Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa
Bioengineering

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Summary

Presentiamo in questo articolo un romanzo stiramento piattaforma che può essere usato per studiare le risposte delle cellule singole a complessi anisotropo deformazione meccanica biassiale e quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici.

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Tremblay, D., Cuerrier, C. M., Andrzejewski, L., O'Brien, E. R., Pelling, A. E. A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology. J. Vis. Exp. (88), e51454, doi:10.3791/51454 (2014).

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Abstract

Strumenti che consentono l'applicazione di forze meccaniche alle cellule e tessuti o che possono quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mechanobiology base. Queste tecniche sono stati ampiamente utilizzati per dimostrare come l'insorgenza e la progressione di diverse malattie sono fortemente influenzati da stimoli meccanici. Questo articolo presenta un allungamento biassiale (BAXS) piattaforma multi-funzionale che può sia stimolare meccanicamente le cellule singole o quantificare la rigidità meccanica dei tessuti. La piattaforma BAXS consiste di quattro motori voice coil che possono essere controllati in modo indipendente. Singole cellule possono essere coltivate su un substrato flessibile che può essere collegato ai motori permettendo di esporre le cellule a campi di deformazione complessi, dinamici e spazialmente variabili. Viceversa, incorporando una cella di carico forza, si può anche quantificare le proprietà meccaniche dei tessuti primari come sono esposti a cicli di deformazione.In entrambi i casi, un adeguato sistema di aggancio deve essere progettato e montato ai motori piattaforma BAXS per trattenere saldamente il substrato flessibile o tessuto di interesse. La piattaforma BAXS può essere montato su un microscopio invertito effettuare simultanea luce trasmessa e / o fluorescenza per esaminare la risposta strutturale o biochimica del campione durante gli esperimenti di stretching. Questo articolo fornisce dettagli sperimentali di progettazione e l'utilizzo della piattaforma BAXS e presenta risultati per singola cella e gli studi di tutto il tessuto. La piattaforma BAXS stato usato per misurare la deformazione di nuclei in cellule singole topo mioblasti in risposta al substrato ceppo e per misurare la rigidità di isolato aorte topo. La piattaforma BAXS è uno strumento versatile che può essere combinato con vari microscopia ottica al fine di fornire nuovi approfondimenti mechanobiological ai livelli tissutali sub-cellulari, cellulari e complesso.

Introduction

Il microambiente meccanica svolge un ruolo importante in molte funzioni cellulari come la proliferazione, migrazione e differenziazione, che hanno un profondo impatto nello sviluppo e omeostasi dei tessuti e anche in malattie 1-6. Nel corso degli anni, una moltitudine di strumenti sperimentali sono stati utilizzati per stimolare meccanicamente cellule o tessuti e misurare le proprietà meccaniche dei tessuti biologici con l'obiettivo di aumentare la nostra comprensione di mechanobiology base e studiando l'insorgenza e la progressione delle malattie 6-17. Tuttavia, si deve spesso basarsi su varie differenti dispositivi sperimentali per conseguire gli obiettivi di un particolare studio. Questo articolo presenta un unico multi-funzionale, allungamento biassiale (BAXS) piattaforma, che consente per gli studi che indagano il ruolo che le proprietà meccaniche e le forze meccaniche giocano in biologia a livello sub-cellulare per intere scale di lunghezza del tessuto. La piattaforma BAXS permette non solo per la quantification delle proprietà meccaniche dei tessuti isolati, ma agevola anche la capacità di applicare campi di deformazione semplici, complessi e dinamici di cellule viventi per capire le loro risposte a deformazione che si verifica in vivo. La piattaforma BAXS mantiene anche la capacità di eseguire la microscopia live-cell durante le prove meccaniche e perturbazioni sulle cellule e tessuti.

La piattaforma BAXS è un apparecchio su misura che può essere usato per studiare l'effetto di substrato deformazione a livello cellulare ed eseguire prove di trazione sui tessuti biologici (Figura 1A). Un riscaldatore di alluminio è stato fabbricato per accogliere un piatto 10 cm Petri standard mantenere le soluzioni fisiologiche a 37 ° C utilizzando un regolatore di temperatura e riscaldatori kapton (Figura 1B). Questa piattaforma BAXS può essere integrato su un contrasto di fase invertita e / o microscopio a fluorescenza e permette l'imaging simultaneo (Figura 1C).In breve, la piattaforma BAXS consiste di quattro motori voice coil lineari i cui movimenti sono montati su sfere in miniatura movimento lineare guide a orientate lungo due assi ortogonali (Figura 1D). Una tavola di posizionamento lineare è montato a ciascuno dei quattro motori per consentire il movimento verticale del sistema di bloccaggio che verrà utilizzato (Figura 1E). La posizione di ciascun motore è controllato da un encoder ottico con una risoluzione di 500 nm (Figura 1F). Tutti e quattro i motori sono controllati in modo indipendente con un controller di movimento impiegando encoder ottici per eseguire comandi di movimento (Figura 1G). Un'interfaccia LabVIEW fornisce il pieno controllo della grandezza spostamento, velocità e accelerazione di ciascun motore per generare deformazioni completamente personalizzabile, statica e dinamica, delle cellule o campioni di tessuto.

La tecnica utilizzata per indurre una deformazione in cellule avviene semplicemente allowincellule g di aderire saldamente ad un substrato flessibile e trasparente e poi si estende questo supporto con i quattro motori della piattaforma BAXS. La piattaforma BAXS permette il montaggio di un set custom-designed di morsetti per il fissaggio del supporto sui motori voice coil. A questo scopo, abbiamo progettato una serie di morsetti per cui un substrato flessibile e trasparente, fatta di polidimetilsilossano (PDMS), può essere fissata (figure 2A-C e Figura 3). Come i morsetti saranno esposti a soluzioni fisiologiche, tutte le parti sono state lavorate da acciaio inossidabile per consentire la sterilizzazione. Questi morsetti sono stati accuratamente progettati per portare il substrato più vicino possibile al microscopio obiettivo di migliorare la qualità dell'immagine riducendo al minimo lo stress sul substrato durante stiramento (Figura 2D).

La stessa piattaforma BAXS può anche essere usato per quantificare la rigidità di piccoli campioni di tessuto, utilizzando un insieme appropriato di pinze con adattatoreTED supporti per i campioni di tessuto e una cella di carico per controllare le forze. Diversi approcci possono essere adottate per montare un tessuto ai motori piattaforma BAXS; in questo caso l'acciaio inossidabile minutiens insetti spilli possono agganciare attraverso l'apertura di tessuti vascolari per eseguire prove di trazione (Figure 4A-B). In alternativa, per i tessuti spessi senza apertura naturale, bordi di tessuto può essere tenuto in posizione con i morsetti collegati ai motori voice coil o incollati ai piccoli vetrini con colla biologica e collegati ai motori con le pinze. Al fine di effettuare test di trazione è richiesta una cella di carico miniatura e facilmente integrabile sui motori piattaforma BAXS e usato per misurare la forza che agisce sul tessuto durante un ciclo stiramento (Figura 4C). Mentre la piattaforma BAXS è composta di quattro motori, l'introduzione di una seconda cella di carico permette di eseguire prove di trazione lungo due direzioni ortogonali. Questa capacità consente di quantify la rigidità meccanica di un singolo tessuto lungo due direzioni perpendicolari durante lo stesso esperimento.

È importante sottolineare che, in tutte le configurazioni, le cellule o campioni di tessuto di interesse sono sempre mantenuti in un bagno a temperatura controllata che è accessibile all'utente. Questa capacità consente l'introduzione di agenti farmacologici durante campione estende per esaminare la risposta temporale del campione. Inoltre, come l'asse ottico del microscopio invertito rimane libera, tutte le forme di microscopia sono ancora disponibili per l'utente. Infine, come tutti i quattro motori della piattaforma BAXS sono indipendenti è possibile applicare campi di deformazione altamente configurabili al campione di interesse. In vivo cellule e tessuti sono esposti a complessi e anisotropo stiramento che può essere più appropriatamente imitato in questa piattaforma rispetto tradizionali monoassiale allungamento piattaforma 7,13,15,18,19. Inoltre, le caratteristiche fisichedel campo di deformazione può essere modificato al volo durante un esperimento. Queste capacità consentono all'utente di esaminare la risposta cellulare e tissutale livello ad un ampio numero di elevata complessità, anisotropo, temporalmente, e campi di deformazione spazialmente variabili. Questo articolo descrive i vantaggi e le limitazioni della piattaforma BAXS così come il suo design, principi di funzionamento, ed i dettagli sperimentali per singola cella e gli esperimenti dei tessuti interi.

Figura 1
Figura 1. Panoramica della piattaforma BAXS. A) Vista dall'alto della piattaforma BAXS che mostra i quattro motori voice coil. B) quadro dettagliato del riscaldatore piastra di Petri usato per mantenere le cellule e tessuti a 37 ° C. C) La piattaforma può essere montato su un microscopio invertito per eseguire live- imaging cellulare durante gli esperimenti di stretching.D) Immagine dettagliata del motore bobina; la parte mobile della piattaforma. E) quadro dettagliato della fase di posizionamento lineare che permette lo spostamento verticale dei sistemi di bloccaggio. F) quadro dettagliato del encoder ottico che fornisce la posizione in tempo reale del motore per il controller di movimento. G) Immagine dettagliata del controller di movimento che mostra i quattro ingressi encoder ottici e le uscite di potenza per i quattro motori voice coil.

Figura 2
Figura 2. Sistema di bloccaggio per esperimenti sulle cellule stretching. AB) immagini che mostrano i dettagli dei morsetti utilizzati per fissare il substrato PDMS ai motori voice coil per stiramento. C) Il substrato è avvolto attorno alla parte cilindrica del morsetto con la sua featur ancoraggioes seduto nella scanalatura in alto. Poi il substrato è fissato con le viti che spingono il substrato / ancoraggio caratteristiche nella scanalatura superiore. D) Illustrazione della piattaforma BAXS con i morsetti tenendo il substrato in posto. L'inserto mostra una vista dettagliata del substrato con cellule attaccate ad esso seduto sopra un vetrino e l'obiettivo microscopio.

Figura 3
Figura 3. Distinte dei materiali della membrana e del suo sistema di bloccaggio. Disegni con le dimensioni delle parti principali integrati alla piattaforma biassiale effettuare esperimenti sulle cellule stretching.

Figura 4
Figura 4. Exampio di un sistema di bloccaggio per valutare la rigidità di vasi di piccolo calibro. AB) Quadri dettagliati del dispositivo di fissaggio utilizzato per indurre la deformazione in una aorta topo diametro di 1 mm. Spilli di acciaio inossidabile sono stati accuratamente modellate in triangoli aperti per permettere alla nave di scivolare su entrambi i pin. C) Illustrazione della piattaforma BAXS con i morsetti mantenere la nave e una cella di carico divisoria tra motore fisso e il morsetto sinistro. L'inserto mostra una vista dall'alto dettagliata della nave montato sui perni.

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Protocol

1. Deformazione meccanica di singole cellule

  1. Realizzazione di un substrato PDMS con perline fluorescenti incorporati
    Prima di montaggio del substrato, microsfere fluorescenti in soluzione acquosa vengono risospese in isopropanolo per migliorare perla di miscelazione nelle PDMS dovute alla natura idrofoba.
    1. Pipettare 500 ml di microsfere fluorescenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 16.200 xg per 10 min.
    2. Eliminare il surnatante e aggiungere 500 ml di isopropanolo seguito con 5 min di vortex. Mettere il flaconcino da parte una notte al buio, al fine di consentire eventuali particelle più grandi aggregati a sedimentare.
    3. La mattina successiva, rimuovere con attenzione il surnatante per una microcentrifuga fiala pulita. Questa soluzione tallone può essere utilizzato per fabbricare più di 5 substrati. NOTA: La soluzione tallone continuerà a sedimentare per i prossimi 3 giorni. Fare attenzione a non risospendere il pellet.
    4. Versare 0,5 g dell'agente indurente fornitocon il kit PDMS in una microcentrifuga fiala 1,5 ml con una bilancia scientifica. Per fasi successive, aggiungere un totale di 90 ml di perle (in sei 15 microlitri integrazioni), vortex per 1 minuto tra ogni aggiunta. Mettere da parte.
    5. Pesare 10 g di PDMS e mescolare per almeno 12 minuti con 0,5 g di agente reticolante integrato con perline fluorescenti.
    6. Realizzare un SU-8 2050 stampo a forma di croce con tecniche di fotolitografia standard, seguendo le istruzioni del produttore. Lo stampo utilizzato ha un'altezza di 320 micron e una superficie del 13,4 cm 2 (Figura 3). Lo stampo può contenere 428 ml o 440 mg di PDMS.
    7. Versare 400 mg di PDMS con perline nello stampo a forma di croce con una pipetta di trasferimento e curare per 2 ore a 80 ° C. Dopo l'indurimento, staccare il substrato dallo stampo (Figura 5A). Il substrato può essere conservato in una piastra di Petri a temperatura ambiente per 2 settimane senza mostrare variazioni significative relative proprietà meccaniche. Versare goccioline di PDMS (induritore: PDMS con un rapporto di 1,20) in una piastra di Petri con una dimensione finale di circa 4 mm di diametro e curare capovolti per 2 ore a 80 ° C (Figura 5B). Queste caratteristiche di ancoraggio possono essere conservati in una capsula di Petri per settimane. NOTA: Mantenere il piatto capovolto per evitare che le gocce di appiattimento durante il processo di polimerizzazione.
    8. Trattamento aria-plasma (30 sec a 30 W), il substrato e 8 funzioni di ancoraggio. Associare le caratteristiche su ciascuna estremità del substrato ad una distanza di 4 mm dal trattino forma quadrata presenti sul substrato (Figura 5C).
  2. Montaggio membrana sui morsetti
    1. Avvolgere ogni estremità del substrato intorno alla parte cilindrica scanalato dei morsetti e fissarlo in posizione con le 2 viti di fissaggio dalla parte superiore (Figura 2B e figure 5D-E).
    2. Avvitare le 4 fascette sul supporto pinza e versare PDMS (rapporto 01:20) utilizzando un t usa e gettaransfer pipetta all'interfaccia tra il substrato e la parte cilindrica scanalata dei morsetti. Stendere le PDMS non induriti intorno alla parte cilindrica scanalata utilizzando una chiave esagonale da 1,5 millimetri.
    3. Versare PDMS (1,20) nelle scanalature completamente riempito per azione capillare e curare il montaggio a 80 ° C per 2 ore (Figura 5F).
  3. Semina celle dal Membrane
    1. Trattamento aria plasma (30 sec a 30 W) l'intero gruppo di sterilizzare e funzionalizzare il substrato per consentire rivestimento collagene.
    2. Funzionalizzare la superficie del substrato dove saranno seminate cellule con 1 ml di 0,02 M di acido acetico, completata con 16 ug / ml di coda di topo collagene a temperatura ambiente per 1 ora. La densità collagene finale desiderato è 5 mg / cm 2.
    3. Sciacquare il 3x supporto con tampone fosfato e lasciare asciugare a temperatura ambiente per almeno 10 min.
    4. Aggiungere 40 ml di mezzo di coltura supplementato con 10% fetale Seru bovinam e 1% di penicillina-streptomicina contiene 2.000 celle nella parte centrale del substrato per coprire una superficie di 1 cm 2 (densità delle cellule: 20 cellule / mm 2). Densità cellulare può essere modificata a seconda delle esigenze sperimentali.
    5. Mettere tutto assieme in un incubatore di coltura cellulare standard con il substrato rivolta verso l'alto con la goccia di terreno di coltura contenente cellule su di esso. NOTA: Il gruppo deve essere conservato con il substrato rivolto verso l'alto per almeno 3 ore per permettere alle cellule di allegare saldamente. Per evitare l'evaporazione, 30 ml di terreno di coltura caldo viene aggiunto nella goccia sul substrato ogni 45 min per 3 ore.
    6. Dopo 3 ore, capovolgere l'intera assemblea in una capsula di Petri riempita con terreno di coltura fresco per immergere il substrato e incubare una notte per consentire alle cellule di proliferare.
    7. Il giorno successivo, preparare la soluzione salina tamponata con HEPES (HBSS, 20 mM di Hepes, 120 mM di NaCl, 5,3 mM di KCl, 0,8 mM di MgSO4, 1.8 mM di CaCl 2, e 11,1 mM di dextrose). Regolare il pH a 7,4. NOTA: La soluzione HBSS deve essere preparata giornalmente e mantenute a 37 ° C durante gli esperimenti. Questa soluzione fisiologica viene utilizzato per mantenere le cellule sul palco microscopio imitando il normale ambiente di tessuto / sangue.
    8. Montare il set-up sul contrasto di fase invertito o microscopio a fluorescenza Montare il gruppo pinza-substrato sulla piattaforma e motori BAXS. Riempire il piatto di Petri all'interno del riscaldatore piatto di Petri con tampone HEPES (Figura 2D).

2. Rigidità stazzatura delle navi di piccolo calibro

  1. Preparazione
    1. Soluzione fisiologica Krebs: Preparare una soluzione di 118,1 mM NaCl, 11.1 mM D-glucosio, 25 NaHCO mm 3, 4.7 mM KCl, 1,2 MgSO mm 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, e 2,5 mM CaCl 2. Aggiustare il pH a 7,4 e ossigenare la soluzione con gas medicali CarboGen (95% O 2/5% CO 2) per 30 min. NOTA: Il soluti Krebson deve essere preparato giornalmente e mantenute a 37 ° C durante gli esperimenti. Questa soluzione fisiologica viene utilizzato per mantenere i tessuti vivi simulando l'ambiente normale tessuto / sangue.
    2. Raccogliere strumentazione per la dissezione e la valutazione meccanica dei vasi aortici: forbici chirurgiche, pinzette piegate, micro-forbici, microscopio da dissezione chirurgica, 50 ml provette per centrifuga in polipropilene, e 10 ml pipette sierologiche. La procedura chirurgica e esperimento non richiede condizioni sterili. Montare i morsetti della piattaforma BAXS con la cella di carico anticipo.
  2. Isolamento tessuti e dissezione
    Tutte le procedure sperimentali su animali da laboratorio devono essere approvati dal comitato degli utenti cura degli animali ed uso 'istituzione, conforme alla Guida alla salute per la cura e l'uso di animali da laboratorio degli utenti' paese.
    1. Eseguire il mouse eutanasia con l'inalazione del 99% di CO 2 (7 psi)in una (Figura 6A) camera di plexiglas.
    2. Aprire il mouse addome e tagliare l'aorta toracica a sanguinare il mouse.
    3. Rimuovere il diaframma, la gabbia toracica e lobi polmonari (Figura 6B). NOTA: Per ridurre al minimo il rischio di danneggiare il tessuto, mantenere il cuore attaccato alla aorta ed evitare di toccare direttamente il vaso ma manipolarlo usando cuore.
    4. Rimuovere cuore, la radice aortica e dell'aorta toracica tagliando delicatamente tra la nave e la colonna vertebrale. NOTA: Non provocare alcun allungamento in nave durante l'escissione di mantenere la struttura interna del tessuto intatto (Figura 6C).
    5. Immergere immediatamente e mantenere il cuore e l'aorta in soluzione Krebs.
    6. Tagliare e lavare accuratamente l'aorta in soluzione Krebs per rimuovere eventuali coaguli di sangue. Rimuovere il tessuto connettivo utilizzando micro-forbici, pinzette e chirurgico microscopio da dissezione (Figura 6D-E). NOTA: Conservare tutta la lunghezza della nave e utilizzare il aorradice tic per determinare l'orientamento nave.
  3. Mezzo Dimension Determinazione e montaggio
    Per determinare la rigidità della nave, dalle dimensioni del serbatoio scaricate sono necessari e possono essere determinate con un microscopio calibrato.
    1. Tagliare un anello aortico di circa 2 mm di lunghezza e misurare con precisione la sua lunghezza con una impostazione (figure 6F-G) microscopio calibrato. Mettete questo segmento da parte in soluzione di Krebs.
    2. Tagliare un altro anello aortico più piccolo possibile tra ciascuno dei segmenti mm2 (Figura 6F). Mettere questo piccolo segmento su un vetrino da microscopio con il lume rivolto verso l'alto e misurare lo spessore della parete utilizzando un'impostazione microscopio calibrato (Figura 6H).
    3. Riempire il piatto Petri sulla piattaforma BAXS con soluzione di Krebs e inserire il segmento anello aorta 2 mm perni di trazione (riquadro in Figura 4C).

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Figura 5. PDMS substrato di fabbricazione e di montaggio. A) Dopo l'indurimento, il substrato viene accuratamente staccata il SU-8 2050 stampo e mettere da parte in una capsula di Petri. B) Ancoraggio caratteristiche fatte di PDMS e aiutano a fissare il supporto sul morsetti. C) Substrato di ancoraggio caratteristiche pronta per il montaggio. D) Il substrato è montato sui morsetti 4, che vengono poi montati sul supporto del morsetto (vedi riquadro). E) Un'immagine dettagliata del substrato montati sulle 4 morsetti. F ) Procedimento di colata PDMS alla scanalatura sottostante substrato. La freccia indica il PDMS lentamente riempiendo la scanalatura per capillarità.

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Figura 6. Preparazione ed isolamento dell'aorta toracica. A) Preparazione di strumenti chirurgici e il mouse eutanasia. B) attraverso un'incisione longitudinale addominale, la gabbia toracica e pallonetti polmonari vengono rimossi. C) L'aorta è attentamente rimosso usando il cuore per manipolare il tessuto. D) Il cuore e aorta sono messi in soluzione fisiologica Krebs. L'aorta viene pulita rimuovendo tutti i tessuti connettivi. E) Immagine dettagliata che mostra l'. F) segmento aorta cuore e aorta utilizzata per la valutazione rigidità con piccoli segmenti utilizzati per la misura di spessore. GH) La lunghezza precisa (G) e spessore (H) ripartiti per segmenti di flotta vengono valutate utilizzando un microscopio inverso e un programma di analisi.

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Representative Results

Cella Stretching

La piattaforma BAXS stato usato per studiare la risposta meccanica del nucleo in cellule singole topo mioblasti (C2C12) esposta a una deformazione substrato del 25%. Mioblasti si trovano nel tessuto muscolare e sono costantemente esposti a stiramento meccanico e compressione in vivo. Le proprietà di forma e meccaniche del nucleo cellulare hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica e l'attività trascrizionale 20,21 e anche in una varietà di difetti e malattie come la sindrome di Hutchinson-Gilford progeria (HGPS), Emery sviluppo -Dreifuss distrofia muscolare (EDMD), cardiomiopatia dilatativa, invecchiamento precoce e cancro 22-25. Pertanto, capire come forze dal microambiente meccanico esterno influenzano la struttura e la funzione del nucleo è di estremo interesse. La piattaforma BAXS stato usato per studiare la trasmissione della forza dalla mi croenvironment al nucleo stirando il substrato parallelo al suo asse maggiore o minore. Figure 7A-F illustra le funzionalità della piattaforma per indurre una deformazione nel substrato lungo due direzioni ortogonali. Inoltre, la piattaforma BAXS può indurre campi di deformazione complessi nel substrato in aggiunta a monoassiale livello di campi di deformazione equi-biassiale. Figure 7G-H illustra la flessibilità offerta da un controllo indipendente del campo di deformazione lungo due direzioni ortogonali, che ci permette di produrre sia uno standard (compressione) o puro (non compressione) campo di deformazione monoassiale. La piattaforma BAXS è in grado di produrre un campo di deformazione uniassiale puro tirando leggermente il substrato nella direzione perpendicolare alla direzione principale stiramento (Figura 7G) per compensare la compressione presente nel substrato lungo questa direzione durante un tratto uniassiale standard (Figura 7H ).

S copi "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 7
Figura 7. Rapporti Cilindrata-deformazione di esecuzione standard puro monoassiale stretching. AB) perline fluorescenti vengono selezionati manualmente sul primo fotogramma del video e monitorati da un fotogramma all'altro fino a raggiungere la massima tratto lungo l'orizzontale (C) e verticale (D) le direzioni. Uno script MATLAB calcola automaticamente le componenti del tensore di deformazione verde per ogni fotogramma e produce una curva di calibrazione del ceppo in spostamenti rispetto al motore 27. EF) Le linee blu e rosse corrispondono alla componente del verde tensore di deformazione lungo l'orizzontale e direzioni verticale, rispettivamente. G) stretching stesso substrato da 4 millimetri lungo l'asse x e un po 'si estende lungo laasse y di 1,5 mm (evidenziati in rosso) produce un campo uniassiale puro senza deformazione compressiva nel substrato. H) Stretching substrato lungo l'asse x di 3,5 mm produce una deformazione del 25% e una deformazione a compressione del 7% quando le estremità del substrato lungo l'asse verticale sono fissi (evidenziato in rosso).

Con la possibilità di esibirsi dal vivo-cell immagini di microscopia durante il tratto, i nuclei sono stati colorati con un colorante fluorescente live-cell, che si lega al DNA (Hoescht 33342). In generale, le cellule C2C12 possiedono nuclei ellittica con asse maggiore e minore. In primo luogo, le cellule sono state identificate in cui gli assi nucleari maggiori o minori erano orientate parallelamente alla direzione di allungamento orizzontale. A questo punto, le cellule sono state allungate del 25% lungo ciascun asse ortogonale stiramento durante l'acquisizione immagini del nucleo indeformata e deformata tra ogni ciclo di stretching (figure 8A-I). In questo modo si potrebbe valutare la deformabilità del nucleolungo il suo asse maggiore e minore in un substrato deformazione controllata con precisione. Ovuscule, un plug ImageJ, è stato utilizzato per determinare la lunghezza degli assi maggiore e minore nucleari. Queste lunghezze sono stati registrati durante lo stato non deformato e quando il nucleo è stato sequenzialmente allungata lungo i suoi assi maggiore e minore (figure 8G-I). Per calcolare la deformazione del nucleo lungo i suoi assi minori e maggiori, la variazione relativa lunghezza lungo ciascun asse negli stati allungate e deformate stato calcolato:

dove ε è la deformazione, 1 L è la lunghezza deformata e L 0 è la lunghezza indeformata.

La deformabilità del nucleo in C2C12 presenta una anisotropia meccanica in quanto visualizza una deformabilità significativamente più alto lungo il suo asse minore (6,3 ± 1,1%) rispetto al suo asse maggiore (3,077; 0,6%) (Figura 8J). Inoltre, abbiamo anche esaminato il ruolo del citoscheletro di actina e microtubuli nella regolazione deformabilità nucleare. Questo è stato ottenuto depolimerizzante i filamenti di actina e microtubuli selettivamente con citocalasina-D e nocodazole, rispettivamente. Depolimerizzazione dei filamenti di actina e microtubuli è stato trovato per indurre una perdita della deformabilità anisotropo del nucleo (Figura 8J). Questi risultati supportano i risultati che componenti citoscheletrici trasmettono forze al nucleo dal substrato e sono anche essenziale per preservare il comportamento meccanico naturale del nucleo durante la deformazione 25.

Figura 8
Figura 8. Stretching protocollo e deformabilità nucleare. AC) Illustrazione schematica della Stre protocollo tching di una singola cella con il suo nucleo orientata orizzontalmente. Immagini a contrasto di fase (DF) e le immagini epi-fluorescenza (GI) di una cella colorati con colorante fluorescente specifico DNA. Questa sequenza immagine illustra un tipico esperimento cella estende in cui la stessa cellula è esposta a campi di deformazione ortogonali. Barre di scala sono di 25 micron. J) C2C12 mostra deformabilità nucleare anisotropico con l'asse minore deformazione molto più che l'asse maggiore. In-actina o cellule microtubuli-privato (CYT-d e nocodazole, rispettivamente), questa anisotropia scompare. In tutte le condizioni, deformazioni nucleo sono significativamente diversi da zero con un substrato deformazione del 25%. ** P-value <0.01, paired t-test. † † p-value <0.01, † † † p-value <0,001, un campione t-test.

Vessel Rigidità Assessment

t "> Recentemente, il nostro gruppo ha studiato l'effetto della cronica sovraespressione di Heat Shock Protein-27 (HSP27 o / e) per la formazione di placche aortiche in un modello murino di aterosclerosi incline (apoE - / -). 26 Noi ha mostrato che HSP27 agisce come una proteina atheroprotective che riduce la placca dei lipidi e macrofagi abbondanza e aumenta i intimali cellule muscolari lisce e contenuto di collagene (Figure 9A-B). Per determinare l'impatto di questo rimodellamento istologico su navi proprietà meccaniche, la piattaforma BAXS è stato utilizzato per misurare la rigidità aortica.

La figura 9C mostra una tipica curva di sollecitazione-deformazione dalla trazione stiramento di un anello aortico. Per quantificare la rigidità, il modulo incrementale è stato calcolato dalle curve sforzo-deformazione ad una deformazione del 30%. La rigidità è la pendenza della tangente alla curva. Introducendo una cella di carico su uno dei motori piattaforma BAXS, l'acquisizione contemporanea dei CILINDRATAnt e dati della forza è possibile. Le curve spostamento-forza sono stati convertiti in curve sforzo-deformazione basata sulle dimensioni non deformate di ciascun anello aortico. Lo stress e la tensione sono calcolate utilizzando le seguenti formule:

dove ε è la deformazione, 1 L è la lunghezza deformata, L 0 è la lunghezza indeformata, s è la tensione, F è la forza e A 0 è l'area indeformata del tessuto sotto carico. Nel caso specifico di un anello aortico, l'area indeformata (A 0) è il doppio dello spessore dei tempi dell'anello la lunghezza del segmento.

Ogni campione è stato deformato ciclicamente con una deformazione massima del 40% ad una velocità di spostamento di 50 pm / sec per 12 cicli con i primi 11 cicli consentono precondizionamento del tessuto e la last uno per l'acquisizione dei dati. Abbiamo scoperto che la rigidità dei segmenti aortici di apoE - / - HSP27 o / e topi (62,8 ± 3,0 kPa) sono risultati significativamente aumentati del 41% rispetto al apoE - / - modello murino di controllo (44,4 ± 3,8 kPa) (Figura 9D) .

Presi insieme, la valutazione meccanica combinata con la nave e placca istologia dimostrato che la sovra-espressione di HSP27 è caratterizzata da una maggiore rigidità nave e collagene / contenuto delle cellule muscolari lisce. Questi risultati suggeriscono che HSP27 potrebbe potenzialmente aumentare la stabilità delle lesioni aterosclerotiche e quindi diminuire il rischio di rottura della placca.

Figura 9
Figura 9. Effetto della HSP27 over-espressione vaso rigidità. Abbiamo dimostrato che HSP27 ha modificato la componente istologicazione delle lesioni aterosclerotiche aumentando cellule muscolari lisce dell'intima (A: anti-α-SMA) e contenuto di collagene (B: picrosirius macchia rossa) C) tipica curva sforzo-deformazione ottenuta dalla estende un vaso aortico dove la rigidità è calcolata a 30. % di deformazione. . La rigidità è la pendenza della tangente (linea rossa) alla curva D) cronica over-espressione di HSP27 aumenta navi rigidità rispetto del controllo apoE - / - mice modello (D). Barre di scala in (A) e (B) sono entrambi di 40 micron e 400 micron di inserti. L = lumen, I = intima, linee tratteggiate delinea i media. * P-value <0.05, ANOVA. *** P-value <0,001, ANOVA. Figura adattata dal lavoro di Cuerrier et al 26.

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Discussion

La piattaforma BAXS qui presentato facilita numerosi esperimenti nello studio di mechanobiology, dalle indagini di singole cellule ai tessuti interi. Inoltre, la piattaforma è altamente flessibile e configurabile, consentendo numerosi esperimenti di stimolazione meccanici e prove di trazione multiassiale. La piattaforma consente anche la manutenzione di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche e permette di microscopia simultanea durante gli esperimenti di stretching. I due esperimenti descritti nelle sezioni precedenti dimostrano la versatilità della piattaforma BAXS quando si utilizza un appropriato insieme di morsetti. Un sistema modulare e personalizzabile campione di montaggio, accesso ottico e la possibilità di aggiungere ulteriori sensori (per esempio una cella di carico), aprono numerose possibilità di ulteriori tipi di esperimenti da eseguire.

Il protocollo presentato qui sopra contiene molti passaggi critici che devono essere eseguite unadequately al fine di produrre i migliori risultati. All'interno del protocollo cella stiramento, il montaggio del substrato PDMS a morsetti richiede manipolazione delicata e precisa. Il substrato PDMS deve essere ben centrata rispetto ai quattro morsetti per evitare movimenti laterali indesiderati del substrato durante stiramento. Tali movimenti laterali possono effettuare il tracking delle celle difficile durante lo stretching esperimenti. Inoltre, è fondamentale per monitorare l'evaporazione della goccia di terreno di coltura durante la semina cellulare quando il substrato è rivolto verso l'alto in incubatrice. A seconda della frequenza della porta dell'incubatore vengono aperti durante il processo, la velocità di evaporazione può cambiare. All'interno del protocollo nave stiramento, la fase più critica è la misurazione delle dimensioni del campione da testare. Queste dimensioni devono essere quanto più precisa possibile in quanto sono coinvolti nel calcolo della rigidità dei tessuti e quindi avere un impatto diretto sui risultati. Avendo la stessa persona di eseguire vaso dmisure imension saranno di aiuto nel ridurre la variabilità tra i campioni.

La fabbricazione dei morsetti utilizzati per tirare il substrato PDMS durante cellulari esperimenti di stretching coinvolto diversi cicli di sviluppo. La prima versione dei morsetti non hanno una scanalatura di ancoraggio situata nella parte inferiore delle parti cilindriche (Figura 2B). Senza questa scanalatura, il substrato avanza lungo la parte cilindrica, inducendo una notevole variabilità nel substrato deformazione nel tempo. Con la presenza della scanalatura e l'aggiunta di PDMS stagionati (Figura 5F), il substrato non scivola. Questa configurazione sperimentale produce una deformazione costante nel substrato nel tempo. Per il tessuto che si estende esperimenti, scegliendo la cella di carico corretta è molto importante. La cella di carico qui utilizzato ha una gamma basso carico (fino a 150 g), che è adeguata per i campioni testati qui. La cella di carico molto sensibili necessarie measurante tirando le forze su piccoli campioni possedeva un segnale relativamente basso rumore (s / n) il rapporto. Per migliorare la s / n rapporto e quindi migliorare la risoluzione, la cella di carico è stato elettricamente isolato dal motore bobina e tutte le parti metalliche con viti e distanziali in plastica. In questo modo è stato ottenuto un elevato rapporto s / n con una risoluzione di 0,03 g. Per campioni morbidi, l'uso di una cella di carico gamma inferiore è raccomandato per mantenere alta risoluzione.

Attualmente, il limite principale della piattaforma BAXS è la capacità di eseguire lungo termine si estende esperimenti a causa dell'evaporazione del buffer HBSS nel tempo. Evaporazione dell'acqua aumenta concentrazione di soluto che può potenzialmente avere un effetto sulle cellule. Con la configurazione corrente della piattaforma BAXS, è difficile avere un esperimento che stimolare meccanicamente cellule o tessuti per giorni come il buffer in cui le cellule e tessuti sono immersi deve essere supplem ENTED di liquido nel tempo. Nella impostazione corrente, la velocità di evaporazione è di circa 0,9 ml / hr da un volume iniziale di 25 ml di soluzione tampone HBSS. L'impostazione corrente è ideale per esperimenti di breve termine. Per eseguire cellule e tessuti estende esperimenti su periodi di tempo più lunghi affidabile, due aggiunte sono proposte: 1) Un sistema fluidico per mantenere il volume di tampone, e 2) l'aggiunta di un built camera dell'incubatore commerciale o domestico che racchiude l'intero sistema per mantenere umidità e temperatura costante e fornire una atmosfera di CO 2 / aria 5% / 95%. Per quanto riguarda la possibilità di allungamento tessuti vascolari, la configurazione sopra descritta ha permesso di misurare la rigidità dei piccoli vasi di calibro. E 'importante usare perni con un diametro adeguato per assicurarsi che essi non deformarsi durante lo stretching, ma sono abbastanza piccolo da entrare nel lume del vaso. Non prendere questo particolare conto potrebbe introdurre imprecisioni nella deformazione misurata del tessuto.

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In vivo, le cellule del tessuto-embedded sono esposti a forze meccaniche e ceppi che variano sia spaziale che temporale, ma soprattutto sono spesso multiassiale. Un buon esempio è il comportamento meccanico delle pareti vascolare in risposta a forze emodinamiche. La combinazione di forze emodinamiche locali 28-30 con le proprietà anisotrope dei tessuti vascolari 13,14,16,27 risultato in una microambiente meccanica complessa, che espone cellule endoteliali e muscolari lisce vascolari a campi multiassiali e deformazione ciclica complesse. Sebbene cella esistente esperimenti di stretching hanno notevolmente contribuito alla comprensione di base di mechanotransduction e mechanobiology, hanno tradizionalmente fatto affidamento su idealizzate campi di deformazione monoassiale o equi-biassiale che non riproducono complessi vivo campi di deformazione in 8-10,19,29,31-34 . La piattaforma BAXS permette anisotropico cella allungamento biassiale con contestuale live-celmicroscopia l. La capacità di controllare la deformazione del substrato lungo due direzioni ortogonali ci permette di avere il pieno controllo del campo di deformazione. Ciò consente la produzione di campi di deformazione complessi oltre a semplici campi di deformazione uniassiale e equi-biassiale. Inoltre, la piattaforma permette di modificare dinamicamente la direzione del campo di deformazione entro lo stesso esperimento stiramento.

La possibilità di integrare un sistema di serraggio modulare e personalizzato apre la possibilità per molte applicazioni in mechanobiology cellula e meccanica del tessuto utilizzando una singola piattaforma stretching. Ad esempio, con sistemi di bloccaggio adeguati 13,27, questa piattaforma può eseguire planare monoassiale e biassiale prove di trazione su tessuti biologici. In questo modo, le proprietà meccaniche di qualsiasi tessuto, tagliato in una forma rettangolare o quadrata, possono essere quantificate lungo due assi ortogonali in un singolo esperimento. Inoltre, eseguendo un istologiconalyses dopo stimolazione meccanica può rivelare cambiamenti strutturali tratto indotta nei tessuti. Torsione è anche un tipo molto importante di carico meccanico per i tessuti muscolari e legamenti 35. Questa piattaforma fornisce il potenziale per progettare un sistema di bloccaggio che può indurre una rotazione attorno all'asse estende per produrre un carico meccanico combinatoria sollecitazione di torsione e tensione. E 'anche possibile valutare navi calibro di grosse dimensioni con opportuni perni di montaggio. Studiare le risposte cellulari seguente deformazione meccanica è anche sotto inchiesta intenso. La piattaforma BAXS offre una caratteristica unica di cambiare la direzione e la complessità del campo di deformazione entro lo stesso esperimento oltre a consentire per l'imaging simultaneo. Importante, forme multimodali di microscopia sono ancora possibili, come la piattaforma non interferisce con l'asse ottico del microscopio. Questa è una caratteristica importante in quanto le risposte live-cellule strutturali e biochimici a d meccanicaeformation può essere misurata. Nel loro insieme, il design della piattaforma BAXS possiede diverse caratteristiche importanti che facilitano l'uso per singola cella e gli esperimenti dei tessuti interi. Con l'ausilio di un sistema di serraggio modulare e l'aggiunta di un massimo di quattro possibili celle di carico, la piattaforma BAXS può essere impiegato per una moltitudine di esperimenti. Questo articolo illustra i dettagli di due esempi di esperimenti; tuttavia la modularità e la flessibilità del sistema può essere ulteriormente sfruttata per studiare molti aspetti diversi della mechanobiology ai sub-cellulari, scale di lunghezza tessuti cellulari e interi.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

DT è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato da Le Fonds de Recherche du Québec-Natura et Technologies (FQRNT) e ha una MITACS Elevate strategico Fellowship. CMC è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato da Le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e Ernest e Margaret Ford cardiologia dotato ricerca borsa di studio presso l'Università di Ottawa Heart Institute. EOB è stato sostenuto da sovvenzioni di funzionamento MOP80204 dal Canadian Institute for Health Research (CIHR) e T6335 dalla Heart and Stroke Foundation of Ontario. Il CIHR e Medtronic collettivamente forniscono EOB con una sedia di ricerca peer-reviewed (URC # 57093). AEP è finanziato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC) Discovery Grant, un supplemento NSERC Discovery Accelerator e riconosce con gratitudine il sostegno dei presidenti di ricerca Canada (CRC) del programma e di un ricercatore Award anticipata dalla Provincia dell'Ontario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your 
FluoSpheres fluorescent microspheres Invitrogen F8810 Keep away from light.
Linear voice coil Moticont LVCM-051-051-01 The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide Edmund Optics NT37-360 Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage Edmund Optics 38-960 Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder GSI microE systems Mercury II 1600S - 0.5um resolution reflective incremental encoder.
Motion controller Galil DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell Honeywell 31 low miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm) Pin Service Austerlitz Insect pins Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050 Micro Chem SU-8 2050 Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system Glowresearch Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen Invitrogen A10483-01 Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342 Invitrogen R37605 DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters omega.ca KHLV-0504/(10)-P 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers omega.ca CN63200-R1-LV Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium Hyclone SH3024301 Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010 Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH3039603C Keep frozen.
Trypsin 0.05% Hyclone SH30236.02 Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes Wisent Inc 330-050-EL HEPES-buffered salt solution 
NaCl Fisher Scientific BP358-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl Fisher Scientific BP366-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4 Fisher Scientific M65-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2 Fisher Scientific C614-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose Fisher Scientific BP220-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1 Krebs physiological solution
KH2PO4 Fisher Scientific BP362-500 Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2 Lindle DIN:02154749 Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole Sigma M1404 Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D Sigma C8273 Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC Sigma F3777 Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain Fluka 43665 Used to stain and quantify collagen content

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References

  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  4. Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
  5. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
  6. Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
  7. Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
  8. Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
  9. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
  10. Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
  11. Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
  12. Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
  13. Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
  14. Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
  15. Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
  16. Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
  17. Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
  18. Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
  19. Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
  20. Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
  21. Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
  22. Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
  23. Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
  24. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  25. Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. (2013).
  26. Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
  28. Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
  29. Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
  30. Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
  31. Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
  32. Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
  33. Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
  34. Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
  35. Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).

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