av Ml induceras av detta tillvägagångssätt. De flesta tillgängliga teknik endast beskrivits generellt den ungefärliga placeringen av LAD i den främre väggen av hjärtat. Eftersom förgreningen och riktningen av LAD kan variera i enskilda djur platsen är inte alltid fast och kan lätt förväxlas 4,5, vilket kan leda till komplikationer under operation 6. Konsekvenserna av felaktig placering av ligaturen kan köra från variabilitet i storleken på infarkt framkallad i den vänstra ventrikeln för att fullständigt göra avkall specificiteten av modellen. Här presenterar vi en modifierad metod för myocardial I / R och permanent ligation i möss som ger större träffsäkerhet för placering av ligatur på LAD. Genom att tillämpa särskilda metoder för den initiala snittet och intern dissekering, liksom användningen av manipulationer för att lyfta förmaken för att möjliggöra en bättre uppskattning av LAD och den plats där den kommer ut från aorta. Inrättande avposition på LAD och dess ursprung ger möjlighet att ligera LAD på ett reproducerbart sätt. Denna modell av myokardisk l / R och permanent ligering minskar inte bara variationen i infarktstorlek efter kirurgi, kan det också minska förekomsten av överdriven blödning under operationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna djur protokoll godkändes av och är i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Ohio State University. All politik som utvecklats av lokala IACUC är i överensstämmelse med den djurförsöks Guide utvecklats av Office of Laboratory Animal Welfare vid National Institutes of Health.

1. Anestesi och luftstrupsintubation

  1. Autoklavera alla instrument och kirurgiska leveranser före användning. Bär sterila engångsbruk operationshandskar under hela förfarandet. Upprätthålla ett sterilt område under hela förfarandet. Användning av en steril duk föreslås men inte visas i videon för att möjliggöra bättre visualisering av anatomiska landmärken på musen.
  2. Placera varje mus individuellt i en induktionskammare och ger anestesi med användning av 5% isofluran och syre med en flödeshastighet av 0,4 l / min tills förlust av upprätningsreflex och sedan upprätthålla the djur med 2% isofluran i 100% syre med ett flöde av 0,4 l / min med hjälp av en noskon röret anslutet till anestesiapparaten tills trakealtuben är på plats. Den isoflurananestesi maskin som används bör vara lämpligt ventilerat och utrustade med kolfilter för att minimera exponeringen för kirurgen att isofluran ångor under förfarandet. Noskonen är noterade men inte visas i videon för att möjliggöra visualisering av manipulation utföra intubation musen.
  3. Raka djuret bröstkorg med en djur hårklippare på en annan plats än den operation plattform för att undvika förorening av kirurgi plats.
  4. Placera musen i liggande ställning på kirurgi plattform för efterföljande intubation. En enkel liten polystyrenskum plattform kan fungera som en operativ plattform. Täck plattformen med en försteriliserad drapering för att åstadkomma en steril yta. Placera en värmedyna mellan plattformen och drapering för att upprätthålla kroppstemperaturen hos mössen i surgical förfaranden.
  5. Bifoga en längd på 2-0 silke sutur på minst 10 cm till plattformen med tejp och sedan slinga suturen runt de främre övre framtänderna. Placera konen i närheten (2-3 cm) till kanten av plattformen över näsan på musen. Dra musen stram och fäst den till plattformen i svansen med en bit tejp.
  6. Fäst benen vid sidorna av kroppen med strängar av tejp. Det är viktigt att frambenen inte är överbelastade eftersom detta kan äventyra andning.
  7. Förbered rakade kirurgiska platser med Betadine och alkohol innan hals och bröst snitt görs.
  8. Placera plattformen med musen huvud pekar i riktning mot operatören. Skär en 0,5 cm median livmoderhalscancer hud snitt. Separera lober i sköldkörteln hos deras näset att exponera sternohyoideus muskeln där luftstrupen kan ses under muskeln.
  9. Ta bort den inre nålen av en 18 gauge trokar så att den kan användas som en intubation röret. Nålen punkt kan fungera som en hållare och 1 cm av det yttre röret kan tjäna som den trakeala tuben.
  10. Håll tungan av musen med böjda pincett i ena handen och flytta den en aning uppåt. Se luftstrupen genom hals hudsnitt. Använd den andra handen för att försiktigt in intubation röret tills röret är sett inuti luftstrupen.
  11. Så fort röret är i luftrör, flytta böjda pincetten i andra hand mot röret och snabbt ta bort den inre nålen. Om röret inte kan införas i den trakeal bör röret dras ut för att undvika framställning av andningsproblem. Det är viktigt att påpeka att spetsen på röret när det är nära till halsen, för att undvika att föra in röret in i matstrupen istället för luftstrupen.

2. Ventilation och Fixering

  1. Ge konstgjord andning med en djur respirator avluftning 2% isofluran i syre med en flödeshastighet av 0,4 l / min. Använd en modifierad Y-shape-kontakt för att ansluta intubation rör med ventilatorn. Rätt placering av trakealtuben kan bekräftas genom att döma den symmetriska expansionen bröstet.
  2. Ställ tidalvolym på 260 | il / slag-och ventilationshastigheten är 130 slag per minut, som kan justeras med avseende på kroppsvikt av en speciell mus om nödvändigt.
  3. Ta bort tejpen på svansen och slå på musen försiktigt för att placera den i en rätt sidoläge trycksår ​​för den efterföljande operationen. Använd tejp för att fästa svansen och benen till plattformen igen.
  4. Sätt den rektala sonden för att övervaka kroppstemperaturen och justera uppvärmningsplattan för att hålla temperaturen runt 37 ° C.
  5. Fäst sonden till plattformen med hjälp av tejp. Injicera bupivakain subkutant vid snittet platsen att bedöva området innan snittet görs.

3. Torakotomi

  1. Gör ett snett snitt som är ungefär 1 cm lång på en plats 2 mm från vänstersternala gränsen i riktning mot där det vänstra frambenet möter kroppen (ca 1-2 mm nedanför där benet och kroppen gå). Den ytliga bröstkorg ven ligger nära denna plats och snittet ska göras så att den laterala änden av snittet går upp till, men inte skära i, venen.
  2. Skär även bröstmuskeln att exponera revbenen under. Under detta steg att undvika oavsiktlig skada av kärlet. Om blödningen inträffar, använd bomulls applikatorer för att stoppa blödning innan du går vidare till nästa steg 7.
  3. Visualisera revbenen och blåsa upp lungorna genom den tunna och halvbröstkorgen. Öppna brösthålan med hjälp av kirurgisk sax för att göra ett 6-8 mm snitt i den tredje interkostalrummet. Detta snitt bör vara minst 2 mm från den sternala gränsen där den interna bröstkorg artär är belägen. Skador på artären kommer att producera kraftig blödning som är svår att kontrollera.
  4. Sätt i de pre-steriliserade hemlagade bröst upprullningsdon into snittet och dra försiktigt tillbaka för att öppna snittet så att det är ca 8-10 mm bred och samtidigt vara noga med att undvika lungan. De sårhakar bör fästas på kirurgisk plattform med stift.
  5. Vid det här laget bör hjärtat vara synliga, men kommer lungan fortfarande täcker en del av hjärtat. Plocka upp hjärtsäcken försiktigt med böjda pincett, dra isär och skjut vävnaden bakom upprullningsdon. Under denna manipulation lungan kommer att lyfta upp och bort från hjärtat.

4. Positionering LAD

  1. Lokalisera LAD på ytan av hjärtat genom ett dissektionsmikroskop. The LAD rinner ner i mitten av hjärtväggen från nära spetsen av hjärtat nedåt genom den vänstra ventrikeln. Den LAD verkar klarröda och kommer att pulsera kraftigt. Det ven här är ibland misstas för LAD, dock ordentlig belysning kan hjälpa skilja de två fartygen. Om belysningen är för ljus kan det vara svårt att uppskatta den färgskillnader mellan fartygen.
  2. Använd en steril bomullstuss fragment med en diameter av ca 1-2 mm för att förbereda LAD för ligering. Placera bomulls mellan vänster förmak och vänster kammare, vilket kommer att lyfta vänster förmak och hjälpa utsätta LAD och klargöra sin ståndpunkt. Om LAD inte kan lokaliseras, kan fragment glida ytterligare i så vänster förmak lyfts ännu högre för att avslöja aortan där LAD härstammar.

5. LAD Ligation

  1. Den ideala placeringen för ligaturen är ca 2 mm lägre än spetsen på det vänstra förmaket. Den pulmonell stammen kan användas som en markör för att identifiera den vänstra förmaket. Alternativt kan ligering positionen visualiseras som en punkt 1-2 mm från förgreningen av den vänstra cirkumflex. Använd böjd pincett för att försiktigt applicera tryck på en plats omedelbart under den avsedda ligation punkten. Detta kommer att göra det lättare att se i artären och kommer också att bidra till att hålla hjärtat på platsoch förenkla binda ligaturen. Tryck inte med pincetten i mer än fem sekunder i taget och undvika kompression av hjärtat som kan förändra pumpning.
  2. Använd en avsmalnande nål att passera en 6-0 silkessutur under LAD under observation med ett dissektionsmikroskop. Stick in nålen i artären med precision eftersom nålen kommer in i vänster kammare kammare om de placeras för djupt eller skada LAD om nålen är för grunt. Om LAD skadas avlägsna nålen och sutur LAD att kontrollera blödning, men om blödningen inte kan kontrolleras är det föredraget att avliva djuret.
  3. Gör en lös dubbelknut med suturen, lämnar en diameter slinga 2-3 mm genom vilken en 2-3 mm lång bit av PE-10 slang placeras 8.
  4. Dra åt öglan runt artären och slang fäst sedan slingan genom att knyta ytterligare en slipknot, noga med att inte skada ventrikeln väggen. För permanent ligation, direkt knyta LAD med enknut 9. Bekräfta ocklusion av LAD genom att kontrollera uppkomsten av en blekare färg i den främre väggen av LV som ska visas inom några sekunder efter ligation.
  5. Ta upprullningsdonet och stänga såret tillfälligt genom att klämma ihop huden med en bulldog klämma. Den tid som ischemi bibehålls beror på experiment design, men är ofta 20, 30, 45 eller 60 min. Musen förblir vid ventilatorn i varaktigheten av LAD artärocklusion.

6. Reperfusion

  1. Efter ischemi perioden ta bort bulldog klipp och sätt in bröst upprullningsdon att exponera ligatur. Lösa knuten och avlägsna PE-10 slang. Bekräfta reperfusion genom att observera en avkastning på den rosa-röda färgen på den främre väggen av LV efter 15-20 sek.
  2. Lämna suturen på plats om 2% trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) och blå-färgning kommer att utföras efter reperfusion. Om färgning är inte nödvändigt, kan suturen be bort.
  3. Den reperfusion tiden beror på experimentets utformning, vanligtvis sträcker sig från 1 timme till 24 timmar.

7. Bröst Stängning och postoperativ vård

  1. Stäng brösthålan genom sömnad stänga snittet i 3: e interkostalrummet med 4-0 silkessutur. Det är viktigt att lungorna är tydliga av suturen och inte blir fångade som den 3: e och 4: e revben sutureras tillsammans. Medan knyta suturen knop är det bra att applicera ett lätt tryck på bröstkorgen med nålhållaren för att minimera rumsluft som kan fastna i brösthålan.
  2. Stäng alla lager av muskler med kontinuerliga suturer som använder 4-0 silke. Använd nylonsuturer att stänga huden med en kontinuerlig sutur. Alternativt kan huden vara stängd med avbruten sutur.
  3. När suturering är klar upphör flödet av isofluran medan syre fortsätter att flöda. När musen flyttas sina morrhår och svans det, should börja göra försök att andas spontant. Ta bort musen från ventilatorn med intubation röret fortfarande hålls i luftstrupen.
  4. Observera djuret försiktigt tills musen återupptar en normal andningsmönster och sedan extubera musen. Röret bör avlägsnas långsamt för att undvika aspiration av munhålan sekret.
  5. Bekräfta musen är inte på något andnöd genom att observera den för en annan 3-5 min innan den till en bur. Om tecken på uttorkning observeras efter kirurgi, ge upp till 0,5 ml steril saltlösning genom intraperitoneal injektion.
  6. För postoperativ smärtlindring, administrera ett opioidanalgetikum (buprenorfin, 0,1 mg / kg) subkutant (SC) innan djuret är ambulatorisk och sedan ge ytterligare en dos varje 4-6 timmar för nästa 24 timmar. Kontrollera djuret tecken på smärtor i 12 timmar efter operationen. Simulering av hjärtinfarkt med hjälp av överlevnadskirurgi kräver bedömning av smärta och ångest efter återhämtning från SUrgery. Den nuvarande accepterade bästa praxis är att ge smärtlindring för den första 24 tim efter en invasiv förfarande med ytterligare doser ges som befogat på grund av viktnedgång eller tecken på smärta. För permanent ligation, bör kroppsvikten spåras dagligen för att hjälpa till att mäta djurets återhämtning.
  7. Ibuprofen (Motrin), icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) med antiinflammatorisk, smärtlindring och febernedsättande aktivitet, eller andra NSAID-preparat, kan tillhandahållas i djurets dricksvatten som en 0,2 mg / ml lösning för två dagar före operationen och upp till 7 dagar efter operationen i tillsammans med buprenorfin för att hantera ytterligare smärta / lidande.

8. Mätning av myokardinfarktstorlek

  1. Bedöva och intuberas musen vid slutet av önskad reperfusion tid. Skär bröstet huden i mittlinjen på xyphoid. Öppna buken och membranet under bröstkorgen och från båda sidor av medioklavikularlinjen.
  2. <li> exponera hjärtat och sedan åter ligera LAD på samma plats. Kanylera aorta så 10% Phthalo Blue kan långsamt injiceras direkt i aorta att färga hjärtat för avgränsningen av den ischemiska zonen från nonischemic zonen 10.
  3. Snabbt skära hjärtat och tvätta den i 30 mM KCl (kaliumklorid) att upphöra med hjärtslag och möjliggöra mer konsekventa sektionering. Freeze hjärtat i minst 4 timmar vid -20 ° C och skärs hjärtat i skivor av 1 mm med användning av en hjärt matris sektione anordning 11.
  4. Inkubera hjärt skivor med 2% TTC vid 37 ° C i 40 minuter. Infarktområdet avgränsas som ett vitt område samtidigt livsduglig vävnad fläckar rött.
  5. Fäst färgade skivor med 10% formaldehyd över natten, vilket kommer att bidra till att öka kontrasten mellan infarktområdet och den normala vävnaden. Fotografera skivor och beräkna riskområdet (AAR), den nonischemic zonen och infarktområdet med ImageJ programvara.
<p class = "jove_title"> 9. Mätning av hjärtenzymvärden

Mät cardiac troponin I (cTnI) nivåer i serum hos möss genom att erhålla blod från portalen ven och sedan isolera serum genom centrifugering. Serum cTnI-nivåer bestäms sedan med en kvantitativ snabb cTnI analys 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter 24 timmars reperfusion, analys av infarktstorlek och området-at-risk (AAR), genom Phthalo blått färgämne och trifenyltetrazoliumklorid (TTC), ligation av LAD kan bekräftas genom att observera blekning av myocardial vävnad distalt om suturen såväl som dysfunktion i den främre väggen. Reperfusion kan verifieras genom återlämnandet av röd färg till hjärtmuskelvävnaden och demonstration av en viss återhämtning av främre väggen rörelse.

Infarkt områden (vita) ska kunna skiljas från riskområden (röd) och området inte riskerar (blå). Tillämpning av Phthalo Blue färgämne (Figur 1A) medger upplösning av det område hos hjärtat där ocklusion av LAD, medan hjärtan som inte färgats med blå färg endast kan visa området med infarkt (Figur 1B). Infarkt storlekar är beroende av varaktigheten av ischemi. Viktigt cardiac troponin I (cTnI) är låga i skenopererade djur som genomgick allakirurgiska procedurer förutom ischemi och reperfusion jämfört med djur som genomgick hjärtmuskelinfarkt (Figur 2). Detta indikerar bluff kirurgi gav ingen signifikant hjärt patologi medan ischemi / reperfusion skada var tillräcklig för att producera höjd av detta i stor utsträckning biomarkör för MI.

Figur 1
Figur 1:. Kvantifiering av omfattningen av infarkt efter LAD ocklusion kirurgi (A) representant bild av vildtyp mus hjärtsektioner från djur som utsatts för 45 minuters ischemi och 24 timmars reperfusion. Injektion av blått färgämne möjliggör bedömning av den icke-ischemiska zonen av hjärtat som inte är i riskzonen för en infarkt. (B) En representativ bild av ett hjärta där blått färgämne inte injicerasatt betona området-at-risk (AAR), som är röd, och infarktområdet, som är vit. De områden i varje region beräknas som procentandelar av den totala vänster kammare (LV)-området multiplicerat med den totala vikten av denna skiva. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2:. Användning av hjärt-troponin nivåer som ett mått på omfattningen av hjärtinfarkt Ett stapeldiagram av hjärt-troponin I (CTnl)-nivåer hos möss som utsatts för 45 minuters ischemi och reperfusion under 24 timmar (I / R) eller sham operation som en kontroll. Blod uppsamlades från portvenen vid 24 timmar efter kirurgi från tre djur i varje grupp. Nivåerna av cTnI är signifikant förhöjda idjur efter I / R skada (9,195 ± 0,07146) jämfört med simulerad kontrolldjur (1.195 ± 0,06651). Data presenteras som medelvärde ± SEM och *** indikerar P <0,0001 jämföra bluff kontroll och I / R-grupper av T-testet. Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mus myocardial ischemi-reperfusion modeller är en effektiv metod för kardiovaskulär forskning för att simulera klinisk akut eller kronisk hjärtsjukdom 13,14. Betydande ansträngningar har gjorts för att utveckla och förfina kirurgiska metoder som producerar ischemiska händelser och reperfusion skador i hjärtat hos många olika djurtyper. Även om det finns särskilda fördelar med att användningen av olika djursystem, har musen egenskaper som har lett till ett stort intresse i att producera myocardial I / R i musen hjärta. En av de viktigaste orsakerna är den genetiska spårbarhet system musen. Den omfattande urval av genetiskt modifierade djur som finns, och den relativa lätthet med vilken nya modeller kan genereras för att behandla specifika frågor, har ingen match i andra djurmodellsystem. En annan orsak till den ökande användningen av möss i hjärt-studier är den ökade tillgången på kirurgisk utrustning och andra experimentella verktyg specifikaally utformad för användning i möss. Den relativt låga kostnaden för musmodeller är också en viktig bidragsgivare till deras användning i studier. Det ökande behovet av stringens i prekliniska studier det nödvändigt att använda ytterligare djur, vilket kan vara mer realistisk när mindre resurser är nödvändigt att inkludera lämpligt antal djur. Även om användningen av musen modellen har flera fördelar det finns nackdelar också, särskilt när man beaktar de olika aspekterna av mus och människa kardiovaskulär fysiologi. Många större djurmodeller, såsom hunden och grisen, närmare efterlikna de flesta aspekter av mänsklig kardiovaskulär fysiologi än musen. En annan nackdel är storleken på musen, manipulering av det mindre hjärtat hos mus kräver en högre grad av kirurgisk skicklighet, särskilt i att lokalisera LAD och reproducerbart ligera den för att producera en konsekvent infarktområdet i den vänstra ventrikeln. Den metod som presenteras här kan ge en betydande förbättring av identifiering and ligering av LAD. Våra tillförlitliga resultat i mängden cTnI frisättning från hjärtat (figur 2) föreslår att vi reproducerbart kan generera infarkt av liknande storlek och nivå på hjärtmuskelceller död.

En viktig aspekt av operationer för att inducera experimentell hjärtinfarkt är att tydligt identifiera och ligering av LAD. I vårt tillvägagångssätt beskrivs här har vi förbättrat den metod för att identifiera och komma åt LAD, vilket möjliggör mer konsekvent positionering av ligation på fartyget. Under operationen, använder vi oss av en liten bit av steril bomull för att lyfta vänster förmak och till fullo exponera LAD, som klargör läget för LAD och underlättar ligation av LAD. Detta ett kritiskt steg för tekniken och en differentieringspunkt från andra metoder. Införandet av dessa ändringar för LAD ligation bör möjliggöra mer reproducerbara resultat under simulering av MI i musmodeller. Även förbättrad precision i ställetning av ligatur bör förbättra konsekvensen i storleken på infarkt genererade det är fortfarande viktigt att mäta i riskzonen med hjälp av perfusion av Phthalo blå färg. Detta gäller särskilt vid användning av genetisk modifiering mus linjer där manipulation av genuttryck kan resultera i förändringar i svaret av blodkärlen i hjärtat ligering.

Ett annat kritiskt steg under ligering på i vilket bekräftar att ischemi har effektivt genererad av ligering av LAD. Observation av en distinkt, snabb färgförändring i riskområdet är viktigt att vara säker på att ischemiska tillstånd har producerats i den riktade delen av hjärtmuskeln. Förändringen av färgen i hjärtmuskulaturen bör ses inom några sekunder om LAD är effektivt blockerad. Andra kritiska steg i proceduren innebär varaktighet ischemisk period och den tillåtna tiden för reperfusion innan experimentella endpoints mäts. Som nämnts i protocol kan längden av den ischemiska perioden varieras för att ge olika grader av ischemisk skada på hjärtat. I allmänhet en längre period av ischemi resulterar i mer omfattande myocyt död hela riskzonen. Längden på reperfusion kan ha effekter på utvecklingen av hjärt-patologi, inklusive uppkomsten av fibrotiska lesioner i hjärtat liksom stabiliseringen av hjärtminutvolym och elektrofysiologiska förändringar. Således måste den specifika längden på dessa experimentella steg skräddarsys för att möta de specifika frågor som undersöktes i studien. De experimentella ändpunkter bör också väljas baserat på längden av ischemi och reperfusion perioder som används och de specifika frågor som ska tas upp i experimentet. Vi presenterar användning av TTC färgning för att mäta infarktstorlek och ELISA-mätningar av serum cTnI nivåer som slutpunkter för att bedöma omfattningen av hjärtskada. Dessa slutpunkter kan användas för någon längre reperfusion, men de är särskilt useful kortare reperfusion perioder (24 timmar) där funktionsfel kanske inte har stabiliserats ännu. Även om vi inte gå in på detaljer här på funktionella mätningar av hjärtminutvolym, till exempel Doppler ekokardiografi 15 och mikrosfär mätningar av koronar blodflödet 16, dessa metoder är användbara för att förstå de förändringar i hjärtfunktionen under långtidsförsök längre, såsom kronisk ocklusion av LAD.

Medan användningen av musmodeller av MI har stora fördelar för studier av l / R skada i hjärtat finns det fortfarande begränsningar i dessa metoder. Eftersom större kirurgiska snitt skall göras in i brösthålan de resulterande vävnadsstörningar och tillhörande inflammation kan påverka svaret på hjärtat till MI-effekter. Dessa problem kan delvis åtgärdas genom att använda falska kirurgiska kontrollmöss, där alla kirurgiska åtgärder är alla utförda med undantag för åtdragning av ligatur runtLAD. En annan fråga som är producerad av den invasiva naturen av kirurgi är det nödvändigt att hantera den smärta och det lidande som sker under och efter proceduren. Smärtlindring metoder som uppfyller nuvarande bästa praxis i detalj i denna procedur och är nödvändiga för att förhindra lidande av försöksdjuren. Det är viktigt att vara medveten om att användningen av många olika typer av bedövningsmedel och smärtstillande medel kan ha hjärtskyddande effekter efter deras ansökan. Således, det lämpligt att tillämpa dessa medel med kontrollmössen, även eventuella kontrollmöss som inte används för falska operationer, för att undvika eventuella komplikationer till tolkning av experimentella resultat. En annan begränsning med denna metod är att den inte ger en perfekt simulering av patologi i samband med mänsklig MI. Ofta musmodeller används för sådana experiment inte lider av komorbiditet som ligger till grund för MI i människor, såsom kranskärlssjukdom, diabetes och högt blodtryck. Sådankomplikationer som inte finns i musmodell kan få effekter på de vägar som studeras i ett visst experiment och bör därför beaktas vid tolkning av resultaten. I dessa fall kan användning av genetiskt modifierade möss som visar en del av dessa underliggande patologier vara lämpligt att mer effektivt modellera sjukdomen som det skulle hos människor. I framtiden kan andra aspekter av detta synsätt modifieras för att mer exakt simulera ytterligare aspekter av mänsklig MI patologi.

Trots dessa begränsningar, de metoder som beskrivs här utgör en effektiv metod för att producera lokaliserad I / R skada i musen som simulerar mycket av de patologiska effekterna av MI hos människor. Vår teknik medger lättare manipulering av LAD, som kan leda till mer reproducerbara resultat och förenkla operationen. Men behärska denna teknik fortfarande kräver betydande kirurgisk skicklighet som bara kan vinnas genom träning avförfarandet. Att ta tillräcklig omsorg när de utför operationen, särskilt på platser där detta noteras i protokollet, kommer att förbättra överlevnaden av djur samt och reproducerbarhet av de experimentella resultaten. När den kirurgiska tillvägagångssätt behärskar, kommer detta protokoll vara ganska bra att utredare som studerar effekten av MI på kardiovaskulär fysiologi samt de som är intresserade av att testa effektiviteten av terapeutiska ingrepp på en musmodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr Noah Weisleder är en grundare och Chief Scientific Officer på TRIM-edicine, Inc.

Acknowledgments

Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala och hudsjukdomar, en del av National Institutes of Health, enligt Award Number R01-AR063084. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming Kent Scientific Corp PS-RT
Light source Zeiss KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix Zivic Miller HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) Fine Science Tools 6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma Aldrich T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable) Reckitt Benkiser Healthcare NDC 12496-0757-1
bupivacaine Hospira NDC 0409-1163-01
Isoflurane Abbott NDC 5260-04-05
Betadine Soultion  Purdue Pharma 25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA Kamiya Biomedical Company KT-58997
Fine Scissors Fine Science Tools 14040-10
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Slim Elongated Needle Holder Fine Science Tools 12005-15
Round Handled Needle Holders Fine Science Tools 12075-12
Omano Trinocular Stereoscope Microscope.com OM99-V6
SB2 Boom Stand with Universal Arm Microscope.com V6
Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y Kent Scientific Corp RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals VetEquip, Inc 901807
4-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2515N
6-0 silk taper suture Sharpoint™ Products DC-2150N

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. J Surg Res. 162, 239-249 (2010).
  2. Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107, 1445-1453 (2010).
  3. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (2011).
  4. Salto-Tellez, M., et al. Myocardial infarction in the C57BL/6J mouse: a quantifiable and highly reproducible experimental model. Cardiovasc Pathol. 13, 91-97 (2004).
  5. Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16, 41-44 (2005).
  6. Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Exp Physiol. 89, 497-505 (2004).
  7. Shao, Y., Redfors, B., Omerovic, E. Modified technique for coronary artery ligation in mice. J Vis Exp. (2013).
  8. Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).
  9. Nossuli, T. O., et al. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, 1049-1055 (2000).
  10. Cozzi, E., et al. Ultrafine particulate matter exposure augments ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, 894-903 (2006).
  11. Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. J Vis Exp. 3896 (2012).
  12. Nagarajan, V., Hernandez, A. V., Tang, W. H. Prognostic value of cardiac troponin in chronic stable heart failure: a systematic review. Heart. 98, 1778-1786 (2012).
  13. Borst, O., et al. Methods employed for induction and analysis of experimental myocardial infarction in mice. Cell Physiol Biochem. 28, 1-12 (2011).
  14. Diepenhorst, G. M., van Gulik, T. M., Hack, C. E. Complement-mediated ischemia-reperfusion injury: lessons learned from animal and clinical studies. Ann Surg. 249, 889-899 (2009).
  15. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7, 41691 (2012).
  16. Bamberg, F., et al. Accuracy of dynamic computed tomography adenosine stress myocardial perfusion imaging in estimating myocardial blood flow at various degrees of coronary artery stenosis using a porcine animal model. Invest Radiol. 47, 71-77 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics