Роман Растяжка Платформа для приложений в клеточной и тканевой Mechanobiology

1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa
Published 6/03/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Мы представляем в этой статье новый растяжения платформу, которую можно использовать для исследования одиночных клеточные реакции в сложной анизотропной двухосной механической деформации и количественной оценки механических свойств биологических тканей.

Cite this Article

Copy Citation

Tremblay, D., Cuerrier, C. M., Andrzejewski, L., O'Brien, E. R., Pelling, A. E. A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology. J. Vis. Exp. (88), e51454, doi:10.3791/51454 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Инструменты, которые позволяют применение механических сил в клетках и тканях или которые могут количественно механические свойства биологических тканей резко вклад в понимание фундаментальных mechanobiology. Эти методы широко используются для демонстрации того, как начало и прогрессирование различных заболеваний находятся под сильным влиянием механических сигналов. В данной статье представлен многофункциональный двухосного растяжения (BAXS) платформу на которые могут либо механически стимулировать отдельные клетки или количественно механическую жесткость тканей. Платформа BAXS состоит из четырех звуковой катушки двигателей, которыми можно управлять независимо. Отдельные клетки можно культивировать на гибкой подложке, которую можно присоединить к двигателям, позволяющих одним подвергать клетки к сложным, динамических и пространственно меняющихся полей деформации. С другой стороны, за счет включения нагрузки силой ячейку, можно также количественно механических свойств первичных тканей, которые подвергаются воздействию циклов деформации.В обоих случаях, надлежащий комплект зажимов должны быть спроектированы и установлены на платформе двигателей BAXS для того, чтобы твердо удерживать гибкую подложку или ткани интересов. Платформа BAXS может быть установлен на инвертированный микроскоп одновременно осуществлять проходящем свете и / или визуализации флуоресценции для изучения структурной или биохимической реакции образца при растяжении экспериментов. Эта статья предусматривает экспериментальные детали дизайна и использования платформы BAXS и представляет результаты для одной клетки и целые исследований тканей. Платформа BAXS был использован для измерения деформации ядер в отдельных клеток мыши миобластов в ответ на подложку напряжения и измерить жесткость изолированных аорты мыши. Платформа BAXS является универсальным инструментом, который может быть объединен с различными оптическими микроскопии того, чтобы обеспечить новые mechanobiological идеи на ткани уровней субклеточном, клеточном и вся.

Introduction

Механический микросреда играет важную роль во многих клеточных функций, таких как пролиферация, миграции и дифференциации, которые имеют огромное влияние в разработке и гомеостаза тканей, а также при заболеваниях 1-6. На протяжении многих лет, множество экспериментальных средств были использованы для механически стимулируют клетки или ткани и измерения механических свойств биологических тканей с целью повышения нашего понимания основного mechanobiology и изучения возникновения и прогрессирования заболеваний 6-17. Однако, надо часто основаны на различных экспериментальных устройств для достижения целей конкретного исследования. Данная статья представляет собой единый, многофункциональный, двухосного растяжения (BAXS) платформу, которая позволяет для исследований, которые исследуют роль, которую механические свойства и механические силы играют в биологии в субклеточном до целых масштабах длины ткани. Платформа BAXS позволяет не только для quantificatioн механических свойств изолированных тканей, но также облегчает способность применять простые, сложные, и динамические поля деформации в живых клетках, чтобы понять свои ответы на растяжение, что происходит в естественных условиях. Платформа BAXS также поддерживает способность выполнять живых клеток микроскопии во механических испытаний и возмущений на клетки и ткани.

Платформа BAXS является на заказ аппарат, который может быть использован для изучения влияния деформации подложки на клеточном уровне и выполнять испытания на растяжение на биологические ткани (рис. 1А). Алюминий нагреватель был изготовлен для размещения стандартную антенну 10 см Петри и поддерживать любые физиологические растворы при 37 ° С с помощью контроллера температуры и Kapton нагреватели (рис. 1b). Это BAXS платформа может быть интегрирована на перевернутой фазового контраста и / или флуоресцентного микроскопа и позволяет одновременно томографии (рис. 1в).Вкратце, платформа BAXS состоит из четырех линейных звуковой катушки двигателей из которых движущиеся части, установленные на миниатюрные шаровые линейное движение несущих горками, ориентированных вдоль двух перпендикулярных осей (рис. 1D). Этап линейного позиционирования установлен на каждой из четырех двигателей, чтобы обеспечить вертикальное перемещение зажимного системы, которая будет использоваться (рис. 1E). Положение каждого двигателя контролируется с помощью оптического датчика с разрешением 500 нм (рис. 1F). Все четыре двигателя регулируются независимо с контроллером движения, использующего оптический обратной связи с датчиком для выполнения команды движения (рис. 1 г). Интерфейс LabVIEW предоставляет полный контроль над величиной смещения, скорости и ускорения каждого двигателя в целях получения полностью настраиваемый, статическую и динамическую, деформацию клеток или образцов ткани.

Техника используется, чтобы вызвать деформацию в клетках достигается простым allowinг клеток твердо придерживаться гибкой и прозрачной подложке, а затем растяжение этот субстрат с помощью четырех двигателей платформы BAXS. Платформа BAXS позволяет устанавливать любой специально разработанный набор хомутов прикрепить основу на звуковой катушки двигателей. С этой целью мы разработали множество зажимов, к которой гибкая и прозрачная подложка, изготовленная из полидиметилсилоксана (ПДМС), могут быть прикреплены (2а-с и рис. 3). Поскольку зажимы будут подвергаться воздействию физиологических растворах, все части были изготовлены из нержавеющей стали, чтобы обеспечить стерилизации. Эти зажимы были тщательно разработаны, чтобы принести подложку как можно ближе к объектива микроскопа для повышения качества изображения при минимизации стресса на подложке при растяжении (рис. 2, г).

То же самое BAXS платформа может также использоваться для количественного определения жесткости маленькие образцы ткани, используя соответствующий набор зажимов с ADAPТед опоры для образцов ткани и клетки нагрузки для мониторинга силы. Несколько подходов могут быть приняты, чтобы смонтировать ткани платформы двигателей BAXS; в этом случае нержавеющей стали minutiens насекомых штифты можно подключить через отверстие сосудистых тканей для выполнения испытания на растяжение (фиг. 4A-B). Кроме того, для толстых тканей без естественное отверстие, ткани края могут быть на руках в положении с помощью зажимов, прикрепленных к звуковой катушки двигателей или приклеенных к маленькие стеклянные слайды с биологической клея и приложенных к двигателям с зажимами. Для выполнения испытания на растяжение требуется миниатюрный датчик нагрузки и могут быть легко включены на платформу двигателей BAXS и используется для измерения силы, действующей на ткани при растяжении цикла (фиг.4С). Поскольку платформа BAXS состоит из четырех двигателей, введение второго тензодатчика позволяет выполнять испытания на растяжение вдоль двух ортогональных направлениях. Эта способность позволяет quantifу механическое жесткость одной ткани вдоль двух перпендикулярных направлениях в течение того же эксперимента.

Важно отметить, что во всех конфигураций, клетки или образцы ткани, представляющие интерес, всегда поддерживается в контролируемой температурой бане, доступной для пользователя. Эта способность позволяет для введения фармакологических средств во время выборки растяжения с целью изучения временного отклика образца. Кроме того, как оптическая ось инвертированного микроскопа остается беспрепятственно, все формы микроскопии по-прежнему доступны для пользователя. Наконец, так как все четыре двигатели платформы BAXS независимы можно применить настраиваемый полей деформации в образце, представляющего интерес. В естественных клеток и тканей подвергаются сложным и анизотропной растяжения, которые могут быть более соответствующим образом имитируется в этой платформе, в отличие к традиционному одноосного растяжения платформы 7,13,15,18,19. Кроме того, физические характеристикиполя деформаций может быть изменен на лету во время эксперимента. Эти способности позволяют пользователю исследовать клеточный и тканевом уровне ответ на широком ряде весьма сложной, анизотропной, временно, и пространственно меняющихся полей деформации. В этой статье описаны преимущества и ограничения платформы BAXS а также его дизайн, принцип работы, и экспериментальные данные для одной клетки и экспериментов целых тканей.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор платформы BAXS. А) Вид сверху на платформе BAXS показывая четыре звуковой катушки двигателей. Б) детальную картину блюдо нагревателя Петри, используемой для поддержания клеток и тканей при температуре 37 ° C. C) Платформа может быть установлен на инвертированный микроскоп выступать с концертами- изображений клеток при растяжения экспериментов.D) Подробная картину двигателя звуковой катушки; подвижная часть платформы. Е) детальную картину сцены линейная позиционирования, позволяющей вертикальное перемещение зажимных систем. F) детальную картину оптического датчика, который обеспечивает в режиме реального времени положение двигателя в контроллер управления движением. G) детальную картину контроллера движения показывая четыре входа оптических датчиков и выходные мощности к четырем звуковой катушки двигателей.

Рисунок 2
Рисунок 2. Зажима для экспериментов клетки растяжения. AB) Фотографии, показывающие детали зажимов, используемых для крепления PDMS подложки звуковой катушки двигателей для растяжки. C) Субстрат оборачивают вокруг цилиндрической части зажима с его крепежной FeaturES сидит в канавке в верхней части. Затем подложка прикреплена с помощью винтов, которые толкают субстрат / якорь особенности в верхний паз. D) Иллюстрация платформы BAXS с зажимами проведение субстрат на месте. На вставке подробный вид подложки с клетки, прикрепленные к ней сидит чуть выше покровным стеклом и объектива микроскопа.

Рисунок 3
Рисунок 3. Ведомость материалов мембраны и ее системы зажима. Рисунки, показывающие размеры главных частей интегрированы в двухосной платформы для проведения экспериментов клетки растяжения.

Рисунок 4
Рисунок 4. Эксдостаточно зажимного системы оценки жесткости мелких сосудов калибра. AB) детальные снимки зажимного системы, используемой, чтобы вызвать деформацию в 1 мм аорты диаметр мыши. Штифты из нержавеющей стали были тщательно формируется в открытых треугольников разрешить судну скользить по обе булавки. C) Иллюстрация платформе BAXS с зажимы держала сосуд и датчик нагрузки, прикрепленный между неподвижным двигателем и левой зажима. На вставке показан детальный вид сверху судна, установленного на штифтов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Механической деформации отдельных клеток

  1. Изготовление из PDMS субстрата с внедренными флуоресцентные шарики
    До изготовления подложки, флуоресцентные микросферы в водном растворе ресуспендируют в изопропаноле для повышения шарик перемешивание в PDMS из-за его гидрофобной природы.
    1. Пипетка 500 мкл флуоресцентных микросфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге при 16200 х г в течение 10 мин.
    2. Удалите супернатант и добавить 500 мкл изопропанола следуют с 5 мин встряхивания. Поместите флакон в сторону ночи в темноте, с тем чтобы позволить любые крупные частицы агрегатов для осаждения.
    3. На следующее утро, осторожно удалите супернатант в чистую микроцентрифужную флаконе. Это решение шарик может быть использован для изготовления более 5 субстраты. ПРИМЕЧАНИЕ: Решение шарик будет продолжать оседать в течение следующих 3 дней. Будьте осторожны, чтобы избежать ресуспендированием осадок.
    4. Налейте 0,5 г отвердителя при условии,с комплектом PDMS в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку с помощью научных баланс. По последовательных шагов, добавить в общей сложности 90 мкл шариков (в шести 15 дополнений мкл), встряхиванием в течение 1 мин между каждым добавлением. Отложите.
    5. Взвешивают 10 г PDMS и перемешивают в течение по крайней мере 12 мин с 0,5 г отвердителя с добавлением флуоресцентных шариков.
    6. Изготовление в СУ-8 2050 крестообразные формы, используя стандартные методы фотолитографии в соответствии с инструкциями изготовителя. Используемая форма имеет высоту 320 мкм и площадью 13,4 см2 (рис. 3). Пресс-форма может содержать 428 мкл или 440 мг PDMS.
    7. Налейте 400 мг в PDMS с бисером в крестообразным плесени с помощью пипетки передачи и вылечить в течение 2 часов при 80 ° С После отверждения, снимите подложку из формы (рис. 5А). Подложка может быть в чашке Петри при комнатной температуре в течение 2 недель без предъявления значительных изменений в его механических свойств. Налейте капельки PDMS (отвердитель: PDMS в соотношении 1:20) в чашке Петри с конечным размером примерно 4 мм в диаметре и вылечить их вверх дном в течение 2 часов при 80 ° C (фиг.5В). Эти анкерные особенности могут быть сохранены в чашке Петри в течение многих недель. Примечание: Поддержание блюдо вверх дном, чтобы предотвратить сплющивание капель от во время процесса отверждения.
    8. Воздушно-плазменная удовольствие (30 с при 30 Вт) субстрат и 8 анкерных особенности. Привязка функции на каждом конце подложки на расстоянии 4 мм от квадратной формы абзаце, присутствующих на подложке (рис. 5С).
  2. Монтаж мембраны на хомут
    1. Оберните каждый конец подложки вокруг рифленой цилиндрической части зажимы и закрепите его на месте с 2 винтами сверху (рис. 2б и показатели 5D-E).
    2. Винт 4 зажимы на держателе зажима и залить PDMS (соотношение 1:20), используя одноразовые тransfer пипетки на границе раздела между подложкой и рифленой цилиндрической части зажимов. Разведите неотвержденных PDMS вокруг рифленой цилиндрической части с помощью шестигранного ключа 1,5 мм.
    3. Налейте PDMS (1:20) в канавках до полного заполнено под действием капиллярных сил и вылечить сборку при 80 ° С в течение 2 часов (рис. 5F).
  3. Сеялки клетки на мембране
    1. Воздушно-плазменная удовольствие (30 с при 30 Вт) все собрание для стерилизации и функционализировать субстрат для обеспечения коллагена покрытием.
    2. Функционализации поверхности подложки, где клетки будут посеяны 1 мл 0,02 М уксусной кислоты с добавлением 16 мкг / мл крысиного хвоста коллагена при комнатной температуре в течение 1 часа. Желаемый конечный плотность коллаген 5 мкг / см 2.
    3. Промыть подложки 3 раза фосфатным буфером и дать высохнуть при комнатной температуре в течение по крайней мере в течение 10 мин.
    4. Добавить 40 мкл культуральной среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей Серум и 1% пенициллина-стрептомицина, содержащий 2000 клеток в центральной части подложки, чтобы покрыть площадь 1 см 2 (плотность клеток: 20 клеток / мм 2). Плотность клеток могут быть изменены в соответствии с экспериментальными требований.
    5. Положите весь узел в стандартном инкубаторе для клеточных культур с субстратом вверх с падением культуральной среде, содержащей клетки на ней. ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка должна храниться вместе с субстратом вверх, по крайней мере 3 часа, чтобы позволить клеткам прочно прикрепить его. Чтобы предотвратить испарение, 30 мкл теплой культуральной среде добавляют в капли на подложке каждые 45 мин в течение 3 часов.
    6. Через 3 ч, флип весь узел в чашку Петри, наполненную свежей культуральной средой, чтобы погрузить подложку и инкубировать в течение ночи, чтобы позволить клеткам пролиферировать.
    7. На следующий день, подготовить HEPES-буферный солевой раствор (HBSS; 20 мМ Hepes, 120 мМ NaCl, 5,3 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO 4, 1,8 мМ CaCl 2, и 11,1 мМ деxtrose). Отрегулируйте рН до 7,4. Примечание: раствор HBSS должен быть подготовлен в день и выдерживают при 37 ° С в течение экспериментов. Это физиологический раствор используется для поддержания клеток на столике микроскопа, имитируя нормальную среду ткани / крови.
    8. Установите настройку на перевернутой фазового контраста или флуоресцентного микроскопа горе зажим-субстрат сборки на платформе и двигателей BAXS. Заполните чашку Петри внутри посудомоечной нагревателя Петри с Гепеса (рис. 2D).

2. Жесткость Измерение малого калибра судов

  1. Подготовка
    1. Кребс физиологический раствор: Приготовьте раствор 118,1 мМ NaCl, 11,1 мМ D-глюкозы, 25 мМ NaHCO 3, 4,7 мм KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 1,2 мм KH 2 PO 4 и 2,5 мМ CaCl 2. Отрегулируйте рН до 7,4 и кислородом решение с карбогена медицинского газа (95% O 2/5% СО 2) в течение 30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Кребс решением,на должен быть подготовлен в день и выдерживают при 37 ° С в течение экспериментов. Это физиологический раствор используется для поддержания тканей живых, имитируя нормальную среду ткани / крови.
    2. Соберите приборы для вскрытия и механического оценки аорты сосудов: хирургические ножницы, согнутые пинцетом, микро-ножницы, хирургическое вскрытие микроскопа, 50 мл полипропиленовые центрифужные пробирки и 10 мл серологические пипетки. Хирургическая и эксперимент процедура не требует никаких стерильных условий. Установите зажимы платформы BAXS вместе с датчиком нагрузки заранее.
  2. Ткань Выделение и Рассечение
    Все экспериментальные процедуры, связанные лабораторных животных должны быть одобрены уходу и использованию животных комитета пользователей учреждения, что соответствует путеводителя по здравоохранению по уходу и использованию лабораторных животных пользователей стране.
    1. Выполните мыши эвтаназию с вдыханием 99% CO 2 (7 фунтов на квадратный дюйм)в Оргстекло камера (рис. 6А).
    2. Живота Открыть мыши и сократить грудной аорты кровотечение мышь.
    3. Снимите мембрану, грудной клетки и долей легких (рис. 6, б). ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации риска повреждения ткани, сохранить сердце, прикрепленный к аорте, не касаясь судно непосредственно, но работать с ним, используя сердце.
    4. Снимите сердце, корня аорты и грудной аорты, осторожно резки между судном и позвоночника. ПРИМЕЧАНИЕ: Не вызывать любую удлинение в сосуде во время иссечения сохранить внутреннюю структуру ткани нетронутыми (фиг.6С).
    5. Сразу погрузиться и держать сердце и аорту в растворе Кребса.
    6. Вырезать и тщательно мыть аорту в растворе Кребса, чтобы удалить любые сгустки крови. Удалить соединительную ткань с помощью микро-ножницы, пинцеты и хирургические рассекает микроскопом (рис. 6D-E). ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все длины судна и использовать ЗОкрестики корень для определения ориентации судна.
  3. Определение Размеры судов и монтажа
    Для определения жесткости сосуда, ненагруженном размеры сосуда необходимы и могут быть определены с помощью калиброванного микроскопа.
    1. Вырежьте аорты кольцо около 2 мм в длину и точно измерить его длину с помощью калиброванного микроскопа настройки (рисунки 6F-G). Положите этот сегмент сторону в растворе Кребса.
    2. Вырезать другой аорты кольцо как можно меньше между каждым из сегментов 2 мм (рис. 6F). Поместите этот небольшой сегмент на микроскоп стекло с просветом вверх и измерить толщину стенки с помощью калиброванного настройку микроскопа (рис. 6H).
    3. Заполните чашку Петри на платформе BAXS раствором Кребса, и вставьте 2 мм аорты кольцевой сегмент на мелкий штифтов (вставка на фиг.4С).

GE = "всегда"> Рисунок 5
Рисунок 5. Изготовление PDMS субстрат и монтаж.) После отверждения субстрат тщательно снимают СУ-8 2050 плесень и отложить в сторону в чашке Петри. Б) якорь особенности, сделанные из PDMS и помочь обеспечить подложку, на Зажимы. С) Субстрат с крепления особенности готов к установке. D) Подложка установлена ​​на 4 зажимов, которые затем смонтированных на держателе зажима (см. вставку). E) Подробное изображение подложки, установленный на 4 зажимами. F ) Процедура заливки PDMS в канавке под подложкой. Стрелка показывает PDMS медленно заполняя паз под действием капиллярных сил.

454fig6highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 6. Получение и выделение грудной аорты.) Подготовка хирургических инструментов и эвтаназии мыши. B) через продольную разрез брюшной стенки, грудной клетки и легких больших объектов, удаляются. С) аорта осторожно удаляют с помощью сердца, чтобы манипулировать ткань. D) Сердце и аорта ставятся в Кребса физиологического раствора. Аорта очищают путем удаления всех соединительных тканей. E) подробное изображение показывает сердце и аорта. F) сегмент аорты используется для оценки жесткости вместе с маленьких сегментов, используемых для измерения толщины. GH) точное длину (G) и толщину (H) каждого сегмента сосуда анализируются с помощью программы анализа обратную микроскоп и.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сотовый Растяжка

Платформа BAXS использовалась для исследования механической реакции ядра в отдельные клетки мыши миобластов (С2С12), подверженную подложки деформации 25%. Миобластов клетки находятся в мышечной ткани и постоянно подвергаются механическим растяжением и сжатием в естественных условиях. Форма и механические свойства клеточного ядра, было показано, играют важную роль в регуляции экспрессии генов и транскрипционной активности 20,21, а также в различных пороков развития и заболеваний, таких как Хатчинсона-Гилфорда прогерии синдрома (HGPS), Эмери -Дрейфус мышечная дистрофия (EDMD), дилатационная кардиомиопатия, преждевременное старение и рак 22-25. Таким образом, понимание того, как силы от внешнего механического микросреды влияют на структуру и функцию ядра исключительный интерес. Платформа BAXS был использован для исследования передачу усилия от ми croenvironment к ядру, растягивая подложки параллельно ее большой или малой оси. 7А-F иллюстрирует возможности платформы для стимулирования деформацию в подложке вдоль двух ортогональных направлениях. Кроме того, платформа BAXS может вызвать сложные деформации поля в подложке в дополнение к стандартной одноосной деформации полей равно-двухосного. На фиг 7G-H иллюстрирует гибкость обеспечивается независимый контроль области деформации вдоль двух ортогональных направлениях, что позволяет нам производить либо стандарт (сжатие) или чистый (не на сжатие) поле одноосной деформации. Платформа BAXS способен производить чистый одноосное поле деформаций, слегка потянув подложки в направлении, перпендикулярном к основной растяжения направление (рис. 7 г), чтобы компенсировать настоящее сжатия в подложке вдоль этого направления во время стандартной одноосного растяжения (рис. 7H ).

ntent "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 7
На рисунке 7. Смещение-деформация отношения от выполнения стандартных и чистый одноосном растяжении. AB) Флуоресцентные шарики вручную выбирается на первом кадре видео и гусеничные от одного кадра к другому до тех пор, максимальное протяжение не будет достигнута по горизонтальной (С) и вертикальной (D) направлениях. Сценарий MATLAB автоматически вычисляет компоненты тензора Грина натяжения для каждого кадра и производит калибровочной кривой штамма в отношении двигателя смещений 27. EF) Синие и красные линии соответствуют компонента Зеленого тензора деформаций по горизонтали и вертикальные направления соответственно. G) на растяжку и тот же субстрат на 4 мм по оси х и слегка тянутся вдольОсь у 1,5 мм (выделено красным) производит чистый одноосную поле, не компрессионной деформации в подложке. H) Растяжение подложки по оси абсцисс на 3,5 мм приводит к деформации 25% и компрессионной деформации 7%, когда концы подложки вдоль вертикальной оси закреплены (выделены красным цветом).

С возможностью выполнять визуализацию живых клеток микроскопии во натяжкой, ядра были окрашены флуоресцентным красителем живых клеток, который связывается с ДНК (Hoescht 33342). В общем, C2C12 клетки обладают эллиптические ядра с большой и малой оси. Во-первых, клетки были идентифицированы, в котором главные или второстепенные ядерные направлением оси, параллельной горизонтальном направлении растяжения. В этот момент клетки растягивается на 25% по каждой ортогональной оси растяжения во время получения изображения недеформированном и деформированном ядре, простирающихся между каждыми циклами (фиг. 8A-I). Таким образом, мы может оценивать деформируемость ядравдоль ее большой и малой оси под точно контролируемой деформации подложки. Ovuscule, плагин ImageJ, был использован для определения длины большой и малой ядерных осей. Эти длины были записаны в недеформированном состоянии и, когда ядро последовательно вытянуты вдоль ее большой и малой осей (фиг. 8G-I). Для расчета деформации ядра вдоль ее мелких и крупных осей, относительное изменение длины вдоль каждой оси в растянутых и недеформированных государств была вычислена:

где ε является деформация, L 1 является деформированной длина и L 0 является недеформированной длина.

Деформируемость ядра в С2С12 показывает механическую анизотропию, как это показывает значительно более высокую деформируемость вдоль малой оси (6,3 ± 1,1%) по сравнению с его главной осью (3,077; 0,6%) (рис. 8J). Кроме того, мы также рассмотрели роль актина и микротрубочек цитоскелета в регуляции ядерной деформируемость. Это было достигнуто путем деполимеризации нитей актина или микротрубочки избирательно используя цитохалазин-D и нокодазол соответственно. Деполимеризации нитей актина или микротрубочки был найден, чтобы вызвать потерю анизотропной деформируемости ядра (рис. 8J). Эти результаты подтверждают выводы, что цитоскелетные компоненты передают силы к ядру от подложки и которые также важны для сохранения природного механическое поведение ядра при деформации 25.

Рисунок 8
Рисунок 8. Растяжка протокол и ядерной деформируемость. Переменного тока) Схематическое изображение Stre tching протокол из одной клетки с ядром ориентирован горизонтально. Фаза контрастные изображения (DF) и эпи-флуоресцентный изображения (GI) из клетки окрашивали ДНК конкретного флуоресцентным красителем. Эта последовательность изображений иллюстрирует типичный сотовый растяжения эксперимент, в котором та же ячейка подвергается воздействию ортогональных деформационных полей. Масштабные бары 25 мкм. J) C2C12 показывает анизотропную ядерной деформируемость с малая ось деформации значительно больше, чем большой оси. В актин-или микротрубочки лишен клетки (CYT-й и нокодазолом, соответственно), эта анизотропия исчезает. В любых условиях, ядро ​​деформации существенно отлична от нуля под подложки деформации 25%. ** Р-значение <0,01, в паре Т-тест. † † Р-значение <0,01, † † † р-значение <0,001, один образец Т-тест.

Оценка судов Жесткость

т "> В последнее время наша группа исследовали влияние хронической избыточная экспрессия белка теплового шока-27 (HSP27 о / д) на формирование аорты бляшек в модели мыши атеросклероза подверженных (ароЕ - / -) 26. We показали, что HSP27 действует как atheroprotective белка, что снижает налета липидов и макрофагов изобилие и увеличивает интимы гладкомышечных клеток и содержание коллагена (9А-B). Для определения влияния данного гистологического ремоделирования на судно механических свойств, был использован платформа BAXS для измерения жесткость аорты.

Рисунок 9С показана типичная кривая напряжение-деформация от растяжения растяжения аорты кольца. Для количественной оценки жесткости, дополнительные модуль был вычислен из кривых растяжения при деформации 30%. Жесткость наклон касательной к кривой. Вводя датчик нагрузки на одну из платформ двигателей BAXS, одновременного получения displacemeнт и данные силы можно. Кривые смещения-сила были переведены в кривые напряжение-деформация на основе недеформированных расстояние от каждой аорты кольца. Напряжение и деформация вычисляются по следующим формулам:

где ε является деформация, L 1 является деформированной Длина, L 0 является недеформированной длина, с является стресс, F является силой и 0 является недеформированной площадь ткани под нагрузкой. В конкретном случае аорты кольца, недеформированная область (0) в два раза толщина кольцевых раза превышает длину сегмента.

Каждый образец был деформирован циклически с максимальной деформацией 40% при скорости сдвига 50 мкм / сек в течение 12 циклов с первых 11 циклов, позволяющих предварительной подготовки ткани и лаул одна для сбора данных. Мы обнаружили, что жесткость аорты сегментов ароЕ - / - HSP27 O / E мышей (62,8 ± 3,0 кПа) были значительно увеличены на 41% по сравнению с ароЕ - / - контроль модель мыши (44,4 ± 3,8 кПа) (рис. 9D) .

Взятые вместе, механическое оценка в сочетании с судна и зубного налета гистологии показали, что сверхэкспрессия HSP27 характеризуется повышенной жесткости сосуда и коллагена / гладкой содержанием мышечных клеток. Эти результаты позволяют предположить, что HSP27 может потенциально увеличить стабильность атеросклеротических поражений и, следовательно, уменьшить риск разрыва бляшки.

Рисунок 9
Рисунок 9. Влияние HSP27 над-выражением на жесткость сосудов. Мы показали, что HSP27 изменение гистологический компоsition атеросклероза поражения за счет увеличения интимы гладкомышечных клеток (A: анти-α-SMA) и содержание коллагена (B: picrosirius красное пятно) С) Типичный кривая напряжение-деформация, полученная от растяжения аортального сосуда, в котором жесткость вычисляется на 30. % от штамма. . Жесткость наклон касательной (красная линия) к кривой D) Хроническая избыточная экспрессия HSP27 увеличивает сосудов жесткость по сравнению контрольного ароЕ - / - мыши модель (D). Шкала бар в (а) и (B) являются 40 мкм и 400 мкм на вставках. L = просвет, я = интима, пунктирные линии очерчивает СМИ. * Р-значение <0,05, в одну сторону ANOVA. *** Р-значение <0,001, в одну сторону ANOVA. Рисунок адаптирован из работы Cuerrier др. 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Платформа BAXS представленные здесь облегчает многочисленные эксперименты в изучении mechanobiology, из исследований отдельных клеток до целых тканей. Кроме того, платформа является очень гибким и настраиваемым, что позволяет многочисленным механических экспериментов стимуляции и многоосных испытаний на растяжение. Платформа также позволяет поддержание клеток и тканей в физиологических условиях и позволяет одновременно микроскопии при растяжении экспериментов. Два Эксперименты, описанные в предыдущих разделах продемонстрировать универсальность платформы BAXS при использовании соответствующего набора крепежных зажимов. Модульная и настраиваемый образец система монтажа, оптического доступа и возможность добавлять дополнительные датчики (например нагрузка клеток), открывают многочисленные возможности для дополнительных видов экспериментов, которые должны выполнять.

Протокол, представленные выше, содержит много важных шагов, которые необходимо выполнитьdequately для получения наилучших результатов. В протоколе клеток растяжения, монтажа PDMS субстрат на зажимах требует тонких и точных манипуляций. PDMS подложка должна быть хорошо центрирован относительно четырех зажимов, чтобы избежать нежелательных боковых движений подложки во время растяжения. Такие боковые движения может сделать отслеживание клеток трудно во время растяжения экспериментов. Кроме того, очень важно, чтобы контролировать испарение капли культуральной среде в течение посева клеток когда подложка вверх в инкубатор. В зависимости от того, как часто инкубатор дверь открыта во время процесса, скорость испарения может измениться. В протоколе сосуда растяжения, наиболее важным шагом является измерение размеров образца для тестирования. Эти размеры должны быть как можно более точным, поскольку они вовлечены в расчете жесткости ткани и, следовательно, оказывают непосредственное влияние на результаты. После тот же человек выполняет судно DИзмерения imension поможет в снижении изменчивости между образцами.

Изготовление зажимов, используемых, чтобы вытащить на PDMS подложки во время клеточных растяжения экспериментов участие несколько циклов развития. Первый вариант зажимов не было крепежный паз, расположенный в нижней части цилиндрических частей (фиг. 2B). Без этой канавке, подложка упал вдоль цилиндрической части, вызывая значительное изменчивость деформации подложки с течением времени. не При наличии канавки и добавлением отвержденных PDMS (фиг. 5F), подложка уже не проскальзывает. Это экспериментальная установка производит постоянную деформацию в подложке с течением времени. Для ткани растяжения экспериментов выборе надлежащего датчик нагрузки также очень важно. Ячейка нагрузки используется здесь есть ряд низкой нагрузки (до 150 г), что достаточно для испытанных образцов здесь. Очень чувствительны датчик нагрузки, необходимые для МПСо время силы тяги на малых образцов обладал сравнительно низкий сигнал к шуму (S / N) отношение. Для улучшения Отношение сигнал / шум и, следовательно, улучшить качество изображения, нагрузка клеток электрически изолирован от звуковой катушки двигателя и металлических деталей с использованием пластиковых винтов и прокладок. Таким образом было получено высокое отношение сигнал / шум с разрешением 0,03 г. Для мягких образцов, использование более низкой нагрузки диапазон ячейки рекомендуется для поддержания высокого разрешения.

В настоящее время основным ограничением платформы BAXS является возможность выполнять долгий срок растяжения экспериментов из-за испарения буфере HBSS с течением времени. Испарение воды увеличивает концентрацию растворенного, которые потенциально могут оказать влияние на клетки. С текущей конфигурации платформы BAXS, трудно иметь эксперимент, который будет механически стимулировать клетки или ткани в течение нескольких дней, как буфер, в котором клетки и ткани погружают должен быть Доп.рук.по подарил жидкостью с течением времени. В текущей настройки, скорость испарения составляет около 0,9 мл / ч от первоначального объема 25 мл буферного раствора HBSS. Нынешний режим идеально подходит для краткосрочных экспериментов. Для выполнения надежную клетку и ткань растяжения эксперименты над более длительных периодов времени, два дополнения предлагается: 1) жидкостный система поддержания объема буфера, и 2) добавление коммерческого или домашнего построен инкубатор камеры, охватывающей всю систему для того, чтобы поддерживать постоянная влажность и температура, и обеспечить 5% / 95% CO атмосферу 2 / воздуха. Что касается варианта растяжения сосудистых тканей, установка описано выше позволило нам измерить жесткость мелких сосудов калибра. Важно использовать флажки с соответствующего диаметра, чтобы убедиться, что они не будут деформироваться при растяжении, но достаточно малы, чтобы поместиться в просвете сосуда. Не принимая эту деталь во внимание могли бы ввести неточность в измеряемой деформации ткани.

ve_content ">

В естественных условиях, ткани встраиваемый клетки подвергаются воздействию механических сил и деформаций, которые изменяются как в пространстве и времени, но что более важно, они часто многоосной. Хорошим примером является механическое поведение сосудистой стенки в ответ на гемодинамических сил. Сочетание местных гемодинамических сил 28-30 с анизотропными свойствами сосудистых тканей 13,14,16,27 привести к сложной механической микросреды, который предоставляет эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов в сложных многокомпонентных осевых и циклические деформации полей. Хотя существующие сотовые растяжения эксперименты внесли большой вклад в общее представление о механотрансдукции и mechanobiology, они традиционно полагались на идеализированных одноосных или равно-двухосного полей деформации, которые не воспроизводят сложные Vivo поля деформации в 8-10,19,29,31-34 . Платформа BAXS позволяет анизотропной двухосный клеток растяжения с одновременным живого челл микроскопии. Способность контролировать деформацию подложки вдоль двух ортогональных направлениях позволяет нам иметь полный контроль над полем деформации. Это позволяет производить сложные деформации полей в дополнение к простых одноосных и равно-двухосного полей деформации. Кроме того, платформа позволяет динамически изменять направление поля деформации в пределах того же растяжения эксперимента.

Возможность интеграции модульную и пользовательский системы зажима открывает возможность для многих приложений клеток mechanobiology и механики тканей с использованием одного растяжения платформу. Например, с надлежащими зажимных систем 13,27, эта платформа может выполнять плоскую одноосную и двухосного растяжения тестирование биологических тканей. Таким образом, механические свойства любой ткани, вырезать в прямоугольной или квадратной формы, может быть количественно вдоль двух ортогональных осей в одном эксперименте. Кроме того, выполнение гистологического Analyses после механической стимуляции может раскрыть стрейч-индуцированной структурные изменения в тканях. Кручения также очень важный тип механической нагрузки для мышечных тканей и связок 35. Эта платформа обеспечивает потенциал для разработки прижимную систему, которая могла вызывать вращение вокруг оси растяжения для получения комбинаторной механическую нагрузку с участием кручение и напряжение. Кроме того, можно оценить более крупные сосуды калибра с соответствующими монтажными штифтами. Изучение клеточных реакций следующие механической деформации также под сильным расследования. Платформа BAXS предлагает уникальную особенность изменения направления и сложность поля деформаций в пределах одного эксперимента в дополнение к возможности для одновременного визуализации. Важно отметить, что мультимодальные формы микроскопии все еще возможны, так как платформа не мешает оптической оси микроскопа. Это является важной особенностью, как структурных и биохимических реакций живых клеток к механическим гeformation может быть измерена. Взятые вместе, дизайн платформы BAXS обладает несколько важных особенностей, которые облегчают его использование для одной клетки и экспериментов целых тканей. Используя модульную систему зажима и добавление до четырех возможных датчиков, платформа BAXS могут быть использованы для множества экспериментов. Эта статья показывает детали двух примеров экспериментов; однако модульность и гибкость системы могут быть дополнительно использованы для расследования много разнообразных аспектов mechanobiology на субклеточных, клеточных и целых масштабах длины ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

DT поддержали докторской студенчества от Ле Fonds по исследованиям Квебека-природе ET технологий (FQRNT) и MITACS Elevate стратегического стипендий. CMC поддержали докторской студенчества от ле Fonds по исследованиям ан Санте Квебека (FRSQ) и Эрнеста и Маргарет Форд кардиологии наделен исследований общения из Университета Оттавы института сердца. EOB поддержали операционной грантов MOP80204 от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) и T6335 от сердца и инсульта Фонда Онтарио. CIHR и Medtronic коллективно обеспечить EOB с рецензируемом заведующая кафедрой (УРК # 57093). AEP финансируется естественных и технических наук исследовательский совет (NSERC) Discovery Грант, в Приложении NSERC Discovery Accelerator и благодарит за поддержку научно-исследовательской кафедр Канада программы (КПР) и раннего премии исследователь из провинции Онтарио.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your 
FluoSpheres fluorescent microspheres Invitrogen F8810 Keep away from light.
Linear voice coil Moticont LVCM-051-051-01 The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide Edmund Optics NT37-360 Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage Edmund Optics 38-960 Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder GSI microE systems Mercury II 1600S - 0.5um resolution reflective incremental encoder.
Motion controller Galil DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell Honeywell 31 low miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm) Pin Service Austerlitz Insect pins Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050 Micro Chem SU-8 2050 Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system Glowresearch Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen Invitrogen A10483-01 Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342 Invitrogen R37605 DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters omega.ca KHLV-0504/(10)-P 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers omega.ca CN63200-R1-LV Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium Hyclone SH3024301 Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010 Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH3039603C Keep frozen.
Trypsin 0.05% Hyclone SH30236.02 Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes Wisent Inc 330-050-EL HEPES-buffered salt solution 
NaCl Fisher Scientific BP358-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl Fisher Scientific BP366-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4 Fisher Scientific M65-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2 Fisher Scientific C614-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose Fisher Scientific BP220-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1 Krebs physiological solution
KH2PO4 Fisher Scientific BP362-500 Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2 Lindle DIN:02154749 Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole Sigma M1404 Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D Sigma C8273 Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC Sigma F3777 Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain Fluka 43665 Used to stain and quantify collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  4. Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
  5. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
  6. Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
  7. Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
  8. Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
  9. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
  10. Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
  11. Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
  12. Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
  13. Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
  14. Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
  15. Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
  16. Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
  17. Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
  18. Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
  19. Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
  20. Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
  21. Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
  22. Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
  23. Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
  24. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  25. Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. (2013).
  26. Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
  28. Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
  29. Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
  30. Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
  31. Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
  32. Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
  33. Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
  34. Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
  35. Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats