Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme

Engineering
 

Summary

Burada sunulan tekniği özgürce tek dalga boyu maruz kullanılarak mikroskobik türler yüzme yolunu ölçer. C. elegans pahalı mikroskoplar için ucuz bir alternatif olarak gölge görüntüleme göstermek için kullanılır. Bu teknik yönü, hız, ivme ve güçlerini ölçmek için çeşitli yönelimleri, ortamları ve türler karşılamak için adapte edilebilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu çalışma, pozisyon, hız, ivme ve ışık tek dalga boyuna karşılık olarak su içinde süspansiyon haline getirilmiş bir sütun nematodların ettirici davranışı ile ilgili kuvvetleri gibi fiziksel özelliklerinin ölçümü sağlayan bir ucuz ve basit bir teknik gösterilmiştir. Biz iki farklı örnekler kullanarak Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme (SWSI) kullanılarak mikroskobik organizmanın lokomosyonu değerlendirmek nasıl gösterilmektedir.

İlk örnek C ortalama kökenli bir sistematik ve istatistiksel açıdan bir çalışmadır bir su sütununda elegans. Bu çalışma için, canlı ve ölü vahşitip C kullanılır biz yerçekimi alanındaki ölü solucanlar pasif iniş ile nematod aktif hareketin hızını ve yönünü karşılaştırıldığında elegans., bu çalışmada iniş-zamanlarda hiçbir fark olmadığını göstermiştir. Ortalama iniş tutarlı 633 nm kullanarak hem canlı hem ölü solucanlar için 0.1 mm / sn ± 1.5 mm / snışık.

İkinci örnek seçme bireysel C'lik bir vaka çalışması elegans dikey su kolonunda iniş sırasında yönünü değiştirerek. Hızlanma ve kuvvet bu örnekte analiz edilir. Bu vaka çalışması, geleneksel mikroskopları ile erişilebilir olmayan bir ortamda tek dalga boylarını kullanarak davranışlarını değerlendirirken Swsi kullanılarak değerlendirilebilir diğer fiziksel özelliklerinin kapsamını göstermektedir. Tek başına bir nematodu yaklaşık Bu analiz kullanılarak 28 nN aşan bir kuvvet ile agresif yeteneğine sahiptir.

Bulgularımız dönüm veya yerçekimi alanına karşı taşırken yaşayan nematod 28 NN uygulamak olduğunu göstermektedir. Bulgular ayrıca nematod pasif bir su sütunu iner öneririz, ancak aktif öncelikle yönünü çevirerek yerçekimi gücüne dayanabilecek.

Introduction

Caenorhabditis elegans duyusal biyolojisi ve davranışları anlamak için son zamanlarda gen regülasyonu, kalkınma ve daha mekanizmaları çalışmak için güçlü bir model organizmadır bir serbest yaşayan faydalı toprak nematod olduğunu. Sadece 302 nöronlar, C olmasına rağmen elegans kompleks ettirici desenler, üreme davranışları, navigasyon, kemotaksi ve diğer davranışları yeteneğine sahiptir. C. elegans mekanoreseptörleri, kemoreseptörleri ve hatta mavi dalga boyundaki ışığın (Ward ve ark., 2008) 1. algılar sahip. Çok duyu ve motor fonksiyonda sinir devresi ve C genel ettirici desenleri hakkında bilinen iken elegans, daha az çoklu, eşzamanlı uyaranlara veya mikroskop altında örnek alınabilir daha karmaşık çevre koşullarına tepkileri hakkında bilinmektedir. Birkaç çalışmada yüksek plastik 2,3,4 daha da karmaşık ettirici desenleri ortaya koymuştur. Bizim metodolojik yaklaşım NEM çalışmalarını sağlayacakbunların da aynı anda birden fazla çevre koşulları sağlamak için, gerçek zamanlı olarak çözelti içinde atodes. Bu soru, geleneksel mikroskop tabanlı görüntüleme teknikleri kullanılarak ele zordur. Biz bize ettirici davranışlarını incelemek, hem de farklı çevre koşullarına yanıt lokomosyonu değiştirmek için nematod yeteneklerini belirlemek için bir su sütunu içinde nematod yerleştirmek için olanak sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdi.

Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme (SWSI) geleneksel mikroskoplar eksikliklerin giderilmesi için ilk kez bu yazıda sunulmaktadır. Geleneksel mikroskoplar derinliği 5,6 yatay bir odak düzlemi birkaç mikron türün gözlemlemek için sınırlıdır. Tek dalga boyu çalışmaları ile ilgili, en geleneksel mikroskoplar çok geniş, genellikle, 50-100 nm beyaz ışık süzmek için renk filtreleri kullanın. Işaret korurken SWSI için bir lazer kullanarak en az 1 nm dalga boyu seçimi daraltırificant ışık yoğunluğu 7. Benzer şekilde, tek bir dalga boyu C yüzme frekansları ölçmek için kullanılmıştır gerçek zamanlı 8 elegans.

Bizim yöntemin ilk gösterimi için, bir serbest yüzme C yatay konum, x, ve dikey konumu, y, monitör yaklaşık bir santimetre bir mesafede bir su sütununda elegans. Yerçekimi dikey olarak da hareket ettiği için, özellikle, dikey hareketi ilgilendi. Bu su sütununda iner gibi dikey konuma lineer uyum eğimi nematod düşey hız, v Y verir:
Formül (1)

Kök ortalama hatası (RMSE) 9 kare uyum kalitesini gösterir ve azalan hızı genellikle sabit olup olmadığını gösterir. Dikey hızları daha sonra gereksinimleri için ortalaması alınırh türleri ve ölü solucanlar. Bu sonuçları kullanarak, solucanlar deneyim tahmin edilebilir sürükleyin.

Bizim yöntemin ikinci gösteri için, C seçili gözlenen solucanlar çoğunluğunun aksine sabit bir oranda alçalma vermedi elegans. Seçilen solucanlar etrafında döndü ve yukarı yüzerek veya iniş devam etmeden önce bir süre süpürdü ya. Fiziksel, bu vaka çalışması bir yüzme mikroorganizmanın itme hesaplanabilir olduğunu göstermektedir. Newton yasaları yön değiştiren bir vücut net bir kuvvet ima hızlandırır dikte, Formül 1 O vücutta 10 etkili olduğunu:
Formül 2 (2)

nerede p olduğunuDoğrusal momentum ve t zamandır. Solucanın kütlesi sabit kaldığı için, solucanın ivme solucan üzerine etki eden kuvvet ile doğrudan orantılıdır. Bunun bir sonucu olarak, dikey net güçtür:
Formül 3 (3)

m bir solucanın kütlesi ve bir y ivmenin temsil eder. Dikey yönde net kuvvet daha sonra aynı yönde sonsuz itme temsil eder. Toplam itme hesaba yatay bileşeni alınarak hesaplanabilir.

Protocol

1.. C. elegans Hazırlık

  1. Genç yetişkin C petri tabak hazırlayın C süspansiyonu içeren önceki deneylerde de tarif edildiği gibi elegans sıvı dolu bir küvet 11 elegans.
  2. Video analiz gününde, doğrudan adım 2'de tarif edildiği gibi bir platin almak kullanarak iyonu giderilmiş, damıtılmış su ile doldurulmuş bir küvet içine canlı genç yetişkin nematodları almak.
  3. Ölü C'yi hazırlayın kloroform maruz elegans. Aşama 2'de tarif edilen canlı nematodları toplama için tarif edilen prosedür takip edilerek devam edin.

Video Analizi 2. Optik Kurulumu

  1. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, gölge görüntüler oluşturmak için deney düzeneği bir araya getirin. Kamera, ekranın bir önden görünüşünü yakalamak mümkün olduğu gibi ekrandan herhangi bir mesafede yerleştirilebilir. Iyi bir yer ekrana bakacak küvete yanındadır.
    1. En az iki aynalar kullanmakiriş 12 mm'lik bir çapa genişletilir, böylece ışın Galilean genleştirici içine ayarlanabilir helyum-neon lazer çıkışını yönlendirmek.
    2. Kiriş engel olmadan iğne delikleri içinden geçer, böylece ışın yolu, bir veya iki iğne delikleri yerleştirin. Hizalama korunur sağlamak için iğne delikleri kullanın.
    3. 10 mm derinliğinde ve 4 cm boyunda, 10 mm genişliğinde olan bir monte kuvars küvet üzerine genişletti ışını doğrudan.
    4. 75 mm pozitif odak uzunluğuna sahip bir dışbükey lens kullanarak ışın büyütün.
    5. Yaklaşık 120 cm lensten bir projeksiyon ekranı yerleştirin. Bu daha büyük mesafeler gölge görüntünün daha büyük bir büyütme verecektir. Ancak, görüntünün kalitesi daha düşük bir ışık yoğunluğu ve parazit kırınım artan bir fark edilebilirlik ile birlikte azalacaktır.
    6. Hemen yanındaki ekrana bakacak küvete, en az 60 fps kapasitesine sahip yüksek hızlı bir kamera yerleştirin.
  2. Optik dizi yakın bir diseksiyon mikroskobu yerleştirinküvetin içine nematod hızlı aktarımı için.
  3. Geçici bir süre için genleşmiş kirişe dik bir küvet tutucusu merkezine mm bölünmeler ile şeffaf bir cetvel sağlamak, böylece yayar ekrana cetvelin büyütülmüş görüntüsü. Video analizi için uzunluk ölçeğini ayarlayın.
    1. Projeksiyon ekranında, projeksiyon ile müdahale önlemek için yansıtılan görüntüden merkezi şeffaf cetvel kapalı kullanarak ölçek mesafeyi işaretleyebilirsiniz. videosu için tıklayınız.
    2. Bu görüntü kaydetmek ve büyütme ölçmek. Kurulumdan cetvel çıkarın. Nedeniyle renk sapmalarını değişecektir merceğinden her dalga için ışığın kırılma açısı gibi diğer dalga boyları için bu adımı tekrarlayın.
  4. Küvet yerine ve damıtılmış su ile jantın arasında, 1 mm olarak doldurun.
  5. Ölçek mesafe aynı yer, böylece oda ışığı yanarken kayda başlamakYansıtılan görüntü olarak görüntüleri. Işık kapatmak.
  6. Ince, basık platin tel kıracağı kullanarak, bireysel genç erişkin C'yi hareket suyun yüzeyine seçim dokunarak küvet içinde agar plakasından her seferinde bir elegans. Nedeniyle dağınık ışık demeti girdiğinde nematod su sütununda görünür hale gelecektir. videosu için tıklayınız.
  7. Onlar genişletilmiş lazer ışınının geçerken solucanlar yansıtılan görüntüleri filme. Bu yansıtılan görüntü ters ve solucanlar gerçek hareket ters yönde hareket görünecek dikkat etmek önemlidir. Yerçekimi ile inen Worms (Şekil 2) ekranda yukarı doğru hareket görünür.

3.. Video Veri Hazırlama

  1. Video analiz programına ithal video.
  2. Önceden belirlenen büyütme faktörü kullanılarak ölçek ayarlayın.
  3. Track bütün yolu boyunca en az 10 veri noktası ile gölgeli nematodun başının doğrusal yer değiştirme alınmıştır.
  4. Türevi ("Y", "zaman") alarak dikey yönde hız bulun ve aşama 2.2 'de belirlenen büyütme faktörü ile bu değer bölün.

4.. Veri Analizi

  1. Bir C doğrusal iniş analiz elegans:
    1. Karşı zaman grafiği üzerinde dikey konumda veri noktaları genel olarak düz bir çizgi oluşturacak şekilde kontrol ediniz. Bazı sapmalar nedeniyle nematod baş hareketi göz ardı edilebilir. Veri noktaları genellikle, düz bir çizgi oluşturacak 4.1.2 adıma devam ederseniz, aksi halde iniş doğrusal olmayan ve analiz Bu protokol adımı 5.1 kullanılarak devam edilmelidir.
    2. Analiz menüden verilere düz bir çizgi 12 uyarak bir lineer regresyon çizgi oluşturun. Bu çizginin eğimi daha sonra C dikey hızıdır.elegans. Eğim, belirli bir aralık boyunca zamanlı olarak değişiklik bölü konumda değişimdir. Bu şekilde, canlı ve ölü kurtların azalan hız (Şekil 3) belirler.
    3. Nematodlardan dikey yüzme hızlarını ortalama. Yaklaşık 50 solucanlar bir numune boyutu yeterlidir. Ölü solucanlar sürüklenme hızları canlı solucanlar yüzmek hızlarını karşılaştırın.

5. C. Doğrusal Olmayan Hareket Analizi elegans

  1. Bölüm 3, su sütunu içinde doğrusal olmayan bir iniş (Şekil 4) gösteren bir analiz video dosyasını seçin. Doğrusal olmayan bir iniş bu protokolde adımı 4.1.1 kullanılarak tespit edilebilir.
  2. Video analiz yazılımı 'Analiz' menüsünden 'Curve Fit' seçeneğini seçin. İkinci bir emri (kuadratik) polinom seçin. Eğriye uyacak.
  3. Ilgi bir bölge için, her yan o üzerinde parantez kaydırarak grafiğinde uyacak şekilde ayarlayabilirsinizf grafik üzerinde uygun eğri kadar uyum içinde ve / veya iyi hata çubukları, içinde veri noktalarına çok yakındır. Uydurma programı zamana karşı dikey konumu takılan eğri için bir matematiksel ifade verir. Fiziksel özellikleri ile bağlantılı program tarafından verilen uygun eğri hataları göz önünde bulundurun. Aşağıda% 15 veya göreceli bir hata, genellikle kabul edilebilir.
  4. Devamı için eğrisi verilerinin ek bölümleri kapsayacak şekilde uyar. Optimum kapsama alanı için 13 fonksiyonları Spline: Eğri örtüşme uygun olduğundan emin olun ve komşu eğrileri hizaya çalışın böylece örtüşen bölgelerde yamaçları maç.
  5. Adım 5.1.3 elde matematiksel ifadeyi kullanarak monte eğrisinin türevini alarak ilgi bölge için hızını elde. Hızları zaman içinde değişebilir. Türev fonksiyonu eğiminin olduğuna dikkat edin. Matematiksel türevi ya da grafiksel olarak elde edilebilir. Bu durumda, belirli bir matematiksel expr kullanımı pratikEssion.
  6. Ivme elde etmek için monte eğrilerinin ikinci türevi al. Hızlanma süresi değişebilir.
  7. Solucan uyguladığı itme, hesaplamak için solucan kütlece ivme çarpın. Bir tahmini makul kitle su solucanı çoğunlukla oluştuğunu farzedelim 3 ug olduğunu.

Representative Results

Sabit Descent

İlk soruşturma C azalan oranlarında hiçbir ayırt farklılık gösterir SWSI 633 nm kullanarak sırasında elegans. Azalan oranları canlı ve ölü C hem de 0.1 mm / sn ± 1.5 mm / sn 'de sabit olduğu bulundu elegans. 50 solucan bir numune boyutu canlı ve ölü solucanlar her ikisi için de% 7 makul bir varyans oluşturulur. Sürükleme kuvveti yerçekimi kuvveti eksi kaldırma kuvveti eşittir, böylece azalan hızı sabit olduğundan solucanlar üzerinde etkili hiçbir hızlanma yoktur. Bu solucanın yoğunluk suyunkinden biraz daha büyük olduğunu ifade eder; Ancak altındaki tahminleri için bir nematodun yoğunluğunun yaklaşık bu suyun olduğunu varsaymak halen pratik değildir.

Değişen Yönü

İkinci soruşturma, bir vaka çalışması, nematod yön değiştirme yeteneğine sahiptir ve karşı yukarı yüzebilirsiniz gösteriyoryerçekimi. Bu eğrilerin ikinci türevleri zamana karşı ivme (Şekil 5) grafiğini oluşturmak için yivli olabilir, böylece iki eğrileri nematodun dik yer değiştirme halinde monte edilmiştir.   Bu iyi bir uyum korurken mümkün olduğunca düşük polinom düzeni tutmak için tavsiye edilir. Bir alt polinom düzeni zamanla hızlanma az farklılık gösterir. Polinomun sırası çok yüksek ise, daha yüksek dereceden polinom, ihmal edilebilir ve bu nedenle gereksiz olacaktır. Bu solucan 2 ± 0.002 mm / sn 2, etrafında döner ve kısa bir süre sonrasına kadar aynı oranda 0.110 mm / sn 2 ± 0.002 mm / sn 2 de hızlandırır 0.110 mm / sn sabit bir oranda yavaşlar dönüş noktası. C. ivme sıfıra düşene kadar mm / sn 2 0,00708 t - elegans 1,252 azalan bir ivme ile yukarı doğru hareket eder. Zihin Denk tutulması. 3 ve 3 & # tahmini kitle solucan956, gr, solucan kısa dönüş noktasına kadar sonra 0.33 pN dikey bir net kuvvet, F Ny uğrar.

Descent: yerçekimi, sürükle, kaldırma kuvveti ve itme (Şekil 6a): solucan dönüş noktasına ulaşıncaya kadar solucanın üzerine etki eden kuvvetlerin üç tipi vardır. Net kuvvet üç güçlerin vektör toplamına eşittir. Burada dikey bileşenleri sadece düşünün:
F Ny = F Dy + F Ty-F g + F B (4)

F B kaldırma kuvveti olduğu. F g büyüklük olarak eşittir, ancak solucanın yoğunluğu suyun olduğunu varsayarak kaldırma kuvvetine yönde tersidir. Denk. 4 daha sonra aşağıdaki şekilde yazılabilir:
F Ny = F Dy + F Ty (5)

F Ny iniş esnasında sabit kalır. Bu imaNematod dönüş noktasına ulaşıncaya kadar F Dy + F Ty sabit kalır. F Dy yolun başlangıcıdır üst, en büyük ve hızlı dönüş noktasında sıfır olana kadar yavaş yavaş sıfıra düşürür F Ty F Ny sabit tutmak için artırmak gerekir.

Turnaround: düşey hızı bu noktada sıfıra eşit beri dönüş noktasında düşey yönde hiçbir sürtünme kuvveti yoktur. Şekil 6b'de gösterildiği gibi, K g, kaldırma kuvveti, F ve B dikey sonsuz baskı, F Ty - dikey doğrultuda etki eden kuvvetler, sadece yerçekimi vardır. Bu noktada, C itme elegans belirlenebilir:
F Ty = F Ny (6)

Yörünge altındaki basınç daha sonra solucan ağırlığının yaklaşık% 0.001 olan 0.33 pN, kabaca eşittir. Dikkate alarakbu hesabı tahmini ağırlığı, bir C F g elegans, 28 nN olduğu

Ascent: Benzer şekilde, çıkış, sürükle artar ama aşağı çekti (Şekil 6c) sırasında:
F Ny =-F Dy + F Ty (7)

Solucan tarafından uygulanan itme şimdi daha büyük olması ve sürükleme kuvvetinin toplamını ve ağırlığını eşit olmalıdır. Solucan kadar yüzmeyi başlayan sonra yavaşlıyor. Solucan soyundan ile aynı oranda yukarı yüzmek için, sonsuz en azından iki kere ağırlığın bir yukarı doğru kuvvet uygulamak gerekir.

Gezinip

Yaklaşık 3 saniye için iniş yavaşlatan bir solucan bir örneği Şekil 7 de gösterilmiştir.   A 3 üncü derece polinom genel yolu için makul bir seçimdir. Bu uyum ikinci hızlanma ve hız, en hatalar% 15 daha az bulunmaktadır. Solucan önemli bir upwa ile başlarrd itme, yavaşlar ve 68 sn arkanı başlar; Bununla birlikte, yukarı doğru ivme sürekli olarak azalır (Şekil 8)   net ivme sıfır 68.5 çevresinde saniye eşittir kadar. Bu da hız başka bir sıfır noktasına ardından aşağı yönde bir net hızlanmasına neden olur (Şekil 9)   ve nematod 69 sn tekrar inmeye başlar.

Bu durumda, gözlemlenen maksimum dikey ivme 2.7 mm / sn 2 olması dikkat çekicidir. Dönüm noktalarında hızlanma / sn 2 0,455 mm ve vardır - sırasıyla 0.455 mm / sn 2; etrafında döner ve yüzer nematod durumunda yaklaşık dört kat daha büyüktür. Denklem kullanma. 6, bu yukarı doğru itme ilk dönüm noktasında yaklaşık 1.32 pN olduğu tahmin edilebilir. Yukarı itme 1.32 pN, böylece ikinci dönüm noktasında, net ivme negatiftir.

o: keep-together.within-page = "always"> Şekil 1
Şekil 1.. Deneysel kurulum. Lazer ışın genişletici, lens ve ekran deneysel kurulum için gereklidir. Direksiyon aynalar ve pinholes ihmal edilebilir, fakat optik hizalama daha az istikrarlı hale getirecek.

Şekil 2,
Şekil 2.. Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüsü (SWSI). 543 nm lazer ışığı 2 mW bir solucanın gölge kullanarak ekrana yansıtılıyor. Nematod yukarı düşmeye görünür böylece görüntü terstir.

424/51424fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/>
Tek bir yabanitip C Şekil 3.. Dikey iniş su kolonunda elegans. Bu nematod 633 nm tutarlı ışığın gölgesinde kalmıştır. Doğrusal bir uyum eğimi 0.01 mm / sn ± 1.09 mm / sn aşağı hızını gösterir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4,. Tek bir yukarı doğru yüzme vahşi tipli C değiştirme grafiği elegans. iki yivli uyan nematod genel yolu izlemek. Uyum ikinci türev ivme ortaya koymaktadır. 0.110 mm: maksimum ivme kolayca uyum birinci belirlenir / Sn 2 ± 0.002 mm / sn 2. Veri noktaları ve zinde görünür kalabilir, böylece sadece bir kaç hata çubukları gösterilir. Bu nematod 633 nm tutarlı ışığın gölgesinde kalmıştır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Tek bir vahşi tipli C Şekil 5,. Hızlanma grafik elegans. Bu nematod yavaşlatacak ve sonra yukarı doğru hareket etmesine neden olan 0.110 mm / sn 2 ± 0.002 mm / sn 2 sabit bir yükseliş ivmesini sürdürüyor. Kısa bir süre dönüş noktasından sonra hızlanma giderek azalmakta ve net ivme sıfıra azalır. g "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Bu güçlerin etkisi birbirlerini iptal böylece noktası ve tırmanış. Buoyancy ve yerçekimi dönüm iniş için Şekil 6. Kuvvet şemaları, yönde büyüklüğü ve karşısında eşittir. Bu nedenle bu diyagramlar gösterilmemektedir. (A) solucan sürükle ve itme yukarı bakacak şekilde azalan edilir. (B) solucan sürükle olmadan yörünge düşük noktada. İtme yukarı işaret ediyor. (C) solucan itme yukarı bakacak iken sürükle aşağı bakacak şekilde yükseliyor.

"Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/>
Şekil 7. Tek gezinip nematod Hacmi grafiği. Solucan yavaşlar ve yaklaşık 68 sn civarında dönüş başlar ama yaklaşık 69 saniye azalan başlar. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 8,
.. Şekil 8 tek bir uçan nematod ivmesi grafiği Bu solucan, 2.7 mm / sn 2 yukarıya doğru bir ivme ile başlar sıfıra düşer ve sonunda bir düşüş ivme var -. 2.6 mm / sn 2 daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınızBu rakamın iyon.

Şekil 9,
Şekil 9. Tek bir uçan nematod Velocity grafiği. Bu solucan 68 sn durma noktasına gelir ve yukarı baş başlar, yavaşlar ve bir iniş ardından 69 sn dikey yönde sıfır hız ulaşır. bir görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.

Tablo 1
N2 C Tablo 1.. Ortalama iniş hızları elegans. canlı 50 ve 50 ölü nematod tr vardırOnların iniş sırasında acked. Inişlerde için ortalama hız Canlı ve ölü solucanlar için aynıdır: 0.1 mm / sn ± 1.5 mm / sn.

Discussion

SWSI tekniği serbest yaşayan nematod gibi mikroskobik organizmaların ettirici yeteneklerini anlamak için ek bir yol sağlar. Bu teknik sayesinde biz yerçekimi ölü nematod üzerinde çalışan aktif hareketlilik (yüzme) ve pasif sürüklenme arasında ayrım yapmak zorunda. Serbest yüzme nematodları suda hareket sırasında yönünü değiştirmek Buna ek olarak, biz nematod faaliyet ve nematod tarafından uygulanan olan sürükleme güçleri ve açısal kuvvetleri ölçebilir.

Nematodlar toprak içinde farklı çevresel koşullar karşılaşabilirsiniz. Su toprak içinde cepler, hem de katı parçacıklar ve farklı şekil ve dokular biyolojik malzeme vardır. Buna ek olarak, bunlar, 14 nematodlar yanıt bir çekim ortamı içinde mevcuttur. Ayrıca, toprağın yüzeyine yakın nematodlar farklı dalga boylarında ışık, sıcaklık ve nemde meydana gelen değişikliklerin yanı sıra maruz biyolojikbakteri, mantar ve diğer yırtıcı toprak organizmalar gibi değişkenler. Nematodlar, tüm bu farklı değişkenler yüzme ve farklı ortamlarda, emekleme, tornalama ve seyir stratejilerini değiştirerek yanıt vermek zorundadır. Bu karmaşık hesaplama tümü sadece 302 nöronlar, hareket içinde yer aldığı bir alt kümesi ve 95 vücut duvarı kas hücreleri tarafından gerçekleştirilmektedir. SWSI tekniği tarif tür ölçümler nematod bu seyir karmaşıklığı başarmak nasıl içine önemli bilgi sağlar.

Ilk bölümü için, biz yabanitip C genel azalan hızını ölçtük 633 nm ışık elegans. Bu ölçümleri kullanarak, sürükleme kuvveti bir solucan karşılaşır tahmin edebilirsiniz.

Bir hızlanan nematodun vaka çalışması için, kuvvetler hızı ile sürtünme kuvveti değişiklikleri beri sürekli bir değişim çıkıyor. Biz solucanın etkiyen kuvvetler hakkında yapabiliyorsunuz bazı ifadeler vardır. Solucan yavaşlar ve sw için çalışır gibiBu nematod'un yörünge düşük bir noktada sıfıra ulaşıncaya kadar im yukarı sürükleme kuvvetinin düşey bileşeni azalır. Bu noktada, solucan yüzmeye kadar yukarı doğru bir güce sahip olmalıdır.

Bu yöntem, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Berrak bir sıvı dolaşır herhangi mikroskobik türler Swsi kullanılarak izlenebilir. Çalışmalar dijital kameralar için erişilebilir herhangi bir dalga boyları ile yapılabilir. Dijital fotoğraf makineleri genellikle UV yakın IR dalgaboylarını almak olacaktır. Buna ek olarak, yatay çalışmalar dikey olarak yukarı lazer yönlendirilmesi ile gerçekleştirilebilir. Bu tür daha sonra bir mikroskoba gibi, yatay bir şeffaf yüzey üzerine yerleştirilebilir. Işın genişletici sonra ışın genişletici veya büyütücü lens ayarlayarak bulanık görüntüleri netleştirmek olabilir. Kullanıcı tutarlı ve kolay ışın uyum sağlamak için tabloya tüm bileşenleri tutturmak için emin olmalıdır.

Yöntem, uygun bir lazer wavelengt ile sınırlıdırhs ve çözünürlük. Kurulum basit olduğundan özünde yön ve dalga boylarında esneklik mevcut mikroskopları, üzerinde bu yöntemin avantajları da zayıflıkları vardır. Lazer içeriksiz optik ve benekler çözünürlüğünü sınırlamak. Bu sakıncaları bazıları kesinlikle uzaysal filtre içeren ve bir CCD kamera doğrudan görüntüsünü yansıtarak gelecekte gelişmiş olabilir.

Deney ilk defa yapıldığı gibi protokolde en kritik adımlar kolayca öğrenilebilir. Türbülans yaratmadan küvet içinde nematod yerleştirilmesi önemlidir. Ayrıca, titreşimler kurulum rahatsız ve solucanlar davranışını değiştirebilir. Görüntüyü gölge için kullanılan güç, sınırlamak için emin olun. Çapı 1 mm olan bir lazer ışın demeti boyunca 2 mW ısıtma etkileri önlemek için en fazla olmalıdır. Kurulum damıtılmış su haricindeki sıvıların kullanırken etkilerini saçılma için test edilmelidir.

Şu anda en çok microscopes dalga boyu aralığında hala çok geniştir beyaz ışık ya da renk filtreleri kullanarak yatay bir düzlemde çalışır. Gerçekten tek dalga boylarını kullanın ve görüntüleme senaryoda esneklik, yani yatay yerleşimini var mikroskoplar, genellikle bir avantaj veya diğer sınırlıdır. Ayrıca, mikroskoplar bu tür genellikle çok pahalı ve hala bizim yöntemin aksine odak düzlemleri ile sınırlıdır. Bizim kurulumu kolay son derece düşük bir bütçe ile inşa edilebilir. Bu yöntem, küçük finansmanı ile faaliyet okullarda, çevre şirketlerin yanı sıra diğer kuruluşlar tarafından kullanılmak üzere hazırdır. Gelecekte, bu yöntem hareketin ve mikroskopik türlerin mechanosensation gerçek zamanlı etkilerini incelemek amacıyla bir çok sofistike kurulumunda kullanılabilir. Bu yöntem, açıları ve kolayca kullanılabilir görüntüleme derinliklerde geniş bir dalga boyu aralığında bir yoğun çalışmalar yapmaktadır.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz Vassar Koleji Lisans Araştırma Yaz Enstitüsü (URSI), Lucy Maynard Salmon Araştırma Fonu, NASA ödül No NX09AU90A, Bilim ve Teknoloji (NSF-TEPE) Araştırma Mükemmellik Ulusal Bilim Vakfı Merkezi ödül No destek için minnettarız 0630388 ve NSF ödül No 1.058.385.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tunable Helium-Neon laser  Research Electro-Optics 30602 Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors Thorlabs PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera Casio
Quartz Cuvette Starna Cells 21/G/5
LoggerPro (Software) Vernier http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8 Wolfram http://www.wolfram.com/
5x-10x variable zoom Galilean beam expander Thorlabs BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm Thorlabs LA1257

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  2. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105-20987 (2008).
  3. Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
  4. Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
  5. Pawley, J. B. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd Edition, Springer. New York. (2006).
  6. Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
  7. Demtröder, W. Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. Springer 3rd Ed. New York. (2003).
  8. Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, (3), 101-107 (2012).
  9. Mood, A., Graybill, F., Boes, D. Introduction to the Theory of Statistics. 3rd edition, McGraw-Hill. (1974).
  10. Taylor, J. R. Classical Mechanics. University Science Books. (2005).
  11. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
  12. Bevington, P. R. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. McGraw-Hill Book Company. New York. (1969).
  13. Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15, (4), 294-325 (1975).
  14. Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics