Singola lunghezza d'onda Ombra Imaging di

Engineering
 

Summary

La tecnica qui presentata misura il percorso di nuotare liberamente specie microscopiche con esposizione singola lunghezza d'onda. C. elegans sono utilizzati per dimostrare l'imaging ombra come un'alternativa economica ai costosi microscopi. Questa tecnica può essere adattata per ospitare diversi orientamenti, ambienti e specie per misurare direzione, velocità, accelerazione e forze.

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Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

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Abstract

Questo studio dimostra una tecnica poco costoso e semplice che permette la misura di proprietà fisiche come posizione, velocità, accelerazione e forze coinvolte nel comportamento locomotorio di nematodi sospesi in una colonna di acqua in risposta a singole lunghezze d'onda della luce. Dimostriamo come valutare la locomozione di un organismo microscopico utilizzando Lunghezza d'onda singola ombra Imaging (SWSI) utilizzando due diversi esempi.

Il primo esempio è uno studio sistematico e statisticamente valida della discesa media di C. elegans in una colonna d'acqua. Per questo studio, abbiamo utilizzato vivi e morti di tipo selvatico C. elegans. Quando abbiamo confrontato la velocità e la direzione del nematode movimento attivo con la discesa passivo di vermi morti all'interno del campo gravitazionale, questo studio ha mostrato alcuna differenza nella discesa volte. La discesa media è stata di 1,5 mm / sec ± 0.1 mm / sec per entrambi i vermi vivi e morti con 633 nm coerenteluce.

Il secondo esempio è un caso di studio di selezione individuale C. elegans cambiare direzione durante la discesa in una colonna d'acqua verticale. Accelerazione e forza vengono analizzati in questo esempio. Questo studio dimostra la portata di altre proprietà fisiche che possono essere valutati utilizzando SWSI durante la valutazione del comportamento utilizzando singole lunghezze d'onda in un ambiente che non è accessibile con microscopi tradizionali. Utilizzando questa analisi abbiamo stimato un individuo nematode è in grado di spingere con una forza superiore a 28 nN.

I nostri risultati indicano che i nematodi vivono esercitano 28 nN quando si gira, o muoversi contro il campo gravitazionale. I risultati suggeriscono inoltre che nematodi passivamente discendono in una colonna d'acqua, ma possono resistere attivamente la forza di gravità principalmente dal senso di rotazione.

Introduction

Caenorhabditis elegans è un nematode terreno favorevole a vita libera che è un potente organismo modello per lo studio dei meccanismi di regolazione genica, sviluppo e più recentemente per la comprensione della biologia e del comportamento sensoriale. Pur avendo solo 302 neuroni, C. elegans sono capaci di modelli complessi locomotoria, comportamenti riproduttivi, la navigazione, la chemiotassi e molti altri comportamenti. C. elegans possiedono meccanocettori, chemiorecettori e persino di rilevare le lunghezze d'onda di luce blu (Ward et al., 2008) 1. Mentre si sa molto circa i circuiti neurali della funzione sensomotoria e modelli locomotore generali in C. elegans, meno si sa circa le risposte a molteplici stimoli simultanei o condizioni ambientali più complessi di quanto può essere modellata sotto un microscopio. Alcuni studi hanno rivelato modelli locomotore più complessi che sono 2,3,4 altamente plastica. Il nostro approccio metodologico permetterà studi di nematodes in soluzione in tempo reale in cui possiamo facilmente fornire molteplici condizioni ambientali contemporaneamente. Questa domanda è difficile da affrontare utilizzando tecniche di imaging basata microscopio convenzionali. Abbiamo sviluppato una tecnica di imaging che ci permette di collocare nematodi all'interno di una colonna d'acqua di esaminare comportamenti locomotoria, nonché determinare le capacità di nematodi cambiare locomozione in risposta a differenti condizioni ambientali.

Singola lunghezza d'onda Ombra Imaging (SWSI) viene presentato in questo lavoro per la prima volta ad affrontare le carenze di microscopi tradizionali. Microscopi tradizionali sono limitati a osservare specie in un piano focale orizzontale pochi micron di profondità 5,6. Per quanto riguarda gli studi singola lunghezza d'onda, la maggior parte dei microscopi tradizionali usano filtri colorati per filtrare la luce bianca molto ampia, in genere, 50-100 nm. Utilizzando un laser per SWSI restringe la selezione di lunghezza d'onda inferiore a 1 nm mantenendo segnoificant intensità della luce 7. Analogamente, singole lunghezze d'onda sono state utilizzate per misurare frequenze nuoto di C. elegans in tempo reale 8.

Per la prima dimostrazione del nostro metodo, abbiamo monitorare la posizione orizzontale, x, e la posizione verticale, y, di una C. banche nuoto elegans in una colonna d'acqua, per una distanza di circa un centimetro. In particolare, ci interessa il movimento verticale da gravità agisce anche in verticale. La pendenza di una misura lineare alla posizione verticale fornisce la velocità verticale, v y, del nematode mentre scende nella colonna d'acqua:
Formula (1)

Il quadratico medio dell'errore (RMSE) 9 indica la qualità della forma e indica se la velocità di discesa è generalmente costante. Le velocità verticali sono poi mediati per each specie e vermi morti. L'utilizzo di questi risultati, la resistenza, che l'esperienza worm può essere stimato.

Per la seconda dimostrazione del nostro metodo, abbiamo selezionato C. elegans che non scendono a velocità costante a differenza della maggior parte dei vermi osservati. I vermi selezionati sia girato e nuotato verso l'alto o aleggiava per un po 'prima di continuare la discesa. Fisicamente, questo caso studio mostra che la spinta di un microrganismo nuoto può essere calcolato. Leggi di Newton dettano che un corpo che cambia indicazioni accelera, il che implica una forza netta, Formula 1 , Agisce su quel corpo 10:
Formula 2 (2)

dove p èla quantità di moto e t è il tempo. L'accelerazione del verme è direttamente proporzionale alla forza che agisce sul verme poiché la massa del verme rimane costante. Come risultato, la forza netta verticale è:
Formula 3 (3)

dove m è la massa di un verme e un y rappresenta l'accelerazione verticale. La forza netta nella direzione verticale rappresenta la propulsione verme nella stessa direzione. La spinta totale può essere calcolato dalla componente orizzontale in considerazione.

Protocol

1. C. elegans Preparazione

  1. Preparare le piastre di Petri di giovane adulto C. elegans come descritto in precedenti esperimenti che comportano la sospensione di C. elegans in un pieno di liquido cuvetta 11.
  2. Il giorno della video analisi, raccogliere i giovani vivono nematodi adulti direttamente in una vaschetta riempita con acqua deionizzata, acqua distillata con un plettro di platino, come descritto al punto 2.
  3. Preparare morti C. elegans all'esposizione cloroformio. Proseguire seguendo la procedura descritta per la raccolta di nematodi vivi di cui al punto 2.

2. Setup ottico per l'analisi video

  1. Assemblare setup sperimentale per creare immagini ombra come mostrato in Figura 1. La telecamera può essere collocata in qualsiasi distanza dallo schermo finché è in grado di acquisire una vista frontale dello schermo. Un buon posto è accanto alla cuvetta di fronte allo schermo.
    1. Utilizzando almeno due specchiguidare il sintonizzabile uscita laser a elio-neon in un espansore del fascio Galileo modo che il fascio è espanso ad un diametro di 12 mm.
    2. Posizionare uno o due fori nel percorso ottico in modo che il fascio passa attraverso i forellini senza essere ostacolati. Utilizzare i fori per assicurare l'allineamento viene mantenuto.
    3. Dirigere il fascio esteso su una cuvetta di quarzo montato che è largo 10 mm, 10 mm di profondità e altezza 4 cm.
    4. Ingrandire il fascio utilizzando una lente piano-convessa con una lunghezza focale positiva di 75 mm.
    5. Collocare uno schermo di proiezione circa 120 cm dalla lente. Distanze maggiori di questo produrrà un maggiore ingrandimento dell'immagine ombra. Tuttavia, la qualità dell'immagine diminuisce con una intensità di luce inferiore e una maggiore noticeability di interferenza diffrazione.
    6. Posizionare una telecamera ad alta velocità, che è capace di almeno 60 fps, proprio accanto alla cuvetta di fronte allo schermo.
  2. Posizionare un microscopio da dissezione vicino al set otticaper rapido trasferimento di nematodi nella cuvetta.
  3. Fissare temporaneamente un righello trasparente con divisione mm al centro del supporto cuvetta perpendicolare al fascio espanso in modo che i progetti raggio un'immagine ingrandita del righello sullo schermo. Impostare la scala di lunghezza per l'analisi video.
    1. Sullo schermo di proiezione, marcare la distanza scala utilizzando un righello trasparente fuori centro dall'immagine proiettata per evitare di interferire con la proiezione. Clicca qui per il video.
    2. Registrare questa immagine e misurare l'ingrandimento. Rimuovere il righello dal setup. Ripetere questa operazione per altre lunghezze d'onda come l'angolo di rifrazione della luce per ogni lunghezza d'onda attraverso la lente può variare a causa di aberrazioni cromatiche.
  4. Rimettere la cuvetta e riempirlo di meno di 1 mm del cerchio con acqua distillata.
  5. Iniziare la registrazione mentre la luce della stanza è in modo che la distanza scala è incluso nella stessametraggio come l'immagine proiettata. Spegnere la luce.
  6. Utilizzando un sottile, appiattito scelta filo di platino, spostare la persona giovane adulto C. elegans uno alla volta dalla piastra di agar nella cuvetta toccando il pick alla superficie dell'acqua. Il nematode diventerà visibile nella colonna d'acqua quando entra il fascio a causa di luce diffusa. Clicca qui per il video.
  7. Filmare le immagini proiettate dei vermi che passano attraverso il fascio laser espanso. È importante notare che l'immagine proiettata è invertita ed i vermi sembrerà muoversi in direzione opposta del loro moto attuale. Worms che scendono con la gravità appariranno a muoversi verso l'alto sullo schermo (Figura 2).

Dati Preparazione Video 3.

  1. Importare il video nel programma di analisi video.
  2. Impostare la scala utilizzando il fattore di ingrandimento precedentemente determinata.
  3. Track lo spostamento lineare della testa del nematode ombreggiato con almeno 10 punti di dati per l'intero percorso di presa.
  4. Trovare la velocità nella direzione verticale prendendo derivato ("Y", "Time") e dividere il valore per il fattore di ingrandimento determinata nella fase 2.2.

4. Analisi dei dati

  1. Analizzare la discesa lineare di un C. elegans:
    1. Verificare che i punti dati sulla posizione verticale rispetto al grafico in tempo formano generalmente una linea retta. Alcune deviazioni possono essere ignorati a causa del movimento della testa del nematode. Se i punti dati formano generalmente una linea retta, continuano al punto 4.1.2, in caso contrario la discesa è lineare e l'analisi deve essere continuato con passo 5.1 in questo protocollo.
    2. Creare una linea di regressione lineare da una linea retta 12 ai dati dal menu Analysis. La pendenza di questa linea è poi la velocità verticale della C.elegans. La pendenza è il cambiamento di posizione diviso per il cambiamento nel tempo in un determinato intervallo. Determinare la velocità di discesa dei vermi vivi e morti in questo modo (figura 3).
    3. La media delle velocità di nuoto verticale dal nematodi. Un campione di circa 50 vermi è sufficiente. Confronto velocità di nuotata in vermi vivi con velocità di deriva di vermi morti.

5. Analisi non lineare Mozione di C. elegans

  1. Dalla sezione 3, selezionare un file video analizzato, che mostra una discesa lineare all'interno della colonna d'acqua (Figura 4). Una discesa non lineare può essere identificato con passo 4.1.1 in questo protocollo.
  2. Selezionare 'Curve Fit' dal menu 'analisi' nel software di analisi video. Selezionare un secondo ordine (quadratica) polinomiale. Montare la curva.
  3. Per una regione di interesse, regolare la calzata sul grafico facendo scorrere le staffe su ciascun lato of la misura sul grafico finché la curva è molto vicino ai punti di dati all'interno della forma e / o ben all'interno delle barre di errore. Il programma di montaggio dà una espressione matematica per la curva attrezzata, che è in posizione verticale rispetto al tempo. Considerare gli errori curva adattata trovati nel programma associato con le proprietà fisiche. Un errore relativo del 15% o inferiore è generalmente accettabile.
  4. Aggiungere più curva adatta a coprire ulteriori sezioni di dati. Spline 13 le funzioni per una copertura ottimale: accertarsi che la curva si adatta sovrapposizione e cercare di allineare le curve adiacenti in modo che la partita piste nelle regioni di sovrapposizione.
  5. Avere la velocità per una regione di interesse prendendo la derivata della curva adattata usando l'espressione matematica ottenuto nella fase 5.1.3. Le velocità possono variare nel tempo. Si noti che la derivata è la pendenza di una funzione. Il derivato può essere ottenuta matematicamente o graficamente. In questo caso è pratico usare il dato expr matematicaessione.
  6. Prendere la derivata seconda delle curve montati avere la accelerazione. L'accelerazione può variare nel tempo.
  7. Moltiplicare l'accelerazione dalla massa worm per calcolare la spinta che il worm esercita. Una massa ragionevole stimata è di 3 mg assumendo che il worm consiste principalmente di acqua.

Representative Results

Discesa costante

La prima indagine mostra alcuna differenza distinguibile nei tassi discendenti della C. elegans durante SWSI usando 633 nm. I tassi discendente sono risultati essere costante a 1,5 mm / sec ± 0.1 mm / sec sia per il vivo e il morto C. elegans. Un campione di 50 worm ha generato una variazione ragionevole del 7% sia per vivere e vermi morti. Non c'è accelerazione agendo sulle viti senza fine poiché la velocità di discesa è costante, in modo che la forza di resistenza è uguale alla forza gravitazionale meno la forza di galleggiamento. Ciò implica che la densità del verme è leggermente più grande di quella dell'acqua; tuttavia, per le stime sottostanti è ancora pratico supporre che la densità di un nematode è all'incirca quella dell'acqua.

Modifica della Direzione

La seconda indagine, un caso di studio, dimostra che i nematodi sono in grado di cambiare direzione e possono nuotare verso l'alto controgravità. Due curve sono stati montati allo spostamento verticale del nematode modo che le seconde derivate di quelle curve potrebbero essere calettato grafico dell'accelerazione in funzione del tempo (Figura 5).   È consigliabile mantenere l'ordine polinomiale più basso possibile, pur mantenendo una buona misura. Un polinomio inferiore indica meno variazione dell'accelerazione nel tempo. I termini polinomiali di ordine superiore saranno trascurabili, e quindi inutile, se l'ordine del polinomio è troppo alta. Questo verme decelera a una velocità costante di 0,110 millimetri / sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2, gira e accelera allo stesso tasso 0,110 millimetri / sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2 fino a poco dopo il punto di svolta. La C. elegans continua a muoversi verso l'alto con un'accelerazione diminuzione di 1,252-,00708 t in mm / sec 2 finché l'accelerazione scende a zero. Tenendo presente Eq. 3, ed una massa verme stimato 3 e #956, g, il worm viene sottoposto ad una forza netta verticale, F Ny, di 0,33 pN fino a poco dopo il punto di svolta.

Discesa: Ci sono tre tipi di forze che agiscono sul verme fino a quando il verme raggiunge il punto di svolta: la gravità, trascinare, galleggiabilità e di spinta (Figura 6a). La forza netta è uguale alla somma vettoriale delle tre forze. Qui consideriamo solo i componenti verticali:
F Ny = F + F Dy Ty-F g + F B (4)

dove F B è la forza di galleggiamento. F g è uguale in grandezza ma opposto in direzione della forza di galleggiamento supponendo che la densità del verme è quello dell'acqua. Eq. 4 può essere scritta nel seguente modo:
F Ny = F + F Dy Ty (5)

F Ny rimane costante durante la discesa. Ciò implica cheF Dy + F Ty rimane costante fino a quando il nematode raggiunge il punto di svolta. F Dy è più grande nella parte superiore, che è l'inizio del percorso, e si riduce gradualmente fino a zero la velocità è zero al punto svolta mentre F Ty deve aumentare per mantenere costante F Ny.

Turnaround: Non c'è forza di trascinamento in senso verticale alla svolta in quanto la velocità verticale pari a zero in quel punto. Le sole forze che agiscono nella direzione verticale sono gravità, - F g, galleggiabilità, F B e il verme spinta verticale, F Ty, come illustrato nella Figura 6b. A questo punto, la spinta della C. elegans possono essere determinate:
F Ty = F Ny (6)

La spinta in basso della traiettoria è quindi pari a circa 0,33 pN, che è circa 0,001% del peso del verme. Tenendoconto che il peso stimato, F g di C. elegans è 28 nn,

Salita: Allo stesso modo, durante la salita, trascinare aumenta ma è puntato verso il basso (Figura 6c):
F Ny =-F Dy + F Ty (7)

La spinta implementato dal verme deve ora essere ancora più grande e uguale alla somma della forza di resistenza e il peso. Il worm sta rallentando dopo aver iniziato a nuotare in su. Per risalire alla stessa velocità come il verme discese, il verme dovrebbe esercitare una spinta verso l'alto pari ad almeno due volte il suo peso.

Librarsi

Un esempio di un verme che rallenta la discesa per circa 3 sec è presentato in Figura 7.   Un polinomio di 3 ° grado è una misura ragionevole per il percorso complessivo. Gli errori in accelerazione e velocità di questa misura sono inferiori al 15%. Il verme inizia con un significativo upward di spinta, rallenta e comincia a girare intorno a 68 sec; tuttavia, l'accelerazione diminuisce continuamente verso l'alto (Figura 8)   fino a quando l'accelerazione netta uguale a zero intorno 68,5 sec. Questo conduce infine a una netta accelerazione nella direzione verso il basso seguito da un altro punto della velocità zero (Figura 9)   e il nematode inizia a scendere nuovamente a 69 sec.

È interessante notare che l'accelerazione verticale massima osservata in questo caso è di 2,7 mm / sec 2. L'accelerazione nei punti di svolta sono 0,455 millimetri / sec 2 e - 0,455 millimetri / sec, rispettivamente, 2; circa quattro volte più grande che nel caso del nematode che gira e nuota. Uso Eq. 6, si può stimare che la spinta verso l'alto è di circa 1,32 pN al primo punto di svolta. Al secondo punto di svolta, l'accelerazione netto è negativo in modo che la spinta verso l'alto è 1.32 pN.

o: keep-together.within-page = "always"> Figura 1
Figura 1. Impostazione sperimentale. Il laser, il fascio di espansione, l'obiettivo e lo schermo sono essenziali per il setup sperimentale. Gli specchi di sterzo e fori possono essere omessi, ma farà l'allineamento ottico meno stabile.

Figura 2
Figura 2. Lunghezza d'onda singola ombra Image (SWSI). Usando 2 mW di luce laser 543 nm l'ombra di un worm viene proiettata su uno schermo. L'immagine viene invertito in modo che il nematode sembra rientrare verso l'alto.

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Figura 3. Discesa verticale di un unico tipo selvatico C. elegans in una colonna d'acqua. Questo nematode è stato pedinato da 633 nm luce coerente. La pendenza della regressione lineare indica una velocità di discesa di 1,09 mm / sec ± 0.01 mm / sec. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Grafico spostamento di un singolo rialzo nuoto di tipo selvatico C. elegans. due attacchi scanalati tracciano il percorso complessivo del nematode. La derivata seconda della forma rivela l'accelerazione. L'accelerazione massima è facilmente desumibile da primo fit: 0,110 millimetri / Sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2. Solo poche barre di errore vengono visualizzati in modo che i punti dati e la vestibilità rimangono visibili. Questo nematode è stato pedinato da 633 nm luce coerente. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Grafico Figura 5 Accelerazione. Di un unico tipo selvatico C. elegans. Questo nematode mantiene una costante accelerazione verso l'alto di 0,110 millimetri / sec 2 ± 0,002 millimetri / sec 2 inducendolo a rallentare e quindi spostare verso l'alto. Poco dopo il punto di svolta l'accelerazione diminuisce costantemente e l'accelerazione netto diminuisce a zero. g "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Diagrammi di Figura 6. Forza per discesa, punto e risalita. Galleggiabilità e la gravità di tornitura sono uguali in modulo e direzione opposta in modo che l'effetto di tali forze si annullano a vicenda. Essi non sono quindi mostrati in questi diagrammi. (A) Il worm sta scendendo con il drag e la spinta verso l'alto. (B) Il worm è al punto più basso della traiettoria senza resistenza. Spinta è rivolta verso l'alto. (C) Il worm è crescente con il drag rivolto verso il basso mentre la spinta è rivolta verso l'alto.

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Figura 7. Grafico spostamento del singolo nematode bilico. Il worm rallenta e comincia a girare intorno a circa 68 secondi, ma inizia a scendere intorno al 69 sec. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
.. Figura 8 grafico accelerazione di un singolo nematode bilico Questo worm inizia con un'accelerazione verso l'alto di 2,7 millimetri / sec 2, riduce a zero e, infine, ha una accelerazione verso il basso di -. 2,6 millimetri / sec 2 Cliccare qui per vedere un grande versione di questa figura.

Figura 9
Figura 9. Grafico della velocità di un singolo nematode bilico. Questo worm si ferma a 68 sec e inizia a dirigersi verso l'alto, rallenta e raggiunge la velocità zero nella direzione verticale a 69 sec seguita da una discesa. Cliccare qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1. Velocità media di discesa di N2 C. elegans. vivo 50 e 50 nematodi morti sono tracked durante la loro discesa. La velocità media per le discese è lo stesso per la vita e le vermi morti: 1,5 mm / sec ± 0.1 mm / sec.

Discussion

La tecnica SWSI fornisce un ulteriore modo per capire le capacità locomotorie di organismi microscopici, come i nematodi a vita libera. Con questa tecnica abbiamo distinto tra locomozione attiva (nuoto) e la deriva passive dovute alla circolazione gravità su nematodi morti. Inoltre, quando nematodi privo di nuoto cambiare direzione durante la locomozione in acqua, siamo in grado di misurare le forze di resistenza e le forze angolari, che operano sui nematodi e esercitate dai nematodi.

Nematodi incontrano diverse condizioni ambientali nel suolo. Ci sono sacche d'acqua all'interno del suolo, nonché particelle solide e materiali biologici di diverse forme e texture. Inoltre, esistono nematodi in un ambiente gravitazionale che rispondono a 14. Inoltre, nematodi vicino alla superficie del terreno sono esposti a differenti lunghezze d'onda della luce, variazioni di temperatura e umidità, e anche biologicovariabili come batteri, funghi predatori e altri organismi del suolo. Nematodi devono rispondere a tutte queste diverse variabili, il nuoto e strisciando in diversi media, trasformando e modificando le strategie di navigazione. Tutti questi calcoli complessi vengono svolte solo da 302 neuroni, un sottoinsieme dei quali sono coinvolti nella locomozione, e 95 cellule muscolari della parete del corpo. Misure del genere descritto dalla tecnica SWSI forniscono importante comprendere come i nematodi realizzare questa complessità di navigazione.

Per la prima parte, abbiamo misurato il tasso complessivo discendente di tipo selvatico C. elegans a 633 nm luce. Utilizzando queste misure, possiamo stimare la forza di resistenza un verme incontri.

Per il caso di studio di un nematode accelerazione, le forze coinvolte cambiamento continuo in quanto i cambiamenti di forza di trascinamento con la velocità. Ci sono alcune affermazioni che siamo in grado di fare circa le forze che agiscono sul verme. Come il worm rallenta e cerca di swim verso l'alto la componente verticale della forza di resistenza diminuisce fino a raggiungere zero al punto più basso della traiettoria del nematode. A questo punto, il verme deve avere una forza verso l'alto per swim up.

Questo metodo può essere modificata in diversi modi. Tutte le specie microscopiche che naviga in un liquido trasparente si possono seguire con SWSI. Studi possono essere condotti con eventuali lunghezze d'onda che sono accessibili a fotocamere digitali. Le fotocamere digitali in genere raccogliere lunghezze d'onda che vanno dal UV al vicino IR. Inoltre, studi orizzontali possono essere condotte da dirigere il laser verticalmente verso l'alto. La specie possono essere collocati su una superficie orizzontale trasparente, come un vetrino da microscopio. Regolare l'espansore trave o la lente d'ingrandimento dopo l'expander fascio può affinare le immagini sfocate. L'utente deve assicurarsi di fissare tutti i componenti al tavolo per garantire l'allineamento coerente e facile trave.

Il metodo è limitato dalla wavelengt laserhs e la risoluzione. In sostanza i vantaggi di questo metodo rispetto microscopi esistenti, che sono la flessibilità in direzioni e lunghezze d'onda, sono anche debolezze poiché la configurazione è semplice. L'ottica sofisticati e macchie di laser limitano la risoluzione. Alcuni di questi inconvenienti può certamente essere migliorato in futuro includendo filtro spaziale e proietta l'immagine direttamente su una telecamera CCD.

Le fasi più critiche del protocollo possono essere facilmente apprese come l'esperimento viene eseguita per la prima volta. Posizionamento del nematode nella cuvetta senza creare turbolenze è critica. Inoltre, le vibrazioni possono disturbare la configurazione e modificare il comportamento dei vermi. Assicurarsi di limitare la potenza, che viene utilizzato per ombra dell'immagine. 2 mW per un fascio laser che è di 1 mm di diametro dovrebbe essere il massimo per evitare effetti di riscaldamento. L'installazione dovrebbe essere testato per la dispersione effetti quando si utilizzano liquidi diversi dall'acqua distillata.

Attualmente la maggior parte microscopes operano su un piano orizzontale mediante luminosi o di colore bianco filtri, che sono ancora molto ampio nella gamma di lunghezza d'onda. Microscopi che utilizzano veramente singole lunghezze d'onda e hanno flessibilità nello scenario visualizzazione, cioè posizionamento orizzontale, di solito non è un vantaggio o l'altro. Inoltre, questi tipi di microscopi sono solitamente molto costosi e ancora limitata ai piani focali differenza nostro metodo. La nostra impostazione può essere facilmente costruito con un budget estremamente basso. Questo metodo è pronto per essere utilizzato da scuole, aziende ambientali nonché altri soggetti che operano con risorse limitate. In futuro, questo metodo può essere usato in una configurazione molto sofisticato per studiare effetti in tempo reale su locomozione e mechanosensation di specie microscopiche. Questo metodo rende studi singola lunghezza d'onda in una vasta gamma di angoli e profondità di visione facilmente disponibili.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati per il sostegno del Research Institute Vassar College Undergraduate Summer (URSI), il salmone Fondo di ricerca Lucy Maynard, premio NASA No. NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence in Scienza e Tecnologia (NSF-CREST) ​​award No. 0630388 e la NSF premio n ° 1058385.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tunable Helium-Neon laser  Research Electro-Optics 30602 Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors Thorlabs PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera Casio
Quartz Cuvette Starna Cells 21/G/5
LoggerPro (Software) Vernier http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8 Wolfram http://www.wolfram.com/
5x-10x variable zoom Galilean beam expander Thorlabs BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm Thorlabs LA1257

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References

  1. Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  2. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105-20987 (2008).
  3. Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
  4. Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
  5. Pawley, J. B. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd Edition, Springer. New York. (2006).
  6. Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
  7. Demtröder, W. Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. Springer 3rd Ed. New York. (2003).
  8. Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, (3), 101-107 (2012).
  9. Mood, A., Graybill, F., Boes, D. Introduction to the Theory of Statistics. 3rd edition, McGraw-Hill. (1974).
  10. Taylor, J. R. Classical Mechanics. University Science Books. (2005).
  11. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
  12. Bevington, P. R. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. McGraw-Hill Book Company. New York. (1969).
  13. Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15, (4), 294-325 (1975).
  14. Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).

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