의 리그닌 아래로 규제

Bioengineering

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Summary

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

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Park, S. H., Ong, R. G., Mei, C., Sticklen, M. Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51340, doi:10.3791/51340 (2014).

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Abstract

생물 전환 공정 동안에 대안 바이오 에너지 자원 등 목질 계 바이오 매스의 사용을 촉진하기 위하여, 전처리 단계는 세포벽 탄수화물의 접근성을 증가, 식물 세포벽의 구조를 열 필요가있다. 리그닌, 많은 세포 유형의 벽에 존재하는 폴리 페놀의 재료는, 액세스를 효소 심각한 지장으로 알려져있다. 식물의 구조적 완전성과 방어 시스템을 방해하지 않는 레벨로 리그닌 함량의 감소는 바이오 에탄올 생산 비용을 줄이기 위해 가치있는 단계 일 수있다. 이 연구에서는 유전자 이중 가닥 RNA 간섭 기술을 통해 리그닌 생합성 관련 유전자 중 하나, 신나-CoA 환원 (ZmCCR1)를 아래로 조절했다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 입자 충격 법을 사용하는 옥수수 게놈에 통합 하였다. 형질 전환 옥수수 식물에없이 야생형 대조군 식물과 비교하여 일반적으로 성장형질 전환 식물의 잎 중간 갈비, 껍질에 갈색 착색의 표시를 제외하고, 바이오 매스의 성장이나 방어 메커니즘으로 terfering 및 줄기. 현미경 분석은 조직 학적 분석과 함께, 잎 후벽 섬유 박형화되었지만 다른 주요 혈관 시스템 구성 요소의 구조 및 크기가 변경되지 않았 음을 밝혔다. 유전자 변형 옥수수의 리그닌 함량은 7-8.7 % 감소시키고, 결정 성 셀룰로오스, 리그닌 함량 감소에 응답하여 증가하고, 헤미셀룰로오스는 그대로 남아 있었다. 분석은 탄소 흐름이 셀룰로오스 생합성에 리그닌 생합성에서 변환 된 경우가 있습니다 나타낼 수 있습니다. 이 문서의 RNAi 기술을 통해 옥수수의 리그닌 함량을 하향 조절하기 위해 사용되는 절차를 묘사하고 세포벽 조성은 세포벽 구조에 대한 변형의 효과를 검증하기 위해 사용 분석한다.

Introduction

목질 계 바이오 매스로부터 바이오 연료 생산으로 인해 미국 1 년에 현재 풍부하는 것이 매우 바람직하며, 농림업 잔기의 지속 수확의 경우, 식품 및 동물 사료의 생산에 사용되는 농경지에 직접 경쟁 할 수있는 능력. 그러나, 현재 미국에서 생성 된 바이오 연료의 주요 소스 옥수수 곡물, 달리, 리그 노 셀룰로오스 물질은 훨씬 더 복잡하고 어려운 무너 뜨리는 수 있습니다. 장쇄 탄수화물, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스, 리그 노 셀룰로오스 성 물질의 발효 중에 당류의 주 소스이며, 식물 세포벽의 많은 유형 또한 리그닌을 포함하고, 병원체의 공격에 대하여 강도, 방위를 제공 phenylpropanoid 중합체 및 소수성 외에 벽을 셀. 식물의 성장과 생존에 필요한 반면, 리그닌은 셀룰로오스 hemicellu의 성공적인 효소 전환에 상당한 장벽을 제공합니다수용성 당을 잃게됩니다. 높은 리그닌 함량을 가진 재료는 일반적으로 (생물학적 변환 경로를 통해) 생물 연료 및 가공 특성 및 제품의 품질에 부정적인 영향으로 인한 펄프와 종이 산업에 모두 덜 바람직한 물질이다. 따라서, 작물 구조 강도 및 방어 시스템을 방해하지 않는 수준에서 리그닌 감소를위한 식물 재료의 유전자 조작은 리그 노 셀룰로오스 바이오 연료와 펄프 및 제지 산업을 모두 생산 비용의 감소를 위해 중요 할 수 있습니다.

옥수수 (ZEA 메이)에서 리그닌 공유 ferulate 및 diferulate 다리를 통해 2 차 전지 벽에 헤미셀룰로오스에 대한 상호 연결되어 있습니다. 리그닌 헤미셀룰로오스 복잡한 이차 전지 벽에 무결성과 힘을 부여 복잡한 매트릭스를 형성, 수소 결합을 통해 셀룰로오스 미세 섬유에 결합한다. 식물 세포벽의 기계적 강도는 크게 리튬의 유형에 의해 결정된다gnin 3-5 소단위. 이전의 연구에서, 리그닌 서브 유닛의 비율을 변경하는 효소 소화 6-11에 뚜렷한 경향을 보이지 않고있다. 그러나, 리그닌 함량의 감소는 일반적으로 변환 (12, 13)의 향상을 보여 endocellulases, cellobiohydrolases 및 β-글루코시다 제 (14)를 포함하여 가수 분해 효소에 의해 식물 소재의 소화율을 증가시키는 열쇠가 될 수 있습니다.

전 사체의 발현 정도를 조절하는 유전 공학 광범위 작물 특성을 개선하기 위해 실시되었다. 안티센스 (15)과 공동 16 억제 기술 등 고급 기술은, 아래로 규제 대상 유전자의 효과적인 수 있습니다. 완전한 유전자 녹아웃은 머리핀 구조 (17) 인트론 접합 RNA를 암호화하는 유전자의 구조를 사용하여 달성되었습니다. 또한, 이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술, 강력하고 효과적인 유전자 발현 미디어대상으로 성적 저하 또는 번역 탄압 중 하나에 의해 작동 토르, 목표 mRNA의 18에 억제 효과의 넓은 범위를 유도하는 강력한 수단을 제공한다. 유전자 침묵 기술은 몇 가지 제한 사항을 보여줍니다. 이러한 기술은 정확하게 전사의 수준을 규제하지 않고는 다른 동종 유전자에 예기치 않은 침묵 효과를 일으킬 수 있습니다.

이 방법에서는, 우리는 dsRNAi은 옥수수 게놈에 생성 수행하는 입자 충격을 채택했다. 현재까지 식물 종의 광대 한 배열이 성공적으로 입자 충격, 아그로 박테 리움 매개 형질 전환, 일렉트로 및 미세 주입 방법을 사용하여 변형되었다. 그것은 가장 효율적이므로 옥수수 유전자 변형에서, 입자 충격 법은 모든 다른 방법에 비해 유리하다. 입자 충격 박테리아에 의존하지 않는, 그래서 방법은 유전자의 유전자, 종의 크기 또는 생물 제약은 무료입니다이긴, 또는 식물의 유전자형. 물리적 유전자 전달체는 높은 변환 효율이 19에서 엽록체로 식물 게놈에 및 경우에 따라 도입 될 고 분자량 DNA 복수 유전자를 가능하게한다. 잎 중앙 리브의 혈관계에서 리그닌 환원은 샘플의 지형 및 조성을 조사하기위한 유리한되는 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 가시화 될 수있다.

옥수수 식물, 신나-CoA 환원의 두가 (ZmCCR1 : X98083 및 ZmCCR2 : Y15069) 유전자는 옥수수 게놈 (20)에서 발견되었다. 신나 모일-CoA 환원은 신나 밀 알데히드로 hydroxycinnamoyl 아실-CoA 에스테르의 전환을 촉매한다. 유전자가 모든 lignifying 조직에서 발현되어 있기 때문에 우리는이 효소를 하향 조절하는 ZmCCR1 유전자를 선택했다. 시퀀스 것으로 나타났다 때문에 ZmCCR1 유전자의 3 '말단에 523 개의 뉴클레오티드는 dsRNAi가 구성을 위해 선택되었다ZmCCR2들에 비해보다 다양. 따라서, dsRNAi 구조는 정확하게 21를 입을 오프 대상 피하고 만 ZmCCR1에 바인딩합니다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 세포질 발현 시스템 ImpactVector1.1 태그로 설계 하였다 (1.1 IV) 녹색 조직 특이 적 프로모터를 함유하는, 리불 로스 -1,5 - 비스 포스페이트 카복실 시게나 (RuBisCO).

dsRNAi는 형질 전환 식물에서 생성의 효과를 연구하기 위해, 리그닌 함량을 정량 하였다. Klason (산 불용성) 리그닌 측정 리그닌 (22)의 일부를 용해 산성 세제 리그닌 정량 방법에 비해 더 정확한 것으로 알려져있다. 따라서 Klason 리그닌은 형질 전환 된 옥수수 줄기 측정 하였다. 이 절차는 수용성 단당류 (23) 내로 중합체 탄수화물 변환 두 단계의 산 가수 분해로 구성된다. 가수 매스이어서 산 가용성 및 불용성 분획으로 MATERIALS 및 산 불용성 리그닌은 이전 연구 23, 24에 따라 측정 하였다. 이상적으로, 리그닌 분석 전에 결과를 방해 할 수있는 가용성 물질을 제거하기 위해, 가수 분해 단계, 잔사에 존재하는 회분을 고려하여 리그닌 잔기의 후 가수 분해 연소에 물, 에탄올 추출을 포함해야한다. 이 단계없이, 시료의 리그닌 함량을 인위적으로 팽창 될 수있다. 전체 방법은 그러나 우리의 실험을 위해 우리가로 인해 테스트에 사용할 재료의 작은 볼륨으로 이러한 단계를 모두 수행 할 수 없습니다, 여기에 제시되어

다른 두 세포벽 성분, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 리그닌 하향 조절 된 유전자 변형 옥수수 라인 분석 하였다. 이보고되고있다 그 중 하나를 자신의 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) 25, 4-coumarate 아래로 조절 된 형질 전환 식물 : CoA를 리가 (4CL) 26, 또는 신나lcohol 탈수소 효소 (CAD)는 27 일 다른 세포 벽 구조 구성 요소의 증가를 보여줍니다. 우리의 연구에서 첫 단계로서, 결정질 셀룰로오스 Updegraff 방법 (28)을 사용하여 측정 하였다. 이 방법은 원래 cellulolytic 세균 및 곰팡이의 다수의 셀룰로오스의 결정을 위해 고안되었다. 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 xylosans을 제거하기 위해 간단히, 분쇄 옥수수의 주식은 Updegraff 시약 (물 : 질산 초산)으로 처리 하였다. 결정 셀룰로오스는 완전히 SO 4 H 2를 추가하여 Saeman 가수 분해를 통해 포도당으로 가수 분해시켰다. 결정 셀룰로오스는 다음 비색 트론 방법 29을 사용하여 측정 하였다. 헤미셀룰로오스의 내용이 변경된 경우를 확인하기 위해, 분쇄 된 수피로부터 단당류 추출물을 트리 플루오로 아세트산을 사용하여 가수 분해 알디 톨 아세테이트의 방법을 사용하여 유도체 화 한 후, 가스 크로마토 그래피 (GC) (30)에 의해 분석 하였다. 결정에 셀에 대한 자세한 절차lulose 내용과 매트릭스 다당류 성분의 분석은 포스터 등으로 설명되어 있습니다. (2010) 31.

여기, 우리는 리그닌에 사용되는 절차에 대해 설명 아래 규제의 RNAi 기술, 입자 충격의 변환 및 바이오 연료 발효 설탕에 옥수수 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 가속 해체를위한 리그닌 분석을 통해 옥수수에서.

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Protocol

1. ZmCCR1의 아래 규제에 사용 dsRNAi 구문의 준비

  1. dsRNAi 노크 아웃에 ZmCCR1 유전자를 구성하기 위해 필요한 제한 효소 사이트를 포함한 디자인 유전자 특이 적 프라이머. 두 개의 프라이머 세트는 ZmCCR1의 cDNA의 두 조각 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다 :. 1271 뉴클레오티드 748에서 523 bp의 단편, 그리고 1271 뉴클레오티드 986에서 285 bp의 단편 ZmCCR1의 cDNA는 애리조나 게놈 연구소 (AGI)에서 제공되었다. 더 자세한 내용은 그림 1에 설명되어 있습니다.
  2. ZmCCR1_748F_BglII 프라이머 (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ')와 ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3')를 사용하여 cDNA를 ZmCCR1 템플릿으로부터 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 큰 단편을 증폭한다. ZmCCR1_986F_BglII 프라이머 (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ')와 ZmCCR1_1271R_SacI (5R을 이용하여 더 작은 프래그먼트 (285 BP)를 증폭17]-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ').
  3. 개별 제조업체의 지침에 따라을 pGEM-T 쉬운에 조각을 결찰.
  4. 각각 포함, 개별 형질 전환 체로부터 미니 준비 플라스미드 DNA 분리를 수행을 pGEM-T 상용 미니 준비 플라스미드 키트를 사용하여 구성합니다.
  5. 다이제스트에 BglII과를 NcoI 모두와을 pGEM-T :: ZmCCR1 (523 BP)과 ImpactVector (IV) -1.1 (세포질 발현 벡터).
  6. IV-1.1 정제 소화 젤로 큰 소화 겔 정제 ZmCCR1 조각 (523 BP)을 결찰.
  7. IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 BP)에 작은 조각을 삽입하기 위해 BglII에와 SacI에 모두을 pGEM-T :: ZmCCR1 (285 BP)와 IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 BP)를 소화.
  8. IV-1.1 정제 소화 겔 :: ZmCCR1 (523 BP)에 작은 소화 겔 정제 ZmCCR1 조각 (285 BP)을 결찰.
  9. 523 BP 285 BP의 fragmen 모두 복제거꾸로 반복 조각의 중간에 238 bp의 스페이서 (그림 1 참조)와 285 bp의 역 반복 서열을 가지는 ZmCCR1의 RNAi가 구성 할 수있는 IV-1.1에 TS.
  10. 대장균 (대장균)에 구축 이동, 그들을 성장과 옥수수 유전자 변형에 대한 충분한 플라스미드 DNA를 얻기 위해 미디 준비 크기의 플라스미드 DNA 분리를 수행합니다.

2. 유전자 변형 옥수수

  1. 텅스텐 입자의 제조
    1. 1.5 ML 튜브에 텅스텐 구슬 60 밀리그램 (M10)을 넣고 2 분 동안 소용돌이로 교반하여 70 % 에탄올 1 ㎖로 씻는다. 23 ° C에서 10 분 동안 배양 한 다음 2 분 동안 18,894 XG에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다.
    2. 2 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 버리고, 1 ㎖ 100 % 에탄올로 3 회 씻는다. 60 ㎎ / ㎖로 미세 입자의 농도를 가지고 멸균 50 % 글리세롤의 1 ML을 추가합니다.
  2. 사격에 대한 DNA의 준비
    1. 경기 수1.5 ML 튜브에 50 % 글리세롤 제조 텅스텐 구슬의 50 μL (3 mg)을 에이스. IV-1.1의 5 μL (1 μg) :: ZmCCR1 RNAi의 플라스미드 DNA, 2.5 M 염화칼슘의 50 μL, 0.1 M 스퍼 미딘의 20 μl를 추가합니다. 간단히 위의 시약의 각 추가 사이의 소용돌이.
    2. 소용돌이 30 초 동안 18,894 XG에 텅스텐 비드 DNA 혼합물 간단히 원심 분리기. 뜨는을 붓고, 70 % 에탄올 140 μL에 펠렛을 재현 탁. 액체를 제거하고 폐기. 100 % 에탄올 140 μl를 추가합니다. 액체를 제거하고 폐기.
    3. 100 % 에탄올 48 μl를 추가합니다. 이전의 폭격에 최대 4 시간 동안 즉시 사용하거나 얼음에 저장합니다.
  3. 충격
    1. 32 (osmotium로) 적어도 4 시간 전에 폭격에 N6OSM 미디어를 포함하는 100mm 배양 접시의 중간에 (아이오와 주립 대학의 옥수수 변환 센터에서 제공) 3-5 cm 직경 안녕-II 배 발생 옥수수 캘러스를 놓습니다.
    2. Prepar제조업체의 지침 33에 따라 전자 PSD-1000/He 입자 전달 장치.
    3. 70 % 에탄올로 챔버 벽을 살균. 멸균 고정 캡으로 멸균 650 PSI 파열 디스크를 넣습니다. 마크로 캐리어, 건조 잠깐의 표면에 M10-DNA 솔루션 5-6 μl를 확산. 로드 마크로 캐리어 및 마이크로 캐리어 발사 어셈블리로 화면을 중지.
    4. 정지 화면 (L2 = 6 CM) 및 가까운 문에서 선택한 거리에서 챔버에서 마이크로 캐리어 발사 조립 및 옥수수 캘러스를 놓습니다. 와이어 메쉬 스크린에 대해 27 PSI의 진공 가속화.
    5. 파열판 버스트 및 헬륨 압력 게이지가 제로로 떨어질 때까지 화재 버튼을 누릅니다. 발사 버튼을 놓습니다.
    6. 27 ° C에서 어둠 속에서 16 시간 동안 N6OSM (삼투 배지) (32)를 포함하는 페트리 접시에 포격 캘러스를 품어 약 10 조각으로 캘러스를 중단하고 N6E (캘러스 유도 배지)에 배양 접시에 32을 전송하고 5 일 동안 배양 난N 27 ° C에서 어둠.
  4. 선택
    1. N6E 5 일 후, N6S 매체 (선택 미디어) 32에 캘러스를 전송합니다. 서브 컬쳐 선택 매체의 모든 캘러스 캘러스 구조를 방해하지 않고 8~12주마다 30 일.
    2. 8 ~ 10 주 후, 흰색 빠르게 성장하는 부문은 비 증식 부분적으로 괴사 어머니 캘러스 밖으로 성장할 것입니다. 흰색 빠르게 성장하는 조직을 절제하고 신선한 선택 배지 (N6S) (32)을 배양하고 위의 배양을 계속합니다.
  5. 재건
    1. 재생 매체 (32)에 흰색과 빠르게 성장하는 배아 캘러스를 전송하고 1 주 동안 위와 같이 품어. 25 ~ 27 ° C에서 16 시간의 일광과 8 시간의 어둠의 기간에 재생 배 발생 캘러스 스위치
    2. 회생이 응원에 3-4주 후 유리 테스트 튜브 매체 (32)를 촬영 전송, 상기와 같이 배양을 계속합니다. 상당한 연구 후OOT 개발은 토양 4 "화분에 묘목을 이식 한 후, 물 꼭지에서주의 깊게 뿌리를 씻어 나타납니다. 촉촉하게 유지하기 위해 플라스틱 가방과 함께 냄비를 커버. 이일은 작은 구멍 비닐 봉투를 한 후. 5-6일 후 비닐 봉투를 제거합니다. 다른 5~6일 위와 같이 배양을 계속합니다.
  6. 온실
    1. 토양 18 "화분에 모종을 전송하고 전체 여름 햇빛 또는 온실 빛을 유지한다. 첫 번째 씨앗은 T 1 세대에 속하는 반면, 초기 재생 식물은 T 0이라고합니다.

3. 조직 학적 분석

    1. 10 % 중성 포르말린 5 ㎖에 옥수수 잎 중순 갈비뼈를 고정합니다.
    2. 공정 및 진공 티슈 프로세서를 사용하여 티슈 프로세서 파라핀으로 침투.
    3. HistoCentre III 임베딩 스테이션을 사용하여 파라핀의 조직을 포함합니다.
    4. 가장자리에서 초과 파라핀을 제거 한 번 블록KS는 냉각된다.
    5. 마이크로톰을 사용하여 마이크로톰 4-5 μm의 섹션에 샘플.
    6. 현미경 슬라이드 및 2-24 시간 동안 56 ° C 배양기에서 건조에 섹션을 배치합니다. 확인 섹션은 완전히 슬라이드에 부착되어 있습니다.
    7. 23 ℃에서 5 분 동안 크실렌의 두 가지 사항에 Deparaffinize 섹션
    8. 수화물은 2 분 동안 100 % 에탄올 두 가지 변경, 23 ℃에서 2 분 95 % 에탄올의 두 가지 변경을 통해 슬라이드
    9. 2 분 동안 흐르는 수돗물에 섹션을 씻어.
    10. 1 ~ 2 분 동안 0.05 % 톨루이딘 블루 O와 얼룩 DDH 2 O로 간단히 씻어
    11. 광학 현미경과 침수 오일 및 시각화 샘플을 커버 슬립을 놓습니다.
  1. 주사 전자 현미경 (SEM)
    1. 4 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)의 횡단 옥수수 잎 중순 갈비뼈를 수정하고 1 ~ 2 시간 동안 4 ° C에서 0.1 M 인산 나트륨 완충액 (pH 7.4).
    2. 간단히 버퍼의 샘플을 씻어, 그들에 탈수10 분, 3X 각 계조하고 100 % 에탄올에서 15 분 동안 에탄올 시리즈 (25 %, 50 %, 75 %, 95 %).
    3. 과도 유체로서 액체 이산화탄소를 사용 임계점 건조기에서 탈수 횡단 옥수수 잎 중앙 리브 말린다.
    4. 높은 진공 탄소 탭을 사용하여 알루미늄 스텁에 건조 된 샘플을 탑재
    5. 코트 옥수수 잎 중간 갈비 아르곤 가스로 치환 스퍼터 코팅기에 금 (약 20 nm의 두께)와 알루미늄 스텁에 장착.
    6. JEOL JSM-6400V (란탄 hexaboride 전자 에미 터) 주사 전자 현미경에 코팅 된 샘플을 검사합니다.
    7. 디지털 이미지는 분석 프로 소프트웨어 (버전 3.2)을 사용하여 묘사 하였다.

4. Klason 리그닌 측정

  1. 2 ㎜의 스크린 공장은 샘플.
  2. 각 샘플의 수분 함량을 결정하고 값을 기록하는 수분 분석기를 사용한다.
  3. ~ 각 샘플 1.5 g을 칭량하고 중량을 기록한다. Extract 자동화 된 용매 추출 (추출 당 3 회 ~ 사이클 당 14 분) 또는 속실 렛 장치 (추출 당 8 시간)을 사용하여 두 번째 추출 에탄올 다음에 제 1 추출, 물을 사용하여 샘​​플. (참고 :이 단계는 명백한 Klason 리그닌 함량이 증가, 산 가수 분해 동안 응축하고 정확한 리그닌 측정을 방해 할 수있는 추출액을 제거합니다.)
  4. 밤새 45 ° C에서 추출 된 샘플을 건조하고이를 데시 케이 터, 다시 무게를 할 수 있습니다.
  5. 30 ° C.에 인큐베이터를 설정 (샘플 당 삼중 권장) 나사 정상 고압 튜브에 각각 건조, 추출 된 샘플 0.3 g을 측정하고 가장 가까운 0.1 mg의 무게를 기록한다. 각 압력 튜브에 72 % H 2 SO 4 3 ㎖를 추가합니다.
  6. 유리 또는 테플론 교반 막대를 사용하여 샘​​플을 섞는다. 물이 배양 한 다음 추가 될 때까지 튜브에 교반 막대를 둡니다.
  7. 인큐베이터에 튜브를 놓고 그 자체30 ° C에서 60 분 동안 150 rpm의 t. 1 시간 후 4 %로 산 농도를 희석 교반로드와 혼합 탈 이온수 84 ㎖를 추가합니다. 물 라인 위의 유리 병의 측면에 샘플의 많은 양이 남지 않도록주의하십시오.
  8. 단단히 모든 병의 마개를 밀봉 금속 랙 또는 큰 비커에 배치합니다. 1 시간 동안 액체 살균주기를 사용하여 121 ° C에서 압력솥. 그들을 열기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
  9. 최소 4 시간 동안 575 ° C에서 가열로에서 필터링 도가니를 미리 재가. 도가니는 한 시간 이상 건조기를에 냉각 할 수 있습니다.
  10. 진공 도가니 확보 고무 어댑터를 이용하여, 별도의 도가니를 통해 각각의 튜브로부터 용액을 고를. 튜브에 남아있는 입자를 씻어 탈 이온수를 사용합니다.
  11. 4 시간의 최소 105 ° C에서 리그닌 잔류 물을 건조. 건조 도가니 잔류의 무게를 기록한다.
  12. 575 ° C를 사용하는 경우, 사전에- 화재 분젠 버너에 샘플이 더 연기 나 재가없는 한 후 24 시간 동안 가열로에 배치, 또는 프로그램 노를 사용하는 경우, - 재를 미리 다음과 같은 프로그램을 사용하지 않는 때까지 :
  13. 105 ° C 상온에서 진입로와 12 분 동안 누르고 있습니다.
  14. 10 ° C / 분에서 250 ° C의 램프와 30 분 동안 누르고 있습니다.
  15. 20 ° C / 분에서 575 ° C의 램프 적어도 180 분 동안 누르고 있습니다.
  16. 로에서 도가니를 제거하고 데시 케이 터. 도가니 재 무게.
  17. 다음 식을 이용하여 산 불용성 잔사를 계산

식 (1)

사전 추출 된 바이오 매스의 M PRE = 질량
후 추출 된 바이오 매스의 M POST = 질량
추출 된 바이오 매스의 M 유리 병 = 질량은 유리 병에 추가
도가니와 리그닌 잔 유의 M 잔류 = 질량UE
도가니와 화산재의 M ASH는 = 질량
사전 추출 된 바이오 매스, 총 중량을 기준으로 전체의 MC = 수분 함량

5. 탄수화물 분석

  1. 세포벽 탄수화물 포스터 등을 기준으로 분석한다. (2010) 프로토콜 31을 수행합니다. 간단히, 동결 건조 식물 재료에서 알코올 불용성 잔류 물을 준비합니다. 그런 다음 트리 플루오로 아세트산과 물질을 가수 분해 및 해당 알디 톨 아세테이트에 용해 된 단당류 유도체와 일치합니다. 중극 질량 분석계에 연결된 가스 크로마토 그래피 (GC)에 의해이 휘발성 유도체를 분석.

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Representative Results

우리는 RNAi를 통해 옥수수 식물의 리그닌 함량 감소를 보여 주었다. 입자 충격의 변환 방법은 약 30 % trnasformation 효율을 얻었다. ZmCCR1의 유전자 침묵 일관 T0-T2 세대에서 관찰되었다. 리그닌 감소 된 형질 전환 체는 잎 중간 리브, 껍질, 줄기에 갈색 채색을 표시 제외 야생형 옥수수 식물과 유사하게 성장했다. 조직 학적 분석은 돌연변이 라인 옥수수 잎 중앙 리브 (18)의 후벽 섬유의 셀 벽 두께의 상당한 감소를 나타내고 있음을 보여 주었다. 셀 벽 두께의 감소에도 불구하고, 통 용기, 체관부 및 외피 세포를 포함한 다른 주요 혈관 시스템의 구조는 야생형 제어 (도 2A) (18)와 비교하여 차이점을 공개하지 않았다. 이것은 나에게 줄기에 물 수송, 영양 전송, 또는 기계적 강도 중 하나에 대한 해로운 영향이없는 것을 의미한다N ZmCCR1_RNAi 돌연변이 라인.

리그닌 함량이 Klason의 lingin 측정을 사용하여 정량 하였다. 그림 3 야생형 옥수수와 ZmCCR1_RNAi 유전자 변형 라인 (T1)에있는 산 불용성 Klason 리그닌 (g / kg 콘 여물)의 양을 보여줍니다. 세 개의 형질 전환 라인 (1C -4, -5 및 -6) 야생형 옥수수 식물 (18)에 비해 (각각 8.1 %, 7.0 % 및 8.7 %) 통계적 리그닌 감소를 보였다. 탄소 흐름이 벽 탄수화물 생합성 경로를 셀에 리그닌 생합성 경로에서 이동되었는지 여부를 확인하려면, 셀룰로오스 Updegraff 방법을 통해 분석 하였다. 그림 3a는ZmCCR1_RNAi 돌연변이 라인 (1B-6 1C-6) 결정의 크게 증가 수준을 포함 것을 보여줍니다 셀룰로오스 (1.5과 1.8는 각각 배) 18. 헤미셀룰로오스 함량도 분석 하였다.도 4b는 네 가지 주요 헤미셀룰로오스 성분 (의 양을 나타낸다arabionose, 크 실로 오스, 갈락토오스, 포도당). 네 탄수화물 그룹 중 어느 것도 돌연변이 라인 (18)의 변경 사항을 공개하지 않습니다.

그림 1
그림 1 ZmCCR1 PRbcS1의 아래쪽 규제 dsRNAi 플라스미드 구조에 대한 전략을 복제 :.. 국화하여 국산 마트에서 리불 로스 비스 포스페이트 카르 복실 프로모터. T-RbcS1 : Asteraceous 국화에서 리불 로스 비스 포스페이트 카르 복실 작은 단위 터미네이터. 이 그림은 공원 외 여러분 (2012) 18에서 수정되었습니다.

그림 2
그림 2. 표현형이 야생형 옥수수의 분석 (하이-II) 및 ZmCCR1_RNAi돌연변이 잎의 주맥. A) 브라운 색채가, ZmCCR1 아래 규제 옥수수 나뭇잎에 줄기와 옥수수 껍질. B) 된 야생 형 HI-II (왼쪽)와 ZmCCR1_RNAi 돌연변이 라인 (오른쪽)의 횡단 옥수수 잎 midribs은 0.05 %로 염색했다 보조 통 조직을 시각화하는 1 분 톨루이딘 블루 O. 적색 화살촉 잎 주맥의 후벽 섬유의 세포벽을 나타낸다. (C) ZmCCR1의 주사 전자 현미경 (SEM) 하향 조절 야생형 비 형질 전환 제어 식물 (좌측)의 그것과 비교하여 형질 전환 옥수수 잎 중륵 (오른쪽). 빨간색 화살표는 후벽 섬유를 나타냅니다. 이 그림은 공원 등에서 수정되었습니다. (2012) 18.

그림 3
그림 3. Klason 리그닌 측정 (ACI야생 형 HI-II 및 ZmCCR1_RNAi 돌연변이의 D-불용성 리그닌 내용). 세 돌연변이 라인 1C-5, 1C, 및 건조 물질의 퍼센트는 야생형 대조군 식물과 비교하여 1C-6은 각각 통계적 저급 리그닌 함량, 8.5 %, 7.5 % 및 9.2 %였다. 평균 ± 표준 편차 (P <0.05, N = 3). 이 그림은 공원 등에서 수정되었습니다. (2012) 18.

그림 4
그림 4. 세포벽 조성 3). B) 헤미셀룰로오스 야생형 옥수수와 ZmCCR_RNAi 유전자 변형 옥수수 라인 (T1)의 성분 분석을 통해. ZmCCR1_RNAi 라인 (Tukey의 쌍 비교, * P <0.05) 결정 셀룰로오스 분석을 분석, N = 기체 크로마토 그래피 (GC). 크로마토 그램에서 주 피크 했다니전자는 통합 유지 시간 및 조각 이온의 서명을 기반으로 확인하고, 몰 백분율로 표시 (P> 0.05, N = 3) (Tukey의 쌍 비교, P> 0.05, N = 3). 이 그림은 공원 등에서 다시 사용하고있다. (2012) 18.

그림 5
그림 5 %의 설탕 치료 (UT) 및 암모니아의 농도별로 AFEX TM-전처리 (90 ° C, 5 분) 옥수수 여물에 대한 (글루칸과 크 실란) 전환 (1.0. 1.0 g NH 3 : g 건조 바이오 매스 1.5 : 1.5 G NH 3. G 건조 바이오 매스) 오류 막대는 평균의 표준 편차를 나타내고 처리되지 않은 샘플 및 전처리 샘플에 대한 네 개의 반복 (두 전처리 각 복제 두 가수 분해와 복제)에 대한 두 개의 반복을 기반으로합니다. 전처리 설탕 변환다른 문자로 표시 (24 시간 또는 72 시간)을 (P <0.05) Tukey의 쌍 비교에 따라 통계적으로 다르​​다. 이 그림은 공원 등에서 다시 사용하고있다. (2012) 18.

<TD> 0.69 g / L 프롤린
미디어 화학 성분
N6OSM 4g / L N6 염
(삼투 중) 1 ㎖ / L의 N6 비타민 주식
2 ㎎ / L 2,4-D
100 ㎎ / L의 미오 이노시톨
0.69 g / L 프롤린
30g / L의 자당
100 ㎎ / L 카제인 가수 분해물
36.4 g / L의 소르비톨
36.4 g / L의 만니톨
2.5 g / L의 겔 라이트, pH를 5.8
고압 증기 멸균 후 필터 살균 질산은 (25 μM)를 추가
N6E 4g / L N6 염
(캘러스 유도) 1 ㎖ / L (1,000 배) N6 비타민 주식
2 ㎎ / L 2,4-D
100 ㎎ / L의 미오 이노시톨
2.76 g / L 프롤린
30g / L의 자당
100 ㎎ / L 카제인 가수 분해물
2.5 g / L의 겔 라이트, pH를 5.8
고압 증기 멸균 후 필터 살균 질산은 (25 μM)를 추가
N6S 미디어 4g / L N6 염
(선택 미디어) 1 ㎖ / L의 N6 비타민 주식
2 ㎎ / L 2,4-D
100 ㎎ / L의 미오 이노시톨
30g / L의 자당
100 ㎎ / L 카제인 가수 분해물
36.4 g / L의 소르비톨
36.4 g / L의 만니톨
2.5 g / L의 겔 라이트, pH를 5.8
고압 증기 멸균 후 필터 살균 질산은 (25 μM)를 추가
재생 매체 4.3 g / L MS 염
1 ㎖ / L (1000 배) MS 비타민 주식
100 ㎎ / L의 미오 이노시톨
60g / L의 자당
3g / L의 겔 라이트, pH가 5.8 (100 X 25mm 페트리 접시)
필터 소독 비 알라 포스 (3 ㎎ / L)를 추가 고압 증기 멸균 후 추가
매체를 응원 4.3 g / L MS 염
100 ㎎ / L의 미오 이노시톨
30g / L의 자당
3g / L의 겔 라이트, pH가 5.8 (100 X 25mm 페트리 접시)
10 % 중성 포르말린 포르말린 100 ㎖
(1리터) DDH 2 O 900 ml의
4.0 인산이 수소 나트륨, 수화물 (의 NaH 2 PO 4 · H 2 O)의 g

특정 시약의 표 1. 표.

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Discussion

세포벽 다당류를 심는 미생물 셀룰라아제의 액세스는이 페놀 폴리머 (23)와 연결되어있는 정도에 크게 의존한다. 설탕을 발효 될 수있는 목질 계 바이오 매스 변환 속도에 부정적인 식물 secondadry 세포벽에 입금 리그닌 함량과 상관 관계가있다. 이 상관 관계는 그러한 소수성 (24), 화학 등의 이질성 리그닌의 물성에 기인 한 정규 가수 분해성 intermonomeric의 부재 (25)를 결합하고있다.

본 연구에서는 dsRNAi 기술은 유전자 표적에 유전자 아래로 규제의 다양한 수준을 유도. 구성 ZmCCR1_RNAi에 의해 매개 리그닌 다운 규제는 T1의 transgneic 라인의 갈색 착색 귀착되었다. 브라운 주맥 (BM) 색채가 감소 리그닌 함량과 리그닌 성분에 의해 발생되는 자연적으로 발생하는 현상이다. 다른 자연 occurr 달리만 잎 중반 갈비뼈에 갈색 착색을 보여 에드 BM 돌연변이는 ZmCCR1_RNAi 돌연변이 라인은 줄기와 껍질을 포함하여 식물의 다른 부분에있는 표현형을 공개했다. 조직 학적 분석은 또한 ZmCCR1 하향 조절 잎의 후벽 셀 벽 두께가 야생형 대조군 식물 (도 2a)의 것보다 훨씬 적은 것을 나타냈다. 그러나 통 용기, 사부, 또는 칼집 세포를 inclduing 주요 혈관 시스템의 sturucture 세포 벽 두께는 변경되지 않았습니다. 이 식물의 높이의 관점에서 일반적으로 성장하고 줄기 직경 ZmCCR1_RNAi 유전자 변형 라인의 정상적인 성장을 설명 할 수있다.

리그닌 함량의 20 % 이상의 감소는 일반적으로 바이오 매스의 손실을 야기하고 미생물 병원균 및 해충 27,28 대 식물이 더 취약했다. 그러나, 돌연변이 라인은 10 %의 리그닌 reducti 미만을 발현 본 연구에서 생산에, 식물 바이오 매스 및 비 생물 적 및 생물 적 스트레스에 대한 방어 메커니즘을 손상하지 않았다.

이전 연구는 상당히 감소 CCR 식 트랜스 제닉 담배 라인은 또한 글루코스, 자일 로스 및 벽 바인딩 된 페놀 화합물 (예 sinapic 및 페룰 산) 등의 세포벽 성분의 증가를 보인 것으로 나타났다. 본 연구에서는 가벼운 리그닌 감소는 ZmCCR1 아래 규제 옥수수 식물의 일부 결정 셀룰로오스의 수준을 증가 시켰습니다. 반대로, 셀룰로오스 보정기구는 또한 셀룰로오스 합성 유전자가 35 불완전 때 자궁외 lignification 출품 애기 돌연변이에서 관찰되었다. 한 세포벽 탄수화물 성분의 양적 또는 질적 변화는 다른 구성 요소 (36)의 교대를 유도한다. 이러한 보상 mechansims 식물의 혈관 시스템의 항상성을 maintan하는 것이 중요합니다. 그러나,이 연구에서, hemicelluloSES는 통계적으로 ZmCCR1 아래로 조절 돌연변이 라인에 큰 변화를 보이지 않았다. 관찰 된 리그닌 감소가 추가 헤미 셀룰로스 합성을 유발하기에 충분하지 않았기 때문에 결과가 될 수있다.

리그닌과 증가 결정 셀룰로오스 수준의 감소 수준은 바이오 연료 생산을위한 이중으로 도움이 될 것입니다. 하부 리그닌 함량은 처리 중에 적은 입력 (예, H 2 SO 4, 셀룰라아제, 등)를 요구하고, 바이오 매스 변환 프로세스를 용이하게한다. 여분의 셀룰로오스는 발효 설탕의 수율을 증가시킬 수있다. 이 연구에서 설명 ZmCCR1의 유전자 조작은 lignocelluosic bimoass 유래 바이오 에탄올보다 상업적으로 경쟁력을 활용할 수 있도록 구현 될 수있다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

현미경 이미지는 고급 현미경의 미시간 주립 대학 센터의 서비스를 통해 실시되었다. 옥수수 캘러스 아이오와 주립 대학의 옥수수 변환 센터에서 구입했다. 저자는 탄수화물 분석에 대한 기술적 인 지원을 MSU 식물 연구소의 제프리 R. 웨더에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 관대 미시간의 옥수수 마케팅 프로그램 (CMPM) 및 식물 생명 공학 연구를위한 컨소시엄 (CPBR)에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N6OSM (Osmotic medium) Made in-house
N6E (Callus induction) Made in-house
N6S media (Selection media) Made in-house
Regeneration medium Made in-house
Rooting medium Made in-house
10% Neutral buffered formalin (1 L) Made in-house
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device Hercules, CA, United States
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Jena, Germany For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software.
Excelsior ES Tissue Processor Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
HistoCentre III Embedding Station Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
Microtome Model Reichert 2030 Reichert, Depew, NY, United States
Emscope Sputter Coater model SC 500 Ashford, Kent, England
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope JEOL Ltd., Tokyo, Japan
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States
Screw-top high pressure tubes Ace Glass, Vineland, NJ #8648-27
Screw-top high pressure tube plugs Ace Glass, Vineland, NJ #5845-47

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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