Lignine Neerregeling van
1The School of Plant Sciences, University of Arizona, 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University, 3The Institute for Sustainable and Renewable Resources, The Institute for Advanced Learning and Research, 4Department of Plant, Soil and Microbial Sciences, Michigan State University

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek wordt toegepast om down-reguleren van de maïs cinnamoyl co-enzym A-reductase (ZmCCR1) gen tot lagere planten ligninegehalte. Lignine down-regulatie van de celwand wordt gevisualiseerd door microscopische analyses en gekwantificeerd door de Klason methode. Compositionele veranderingen in hemicellulose en cellulose geanalyseerd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Park, S. H., Ong, R. G., Mei, C., Sticklen, M. Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51340, doi:10.3791/51340 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Om het gebruik van lignocellulosische biomassa als alternatief bio bron tijdens biologische omzettingsprocessen vergemakkelijken, is een voorbehandeling noodzakelijk het openstellen van de structuur van de celwand van planten, waardoor de toegankelijkheid van de celwand koolhydraten. Lignine, een polyfenolische materiaal in vele soorten celwand, staat bekend als een belangrijke belemmering voor toegang enzym. Vermindering van lignine-gehalte tot een niveau dat niet interfereert met de structurele integriteit en het afweersysteem van de plant kan een waardevolle stap om de kosten van de bio-ethanol productie te verminderen. In deze studie hebben we genetisch neerwaarts gereguleerd een van de lignine biosynthese-genen, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via een dubbelstrengs RNA interferentie techniek. De ZmCCR1_RNAi construct is geïntegreerd in het genoom van maïs met de deeltjesbeschieting methode. Transgene maïsplanten groeiden normaal ten opzichte van het wildtype controleplanten zonder interfering met biomassa groei of afweermechanismen, met uitzondering van het tonen van bruin-kleuring in transgene planten blad mid-ribs, schillen en stengels. De microscopische analyse, samen met de histologische analyse onthulde dat het blad sclerenchym vezels werden verdund maar de structuur en de grootte van andere vasculaire systeemcomponenten niet veranderd. Het lignine-gehalte in de transgene maïs verminderd met 7-8,7%, werd de kristallijne cellulose gehalte stijgen na reductie lignine en hemicellulose onveranderd. De analyses kunnen aangeven dat koolstof stroom zou kunnen zijn verschoven van ligninebiosynthese biosynthese van cellulose. Dit artikel schetst de procedures voor neerwaarts reguleren van de lignine in maïs via RNAi technologie en de celwand samenstelling analyses gebruikt om het effect van de wijzigingen aan de celwandstructuur verifiëren.

Introduction

De productie van biobrandstoffen uit lignocellulose biomassa is zeer wenselijk vanwege de overvloed aanwezig in de VS 1 en bij de duurzame oogst van landbouw en bosbouw residuen, het vermogen niet direct concurreren akkerland gebruikt voor voedsel en dierlijke distributienet. In tegenstelling tot maïs, die de belangrijkste bron van biobrandstoffen thans gerealiseerd in de VS, lignocellulose materialen aanzienlijk complexer en moeilijker af te breken. Naast de lange-keten koolhydraten, cellulose en hemicellulose, die de belangrijkste bronnen van suikers tijdens fermentatie van lignocellulose materialen, allerlei soorten planten celwanden ook lignine bevatten, een fenylpropanoïde polymeer die kracht, verdediging tegen pathogene aanval verschaft en hydrofobiciteit aan muren cel. Weliswaar noodzakelijk is voor de groei van planten en overleving, lignine presenteert ook een belangrijke belemmering voor de succesvolle enzymatische omzetting van de cellulose en hemicelluverliezen aan oplosbare suikers. Materialen met een hoog gehalte lignine zijn over het algemeen minder wenselijk materialen voor zowel de biobrandstof (via biologische omzetting pathways) en de pulp-en papierindustrie als gevolg van de negatieve gevolgen voor de verwerking van eigenschappen en kwaliteit van het product. Daarom zou genetische manipulatie van plantaardige materialen voor lignine reductie op een niveau dat niet interfereert met het gewas structurele sterkte en defensie systemen zijn belangrijk voor de verlaging van de productiekosten voor zowel de lignocellulose biobrandstof en de pulp-en papierindustrie.

In maïs (Zea mays), lignine covalent verknoopt hemicellulose in de primaire celwand via ferulate en diferulate bruggen 2. Het lignine-hemicellulose complex bindt cellulose microfibrillen via waterstofbruggen vormen een complexe matrix die integriteit en sterkte verleent aan de secundaire celwand. De mechanische sterkte van plantenbiomassa wordt grotendeels bepaald door het type lignin subeenheden 3-5. In eerdere studies, het veranderen van de verhoudingen van lignine subeenheden heeft aangetoond dat er geen duidelijke trend op enzymatische verteerbaarheid 6-11. Echter, vermindering van de lignine-gehalte tonen over het algemeen een verbetering van conversies 12,13 en kan een sleutel tot het verhogen van de verteerbaarheid van plantmateriaal door hydrolytische enzymen waaronder endocellulases, cellobiohydrolasen, en β-glucosidase 14 zijn.

Genetische manipulatie om de expressie van afschriften te reguleren is uitgebreid geoefend om gewaseigenschappen verbeteren. Geavanceerde technieken, waaronder anti-sense 15 en cosuppressie 16 technologieën, in staat effectief down-regulatie van target genen. Volledige gen knock-out is ook vooruitgang geboekt met behulp van gen-constructen die coderen voor-intron splicing RNA met een haarspeldstructuur 17. Bovendien is een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek, dat wil zeggen een krachtige en effectieve genexpressie mediator die werkt door een gericht transcript afbraak of translatierepressie, verschaft een krachtig middel om uiteenlopende-onderdrukking op het doel mRNA 18 induceren. Gene silencing technieken tonen een aantal beperkingen. Deze technieken niet precies regelen het niveau van transcriptie en het kan onverwachte silencing effect van andere homologe genen veroorzaken.

In deze methode gebruikten we met deeltjes dragen de dsRNAi constructen in het maïsgenoom. Tot op heden, een breed scala aan plantensoorten zijn met succes getransformeerd met behulp deeltjesbombardement, Agrobacterium, elektroporatie, micro-injectie en methoden. In maïs genetische transformatie, de met deeltjes werkwijze is voordelig boven alle andere methoden, omdat het het meest efficiënt. Met deeltjes is niet afhankelijk van bacteriën en dus de werkwijze vrij van biologische beperkingen zoals de grootte van het gen, soort gen ofigin, of de plant genotype. De fysieke transgen levering systeem maakt een hoog moleculair gewicht DNA en meerdere genen in plantengenomen en in bepaalde gevallen moeten worden ingebracht in chloroplasten bij hoge transformatie-efficiëntie 19. De lignine vermindering van het vasculaire systeem van het blad midden rib kan worden gevisualiseerd via scanning elektronen microscopie (SEM) die gunstig is voor de behandeling van de topografie en de samenstelling van de monsters.

In maïsplanten, twee cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1: X98083 en ZmCCR2: Y15069) genen werden gevonden in het maïsgenoom 20. Cinnamoyl-CoA reductase katalyseert de omzetting van de hydroxycinnamoyl-CoA-esters in cinnamyl aldehyden. Wij kozen de ZmCCR1 gen neerwaarts reguleren dit enzym omdat het gen tot expressie wordt gebracht in alle weefsels lignifying. Het 523 nucleotiden aan het 3 'uiteinde van de ZmCCR1 gen werden gekozen voor een dsRNAi construct omdat de sequenties bleekmeer divers in vergelijking met die van ZmCCR2. Zo zou de dsRNAi construct juist alleen ZmCCR1 binden, het vermijden van off-target tot zwijgen 21. Een ZmCCR1_RNAi construct werd ontworpen in de cytoplasmatische expressie systeem ImpactVector1.1-tag (IV 1.1) met de groene weefsel specifieke promotor, ribulose-1, 5-bisfosfaatcarboxylase oxygenase (RuBisCO).

Om de effecten van de dsRNAi construeren van transgene planten te bestuderen, werd de ligninegehalte gekwantificeerd. De Klason (zuur onoplosbaar) lignine meting bekend nauwkeuriger in vergelijking met het zuur reinigingsmiddel lignine kwantificering die enkele van de lignine oplosbaar 22. Daarom werd de Klason lignine gemeten in transgene maïs stengels. Deze procedure bestaat uit twee stappen zure hydrolyse dat polymere koolhydraten omgezet in oplosbare monosacchariden 23. De gehydrolyseerde biomassa werd vervolgens gefractioneerd in zuur oplosbare en onoplosbare materialenALS en het zuur onoplosbare lignine werd gemeten volgens eerdere studies 23,24. Idealiter lignine analyse omvatten extracties met water en ethanol voordat de hydrolysestap, om oplosbare materialen die kunnen interfereren met de resultaten verwijderen en een post-hydrolyse verbranding van de lignine residu om eventuele as aanwezig in het residu. Zonder deze maatregelen zou de lignine van het monster kunstmatig worden opgeblazen. De volledige werkwijze wordt hier voorgesteld, maar voor onze experimenten konden wij beide stappen uitvoeren vanwege de kleine hoeveelheid materiaal voor het testen

Twee andere celwandcomponenten, cellulose en hemicellulose werden ook geanalyseerd in de lignine down-gereguleerde transgene maïs lijnen. Er is beschreven dat transgene planten die zijn down-gereguleerd in zowel de fenylalanine ammonia-lyase (PAL) 25, 4-cumaraat: CoA ligase (4CL) 26 of een cinnamyllcohol dehydrogenase (CAD) 27 laten een toename in andere celwand structurele componenten. Als eerste stap in onze studies, werd kristallijne cellulose gemeten met de Updegraff methode 28. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor bepaling van cellulose in een groot aantal cellulolytische bacteriën en schimmels. In het kort werden de gemalen maïs voorraden behandeld met Updegraff reagens (azijnzuur: salpeterzuur: water) aan hemicellulose, lignine en xylosans verwijderen. De kristallijne cellulose werd volledig gehydrolyseerd tot glucose via Saeman hydrolyse door toevoeging van H 2 SO 4. De kristallijne cellulose werd vervolgens getest volgens de colorimetrische anthronwerkwijze 29. Om te controleren of de inhoud hemicellulose zijn gewijzigd, werden de monosaccharide extracten van gemalen stengels gehydrolyseerd met trifluorazijnzuur, gederivatiseerd met de alditol acetaat werkwijze en vervolgens door gaschromatografie (GC) 30 geanalyseerd. De gedetailleerde procedures voor kristallijne cellulose inhoud en matrix polysacchariden samenstelling analyses worden beschreven in Foster et al.. (2010) 31.

Hier beschrijven we de procedures die worden gebruikt voor lignine down-regulatie in maïs via een RNAi-technologie, deeltjesbeschieting transformatie, en lignine-analyse voor een versnelde afbraak van maïs lignocellulose in fermenteerbare suikers voor biobrandstoffen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van dsRNAi constructen gebruikt voor de Neerregeling van ZmCCR1

  1. Ontwerp gen specifieke primers inclusief de nodige restrictie-enzym plaatsen voor het maken van een dsRNAi construeren om knock-out de ZmCCR1 gen. Twee primer sets zijn ontworpen om twee fragment segmenten van ZmCCR1 cDNA versterken:. Een 523 bp fragment van nucleotide 748-1271, en ​​een 285 bp fragment van nucleotide 986-1271 De ZmCCR1 cDNA werd verstrekt uit de Arizona Genome Institute (AGI). Meer details zijn beschreven in figuur 1.
  2. Amplify het grote fragment door polymerasekettingreactie (PCR) van de ZmCCR1 cDNA template met de primers ZmCCR1_748F_BglII (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ') en ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3'). Versterken de kleinere fragment (285 bp) met de primers ZmCCR1_986F_BglII (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ') en een ZmCCR1_1271R_SacI (5R17,-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ').
  3. Individueel ligeren van de fragmenten in pGEM-T Gemakkelijk de instructies van de fabrikant.
  4. Voer mini-prep plasmide-DNA-isolatie van individuele transformanten, die elk de pGEM-T bouwt met behulp van een commercieel mini-prep plasmide kit.
  5. Verteren zowel de pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) en ImpactVector (IV) -1.1 (cytoplasma expressie vector) met zowel BglII en Ncol.
  6. Ligeren de grote verteerd gel gezuiverd ZmCCR1 fragment (523 bp) in het verteerde gel gezuiverd IV-1.1.
  7. Digest de pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) en IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) met zowel BglII en SacI om het kleine fragment in te voegen in de IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
  8. Ligeren de kleine verteerd gel gezuiverd ZmCCR1 fragment (285 bp) in het verteerde gel gezuiverd IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
  9. Kloon zowel 523 bp en 285 bp fragmentatiets in IV-1.1 om de ZmCCR1 RNAi construct, die een 285 bp inverted repeat sequentie heeft met een 238 bp spacer in het midden van de omgekeerde herhaling fragmenten (zie figuur 1).
  10. Breng deze construct in Escherichia coli (E. coli), groeien ze en uitvoeren van een midi-prep grootte plasmide-DNA-isolatie om genoeg plasmide-DNA voor maïs genetische transformatie te verkrijgen.

2. Maïs genetische transformatie

  1. Bereiding van wolfraamdeeltjes
    1. Plaats 60 mg wolframparels (M10) in een 1,5 ml buis en wassen met 1 ml 70% ethanol door vortexen gedurende 2 minuten. Incubeer gedurende 10 minuten bij 23 ° C en centrifugeer bij 18.894 xg gedurende 2 min en de bovenstaande vloeistof.
    2. Was 3x met 1 ml 100% ethanol, centrifugeren gedurende 2 minuten en weg supernatant. Voeg 1 ml steriel 50% glycerol aan het microdeeltje concentratie 60 mg / ml wordt.
  2. Bereiding van DNA voor Bombardement
    1. Place 50 pl (3 mg) wolfraam korrels bereid in 50% glycerol in een 1,5 ml buis. Voeg 5 pl (1 pg) van IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi plasmide-DNA, 50 ul 2,5 M CaCl2, en 20 pl 0,1 M spermidine. Vortex kort tussen elke toevoeging van de bovengenoemde reagentia.
    2. Vortex de wolfraam kraal-DNA mengsel kort en centrifugeer bij 18.894 xg gedurende 30 sec. Giet het supernatant en resuspendeer de pellets in 140 pl 70% ethanol. Verwijder de vloeistof en gooi deze weg. Voeg 140 ul 100% ethanol. Verwijder de vloeistof en gooi deze weg.
    3. Voeg 48 pi 100% ethanol. Onmiddellijk te gebruiken of op te slaan op ijs voor maximaal 4 uur voorafgaand aan de bombardementen.
  3. Bombardement
    1. Plaats een 3-5 cm diameter Hi-II embryogene calli van maïs (ontvangen van maïstransformatie Center van Iowa State University) in het midden 100 mm platen met N6OSM media 32 (zo osmotium) tenminste 4 uur voor het bombardement.
    2. Prepare de PSD-1000/He Particle Delivery volgens instructies van de fabrikant 33.
    3. Steriliseren kamerwand met 70% ethanol. Laad steriel 650 psi breekplaat in steriele borgkap. Spreid 5-6 ul van de M10-DNA-oplossing op het oppervlak van een macrodrager, droge kort. Belasting macrodrager en stoppen scherm in microdrager lancering montage.
    4. Plaats microdrager lancering assemblage en maïs calli in de kamer op een gekozen afstand van het stopscherm (L2 = 6 cm) en sluit de deur. Versnellen in een vacuüm van 27 psi tegen een gaas scherm.
    5. Druk op de vuurknop tot breuk schijf barst en helium manometer daalt tot nul. Laat de vuurknop.
    6. Incubeer de gebombardeerd calli in een petrischaal met N6OSM (osmotische middel) 32 gedurende 16 uur in het donker bij 27 ° C. Breek de calli in ongeveer tien stukken en over te dragen aan N6E (callusinductiemedium) 32 in petrischaaltjes en incubeer gedurende 5 dagen in het donker bij 27 ° C.
  4. Selectie
    1. Na 5 dagen op N6E, de overdracht van de calli op N6S medium (selectie media) 32. Subcultuur alle calli op selectie medium om de 30 dagen voor 8-12 weken zonder de calli structuur verstoren.
    2. Na ongeveer 8-10 weken, zal wit snelgroeiende sectoren groeien uit de non-proliferatie en gedeeltelijk necrotische moeder calli. Accijnzen de witte snelgroeiende weefsels en subcultuur ze verse selectie medium (N6S) 32 en verder als hierboven broeden.
  5. Wedergeboorte
    1. Breng de witte en snelgroeiende embryonale calli op regeneratiemedium 32 en incubeer zoals hierboven voor 1 week. Schakel de regenererende embryogene calli tot een periode van 16 uur daglicht en 8 uur donker bij 25-27 ° C
    2. Breng de regenererende schiet op de beworteling medium 32 in een glazen reageerbuis na 3-4 weken, blijven zoals hierboven broeden. Na substantiële root ontwikkeling lijkt, wassen wortels zorgvuldig onder water kraan, dan is transplantatie de plantjes tot 4 "potten met grond. Bedek de potten met plastic zakken vochtig te houden. Na 2 dagen maken kleine gaatjes de plastic zakken. Na 5-6 dagen verwijdert de plastic zakken. Blijf zoals hierboven incuberen nog 5-6 dagen.
  6. Broeikas
    1. Breng de zaailingen in 18 "potten met aarde en in volle zomer zonlicht of kas licht te houden. De eerste geregenereerde planten T 0 genoemd terwijl de eerste zaden tot de T1 generatie.

3. Histologische Assay

    1. Bevestig de maïs blad mid-ribs in 5 ml 10% neutraal gebufferde formaline.
    2. Proces en vacuüm infiltreren met paraffine op een tissue processor met een tissue processor.
    3. De weefsels in paraffine insluiten met behulp van een HistoCentre III inbedding station.
    4. Verwijder de overtollige paraffine van de randen een keer blokks gekoeld.
    5. Sectie monster bij 4-5 urn met een microtoom met behulp van een microtoom.
    6. Plaats secties op objectglaasjes en droog in een 56 ° C incubator voor 2-24 uur. Zorg ervoor secties zijn volledig verkleefd aan de dia.
    7. Deparaffinize secties twee veranderingen van xyleen gedurende 5 minuten bij 23 ° C.
    8. Hydrate glijdt via twee veranderingen van 100% ethanol gedurende 2 minuten en twee veranderingen van 95% ethanol gedurende 2 minuten bij 23 ° C.
    9. Spoel de secties in stromend water gedurende 2 minuten.
    10. Vlek met 0,05% toluïdineblauw O voor 1-2 minuten en spoel kort met DDH 2 O.
    11. Plaats een dekglaasje op de monsters met immersie olie en visualisatie met lichtmicroscopie.
  1. Scanning Electron Microscopy (SEM)
    1. Bevestig de doorsnede mais blad mid-ribben 4% glutaaraldehyde en 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,4) bij 4 ° C gedurende 1-2 uur.
    2. Kort spoelen de monsters in de buffer, gedehydrateerd ze in eenethanolreeks (25%, 50%, 75% en 95%) gedurende 10-15 min bij elke gradatie en 100% ethanol gedurende 10 minuten, 3x.
    3. Droog de gedehydrateerde-dwarsdoorsnede gemaakt van maïs blad mid-ribben in een kritisch punt droger met behulp van vloeibare kooldioxide als de overgangsregeling vloeistof.
    4. Monteer de gedroogde monsters op aluminium stompjes met behulp van hoge vacuüm carbon tabs
    5. Coat het blad maïs midden ribben gemonteerd op aluminium stompjes met goud (ongeveer 20 nm dikte) in een sputter coater gespoeld met argon gas.
    6. Onderzoek de beklede monsters in een JEOL JSM-6400V (lanthaan hexaboride elektronenemitter) scanning elektronenmicroscoop.
    7. Digitale beelden werden afgebeeld met behulp van een analyse Pro-software (versie 3.2).

4. Klason Lignine Meting

  1. Molen de monsters door een 2 mm scherm.
  2. Gebruik een vochtanalysator om het vochtgehalte van elk monster te bepalen en noteer de waarde.
  3. Weeg ~ 1,5 g van elk monster en noteer de massa. Extract de monsters met behulp van water voor de eerste extractie, gevolgd door ethanol voor de tweede extractie met behulp van een geautomatiseerd solvent extractor (3 cycli per extractie, ca. 14 min. per cyclus) of soxhletapparaat (8 uur per extractie). (Opmerking: Deze stap verwijdert extractieven dat kan condenseren tijdens zure hydrolyse en interfereren met nauwkeurige meting lignine, waardoor de schijnbare Klason ligninegehalte.)
  4. Droog de geëxtraheerde monsters bij 45 ° C gedurende de nacht, dan laat ze afkoelen in de exsiccator en weeg opnieuw.
  5. Stel een incubator tot 30 ° C. Meet 0,3 g van elke droge, geëxtraheerd monster in schroef-top hoge druk buizen (drie exemplaren per monster wordt aanbevolen) en noteer de gewichten tot op 0,1 mg. Voeg 3 ml 72% H 2 SO 4 aan elke drukbuis.
  6. Meng het monster met behulp van een glas of Teflon roer staaf. Laat het roer staaf in de buis tot het water wordt toegevoegd na incubatie.
  7. Plaats flacons in een incubator set tot 30 ° C en 150 rpm gedurende 60 minuten. Na 1 uur voeg 84 ml gedeïoniseerd water om het zuur te verdunnen tot 4% en meng met de roerstaaf. Wees voorzichtig grote hoeveelheden monster achter te laten op de zijkanten van de flacon boven de waterlijn.
  8. Goed af, de stoppers alle flesjes en plaats ze in een metalen rek of grote bekers. Autoclaaf bij 121 ° C met een vloeibaar sterilisatiecyclus 1 uur. Laat afkoelen tot kamertemperatuur voordat u deze opent.
  9. Pre-as de filtering kroezen in een oven bij 575 ° C gedurende ten minste 4 uur. Laat smeltkroezen afkoelen in een exsiccator gedurende minstens een uur.
  10. Vacuümfilter de oplossing van elk buisje via een aparte smeltkroes, met een rubberen adapter op de smeltkroes te beveiligen. Gebruik gedemineraliseerd water om alle resterende deeltjes uit de buis te spoelen.
  11. Droog het lignine residu bij 105 ° C gedurende ten minste 4 uur. Registreer het gewicht van de droge kroes met het residu.
  12. Bij gebruik van een 575 ° C, pre-Het-vuren van de monsters over een bunsenbrander tot er geen rook of as en plaats in de oven gedurende 24 uur, of bij gebruik van een programmeerbare oven, geen pre-as en gebruik de volgende programma:
  13. Helling van kamertemperatuur tot 105 ° C en houd gedurende 12 minuten.
  14. Geleidelijk naar 250 ° C bij 10 ° C / min en houd gedurende 30 minuten.
  15. Oprit naar 575 ° C bij 20 ° C / min en gedurende minstens 180 minuten.
  16. Verwijder de smeltkroezen uit de oven en afkoelen in een exsiccator. Weeg de smeltkroes en as.
  17. Bereken het zuur onoplosbare residu met behulp van de volgende vergelijking:

Vergelijking 1

M PRE = massa van vooraf gewonnen biomassa
M POST = Massa van post-onttrokken biomassa
M FLACON = Massa van gewonnen biomassa toegevoegd aan de flacon
M GEWASRESTEN = Massa van kroes en lignine residue
M ASH = Massa van kroes en as
MC = Vochtgehalte van pre-geëxtraheerde biomassa, totaal gewichtsbasis

5. Koolhydraatanalyse

  1. Voer celwand koolhydraten analyseert op basis van de Foster et al.. (2010) protocol 31. Kortom, Bereid alcohol onoplosbare residu van gevriesdroogd plantmateriaal. Dan hydrolyseren het materiaal met trifluorazijnzuur en overeenkomen met de oplosbaar monosaccharide derivaten om hun overeenkomstige alditol acetaten. Analyseer de vluchtige derivaten met gaschromatografie (GC) verbonden met een viervoudige massaspectrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben een vermindering van het lignine-gehalte in maïsplanten via RNAi aangetoond. Het met deeltjes transformatiewerkwijze leverde ongeveer 30% trnasformation rendement. De gene silencing van ZmCCR1 werd consistent waargenomen in T0-T2 generaties. De lignine verminderde transgenics groeide op dezelfde wijze als wildtype maïsplanten behalve voor het weergeven van bruine verkleuring in het blad midden-rib, schil en steel. De histologische analyse heeft aangetoond dat het mutante lijnen vertonen een aanzienlijke vermindering in de cel wanddikte van het sclerenchym vezels in het blad maïs midden rib 18. Ondanks de vermindering van de cel wanddikte, de structuur van andere vasculaire systemen zoals het xyleem vat, floëem, en schede cellen geen verschillen met de wildtype-controle (figuur 2A) 18 onthullen. Dit betekent dat er geen schadelijke effecten voor zowel watertransport, nutriëntentransfers of mechanische sterkte aan de stengels in de ZmCCR1_RNAi mutant lijnen.

Het lignine-gehalte werd gekwantificeerd met een Klason lingin meting. Figuur 3 toont de hoeveelheid zuur-onoplosbare lignine Klason (g / kg con stover) in wildtype maïs en ZmCCR1_RNAi transgene lijnen (T1). Drie transgene lijnen (1c-4, -5 en -6) toonde een statistisch significante vermindering lignine (8,1%, 7,0% en 8,7% respectievelijk) vergeleken met die van het wildtype maïsplanten 18. Om te bepalen of carbon stroom werd verschoven van de lignine biosynthese route naar muur koolhydraten biosynthese routes cel, werd cellulose geanalyseerd via de Updegraff methode. Figuur 3A toont dat twee ZmCCR1_RNAi mutant lijnen (1b-6 en 1c-6) bevatte aanzienlijk hogere niveaus van kristallijn cellulose (respectievelijk 1,5 en 1,8 maal) 18. De hemicellulose inhoud werd ook geanalyseerd. Figuur 4B toont de hoeveelheid van vier belangrijke hemicellulose componenten (arabionose, xylose, galactose en glucose). Geen van de vier koolwaterstofgroepen geopenbaard wijzigingen in de mutante lijnen 18.

Figuur 1
Figuur 1 Klonen strategie voor dsRNAi plasmideconstructen voor de down-regulatie van de ZmCCR1 PRbcS1:.. Ribulosebisfosfaatcarboxylase promotor van Chrysanthemum morifolium Ramat. T-RbcS1: ribulosebisfosfaatcarboxylase kleine eenheid terminator uit Asteraceous chrysant. Dit cijfer is gewijzigd van Park et al. (2012) 18.

Figuur 2
Figuur 2. Fenotypische analyses van wild-type maïs (Hi-II) en ZmCCR1_RNAimutant blad hoofdnerf. A) Bruin kleuring werd gezien in ZmCCR1 down-gereguleerd maïs bladeren, stengels en maïsbladeren. B) De doorsnede blad maïs hoofdnerven van wild-type HI-II (links) en ZmCCR1_RNAi mutant lijn (rechts) werden gekleurd met 0,05% toluïdineblauw O gedurende 1 minuut naar secundair xyleem weefsel te visualiseren. De rode pijl geeft de celwanden van sclerenchym vezels van het blad hoofdnerf. (C) Scanning elektronenmicroscopie (SEM) van ZmCCR1 downgereguleerd transgene maïs blad hoofdnerf (rechts) in vergelijking met die van wildtype niet-transgene controle plantaardige (links). De rode pijl geeft sclerenchym vezels. Dit cijfer is gewijzigd van Park et al.. (2012) 18.

Figuur 3
Figuur 3. Klason lignine metingen (acid-onoplosbaar inhoud lignine) van wild-type HI-II en ZmCCR1_RNAi mutant. De drie mutante lijnen 1c, 1c-5 en 1c-6 was statistisch lager lignine, 8,5%, 7,5% en 9,2% respectievelijk als percentage van droge stof vergeleken met het wild type controleplanten. Gemiddelde ± standaarddeviatie (P <0,05, n = 3). Dit cijfer is gewijzigd van Park et al.. (2012) 18.

Figuur 4
Figuur 4. Celwand analyse van de samenstelling. A) Kristallijn cellulose analyse van ZmCCR1_RNAi lijnen (paarsgewijze vergelijkingen Tukey, * P <0,05, n = 3). B) hemicellulose samenstelling analyse van wildtype maïs en ZmCCR_RNAi transgene maïs (T1) via gaschromatografie (GC). De belangrijkste pieken van de chromatogrammen were geïntegreerde, geïdentificeerd op basis van de retentietijden en fragmention handtekeningen, uitgedrukt als mol percentage (P> 0,05, n = 3) (paarsgewijze vergelijkingen Tukey, p> 0,05, n = 3). Dit cijfer is hergebruikt van Park et al.. (2012) 18.

Figuur 5
Figuur 5 Percentage suiker (glucaan en xylaan) conversies onbehandelde (UT) en AFEX TM-voorbehandeld (90 ° C, 5 min) maïs Stover bij verschillende concentraties ammoniak (1,0. 1,0 g NH3: g droge biomassa 1.5: 1.5 g NH3. g droge biomassa) Foutenbalken stellen de standaardafwijking van het gemiddelde en zijn gebaseerd op twee replicaten van onbehandelde monsters en vier replicaten (twee voorbehandeling repliceert met twee replicaten per hydrolyse) voor het voorbehandelde monsters. Voorbehandeld suiker conversies(24 uur of 72 uur) gemerkt met verschillende letters zijn statistisch verschillend gebaseerd op paarsgewijze vergelijkingen Tukey (P <0,05). Dit cijfer is hergebruikt van Park et al.. (2012) 18.

<td> 0,69 g / L proline
Media Chemische samenstelling
N6OSM 4 g / L N6 zouten
(Osmotische gemiddeld) 1 ml / L N6 vitaminestamoplossing
2 mg / l 2,4-D
100 mg / L myo-inositol
0,69 g / l proline
30 g / L sucrose
100 mg / L caseïnehydrolysaat
36,4 g / L sorbitol
36,4 g / L mannitol
2,5 g / L Gelrite, pH 5,8
Voeg filtergesteriliseerd zilvernitraat (25 uM) na het autoclaveren
N6E 4 g / L N6 zouten
(Eelt inductie) 1 ml / L (1000 x) N6 vitaminestamoplossing
2 mg / l 2,4-D
100 mg / L myo-inositol
2,76 g / L proline
30 g / L sucrose
100 mg / L caseïnehydrolysaat
2,5 g / L Gelrite, pH 5,8
Voeg filtergesteriliseerd zilvernitraat (25 uM) na het autoclaveren
N6S media 4 g / L N6 zouten
(Selectie media) 1 ml / L N6 vitaminestamoplossing
2 mg / l 2,4-D
100 mg / L myo-inositol
30 g / L sucrose
100 mg / L caseïnehydrolysaat
36,4 g / L sorbitol
36,4 g / L mannitol
2,5 g / L Gelrite, pH 5,8
Voeg filtergesteriliseerd zilvernitraat (25 uM) na het autoclaveren
Regeneratiemedium 4,3 g / l MS-zouten
1 ml / L (1000x) MS vitaminestamoplossing
100 mg / L myo-inositol
60 g / L sucrose
3 g / L Gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petrischalen)
Voeg filter gesteriliseerd bialaphos (3 mg / L) toegevoegd na autoclaveren
Bewortelingsmedium 4,3 g / l MS-zouten
100 mg / L myo-inositol
30 g / L sucrose
3 g / L Gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petrischalen)
10% neutraal gebufferde formaline 100 ml formaline
(1 liter) 900 ml van DDH 2 O
4,0 g natrium diwaterstoffosfaat monohydraat (NaH 2 PO 4 · H2O)

Tabel 1. Tabel specifieke reagentia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De toegankelijkheid van microbiële cellulasen celwand polysacchariden planten is grotendeels afhankelijk van de mate waarin ze zijn gekoppeld fenolpolymeren 23. Het succespercentage van lignocellulose biomassa tot fermenteerbare suiker is negatief gecorreleerd met ligninegehalte afgezet in planten secondadry celwanden. Deze correlatie wordt toegeschreven aan de fysische eigenschappen van lignine zoals hydrofobiciteit 24, chemische heterogeniteit, en het ontbreken van normale hydrolyseerbare intermonomeric linkages 25.

In deze studie, een dsRNAi techniek veroorzaakte verschillende niveaus van gen beneden-verordening inzake genetische doelwitten. Lignine down-regulatie, gemedieerd door een ZmCCR1_RNAi bouwen, heeft geresulteerd in de bruine verkleuring in T1 transgneic lijnen. Bruine hoofdnerf (bm) kleuring is een natuurlijk verschijnsel dat veroorzaakt wordt door verminderde lignine lignine en veranderde samenstelling. In tegenstelling tot andere natuurlijke occurred. bm mutanten die de bruine verkleuring alleen blad midden ribben tonen de ZmCCR1_RNAi mutantlijnen onthulde de fenotype in andere delen van de plant, zoals de stengels en kaf. De histologische analyse aangegeven dat de sclerenchym cel wanddikte van ZmCCR1 downgereguleerd bladeren was veel minder dan die van het wild type controleplanten (Figuur 2A). Echter, de sturucture en celwand dikte van de belangrijkste vasculaire systemen inclduing houtvaten, floëem of vel cellen niet veranderd. Dit kan de normale groei van de ZmCCR1_RNAi transgene lijnen die normaal groeide qua hoogte van de planten en de steel diameter verklaren.

Een vermindering van meer dan 20% in de lignine content algemeen veroorzaakt een verlies van biomassa en die de planten kwetsbaarder tegen microbiële pathogenen en plagen 27,28. Echter, de mutant lijnen die in dit onderzoek, minder dan 10% lignine reducti uitenop, geen afbreuk doen aan de plantaardige biomassa en defensief mechanisme tegen abiotische en biotische stress.

Eerdere studies hebben aangetoond dat transgene tabakslijnen met aanzienlijk verminderde CCR expressie toonde een toename van andere celwand bestanddelen zoals glucose, xylose en wand gebonden fenolische verbindingen (bijv., sinapinezuur en ferulic zuren). In deze studie, de milde lignine verlaging verhoogde het niveau van kristallijne cellulose in sommige ZmCCR1 down-gereguleerd maïsplanten. Omgekeerd werd een cellulose compensatiemechanisme ook waargenomen in Arabidopsis mutanten waarin buitenbaarmoederlijke lignification tentoongesteld wanneer cellulose synthese-genen waren defect 35. De kwantitatieve of kwalitatieve veranderingen van een celwand koolhydraat component induceert de afwisseling van andere componenten 36. Een dergelijke compensatie mechansims zijn belangrijk voor de homeostase van plantaardige vaatstelsel maintan. In deze studie, hemicelluloses toonde geen statistisch significante veranderingen in ZmCCR1 down-gereguleerd mutant lijnen. Dit resultaat kan zijn omdat de waargenomen lignine daling was niet voldoende om extra hemicellulose synthese leiden.

De verminderde niveau van lignine en de verhoogde kristallijne cellulose niveau zou dubbel gunstig zijn voor de productie van biobrandstoffen. De onderste inhoud lignine zou minder ingangen (bijv. H 2 SO 4, cellulasen, enz.) vereisen tijdens de verwerking van de biomassa conversie proces. De extra cellulose kan de opbrengst aan fermenteerbare suikers verhogen. De genetische manipulatie van ZmCCR1 beschreven in deze studie kan worden uitgevoerd om te helpen lignocelluosic bimoass afgeleid bioethanol meer commercieel concurrerend.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

De microscopische beeldvorming werd uitgevoerd via de diensten van de Michigan State University Center for Advanced Microscopy. Maïs callus werd gekocht van de Maïs Transformation Center van Iowa State University. De auteurs willen graag Jeffrey R. Weatherhead van de MSU Plant Research Laboratory bedanken voor zijn technische bijstand op het koolhydraat analyse. Dit onderzoek werd royaal gefinancierd door de Corn Marketing Program van Michigan (CMPM) en het Consortium voor Plant Biotechnology Research (CPBR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N6OSM (Osmotic medium) Made in-house
N6E (Callus induction) Made in-house
N6S media (Selection media) Made in-house
Regeneration medium Made in-house
Rooting medium Made in-house
10% Neutral buffered formalin (1 L) Made in-house
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device Hercules, CA, United States
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Jena, Germany For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software.
Excelsior ES Tissue Processor Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
HistoCentre III Embedding Station Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
Microtome Model Reichert 2030 Reichert, Depew, NY, United States
Emscope Sputter Coater model SC 500 Ashford, Kent, England
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope JEOL Ltd., Tokyo, Japan
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States
Screw-top high pressure tubes Ace Glass, Vineland, NJ #8648-27
Screw-top high pressure tube plugs Ace Glass, Vineland, NJ #5845-47

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
  2. Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. 275-178 (1995).
  3. Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. Michigan State University. (2011).
  4. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  5. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
  6. Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. 102-6486 (2011).
  7. Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
  8. Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
  9. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
  10. Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
  11. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
  12. Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
  13. Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
  14. Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
  15. Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
  16. Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
  17. Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
  18. Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
  19. Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
  20. Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
  21. Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
  22. Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
  23. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
  24. Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. (2008).
  25. Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
  26. Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
  27. Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
  28. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
  29. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
  30. Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
  31. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
  32. Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. (2005).
  33. Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
  34. Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
  35. Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics