ऑप्टिकल चिमटी से एकल आरएनए अणुओं के Nanomanipulation

Bioengineering

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Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

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Abstract

मानव जीनोम का एक बड़ा भाग लिखित लेकिन अनुवादित नहीं है. इस पोस्ट जीनोमिक युग में शाही सेना के नियामक कार्यों तेजी से महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है. आरएनए समारोह अक्सर वैकल्पिक संरचनाओं को अपनाने के लिए अपनी क्षमता पर निर्भर करता है, यह क्रम से सीधे शाही सेना के तीन आयामी संरचना की भविष्यवाणी करना मुश्किल है. एकल अणु एक समय में आणविक संरचना एक अणु की निगरानी के द्वारा आरएनए संरचनात्मक बहुरूपता की समस्या को हल करने के लिए शो क्षमता दृष्टिकोण. यह काम ठीक ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग कर एकल आरएनए अणुओं की तह और संरचना में हेरफेर करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. सबसे पहले, तरीकों एकल अणु यांत्रिक काम के लिए उपयुक्त अणुओं वर्णित हैं synthesize करने के लिए. ऑप्टिकल चिमटी के समुचित संचालन सुनिश्चित करने के लिए अगला, विभिन्न अंशांकन प्रक्रियाओं पर चर्चा कर रहे हैं. अगला, विभिन्न प्रयोगों व्याख्या कर रहे हैं. तकनीक की उपयोगिता का प्रदर्शन, यंत्रवत् खुलासा आरएनए hairpins के परिणाम और एक भी शाही सेना kissinजी जटिल सबूत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. इन उदाहरणों में, nanomanipulation तकनीक स्वतंत्र रूप से, द्वितीयक और तृतीयक सहित प्रत्येक संरचनात्मक डोमेन, की तह अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अन्त में, सीमाओं और विधि के भविष्य के आवेदनों पर विचार विमर्श कर रहे हैं.

Introduction

ऑप्टिकल चिमटी तकनीक का विकास लंबी जैविक अनुसंधान के क्षेत्र में अपने आवेदन के साथ साथ किया गया है. ऑप्टिकल फँसाने प्रभाव पहले की खोज की थी, जब आर्थर Ashkin दूषित पानी में बैक्टीरिया लेजर फोकस 1 में फंस जा सकता है कि मनाया. तब से, बैक्टीरिया खगोल विज्ञान के छात्रों की पीढ़ियों के लिए एक unintentional, मजेदार प्रयोग के रूप में अच्छी तरह से सूक्ष्म शरीर क्रिया विज्ञान 2,3 अध्ययन करने के लिए एक गंभीर अनुसंधान उपकरण बन गया है फँसाने. ऑप्टिकल फँसाने तकनीक एक सूक्ष्म वस्तु 1 स्थिर केंद्रित लेजर बीम का उपयोग करता है. व्यावहारिक रूप से, यह भी जाल (ΔX) के केंद्र से अपने विस्थापन से फंस वस्तु पर बल (एफ) जो उपाय एक ऑप्टिकल वसंत, के रूप में एक लेजर जाल कार्य करता है. Κ में एक कम दूरी, एफ = κ एक्स ΔX, भीतर जाल के वसंत स्थिर है. ऑप्टिकल जाल एक माइक्रो को piconewton (PN) परिशुद्धता में बल लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैcopic वस्तु और नैनोमीटर (एनएम) सटीकता के साथ अपनी स्थिति को मापने के. पिछले दो दशकों में, ऑप्टिकल चिमटी खगोल विज्ञान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया एकल अणु तकनीकों में से एक बन गए हैं. तकनीक तह और डीएनए 4-6, आरएनए 7-9, और प्रोटीन 10,11 के यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है. ऑप्टिकल चिमटी भी डीएनए प्रतिकृति 12, आरएनए प्रतिलेखन 13, और प्रोटीन संश्लेषण 14,15, साथ ही कई अन्य biomolecular घटनाओं 16-18 निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

एकल अणु दृष्टिकोण मुख्य रूप से शाही सेना के बीहड़ तह ऊर्जा परिदृश्य का पता लगाने के लिए शाही सेना संरचनात्मक अनुसंधान में कार्यरत हैं. एक शाही सेना अनुक्रम आमतौर पर होने के कारण शाही सेना के सरल रासायनिक संरचना और आधार कतरन नियमों को, कई स्थिर, परस्पर अनन्य संरचनाओं में गुना कर सकते हैं. यह लंबे समय से शाही सेना संरचनात्मक बहुरूपता, कि riboswitches 19,20 में होता है, जैसे जीन विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि ज्ञात किया गया है. एक recenटी जीनोम चौड़ा सर्वेक्षण कुछ डिग्री बहुत सेलुलर transcriptome 21 के एक बड़े हिस्से की संरचना और प्रोटीन संश्लेषण को प्रभावित के रूप में छोटे रूप में है कि तापमान विविधताओं से पता चला है. इस उदाहरण से पहले ग्रहण वैकल्पिक आरएनए तह की जैविक भूमिका शायद अधिक महत्वपूर्ण और व्यापक है कि संकेत. स्ट्रक्चरल बहुरूपता, हालांकि, कई अणुओं की औसत संपत्तियों की जांच, जो परंपरागत जैव रासायनिक और biophysical दृष्टिकोण, के लिए एक चुनौती बन गया है. उदाहरण के लिए, "पर" और एक riboswitch की "बंद" रचना परस्पर अनन्य हैं. विषम संरचनाओं से व्युत्पन्न एक औसत संरचना जैविक रूप से प्रासंगिक conformers के दोनों सदृश होने की संभावना नहीं है. इसके अलावा, untranslated शाही सेना और mRNA आमतौर पर संरचनाओं फार्म. प्रोटीन और विनियामक RNAs के साथ उनकी बातचीत सामान्यतः बातचीत के हिस्से के रूप में मौजूदा संरचना का खुलासा आवश्यकता है. इसलिए, आरएनए खुलासा / refolding का अध्ययन कर एक उचित हो जाता हैशाही सेना जीव विज्ञान का मुद्दा. एक ऐसी चुनौती का सामना करने के लिए, एकल अणु दृष्टिकोण एक समय 22-27 से कम एक अणु का अध्ययन करके शाही सेना संरचनात्मक बहुरूपता जानने के लिए नियोजित किया गया है.

लोकप्रिय एकल अणु प्रतिदीप्ति विधि की तुलना में, खुलासा यांत्रिक आधारित चिमटी व्यक्तिगत अणुओं की रचना एप्लाइड बल द्वारा चालाकी से किया जा सकता है और नैनोमीटर सफाई से मापा जा कि एक लाभ प्रदान करता है. इस nanomanipulation क्षमता एक बड़े शाही सेना के श्रेणीबद्ध तह 28 विच्छेदित किया जा सकता है कि इस तरह के व्यक्तिगत संरचनात्मक डोमेन का खुलासा / तह की निगरानी के लिए उपयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक भी कतरा कई conformers में से एक में गुना करने के लिए निर्देशित किया जा सकता है; या एक मौजूदा संरचना यंत्रवत् एक अलग रचना 29 में refold के लिए प्रेरित किया जा सकता है. जैविक शर्तों के तहत, एक शाही सेना संरचना तापमान परिवर्तन या ligand बंधन पर बदला जा सकता है. सीधे जोड़ तोड़ आणविक है की क्षमताtructure आरएनए संरचनात्मक अध्ययन का एक नया स्थान खोलता है. सिद्धांत रूप में, इस तरह के परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी और चुंबकीय चिमटी के रूप में अन्य यांत्रिक तकनीक,, भी एक आरएनए अणुओं की तह अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, इस तरह के अनुप्रयोगों के कारण अपेक्षाकृत कम स्थानिक संकल्प 30 को काफी हद तक सीमित कर रहे हैं.

ऑप्टिकल चिमटी का रोजगार शाही सेना संरचनाओं यांत्रिक शक्ति से सामने आया की अनुमति देता है.

खुलासा यांत्रिक का लाभ कई गुना है. धातु आयनों और ligand प्रेरित तह मुख्य रूप से तृतीयक संरचनाओं को सीमित कर रहे हैं, जबकि सेना, द्वितीयक और तृतीयक दोनों संरचनाओं प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तापमान और denaturant काफी पानी और विलेय की गतिविधियों को प्रभावित कर सकते हैं. इसके विपरीत, बल आणविक संरचना उपद्रव को स्थानीय रूप से लागू किया जाता है; आसपास के वातावरण पर बल का प्रभाव नगण्य है. इसके अलावा, थर्मल पिघलने सबसे छोटे आरएनए संरचनाओं की तह ऊष्मा का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है,ऑप्टिकल चिमटी सात आधार जोड़ी tetraloop बाल के लिये कांटा 28 से 400 न्यूक्लियोटाइड ribozyme 31 से लेकर, विभिन्न आकारों के साथ शाही सेना संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि. इसके अलावा, शाही सेना संरचनाओं यंत्रवत् mesophilic तापमान पर सामने आया जा सकता है. इसके विपरीत, एक थर्मल पिघलने प्रयोग में RNAs प्रकट करने के लिए, तापमान आम तौर पर अच्छी तरह से काफी विशेष रूप से 2 मिलीग्राम + आयनों की मौजूदगी में, आरएनए हाइड्रोलिसिस बढ़ जाती है, जो शारीरिक तापमान, ऊपर उठाया है.

यह बल के यांत्रिक प्रभाव यह एक संरचना करने के लिए लागू किया जाता है पर निर्भर करता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. एप्लाइड बल तह ऊर्जा परिदृश्य झुक जाता. उदाहरण के लिए, बल एक बाल के लिये कांटा करने के लिए लागू किया जाता है, जब बेस जोड़े क्रमिक रूप से, एक समय (चित्रा 1 ए) में एक टूट रहे हैं. तेजस्वी कांटा लगाए गए बल सीधा करने के लिए है जो पेचदार अक्ष, साथ प्रगति. एक न्यूनतम चुंबन जटिल तनाव के अंतर्गत है जब इसके विपरीत,, दो चुंबनएप्लाइड बल के समानांतर हैं जो आधार जोड़े, बल लोड हिस्सा (चित्रा 1 बी). माध्यमिक और तृतीयक तह 28,32 भेद करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो उनके विभिन्न यांत्रिक जवाब में लागू बल परिणाम को बाल के लिये कांटा और चुंबन जटिल रिश्तेदार, के विभिन्न geometries. खुलासा मैकेनिकल के सैद्धांतिक पहलू पहले से 8,9,30 समीक्षा की गई है. इस काम की स्थापना की और एक एकल अणु यांत्रिक खुलासा परख प्रदर्शन करने के लिए बुनियादी दृष्टिकोण की रूपरेखा.

प्रायोगिक सेटअप. हमारे यांत्रिक खींच प्रयोग में, tweezing के लिए शाही सेना नमूना दो डबल असहाय डीएनए / आरएनए संभालती द्वारा flanked ब्याज की शाही सेना (चित्रा 2) के होते हैं 7. पूरे अणु क्रमशः streptavidin बायोटिन और digoxigenin विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी बातचीत के माध्यम से दो सतह लेपित माइक्रोन आकार मोती (SPHEROTECH) के लिए सीमित किया जा सकता है. एक मनका एक बल मापने ऑप्टिकल tr द्वारा आयोजित किया जाता हैAP, जबकि अन्य एक micropipette की नोक पर आयोजित किया जाता है. मोतियों के बीच सापेक्ष दूरी जाल स्टीयरिंग या micropipette आगे बढ़ या तो द्वारा बदला जा सकता है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, मोती tethering एक भी शाही सेना अणु बढ़ाकर और आराम से किया जा सकता है.

नमूनों की तैयारी. tweezing के लिए शाही सेना के नमूने के संश्लेषण के लिए कुछ कदम (चित्रा 3) शामिल हैं. सबसे पहले, ब्याज की शाही सेना के लिए इसी डीएनए अनुक्रम पहले एक प्लाज्मिड वेक्टर में क्लोन है. अगला, तीन पीसीआर प्रतिक्रियाओं दो संभालती है और प्रतिलेखन के लिए एक टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. प्रतिलेखन टेम्पलेट संभाल क्षेत्रों और डाला दृश्यों शामिल हैं. पूरी लंबाई की शाही सेना में इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा संश्लेषित है. अंतिम शाही सेना और रासायनिक संशोधित हैंडल tweezing के लिए अणु उत्पन्न करने के लिए एक साथ annealed रहे हैं.

अंशांकन और चिमटी का ऑपरेशन. Minitweezers उपयोग की बुनियादी डिजाइनइस काम में घ कि दोहरे किरण ऑप्टिकल चिमटी 33 का पालन करती है. पहली पीढ़ी के ऑप्टिकल चिमटी की तुलना में कई सुधार के साथ, Minitweezers असाधारण स्थिरता प्रदर्शित करते हैं. कई देशों में अनुसंधान समूहों की एक संख्या में अपने एकल अणु अनुसंधान 14,15,34-37 में Minitweezers का उपयोग करें. अनुदेश वीडियो सहित डिवाइस, के निर्माण, अंशांकन, और ऑपरेशन का ब्यौरा, "चिमटी लैब" वेबसाइट (http://tweezerslab.unipr.it) पर उपलब्ध हैं. इधर, दैनिक ठिकानों पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता है कि सुधार और अंशांकन प्रक्रियाओं में विस्तार से वर्णन किया गया हैं.

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Protocol

एकल अणु tweezing के लिए आरएनए अणुओं के 1. तैयारी

  1. ब्याज के अनुक्रम क्लोनिंग. एक वेक्टर में शाही सेना संरचना के लिए इसी डीएनए अनुक्रम क्लोन.
  2. संश्लेषण और प्रतिलेखन टेम्पलेट की शुद्धि. पीसीआर से एक प्रतिलेखन टेम्पलेट synthesize. [यहाँ जगह तालिका 1] इसके बाद, एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पीसीआर उत्पादों को शुद्ध, और> 200 एनजी / μl के लिए नमूना ध्यान केंद्रित. शुद्ध डीएनए प्रतिलेखन के लिए प्रयोग किया जाता है, RNase मुक्त पानी क्षालन और एकाग्रता चरणों में प्रयोग किया जाना चाहिए.
  3. इन विट्रो प्रतिलेखन में. शाही सेना उपज को अधिकतम 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा शाही सेना synthesize. प्रतिलेखन के बाद [यहाँ जगह तालिका 2], मैं 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए डीएनए टेम्पलेट को पचाने के लिए 1 μl DNase जोड़ें. एक सिलिका स्पिन स्तंभ का उपयोग शाही सेना शुद्ध.
  4. Biotinylated संभाल ए के संश्लेषण पहले, प्राइमरों वायु सेना और ए.आर. और सान्द्र का उपयोग पीसीआर द्वारा असंशोधित संभाल एक उत्पादनप्रवर्धित डीएनए> 200 एनजी / μl को entrate. इसके बाद, एक प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया का उपयोग पीसीआर उत्पाद में बायोटिन संशोधनों को शामिल. [जगह यहाँ तालिका 3] नोट: biotinylated संभाल ए (बायोटिन हा) सीधे शुद्धि के बिना annealing में इस्तेमाल किया जा सकता है. बायोटिन हा शाही सेना के साथ annealed जा रहा है के रूप में, यह दोनों चरणों में RNase मुक्त पानी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. Digoxigenin संशोधित संभाल बी Synthesize के संश्लेषण प्राइमर BF और digoxigenin संशोधित Oligo डीआईजी BR (चित्रा 3) का उपयोग करते हुए पीसीआर से संभाल बी (डीआईजी एचबी) संशोधित digoxigenin. अगला, पीसीआर उत्पाद शुद्ध और> 200 एनजी / μl के लिए नमूना ध्यान केंद्रित.
  6. हैंडल करने एनीलिंग आरएनए. हैंडल के साथ शाही सेना पानी रखना. [यहाँ जगह टेबल 4 और 5]
  7. Annealed नमूना शुद्ध. Annealed नमूना के इथेनॉल के 3 खंडों जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. कम से कम 1 घंटे के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण स्टोर. 15,800 XG पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. एक lyophilizer का उपयोग कर गोली सूखी. में गोली भंग100 μl RNase मुक्त पानी. नोट: नमूना इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

ऑप्टिकल चिमटी की 2 अंशांकन और ऑपरेशन

  1. वीडियो मॉनीटर की पिक्सेल साइज जांचना
    1. फंसाने के लिए जाना जाता व्यास (आकार मानक) के साथ एक मनका ऑप्टिकल जाल का प्रयोग करें.
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक फंस मनका की कैद छवियों (चित्रा 4).
    3. केन्द्रक पद्धति पर आधारित इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मनका के व्यास का निर्धारण करते हैं.
    4. विभिन्न आकार के मनकों के व्यास का निर्धारण करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
    5. एक पिक्सेल का शारीरिक आकार प्राप्त करने के लिए एक रेखीय प्रतिगमन द्वारा मोतियों की और मापा जाना जाता व्यास फ़िट.
  2. दूरी अंशांकन सत्यापित करें
    1. फंसाने के लिए एक मनका ऑप्टिकल जाल का प्रयोग करें.
    2. छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर द्वारा अपने केन्द्रक की पिक्सेल स्थिति निर्धारित करें और Minitweezers का उपयोग कर अपनी स्थिति रिकॉर्ड.
    3. Diffe को मोती बैल पदों का किराया और स्थिति दृढ़ संकल्प दोहराने.
    4. Calibrated पिक्सेल आकार का उपयोग कर रहा इकाई के लिए पिक्सल से मनका के एक्स और वाई पदों कन्वर्ट.
    5. वीडियो द्वारा और Minitweezers द्वारा मापा स्थितियों के बीच एक्स और वाई की तुलना करें. मूल्यों के दो सेट सहमत होना चाहिए. छवि संकल्प> 0.1 माइक्रोन है, सटीकता सुनिश्चित करने के लिए माप के बीच 1 माइक्रोन से अधिक मनका चाल है. दूरी अंशांकन Minitweezers में संग्रहीत करने के लिए एक तुलनीय नहीं है, साधन recalibrate.
  3. जाल अकड़न अंशांकन
    1. ऑप्टिकल जाल का उपयोग कर एक मनका पर कब्जा है और अभी भी यह पकड़.
    2. 3 सेकंड के लिए एक दर> 5 kHz पर एक बाईपास तेजी से डाटा अधिग्रहण का उपयोग कर के जाल के बल रिकार्ड.
    3. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मनका गति की रिकॉर्डिंग से एक शक्ति स्पेक्ट्रम उत्पन्न करता है. एक Lorentzian (चित्रा 5) 38 करने की शक्ति स्पेक्ट्रम फिट:
      542 / 51542eq1.jpg "चौड़ाई =" 200 "/> (EQ. 1)
      जिसमें एस (च) च की आवृत्ति में शक्ति है, एफ सी कोने आवृत्ति है, और एस 0 asymptotic शक्ति है. कोने आवृत्ति, सी एफ, थर्मल गति की शक्ति asymptotic मूल्य के आधे से कमी आई है, जहां आवृत्ति है. एफ सी लेजर शक्ति और मनका आकार के साथ बदलता रहता है, व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक फंस मनका जांचना.
    4. एफ सी से जाल से लगातार वसंत, κ, कंप्यूट:
      2 समीकरण (EQ. 2)
      जिसमें γ मनका (EQ. 3) की खींचें गुणांक है. बल परिवर्तन से एक शाही सेना के विस्तार के परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए लगातार वसंत का प्रयोग करें.
  4. स्टोक्स 'कानून टेस्ट
    1. ऑप्टिकल जाल का उपयोग कर एक मनका पर कब्जा. पीछे और बल मनका हटो अलग गति से.
    2. मनका की गति रिकार्ड और Minitweezers का उपयोग मजबूर.
    3. मनका की त्रिज्या कंप्यूट.
      नोट: घर्षण बल, एफ डी, एक तरल पदार्थ में एक गोलाकार कण की गति से उत्पन्न स्टोक्स 'कानून द्वारा वर्णित किया जा सकता है:
      3 समीकरण (EQ. 3)
      जिसमें आर क्षेत्र की त्रिज्या, वी वेग है, और संदर्भ तालिकाओं में पाया जा सकता है जो तरल पदार्थ, के गतिशील चिपचिपापन है. एफ डी के रूप में मापा जाता है बल प्रयोग, मनका की त्रिज्या Eq का उपयोग की जा सकती है. 3 (चित्रा 6) और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के द्वारा निर्धारित उस के साथ सहमत होना चाहिए. स्टोक्स 'कानून परीक्षण प्रभावी ढंग से समग्र calibrations और साधन का प्रदर्शन परीक्षणों.

एकल आरएनए अणुओं के 3 Nanomanipulation

  1. Fluidics बनाना.
    1. एक नंबर 2 कांच कवर पर छह छेद (2 मिमी व्यास प्रत्येक) (चित्रा 7A) ड्रिल और (7 बी चित्रा) एक लेजर उकेरक का उपयोग कर दो तरफा Polyimide टेप में तीन slits (2 मिमी चौड़ाई) में कटौती.
    2. दो तरफा Kapton टेप की दो परतों के साथ दो गिलास को कवर sandwiching द्वारा एक प्रवाह चैम्बर बनाओ. टेप (चित्रा 7C) के बीच एक micropipette और दो ​​बाईपास ट्यूब डालें.
    3. Fluidic छेद (चित्रा 7 दिन) मिलान करके एक धातु फ्रेम पर प्रवाह कक्ष माउंट.
    4. पॉलीथीन ट्यूबिंग्स (चित्रा 7E) के माध्यम से चुनाव के बफर के साथ भरा 10 मिलीलीटर सीरिंज को चैंबर के fluidic चैनलों कनेक्ट करें.
    5. दो उद्देश्यों के बीच ऑप्टिकल चिमटी पर पूरे कक्ष माउंट. Fluidic चैनलों के साथ चैंबर के सामने पक्ष सही करने के लिए चेहरे सुनिश्चित करें. सही उद्देश्य को वापस लेना और टी पर बढ़ते छेद करने के लिए फ्रेम (चित्रा 7E) के पीतल पिन प्लगवह चिमटी. कक्ष की स्थिति को ठीक करने के लिए शिकंजा कस.
  2. Annealed नमूना और मोती मिश्रण. विरोधी digoxigenin लेपित मोती (डीआईजी मोती) के साथ annealed नमूना मिक्स, और मिश्रण 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रहने के लिए करते हैं. आमतौर पर, annealed नमूने के 1 μl बफर के 1 मिलीलीटर में 5 μl डीआईजी मोतियों के साथ मिलाया जाता है. नोट: मोतियों की राशि प्रवाह चैम्बर में लोड करने की मोतियों की एक उचित मात्रा दरकिनार ट्यूब से वितरित किया जाना सुनिश्चित करने के लिए चुना जाना चाहिए. मोती को annealed नमूना के अनुपात आसानी मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता. एक आदर्श स्थिति में, सबसे मोती मोती का केवल एक छोटा सा अंश मनका प्रति केवल एक शाही सेना अणु हो सकता है कि ऐसी कोई आरएनए है. Annealed नमूने और मनका निलंबन अंदाजा लगाना मुश्किल हो रहे हैं, एक ही रास्ता वर्तमान में सबसे अच्छा और मिश्रण अनुपात भिन्न है और चिमटी पर मिश्रण का परीक्षण करने के लिए है.
  3. मील के शीर्ष पर, यानी (प्रवाह चैम्बर में प्रतिक्रिया साइट के लिए कुछ micrometers मोती उद्धारcropipette टिप, चित्रा 7C).
    1. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में streptavidin लेपित मोती (स्ट्रेप मोती) का एक निलंबन लोड करें.
    2. प्रवाह चैम्बर (चित्रा 7A) के नीचे चैनल के लिए अग्रणी fluidic ट्यूबिंग के लिए सिरिंज कनेक्ट करें.
    3. चेंबर में स्ट्रेप मोती प्रवाह करने के लिए सिरिंज पुश.
    4. नीचे बाईपास ट्यूब (चित्रा 7B) के उद्घाटन के पास ऑप्टिकल जाल स्थान के लिए मोटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरे कक्ष में ले जाएँ. फिर एक strep मनका कब्जा करने के लिए एक ट्रैकबॉल द्वारा ऑप्टिकल जाल कार्य करते हैं.
    5. मोटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर micropipette की नोक के करीब मनका ले जाएँ.
    6. Micropipette पर मनका चूसना micropipette से जुड़े सिरिंज खींचो.
    7. अतिरिक्त स्ट्रेप मोती बाहर निकलवाने के लिए मध्यम चैनल में सिरिंज का उपयोग करके धीरे प्रवाह लागू करें.
    8. इसी तरह, नमूना के मिश्रण और चैंबर के शीर्ष चैनल को डीआईजी मोती (3.2 कदम देखें) पहुँचा.
    9. एक डीआईजी मनका पर कब्जा है और ऑप्टिकल जाल का उपयोग स्ट्रेप मनका के लिए यह करीब लाने के लिए.
    10. प्रवाह लगाने से मध्यम चैनल साफ करें. नोट: strep- और वे सूक्ष्म देखें तहत नेत्रहीन प्रतिष्ठित किया जा सकता है, ताकि मोती डीआईजी विभिन्न आकार होने के लिए चुना जाता है (चित्रा 4).
  4. मत्स्य पालन "मोतियों की एक जोड़ी के बीच tethering एक एकल अणु.
    1. स्ट्रेप मनका (चित्रा 4) के शीर्ष पर खड़ी डीआईजी मनका रखें.
    2. जाल स्टीयरिंग से नीचे स्ट्रेप मनका की ओर डीआईजी मनका ले जाएँ. बल परिवर्तन कल्पना करने के लिए कंप्यूटर पर एक बल दूरी की साजिश विंडो खोलें.
    3. दो मोती के संपर्क करने पर, खड़ी दूर स्ट्रेप मनका से डीआईजी मनका चाल है.
    4. कोई विशेष संपर्क किया जाता है, बल लगभग शून्य रहता है. दो मोती अणुओं से जुड़े हुए हैं, तो शक्ति बढ़ जाती है काफी दो मोती अलग है. सामान्यतः "मछली पकड़ने" के रूप में संदर्भित यह प्रक्रिया, अक्सर perf हैमोतियों की प्रत्येक जोड़ी पर ORMED कई बार एक प्रभावी एकल अणु पगहा लगता है.

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Representative Results

अंतरिक्ष द्वारा सीमित एकल आरएनए अणुओं के nanomanipulation केवल यांत्रिक खुलासा आरएनए hairpins के उदाहरण और तृतीयक संरचना के साथ एक शाही सेना दिखाकर प्रदर्शन किया है.

एकल लिये कांटा अणु हेरफेर

एक पगहा मोतियों के बीच स्थापित हो जाने के बाद, पगहा पर के विस्तार और बल एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित प्रोटोकॉल का उपयोग चालाकी से किया जा सकता है. चार आम हेरफेर प्रोटोकॉल आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं.

सेना रैंप प्रयोग. एक भी शाही सेना में हेरफेर करने के लिए सबसे सहज और सामान्य प्रयोग (खड़ी चित्रा 4 में दिखाया गया है) बार बार खिंचाव और हैंडल के पेचदार धुरी की दिशा में अणु आराम करने के लिए है. बल, एफ, और जाल स्थिति, वाई, समय के एक समारोह के रूप में दर्ज हैं. टीआरए के वसंत स्थिर है जिसमें एफ / κ, - अणु, का विस्तार, ई = वाई द्वारा की जा सकती हैपी. खींच परिणाम बल विस्तार वक्र (चित्रा 8A) के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है. डबल असहाय संभालती खींच सकारात्मक ढलान के साथ बढ़ती वक्र द्वारा दिखाया गया है. हैंडल के विश्राम की अवस्था है कि खींचने का लेती है. एक साधारण, दो राज्य तह बाल के लिये कांटा के संरचनात्मक संक्रमण एक एकल, सहकारी खुलासा संक्रमण 39 का संकेत नकारात्मक ढलान के साथ एक "चीर" प्रदर्शित करता है. बाल के लिये कांटा के refolding बल विस्तार वक्र पर एक "ज़िप" ने संकेत दिया है. महत्वपूर्ण बात है, एक ही अणु सामने आया और विभिन्न बलों पर हर बार refolded किया जा सकता है. ऐसी प्रवृत्ति संक्रमण बलों (चित्रा 8B) के वितरण पर स्पष्ट है. आमतौर पर, बल एक निश्चित लोड हो रहा है / उतराई दर पर, यानी समय का एक रेखीय समारोह, के रूप में बदल जाता है. एक निरंतर लोडिंग / अनलोडिंग दर के तहत, बल निर्भर कैनेटीक्स संक्रमण बलों 40-42 के वितरण से निकाला जा सकता है.

निरंतर बल प्रयोग. निरंतर बल मोड के तहत, साधन एक निर्धारित मूल्य से बल विचलन क्षतिपूर्ति करने के लिए एक प्रतिक्रिया तंत्र कार्यरत हैं. एक शाही सेना अणु का विस्तार आणविक extensional राज्यों के अवलोकन और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है विशेष आरएनए अणु संक्रमण के संक्रमण बल पर या निकट बल की स्थापना. समय (9 चित्रा) के एक समारोह के रूप में दर्ज है. प्रत्येक राज्य में अणु की जन्मों संरचनात्मक संक्रमण 7 के कैनेटीक्स गणना करने के लिए एक साथ जमा किया जा सकता है. लगातार बल प्रयोग ऐसे hairpins 7,28 के उन लोगों के रूप प्रतिवर्ती तह, पर नजर रखने के लिए किया जाता है.

सेना कूद प्रयोग. एक बल कूद प्रयोग में, बल तेजी से एक अलग मूल्य में बदल गया है और स्थिर रखा जाता है; पहला संक्रमण का जीवनकाल 43 से नजर रखी है. बल कूद के कैनेटीक्स चिह्नित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैअपरिवर्तनीय प्रक्रियाओं, आगे के जीवन काल और रिवर्स प्रतिक्रियाओं सीधे विभिन्न बलों में अलग से मापा जा सकता है. प्रत्येक बल कूद / ड्रॉप में, केवल एक ही जीवन भर में मनाया जाता है. इसलिए, इस तरह के प्रयोगों के कई दौर कैनेटीक्स निकालने के लिए पर्याप्त टिप्पणियों एकत्र करने के क्रम में प्रदर्शन करने की जरूरत है.

निष्क्रिय प्रयोग. निष्क्रिय मोड के तहत, जाल और micropipette के पदों पर दोनों (चित्रा 10) तय कर रहे हैं. एक बाल के लिये कांटा अपने संक्रमण बलों के पास सामने आया और मुड़ा शाही सेना को इसी दो राज्यों दर्शाती है. लगातार बल प्रयोग, बल और संरचनात्मक संक्रमण पर अणु परिवर्तन का विस्तार दोनों के विपरीत. आणविक बदलाव प्रतिक्रिया नियंत्रण की अनुमति देता को खत्म सीधे बाहरी हस्तक्षेप के बिना नजर रखी जा सके. हालांकि, यह निष्क्रिय मोड से पता चलता है के तहत निरंतर बल बनाए रखने के लिए मुश्किल है. ऑप्टिकल जाल में फंस मनका फैलाना के रूप में, बल परिवर्तन तदनुसार. गुई निष्क्रिय मोड काफी बदल गया है मजबूर दौरान जो लंबे समय ध्यान केन्द्रित करना, साथ आणविक राज्यों को मापने के लिए अनुपयुक्त है. निरंतर बल और निष्क्रिय मोड के पेशेवरों और विपक्ष बड़े पैमाने पर अध्ययन किया और 44 चर्चा की गई है.

माध्यमिक और तृतीयक संरचनाओं की सुलझाना तह

मैकेनिकल दो जुड़े हुए GACG tetraloop hairpins द्वारा गठित एक दो आधार जोड़ी चुंबन आरएनए का खुलासा एक उदाहरण यहाँ (चित्रा 11a) के रूप में प्रयोग किया जाता है. स्टेम दृश्यों अलग हैं, हालांकि दोनों, एक 9 बेस पेयर स्टेम hairpins. शाही सेना (चित्रा 11a) के मैकेनिकल खुलासा पथ बल रैंप विधियों 34 की विशेषता है. बल उठाया गया है, जब चुंबन जटिल पहले hairpins का खुलासा अनुक्रमिक द्वारा पीछा किया, टूट गया है. Refolding पर, hairpins कम बल पर एक चुंबन बातचीत के द्वारा पीछा किया, पहला गुना. ये बदलाव बल विस्तार वक्र पर दिखाई दे रहे हैं (चित्रा11b). बाल के लिये कांटा संक्रमण के काम की पुष्टि, hairpins के प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से अध्ययन किया जा सकता है. unkissing / चुंबन बदलाव का काम tetraloops चुंबन बातचीत 28 के गठन को रोकने के लिए उत्परिवर्तित कर रहे हैं, जिसमें एक उत्परिवर्ती आरएनए, अध्ययन द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, सबसे कम बल चुंबन बलों से अधिक 10 पी.एन., पर सेट किया जा सकता है. जैसी कि उम्मीद थी, ऐसी स्थिति में बल विस्तार वक्र hairpins (चित्रा 11C) 34 का ही खुलासा / refolding प्रदर्शित करता है. इसलिए, यह अलग बलों पर स्वतंत्र रूप से दो hairpins के चुंबन बातचीत और प्रत्येक तह जांच करने के लिए संभव है.

यह दो hairpins की तह चुंबन बातचीत बहुत अलग unkissing और चुंबन बलों द्वारा स्पष्ट रूप में, अत्यधिक अपरिवर्तनीय है, जबकि प्रतिवर्ती है, और बड़ी हिस्टैरिसीस द्वारा कि ध्यान देने योग्य है. इसलिए, hairpins की तह कैनेटीक्स का अध्ययन किया जा सकता है directlवाई निरंतर बल प्रयोगों का उपयोग. चुंबन बातचीत के कैनेटीक्स, तथापि, बल कूद पद्धति का उपयोग करके मापा जाना चाहिए. चित्रा 12A एक विशिष्ट बल कूद प्रयोग 28 से पता चलता है. 3 पी.एन. पर, पूरे शाही सेना जोड़ रहा है. बल तो तेजी से 22 पी.एन. करने के लिए उठाया और स्थिर रखा है. कुछ सेकंड के बाद, पूरे शाही सेना में 30 एनएम ~ के विस्तार की अचानक वृद्धि से स्पष्ट रूप में, एक भी कतरा में सामने आया है. यह 13 पी.एन. को उतारा है पहले बल तो, आगे शाही सेना फैलाने के लिए 30 पी.एन. के लिए उठाया है. Hairpins की तह के बाद, बल जल्दी से 8 पी.एन. को गिरा दिया है. चुंबन परिसर के गठन ~ 7-8 एनएम द्वारा विस्तार से छोटा करने से संकेत दिया है. , इन जीवनकाल माप के कई एकत्रित unkissing और निरंतर बलों पर कैनेटीक्स चुंबन से गणना की जा सकती.

सभी प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, चुंबन जटिल हमेशा पहले सामने आया है. Hairpins खुद से अस्थिर कर रहे हैं कि सेना में चुंबन बातचीतआयन खुलासा से बाल के लिये कांटा संरचनाओं की सुरक्षा करता है. इस तरह की एक दर सीमित प्रभाव भी बल कूद प्रयोगों से पता चला है. बल 16 पी.एन. के लिए कूद गया है जब चित्रा 12b 28, में दिखाया गया है, अणु का विस्तार 20 एनएम ~ द्वारा एक खुलासा बढ़ती विस्तार के द्वारा पीछा किया, कुछ सेकंड के लिए बड़े पैमाने पर अपरिवर्तित बनी हुई है. विस्तार में परिवर्तन कमजोर सात आधार जोड़ी बाल के लिये कांटा चुंबन परिसर के बाधित सही होने के बाद सामने आया है संकेत दिया. बाल के लिये कांटा के metastability जन्मों से स्पष्ट है. चुंबन टूट जाने के बाद, बाल के लिये कांटा तेजी से मुड़ा और सामने आया राज्यों के बीच संक्रमण; जन्मों 1 सेकंड से कम नहीं हैं. मूलतः, इस अवलोकन बाल के लिये कांटा खुलासा के लिए एक निरंतर बल प्रयोग है. इसके विपरीत, यह बाल के लिये कांटा के साथ चुंबन जटिल तोड़ने के लिए 10 सेकंड से अधिक लेता है. इसी प्रकार, बल पूरे शाही सेना में से स्पष्ट रूप में, एक भी कतरा में सामने आया है, जिस पर 17.7 पी.एन. (चित्रा 12C), करने के लिए कूद गया है~ 30 एनएम के विस्तार में क्रीज. विस्तार दो मूल्यों के बीच hops के रूप में बड़े, 11 आधार जोड़ी बाल के लिये कांटा के bistability देखा जा सकता है. फिर, बाल के लिये कांटा से कम जन्मों metastable राज्य में अपने लंबे जीवन के लिए इसके विपरीत में हैं. / तह कदम खुलासा बल रैंप और बल कूद प्रयोगों, ऊष्मा और व्यक्ति के कैनेटीक्स का एक संयोजन का उपयोग 28 मापा जा सकता है. चुंबन परिसर के टूटने और गठन के प्रत्यक्ष अवलोकन न्यूनतम चुंबन जटिल 34 ठिकानों flanking की ऊर्जावान योगदान का विश्लेषण करने के लिए और चुंबन बातचीत 45 के नमक निर्भरता को मापने के लिए सक्षम बनाता है.

चित्रा 1
एप्लाइड बल के सापेक्ष चित्रा 1 शाही सेना संरचनाओं. तनाव के तहत एक) एक बाल के लिये कांटा. ख) एक दो आधार पुलिंगजोड़ी जटिल चुंबन. दो बाल के लिये कांटा छोरों लाल और पीले रंग में रंग के होते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रायोगिक सेटअप. शाही सेना संरचना दो डीएनए / आरएनए संभालती द्वारा flanked है. हैंडल के सिरों पर रासायनिक संशोधनों के माध्यम से, पूरी अणु प्रोटीन लेपित माइक्रोन आकार मोतियों की एक जोड़ी से जुड़ा जा सकता है. मोतियों की एक एक वहनीय, बल मापने ऑप्टिकल जाल द्वारा आयोजित किया जाता है. अन्य एक piezoelectric flexture मंच से प्रेरित है जो एक micropipette, पर रखा गया है. ड्राइंग पैमाने पर नहीं है.

चित्रा 3
चित्रा 3 हैंडल के साथ शाही सेना अणु synthesize करने के लिए एक सामान्य योजना. संभाल ए, बी संभाल, और टीranscription टेम्पलेट क्लोन आरएनए अनुक्रम के साथ एक प्लाज्मिड से पीसीआर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. संभाल एक 3 'सिरों पर digoxigenins (डीआईजी) द्वारा संशोधित किया गया है. संभाल बी एक कतरा के 5 'अंत में एक बायोटिन संशोधन किया है. पूरी लंबाई की शाही सेना प्रतिलेखन टेम्पलेट से लिखित है. शाही सेना और संशोधित हैंडल मिश्रित और annealed हैं. ठीक से अणुओं streptavidin और विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी से लिपटे मोतियों की एक जोड़ी के लिए सीमित किया जा सकता है. ड्राइंग पैमाने पर नहीं है.

चित्रा 4
वीडियो द्वारा कब्जा दो मोतियों के बीच एक एकल अणु मछली पकड़ने के 4 छवियाँ चित्रा कार्ड. एक मनका चूषण द्वारा एक micropipette की नोक पर रखा गया है. अन्य आयोजित की और एक बल मापने ऑप्टिकल जाल द्वारा चलाया जाता है. जाल आंदोलनों के निर्देश तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. फंस मनका पहली चालखड़ी micropipette पर मनका की ओर. संपर्क करने पर फंस मनका ऊपर ले जाता है. एक पगहा मोतियों के बीच स्थापित किया जाता है तो अणु बढ़ाया है, मोतियों की जुदाई अणु और बल बढ़ता है पर खींचती है. दो मोती किसी भी अणु से जुड़े नहीं हैं, तो वापस लेना गति कोई बल उत्पन्न करता है.

चित्रा 5
5 चित्रा एक फंस मनका के ब्राउनियन गति की एक शक्ति स्पेक्ट्रम. ठोस वक्र डालने में दिखाया Lorentzian समीकरण (EQ. 1), के लिए एक फिट है. जाल की लगातार वसंत कोने आवृत्ति (EQ. 2) से की जा सकती है.

चित्रा 6
चित्रा 6 स्टोक्स 'कानून परीक्षण का एक उदाहरण है.

चित्रा 7
7 चित्रा tweezing के लिए एक प्रवाह चैम्बर. एक) छह छेद, 2 मिमी की एक व्यास के साथ एक, तीन 2 मिमी चौड़ा slits दो तरफा Polyimide टेप में कटौती कर रहे हैं. ख) एक लेजर उकेरक का उपयोग करके एक नंबर 2 कवर गिलास में drilled रहे हैं. ग) एक करीब देखो micropipette और दो बाईपास ट्यूब युक्त प्रायोगिक क्षेत्र में. ऊपर और नीचे चैनलों से मोती केंद्रों को उनके संबंधित बाईपास ट्यूब (नीला और हरा) के माध्यम से पारतीर द्वारा संकेत दिशाओं में त्राल चैनल. घ) fluidic छेद मिलान करके एक धातु फ्रेम पर fluidic कक्ष माउंट. ई) पाइप प्रवाह से जुड़े तीन चैनल चैम्बर. केंद्रीय चैनल आरएनए खींचने के लिए प्रयोग किया जाता है. शीर्ष (नीला) और नीचे (हरा) चैनल मोती देने के लिए उपयोग किया जाता है. प्रयोगात्मक क्षेत्र एक लाल वर्ग ने संकेत दिया है.

चित्रा 8
8 सेना रैंप चित्रा. यंत्रवत् एक बाल के लिये कांटा का खुलासा के) एक बल विस्तार वक्र. पुलिंग लाल रंग में नीले और विश्राम में दिखाया गया है. बाल के लिये कांटा का खुलासा / refolding तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. ख) (नीला) खुलासा और बाल के लिये कांटा के (लाल) बलों refolding का वितरण. आंकड़ा एक प्रस्तुत पांडुलिपि 39 से अनुकूलित है.


9 चित्रा निरंतर बल के तहत एक शाही सेना बाल के लिये कांटा. प्रयोग की एक) आरेख. बाल के लिये कांटा. बी पर लगातार बल बनाए रखने के लिए जाल की स्थिति बाल के लिये कांटा संयुक्त राष्ट्र / मोड़ने के लिए समय की तुलना में) प्रतिक्रिया के माध्यम से सेना और स्थिति बदल रही है. बल स्थिर रखा जाता है, जाल की स्थिति बल पर बाल के लिये कांटा के bistability दिखा, दो मूल्यों के बीच उतार चढ़ाव होता रहता. जाल वितरण की द्विपद वितरण 19.4 ± 0.2 एनएम का खुलासा बाल के लिये कांटा पर विस्तार परिवर्तन पैदावार. आंकड़ा एक प्रस्तुत पांडुलिपि 39 से अनुकूलित है.

चित्रा 10
एक बाल के लिये कांटा के 10 निष्क्रिय मोड चित्रा. एक) विस्तार) बल. बी में वृद्धि, दूर जाल के केंद्र से फंस मनका लाता है, जो shortens सेना और निष्क्रिय मोड के तहत एक बाल के लिये कांटा के समय की तुलना में विस्तार.

चित्रा 11
दो आधार जोड़ी चुंबन शाही सेना का आंकड़ा 11 सेना रैंप. यांत्रिक तनाव. बी के तहत एक दो आधार जोड़ी चुंबन शाही सेना के एक) श्रेणीबद्ध तह) सेना विस्तार वक्र. स्ट्रक्चरल बदलाव तीर. ग) सबसे कम बल चुंबन बातचीत को रोकने के लिए 10 पी.एन. पर सेट किया जाता है जब सेना के विस्तार की अवस्था से संकेत कर रहे हैं. फाईgure जर्नल अमेरिकन कैमिकल सोसाइटी 34 से अनुमति के साथ अनुकूलित है.

चित्रा 12
दो आधार जोड़ी चुंबन शाही सेना के 12 चित्रा सेना कूदो. एक) एक बल कूद / ड्रॉप चक्र दो अलग बलों पर unkissing और चुंबन जन्मों को मापने के लिए. शीर्ष पैनल बल के समय का पता लगाने से पता चलता है. नीचे पैनल अणु के रिश्तेदार विस्तार से पता चलता है. बल पहले 22 पी.एन. पर चुंबन परिसर के जीवनकाल को मापने के लिए 22 पी.एन. के लिए 3 पी.एन. से कूद गया है. unkissing एक भी कतरा में सामने आया है कि पूरे शाही सेना का संकेत ~ 30 एनएम से विस्तार में एक त्वरित वृद्धि ने संकेत दिया है. छूट पर बल दो hairpins refold को अनुमति देने के लिए 14 पी.एन. के लिए नीचे ramped है. बल तो पी.एन. 8 को गिरा दिया है. चुंबन बातचीत के गठन ~ 7-8 एनएम के विस्तार में कमी के संकेत है. ख)बल 16 पी.एन. के लिए कूद गया है, समय विस्तार का पता लगाने के यह बाल के लिये कांटा करेंगी और तेजी refolds. ग) पूरे चुंबन जटिल है, जिसके बाद प्रकट करने के लिए चुंबन जटिल और सात आधार जोड़ी बाल के लिये कांटा, के लिए कई सेकंड लेता है कि पता चलता है बल के बाद कुछ ही सेकंड 17.7 पी.एन. के लिए कूद गया है एक भी कतरा में सामने आया. शेष ट्रेस 11 आधार जोड़ी बाल के लिये कांटा के bistability से पता चलता है. चुंबन शाही सेना खुलासा में संरचनात्मक बदलाव के प्रत्येक व्यक्ति विज्ञान की 28 राष्ट्रीय अकादमी की कार्यवाही से अनुमति के साथ अनुकूलित है विशिष्ट एक्स से पता चलता है.

अभिकर्मक μL
प्लाज्मिड (10 एनजी / एमएल) 10
प्राइमर T7f (100 मिमी) 10
प्राइमर BR (100 मिमी) 10
dNTP मिश्रण (25 मिमी प्रत्येक) 10
10xपीसीआर बफर 100
एच 2 850
Taq डीएनए पोलीमरेज़ 10
कुल 1000

नोट: 3 KBP डीएनए synthesizing के लिए एक विशिष्ट थर्मल चक्र है: 95 डिग्री सेल्सियस 45 सेकंड, 53 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट.

तालिका 1 प्रतिलेखन टेम्पलेट synthesizing के लिए पीसीआर का एक उदाहरण है.

अभिकर्मक μL
टेम्पलेट (> 200 एनजी / एमएल) 8
NTPs 8 (2 एमएल प्रत्येक)
10x प्रतिक्रिया बफर 2
T7 शाही सेना पोलीमरेज़ 2
कुल 20

नोट: 37 डिग्री सेल्सियस overni पर प्रतिक्रिया सेतेght.

इन विट्रो प्रतिलेखन में तालिका 2.

अभिकर्मक μL
ए (~ 10 मिलीग्राम) हैंडल 50
बायोटिन 11UTP 5
टी -4 पीओएल प्रतिक्रिया बफर 5
बीएसए समाधान 1
टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ 5
कुल 66

नोट: 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते हैं. कमरे के तापमान को धीमी गति से ठंडा करने के बाद, 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से एंजाइम निष्क्रिय.

3 तालिका प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया.

अभिकर्मक μL
Formamide 800
EDTA (0.5 एम, 8.0 पीएच) 2
पाइप (1 एम, पीएच 6.3) 40
NaCl (5M) 80
कुल 922

पानी रखना बफर की तालिका 4 पकाने की विधि.

अभिकर्मक
बायोटिन हा 1,000 एनजी
डीआईजी एचबी 1,000 एनजी
शाही सेना 1,000 एनजी
एनीलिंग बफर 80 एमएल

नोट: annealing के लिए एक विशिष्ट थर्मल चक्र है: 4 डिग्री सेल्सियस तक ramping द्वारा पीछा 95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट, 62 डिग्री सेल्सियस को 1 घंटा, 52 डिग्री सेल्सियस 1 घंटा,.

हैंडल के साथ सारणी 5 पानी रखना आरएनए.

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Discussion

Tweezing नमूनों की तैयारी में संशोधन और समस्या निवारण

क्लोनिंग वेक्टर के विकल्प. यहां वर्णित सामान्य योजना (चित्रा 3) के एक विशेष क्लोनिंग वेक्टर की आवश्यकता नहीं है हालांकि, वेक्टर एक प्रमोटर वांछित पदों पर पीसीआर के माध्यम से पेश किया जा सकता है कि इस तरह प्रतिलेखन में आसानी के लिए आंतरिक T7 या T3 प्रमोटर के लिए नहीं पसंद है.

अनुक्रम और संभालती की लंबाई. हैंडल के लिए कोई विशिष्ट अनुक्रम आवश्यकता है. हालांकि, अनुपात के लिए एक करीबी जीसी homopolymeric और अत्यधिक दोहराया दृश्यों से परहेज किया जाना चाहिए, जबकि पसंद किया जाता है. प्रकाशित निर्माण में, दो संभालती ब्याज की शाही सेना संरचना बीच में मोटे तौर पर रखा गया है कि इस तरह के रूप में इसी तरह की लंबाई रखा जाता है. पिछला काम आसानी से मापा कैनेटीक्स 46,47 प्रभावित करता हैंडल की कुल लंबाई 500 से 10,000 बेस जोड़े से अलग दिखाता है.

Annealed मिश्रण की ve_content "> गुणवत्ता की जांच और Quantitation. हैंडल के साथ करना आरएनए इसके अलावा, अंतिम उत्पाद भी unannealed डीएनए संभालती है और RNAs, साथ ही दूसरों में शामिल है. यह tweezing अणुओं को शुद्ध करने के लिए मुश्किल और अनार्थिक है. इसके बजाय, annealed केवल ठीक से annealed न्यूक्लिक एसिड दो सतह में लिपटे मोतियों के लिए सीमित किया जा सकता है क्योंकि मिश्रण सीधे, tweezing के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ठीक annealed उत्पाद भी संभालती है और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर शाही सेना से प्रतिष्ठित किया जाना मुश्किल है. सबसे अच्छा तरीका परीक्षण करने के लिए गुणवत्ता और annealed उत्पाद की एकाग्रता यों चिमटी पर यह परीक्षण करने के लिए है. हालांकि, यह जांच और विभिन्न आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग कर प्रत्येक चरण में पीसीआर और प्रतिलेखन उत्पादों यों के लिए उपयोगी है.

मोती के तार शाही सेना के लिए वैकल्पिक तरीकों. Covalently या गैर covalently सतहों को 48 आरएनए अणुओं से जोड़ने के लिए कई बोधगम्य तरीके हैं

एकल बनाम एकाधिक अणु तार. Strep- और डीआईजी मोतियों की एक जोड़ी कई अणुओं से जोड़ा जा सकता है. मनका tethering कई अणुओं की ऐसी संभावना बाहर तंग करने, बल दूरी घटता बारीकी से जांच करने की आवश्यकता है. एकल अणु पगहा बहु अणु tethers में आम तौर पर अनदेखी है कि एक कीड़ा की तरह श्रृंखला लोच 4 प्रदर्शन. प्रत्येक प्रणाली के लिए विशिष्ट अतिरिक्त नियंत्रण प्रयोगों एकल अणु पगहा की पुष्टि के लिए आवश्यक हो सकता है.

Minitweezers का सुधार

तेज और धीमी डेटा रिकॉर्डिंग. Minitweezers है एक निर्मित में इस काम में ऑपरेटिंग कंप्यूटर के रूप में भेजा जाएगा, जो एक कंप्यूटर में 200 हर्ट्ज की एक दर पर 21 वाद्य मापदंडों पर निर्भर है कि रिकॉर्ड डाटा अधिग्रहण. हालांकि, कुछ अनुप्रयोगोंons और calibrations एक तेजी से डाटा अधिग्रहण की दर की आवश्यकता होती है. यह अंत करने, बल और दूरी का इलेक्ट्रॉनिक संकेतों ऑपरेटिंग कंप्यूटर में डाटा अधिग्रहण के अलावा, एक नए कंप्यूटर, "तेजी से रिकॉर्डिंग" कंप्यूटर में दर्ज किया जा विभाजित कर रहे हैं. तेजी से रिकॉर्डिंग कंप्यूटर 1 मेगाहर्ट्ज पर कई चैनलों की अनुमति देता है जो एक अलग डाटा अधिग्रहण कार्ड और सॉफ्टवेयर के माध्यम से डेटा पढ़ता है. नए कंप्यूटर और डाटा अधिग्रहण केवल ऑपरेटिंग कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो साधन, के संचालन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. एक प्रयोग में, डेटा एक साथ अलग दरों पर दोनों कंप्यूटर पर दर्ज हैं. समय तुल्यकालन इसी डेटा फ़ाइलों की तुलना द्वारा डेटा विश्लेषण के दौरान किया जाता है.

वीडियो छवि रिकॉर्डिंग. एक वीडियो कार्ड और इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रतिक्रिया का जीना छवियों पर कब्जा करने और वीडियो चित्र का विश्लेषण करने के लिए तेजी से रिकॉर्डिंग कंप्यूटर पर स्थापित कर रहे हैं. इस विकास के टी लागू करने के लिए यह संभव बनाता हैवह पिक्सेल आकार और दूरी calibrations ऊपर वर्णित है.

सीमाओं और विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों

ठीक एक भी शाही सेना अणु के गठनात्मक परिवर्तन हेरफेर और मापने के तरीकों पर चर्चा की गई है. इस तरह की क्षमताओं यह संभव वास्तविक समय में एक शाही सेना किनारा के संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था पर नजर रखने के लिए करते हैं. इसके अलावा, बल दुर्लभ और / या इष्टतम से कम संरचनाओं तह किया जा करने की अनुमति, शाही सेना संरचना और तह रास्ते को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हालांकि, यांत्रिक दृष्टिकोण की सीमाएं हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, गठनात्मक परिवर्तन की व्याख्या करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो विस्तार, तीन आयामी संरचना का एक आयामी प्रक्षेपण है. यह कुछ गठनात्मक परिवर्तन 49-52 मापा नहीं जा सकता, और / या गतिज बाधाओं अवलोकन 53 से छुपा रहे हैं कि संभव है. विभिन्न वाद्य प्रभावों और सीमाएं भी हैं कि हो सकता है एकffect मनाया ऊष्मा और कैनेटीक्स 44,46,47.

जीनोम चौड़ा सर्वेक्षण 54 से सुझाव कई टेप की तुलना में ऑप्टिकल चिमटी, शाही सेना संरचनाओं की एक सीमित संख्या का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है. तकनीक विभिन्न संरचनात्मक रूपांकनों और बड़े RNAs अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. इसके अलावा, विधि आरएनए अनुसंधान में नए आवेदन मिल जाएगा. उदाहरण के लिए, ligand आरएनए बाध्यकारी और प्रोटीन को स्थिर या यांत्रिक दृष्टिकोण का उपयोग कर मापा जा सकता है जो शाही सेना संरचना, बदल सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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