Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een groot deel van het menselijk genoom getranscribeerd maar niet vertaald. In deze post genoom era, hebben regulerende functies van RNA is aangetoond dat steeds belangrijker te worden. Al RNA functie hangt vaak het vermogen om alternatieve structuren aannemen, is het moeilijk om RNA driedimensionale structuren direct van sequentie voorspeld. Single-molecule zal tonen mogelijkheden om het probleem van RNA structurele polymorfisme oplossen bewaken molecuulstructuren een molecuul tegelijk. Dit werk toont een werkwijze voor het vouwen en de structuur van afzonderlijke RNA-moleculen met optisch pincet nauwkeurig manipuleren. Eerste, methoden om te synthetiseren moleculen geschikt voor single-molecule mechanische werkzaamheden worden beschreven. Vervolgens diverse kalibratie procedures om de goede werking van de optische pincetten zorgen worden besproken. Vervolgens worden verschillende experimenten toegelicht. Om het nut van de techniek aan te tonen, resultaten van mechanisch ontvouwen RNA haarspelden en een enkele RNA Kissing complex worden gebruikt als bewijs. In deze voorbeelden werd de Nanomanipulatie techniek om vouwen van elk structureel domein, zoals secundaire en tertiaire studie onafhankelijk. Tenslotte, de beperkingen en toekomstige toepassingen van de werkwijze worden besproken.

Introduction

De ontwikkeling van de optische pincetten techniek lang gepaard met de toepassing in biologisch onderzoek. Als de optische trapping effect voor het eerst werd ontdekt, Arthur Ashkin geconstateerd dat bacteriën in besmet water kan worden opgesloten in de laserfocus 1. Sindsdien trapping bacteriën is uitgegroeid tot een onbedoelde, leuk experiment voor de generaties van biofysica studenten als een serieuze research tool om microbiële fysiologie 2,3 bestuderen. De optische trapping techniek maakt gebruik van gefocusseerde laserbundel een microscopisch object 1 immobiliseren. Praktisch, een laser trap functioneert als een optische bron, controleert tevens kracht (F) op het ingesloten object door de verplaatsing van het centrum van de val (AX). Binnen een kort bereik, F = κ x AX, in κ is de veerconstante van de val. De optische val kan worden gebruikt in piconewton (pN) precisie kracht uitoefenen wanneer microscopic object en haar positie met nanometer (nm) nauwkeurigheid te meten. In de afgelopen twee decennia hebben een optisch pincet een van de meest gebruikte single-molecule technieken in biofysica geworden. De techniek is toegepast om vouwen en mechanica van DNA 4-6, 7-9 RNA en eiwitten te bestuderen 10,11. Optische pincetten zijn ook gebruikt om DNA replicatie 12, RNA transcriptie 13 en eiwitsynthese 14,15, evenals vele andere biomoleculaire evenementen 16-18 observeren.

Single-molecule benaderingen zijn werkzaam in RNA structureel onderzoek vooral naar de ruige vouwen energielandschap van RNA te verkennen. Een RNA-sequentie kan meestal vouwen in meerdere stabiele, elkaar uitsluitende structuren, door de eenvoudige chemische samenstelling en base paring regels van RNA. Het is lang bekend dat RNA structurele polymorfisme, zoals die voorkomt in riboswitches 19,20, speelt een belangrijke rol in genregulatie. Een recent genoom-breed onderzoek is zo klein als een paar graden grote invloed structuur en eiwitsynthese van een groot deel van het cellulaire transcriptoom 21 bleek dat temperatuurschommelingen. Dit voorbeeld duidt dat de biologische rol van alternatieve RNA vouwen is misschien belangrijker en ingrijpender dan gedacht. Structurele polymorfisme echter een uitdaging voor de traditionele biochemische en biofysische benaderingen die gemiddeld in vele nieuwe moleculen te onderzoeken. Bijvoorbeeld, de "aan" en "uit" conformaties van een riboswitch elkaar uitsluiten. Een gemiddelde structuur afgeleid van heterogene structuren is waarschijnlijk een van de biologisch relevante conformeren lijken. Bovendien getranslateerde RNA en mRNA vormen meestal structuren. Hun interactie met eiwitten en regelgevende RNAs gevallen vereist ontvouwing van de bestaande structuur van de interactie. Daarom bestuderen RNA ontvouwen / hervouwing wordt een pertinenteafgifte van RNA biologie. Om een dergelijke uitdaging aan te gaan, is de enkel-molecuul benadering toegepast om RNA structurele polymorfisme ontrafelen door het bestuderen van een molecuul per keer 22-27.

In vergelijking met de populaire single-molecule fluorescentie werkwijze pincet gebaseerd mechanische ontplooiing biedt een voordeel dat conformaties van afzonderlijke moleculen worden gemanipuleerd door toegepaste kracht en worden gemeten nanometerprecisie. Dit Nanomanipulatie capaciteit kan worden gebruikt voor het ontvouwen / vouwing van individuele structurele domeinen zodat de hiërarchische vouwen van een grote RNA kan worden ontleed 28 volgen. Alternatief kan een enkele streng worden aan vouwen tot een van de verschillende conformaties; of een bestaande structuur kan mechanisch worden geïnduceerd opnieuw vouwen in een andere conformatie 29. Onder biologische omstandigheden, kan een RNA-structuur af van de temperatuur veranderingen of ligand bindend worden gewijzigd. De mogelijkheid van het direct manipuleren moleculaire sTRUCTUUR opent een nieuwe locatie van RNA structurele studie. In principe andere mechanische technieken, zoals atomic force microscoop en magnetische pincet, kan ook worden gebruikt om vouwen van afzonderlijke RNA-moleculen te bestuderen. Echter worden dergelijke toepassingen grotendeels beperkt door de relatief lage ruimtelijke resolutie 30.

De tewerkstelling van een optisch pincet maakt RNA structuren worden ontvouwd door mechanische kracht.

Het voordeel van mechanische ontplooiing is verscheidene malen. Kracht kan worden gebruikt om zowel secundaire en tertiaire structuren ontvouwen, terwijl metaalionen en ligand geïnduceerde vouwen voornamelijk beperkt tot tertiaire structuren. Temperatuur en denatureringsmiddel kan een aanzienlijke invloed hebben op de activiteiten van water en opgeloste stoffen. In tegenstelling, is kracht lokaal toegepast op moleculaire structuren verstoren; het effect van de werking op de omgeving is te verwaarlozen. Daarnaast is thermische smelten best gebruikt vouwen thermodynamica van kleine RNA structuren,dat optische pincetten werden gebruikt om RNA structuren bestuderen met verschillende afmetingen, variërend van een zeven-base-pair tetraloop haarspeld 28 een 400-nucleotide ribozym 31. Bovendien kan RNA structuren mechanisch worden ontvouwen bij mesofiele temperaturen. In tegenstelling tot RNA ontvouwen in een thermisch smeltende experiment wordt de temperatuur verhoogd typisch ver boven fysiologische temperaturen, die aanzienlijk verhoogt RNA hydrolyse, met name bij aanwezigheid van Mg2 + ionen.

Het is belangrijk op te merken dat de mechanische effect van werking afhankelijk van deze wordt toegepast op een structuur. De uitgeoefende kracht kantelt het vouwen energielandschap. Bijvoorbeeld, wanneer kracht wordt uitgeoefend op een haarspeld, de basenparen opeenvolgend gebroken, een tegelijk (figuur 1a). De scheuren vork verloopt langs de spiraalvormige as, die loodrecht op de uitgeoefende kracht. Wanneer daarentegen een minimale kussen complex onder spanning, de twee kussenbasenparen, die evenwijdig aan de uitgeoefende kracht is, geef de kracht load (Figuur 1b). De verschillende geometrieën van de haarspeld en kussen complex ten opzichte van de uitgeoefende kracht resultaat in hun verschillende mechanische respons, die kan worden gebruikt om secundaire en tertiaire vouwing 28,32 onderscheiden. Het theoretische aspect van mechanische ontvouwen is eerder beoordeeld 8,9,30. Dit werk beschrijft de fundamentele benaderingen voor het opzetten en uitvoeren van een single-molecule mechanische ontvouwen assay.

Experimentele opstelling. In ons experiment mechanisch trekken, het RNA monster pincet uit het RNA van belang geflankeerd door twee dubbelstrengs DNA / RNA handgrepen (figuur 2) 7. De gehele molecuul kan worden vastgebonden aan twee oppervlak beklede micron-size kralen (Spherotech) via streptavidine-biotine en digoxigenine-anti-digoxigenine antilichaam interactions, respectievelijk. Een kraal wordt gehouden door een kracht meten van optische trap, terwijl de andere is op het puntje van een micropipet gehouden. De onderlinge afstand tussen de korrels kan worden veranderd door ofwel sturen van de val of verplaatsen van de micropipet. Met deze aanpak kan een enkele RNA-molecuul tethering de kralen worden uitgerekt en ontspannen.

Voorbereiding van de monsters. De synthese van RNA monsters voor pincet bevat enkele stappen (figuur 3). Eerst wordt de DNA-sequentie overeenkomend met het RNA van belang eerst gekloneerd in een plasmide vector. Vervolgens worden drie PCR-reacties uitgevoerd om de twee handvatten en een template voor transcriptie genereren. De transcriptie sjabloon omvat de handgreep regio's en de ingebrachte sequenties. De volledige lengte RNA wordt gesynthetiseerd door in vitro transcriptie. Ten slotte worden de RNA en chemisch gemodificeerde handgrepen samen gehybridiseerd met de moleculen te genereren voor pincet.

Kalibratie en uitvoering van de pincet. Het basisontwerp van de Minitweezers gebruikd in dit werk volgt die van de dual-beam optisch pincet 33. Met veel verbeteringen, de Minitweezers bezitten buitengewone stabiliteit vergeleken met de eerste generatie optische pincetten. Een aantal onderzoeksgroepen in verschillende landen gebruiken de Minitweezers in hun single-molecule onderzoek 14,15,34-37. De details van de bouw, kalibratie, en de werking van het apparaat, inclusief instructie video's, zijn beschikbaar op de "pincet Lab" website (http://tweezerslab.unipr.it). Hier, verbeteringen en kalibratie procedures die moeten worden uitgevoerd op dagelijkse basis worden beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Voorbereiding van de RNA-moleculen voor Single-molecule Pincet

  1. Klonen van de sequentie van belang. Kloon de DNA sequentie die overeenkomt met RNA structuur in een vector.
  2. Synthese en zuivering van de transcriptie template. Samenstel transcriptie matrijs door PCR. [Plaats tabel 1 hier] Next, te zuiveren van de PCR producten met behulp van een PCR zuivering kit, en concentreer het monster tot> 200 ng / ul. Omdat het gezuiverde DNA wordt gebruikt voor transcriptie moet RNase vrij water worden gebruikt in de elutie en concentratie.
  3. In vitro transcriptie. Synthetiseren van RNA in vitro transcriptie bij 37 ° C gedurende de nacht RNA opbrengst maximaliseren. [Plaats tabel 2 hier] Na transcriptie voeg 1 pl DNase I van het DNA template verteren gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Zuiver het RNA met een silica spinkolom.
  4. Synthese van de gebiotinyleerde handgreep A. Allereerst produceren ongemodificeerde handgreep A met PCR met gebruik van primers Af en Ar en concEntrate het geamplificeerde DNA tot> 200 ng / ul. Vervolgens nemen biotine wijzigingen in het PCR product op een primerverlengingsreactie. [Place tabel 3 hier] OPMERKING: De gebiotinyleerde handgreep A (biotine-HA) kan direct in de annealing zonder zuivering. Aangezien de biotine-HA wordt gegloeid met RNA, is het essentieel om RNase-free water in beide stappen.
  5. Synthese van de digoxigenine-gemodificeerde handgreep B. synthetiseren digoxigenine gemodificeerde handgreep B (dig-HB) door PCR met primer Bf en digoxigenine-gemodificeerde oligo Dig-Br (figuur 3). Vervolgens zuiveren het PCR-product en concentreer het monster tot> 200 ng / ul.
  6. Gloeien RNA de hendels. Het hybridiseren RNA handgrepen. [Plaats tabellen 4 en 5 hier]
  7. Zuiver gegloeid monster. Voeg 3 volumes ethanol van het gegloeide monster en meng. Bewaar het mengsel bij -70 ° C gedurende tenminste 1 uur. Spin down bij 15.800 xg en gooi supernatant. Droog de pellet met een vriesdroger. Los het pellet in100 gl RNase-free water. Opmerking: Het monster is klaar voor gebruik en kan bij -20 ° C opgeslagen.

2 kalibratie en uitvoering van de optische pincet

  1. Kalibreren pixelgrootte van Video Monitor
    1. Gebruik de optische val te vangen een kraal met een bekende diameter (maat standaard).
    2. Maak foto's van het gevangen kraal met behulp van beeldbewerkingssoftware (figuur 4).
    3. Bepaal de diameter van de kraal met de imaging software gebaseerd op het zwaartepunt methode.
    4. Herhaal deze procedure tot diameters van kralen van verschillende grootte te bepalen.
    5. Breng de gemeten en bekende diameters van de korrels door een lineaire regressie op de fysieke afmetingen van een pixel te verkrijgen.
  2. Verifiëren Afstand Calibration
    1. Gebruik de optische val te vangen van een kraal.
    2. Bepaal de pixel positie van zijn zwaartepunt door de software voor het vastleggen en opnemen van zijn positie met behulp van de Minitweezers.
    3. Sturen de kraal te diffe posities huren en herhaal de positiebepaling.
    4. Zet de X en Y-posities van de kraal van pixels tot m toestel met de gekalibreerde pixelgrootte.
    5. Vergelijk de X en Y tussen posities gemeten video en de Minitweezers. De twee sets van waarden moeten het eens. Als de beeldresolutie is> 0,1 micrometer, beweeg de kraal dan 1 micrometer tussen de metingen om de nauwkeurigheid te garanderen. Als de afstand kalibratie is niet vergelijkbaar met de ene opgeslagen in de Minitweezers, opnieuw kalibreren van het instrument.
  3. Trap Stijfheid Calibration
    1. Het veroveren van een kraal met behulp van de optische val en houd het nog steeds.
    2. Noteer de kracht van de val met behulp van een bypass snelle data-acquisitie met een snelheid> 5 kHz voor 3 sec.
    3. Genereer een vermogensspectrum van de opname van de kraal beweging met behulp van software. Monteer het vermogensspectrum aan van een Lorentz (figuur 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Vgl. 1)
      waarbij S (f) het vermogen bij de frequentie f, f c is de hoek frequentie, S en 0 is de asymptotische kracht. De hoek frequentie fc is de frequentie waar de kracht van thermische beweging is afgenomen tot de helft van de asymptotische waarde. Als f c varieert met laservermogen en korrelgrootte, kalibreren elke gevangen kraal afzonderlijk.
    4. Bereken de veerconstante van de val, κ, van f c:
      Vergelijking 2 (Vgl. 2)
      waarin γ is de Cw-waarde van de kraal (Vgl. 3). Gebruik de veerconstante aan uitbreiding veranderingen van een RNA van kracht verandering bepalen.
  4. Stokes 'Law Test
    1. Het veroveren van een kraal met behulp van de optische val. Beweeg de kraal heen-en-force op verschillende snelheden.
    2. Noteer de beweging van de hiel en forceren met de Minitweezers.
    3. Bereken de straal van de kraal.
      OPMERKING: De wrijvingskracht F d, gegenereerd door de beweging van een bolvormig deeltje in een vloeistof kan worden beschreven door de wet van Stokes:
      Vergelijking 3 (Vgl. 3)
      waarin r de straal van de bol, v de snelheid en h is de dynamische viscositeit van het fluïdum, te vinden in referentietabellen. De gemeten kracht F d, kan de straal van de kraal worden berekend met vergelijking. 3 (figuur 6) en moet eens met dat bepaald wordt door het beeld acquisitie software. De wet van Stokes-test effectief test de algehele kalibraties en de prestaties van het instrument.

3 Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen

  1. Maken fluïdica.
    1. Boor zes gaten (2 mm diameter per stuk) op een nummer 2 afdekglas (figuur 7a) en snijd drie sleuven (2 mm breed) in dubbelzijdig polyimide tape (figuur 7b) met behulp van een laser graveur.
    2. Maak een flow chamber door daartussen twee dekking van glas met twee lagen dubbelzijdig Kapton tape. Plaats een micropipet en twee bypasses tussen de band (figuur 7c).
    3. Monteer de stroom kamer op een metalen frame door het afstemmen van vloeibare gaten (figuur 7d).
    4. Sluit de vloeibare kanalen van de kamer tot 10 ml spuiten gevuld met buffer van keuze via polyethyleen buizen (figuur 7e).
    5. Monteer de hele kamer op het optisch pincet tussen de twee doelstellingen. Zorg ervoor dat de voorzijde van de kamer met de vloeibare kanalen kijkt naar rechts. Trek de juiste doelstelling en steek de koperen pennen van het frame (figuur 7e) om montagegaten op thij pincet. Draai de schroeven vast om de kamer te bepalen van een positie.
  2. Mengen van het gehybridiseerde monster en kralen. Meng het monster gehybridiseerd met anti-digoxigenine-beklede parels (dig-korrels), en laat het mengsel verblijven bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. Typisch wordt 1 ui gegloeid monster gemengd met 5 ui dig-korrels in 1 ml buffer. OPMERKING: De hoeveelheid van de korrels in de stromingskamer worden geladen moeten worden gekozen dat een redelijke hoeveelheid van de korrels van het omzeilen tube te leveren. De verhouding van de gegloeide monster op de kralen kan niet gemakkelijk worden gekwantificeerd. In het ideale geval meeste kralen hebben geen RNA, dat slechts een kleine fractie van korrels slechts een RNA-molecuul per bead kunnen hebben. Aangezien de gegloeide monsters en de kralensuspensie moeilijk te kwantificeren, de beste en enige manier momenteel de mengverhouding varieert en test het mengsel op het pincet.
  3. Lever kralen om de reactie plaats in de stromingskamer (dwz enkele micrometers bovenop de micropipette tip, figuur 7c).
    1. Plaats een schorsing van streptavidine gecoate kralen (strep-parels) in een spuit van 1 ml.
    2. Sluit de spuit aan de vloeibare slang die leidt naar de bodem van het kanaal stromingskamer (Figuur 7a).
    3. Duw de spuit aan de strep-beads stromen in de kamer.
    4. Beweeg de gehele kamer met motor control software om de optische val nabij de opening van de onderste omleidingsbuis (figuur 7b) plaatsen. Opereren dan de optische val door een trackball om een ​​strep-kraal vangen.
    5. Beweeg de kraal nabij de punt van de micropipet met de motor control software.
    6. Trek de spuit verbonden met de micropipet aan de korrel zuigen op de micropipet.
    7. Solliciteer stroom zachtjes door op de spuit om het midden kanaal voor het spoelen van extra strep-kralen.
    8. Evenzo levert het mengsel van monster en dig-korrels (zie stap 3.2) boven kanaal van de kamer.
    9. Leg een opgraving-kraal en breng het dicht bij de strep-kraal met behulp van de optische val.
    10. Reinig het midden kanaal door het toepassen van stroom. OPMERKING: De Streptomyces en graaf-kralen zijn gekozen verschillende afmetingen zodat ze visueel kunnen worden onderscheiden onder microscopisch beeld (figuur 4).
  4. Visserij "een single-molecule tethering tussen een paar kralen.
    1. Plaats de dig-kraal verticaal boven de strep-bead (figuur 4).
    2. Beweeg de dig-kraal naar beneden richting de strep-kraal door het sturen van de val. Open een kracht-afstand plot venster op de computer aan kracht veranderingen te visualiseren.
    3. Bij contact van de twee kralen, verplaats de dig-kraal verticaal weg van de streptokokken-kraal.
    4. Als er geen specifieke contact wordt gemaakt, de kracht is bijna nul. Als de twee kralen zijn verbonden door moleculen, de kracht neemt sterk toe als de twee korrels scheiden. Deze procedure, bekend als "vissen", vaak perfORMED meerdere keren op elk paar kralen aan een effectieve single-molecule tether vinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beperkt door de ruimte, wordt Nanomanipulatie van enkelvoudige RNA-moleculen aangetoond door het tonen van alleen mechanische ontvouwen voorbeelden van RNA haarspelden en een RNA met een tertiaire structuur.

Manipuleren Single Haarspeld Moleculen

Zodra een ketting gelegd tussen de kralen, kan verlenging van en de kracht op de ketting worden gemanipuleerd met een door de gebruiker gedefinieerde protocol. Vier algemene manipulatie protocollen worden vaak gebruikt.

Force-ramp Experiment. De meest intuïtieve en gemeenschappelijke experiment om een RNA te manipuleren herhaaldelijk uitrekken en ontspannen de molecule in de richting van de spiraalvormige as van de handgrepen (verticaal zoals in de figuur 4). De kracht F en val positie Y, geregistreerd als functie van de tijd. De uitbreiding van het molecuul, e, kan worden berekend door e = Y - F / κ, waarin de veerconstante van de trap. Het trekken resultaat kan worden weergegeven als de kracht-extensie curve (figuur 8a). Het strekken van het dubbelstrengs handgrepen blijkt uit de stijgende curve met positieve helling. De versoepeling curve van de handgrepen vertelt dat van de rekken. De structurele overgang van een eenvoudige, twee-staten opvouwbare hairpin toont een "rip" met negatieve helling, wat wijst op een enkele, coöperatieve ontvouwen overgang 39. Het opnieuw vouwen van de haarspeld aangeduid met een "zip" op de kracht-extensie curve. Belangrijk is, kan hetzelfde molecuul worden uitgevouwen en hervouwen bij verschillende krachten elke keer. Zo'n trend is duidelijk over de verdelingen van de overgang krachten (figuur 8b). Gewoonlijk wordt de kracht veranderd als een lineaire functie van tijd, dat wil zeggen op een vaste laden / lossen rate. Onder een constante laden / lossen tarief, kan de kracht afhankelijke kinetiek worden gewonnen uit verdelingen van de overgang krachten 40-42.

Constant Force Experiment. Onder de constante kracht mode, het instrument maakt gebruik van een feedback-mechanisme om de kracht afwijkingen te compenseren van een ingestelde waarde. De uitbreiding van een RNA-molecuul wordt geregistreerd als functie van de tijd (figuur 9). Kracht op of bij de overgang kracht van het bepaalde RNA-molecuul overgang maakt waarneming en kwantificering van moleculaire extensionele toestanden. De levensduur van het molecuul op elke staat kunnen worden samengevoegd tot de kinetiek van de structurele overgang 7 berekenen. De constante kracht experiment wordt gebruikt om reversibele vouwing, zoals haarspelden 7,28 bewaken.

Force Jump Experiment. In een kracht sprong experiment, wordt de kracht snel veranderd in een andere waarde en constant gehouden; de levensduur van de eerste overgang wordt bewaakt 43. De kracht sprong is bijzonder nuttig om de kinetiek van karakteriserenonomkeerbare processen, omdat de levensduur van de voorwaartse en omgekeerde reacties direct afzonderlijk kan worden gemeten bij verschillende krachten. Bij elke kracht jump / drop, slechts een leven waargenomen. Derhalve meerdere ronden van dergelijke experimenten nodig om voldoende waarnemingen kinetiek extraheren verzamelen worden uitgevoerd.

Passieve experimenten. Onder de passieve modus, worden de posities van de val en de micropipet zowel vaste (figuur 10). Een haarspeld vertoont twee staten die overeenkomt met ongevouwen en gevouwen RNA in de buurt van zijn overgang krachten. In tegenstelling tot de constante kracht experiment, zowel de kracht en verlenging van het molecuul wijziging op de structurele overgang. Elimineren van feedback controle maakt moleculaire overgangen direct worden gecontroleerd, zonder inmenging van buitenaf. Het is echter moeilijk om constant handhaven onder de passieve modus toont. Als de gevangen kraal diffuse in de optische val, kracht verandert dienovereenkomstig. The passieve modus is geschikt voor het meten van moleculaire toestanden met lange wachttijd, tijdens welke kracht wordt significant veranderd. De voors en tegens van de constante kracht en passieve modes zijn uitgebreid bestudeerd en besproken 44.

Ontrafel Vouwen van secundaire en tertiaire structuren

Mechanische ontvouwen van een twee-base-paar kussen RNA gevormd door twee gekoppelde GACG tetraloop haarspelden gebruikt als voorbeeld here (figuur 11). Beide haarspelden een 9 baseparen stam, hoewel de steel sequenties verschillen. De mechanische ontvouwen pad van het RNA (Figuur 11a) werd gekenmerkt door geweld oprit methoden 34. Wanneer kracht wordt verhoogd, wordt het kussen complex eerste gebroken, gevolgd door opeenvolgende ontvouwen van de haarspeldbochten. Op hervouwing de haarspelden vouwen, gevolgd door een kussen interactie op lage kracht. Deze overgangen zijn zichtbaar op de kracht-extensie curve (Figuur11b). De toewijzing van de haarspeld overgangen te bevestigen, kan elk van de haarspeldbochten afzonderlijk bestudeerd. De toewijzing van de unkissing / kussen overgangen kan worden geverifieerd door het bestuderen van een mutant RNA, waarbij de tetraloops gemuteerd vorming van de interactie kussen 28 te voorkomen. Als alternatief kan de laagste kracht worden vastgesteld op 10 PN, hoger dan het zoenen krachten. Zoals verwacht, de kracht-extensie curve onder dergelijke omstandigheden worden alleen de ontvouwing / heropvouwing van de haarspelden (Figuur 11c) 34. Daarom kan onderzocht vouwen het kussen interactie en elk van de twee haarspelden onafhankelijk bij verschillende krachten.

Het valt op dat de vouwen van de twee haarspeldbochten is omkeerbaar, terwijl het kussen interactie uiterst onomkeerbaar, zoals duidelijk door zeer verschillende unkissing en kussen krachten, en door grote hysteresis. Daarom kan het vouwen kinetiek van de haarspeldbochten bestudeerd directly met de constante kracht experimenten. De kinetiek van de interactie kussen evenwel worden gemeten met de kracht sprongmethode. De Figuur 12a toont een typische kracht sprong experiment 28. Op 3 PN, wordt de gehele RNA gevouwen. De kracht wordt vervolgens snel verhoogd tot 22 pN en constant gehouden. Na enkele seconden wordt de volledige RNA ontvouwde tot een enkele streng, zoals duidelijk door een plotselinge toename van de verlenging van ~ 30 nm. De kracht wordt dan 30 pN verhoogd tot het RNA verder te rekken, voordat het wordt verlaagd tot 13 pN. Na het vouwen van de haarspelden, wordt de kracht snel gedaald tot 8 pN. De vorming van het kussen complex wordt aangegeven door het verkorten van de uitbreiding door ~ 7-8 nm. Door het verzamelen van veel van deze levensduur metingen unkissing en kussen kinetiek bij constante krachten worden berekend.

Onder alle experimentele omstandigheden, wordt het kussen complex altijd eerst ontvouwd. Op krachten die de haarspeldbochten zijn instabiel door zichzelf, het kussen op elkaar inwerkenion beschermt de haarspeldstructuren uit ontvouwen. Zo'n snelheidsbeperkende effect wordt ook onthuld door geweld sprong experimenten. Zoals weergegeven in de figuur 12b 28, wanneer de kracht wordt gesprongen naar 16 pN, de uitbreiding van het molecuul grotendeels onveranderd gedurende enkele seconden, gevolgd door een ontvouwing verhogen de bij ~ 20 nm. De veranderingen in de verlenging aangegeven zwakkere zeven basenpaar haarspeld direct na ontvouwd verstoren van het kussen complex. De metastabiliteit van de haarspeld is duidelijk door de levens. Zodra het kussen is gebroken, de hairpin snel doortrekt tussen gevouwen en ontvouwen toestanden; de levensduur minder dan 1 sec. In wezen, deze waarneming is een constante kracht experiment voor het ontvouwen van de hairpin. In tegenstelling, het duurt meer dan 10 seconden om de zoenen complexe breken samen met de hairpin. Evenzo wordt kracht sprong 17.7 pN (figuur 12c), waarin het gehele RNA wordt uitgevouwen in een enkelvoudige streng, zoals duidelijk door de invouw in het verlengde van ~ 30 nm. De bistabiliteit van de grote, 11 baseparen haarspeld kan worden gezien als een uitbreiding hop tussen twee waarden. Nogmaals, de korte levensduur van de haarspeld in schril contrast met de lange levensduur in de metastabiele toestand. Met behulp van een combinatie van kracht helling en werking springen experimenten, de thermodynamica en kinetiek van individuele ontvouwen / inklapbare trap kan worden gemeten 28. Directe observaties van het breken en de vorming van het kussen complex kunnen we energieke bijdragen van flankerende bases aan de minimale zoenen complex 34 te analyseren en het zout afhankelijkheid van het kussen interactie 45 meten.

Figuur 1
Figuur 1 RNA structuren ten opzichte van de uitgeoefende kracht. a) Een haarspeld onder spanning. b) trekken van een twee-basepaar kussen complex. De twee haarspeld lussen zijn gekleurd in rood en geel.

Figuur 2
Figuur 2 Experimentele opstart. Het RNA structuur wordt geflankeerd door twee DNA / RNA handgrepen. Door de chemische modificaties aan de uiteinden van de handgrepen kan het gehele molecuul worden verbonden met een paar eiwit beklede microscopisch kleine kralen. Een van de parels wordt gehouden door een bestuurbare, krachtmeters optische val. De andere is geplaatst op een micropipet, die wordt aangedreven door een piëzo flexture fase. De tekening is niet op schaal.

Figuur 3
Figuur 3 Een algemene regeling voor RNA-moleculen te synthetiseren met handgrepen. Het handvat A, handvat B, en transcription template wordt gegenereerd door PCR van een plasmide met de RNA-sequentie gekloneerd. De handgreep A wordt gemodificeerd door digoxigenins (graaf) aan de 3'-uiteinden. Het handvat heeft een B biotine modificatie aan 5 'uiteinde van een streng. De volledige lengte RNA wordt getranscribeerd van de transcriptie template. De RNA gewijzigde handgrepen zijn gemengd en versmolten. De juiste moleculen kunnen vastgemaakt aan een paar korrels bekleed met streptavidine en anti-digoxigenine antilichaam. De tekening is niet op schaal.

Figuur 4
Figuur 4 afbeeldingen van vissen een enkel-molecuul tussen twee kralen gevangen genomen door de videokaart. Een kraal is geplaatst op de punt van een micropipette door zuiging. De andere wordt vastgehouden en gestuurd door een kracht meten van optische val. De richtingen van de val bewegingen zijn aangegeven met pijlen. De gevangen kraal eerste zettenverticaal naar de hiel op de micropipet. Bij de contacten, de gevangen kraal gaat omhoog. Indien een ketting gelegd tussen de korrels, de scheiding van kralen trekt aan het molecuul en de kracht neemt toe als het molecuul verlengd. Als twee kralen niet zijn verbonden door elk molecuul, het intrekken beweging genereert geen kracht.

Figuur 5
Figuur 5 een vermogensspectrum van de Brownse beweging van het gevangen kraal. Het vaste curve is geschikt om de Lorentz vergelijking (Vgl. 1), die in het inzetstuk. De veerconstante van de val kan worden berekend uit de hoek frequentie (Vgl. 2).

Figuur 6
Figuur 6 Een voorbeeld van de wet van Stokes test.

Figuur 7
Figuur 7 Een stroom kamer voor pincet. a) zes gaten, elk met een diameter van 2 mm worden geboord in een nr 2 dekglas met een lasergraveur. b) Drie 2 mm brede spleten gesneden dubbelzijdige polyimide tape. c) loep het experimentele gebied dat de micropipet en twee bypasses. De korrels van de bovenste en onderste kanalen doorkruisen via hun respectievelijke bypasses (blauw en groen) aan de centrale kanaal in de door pijlen richtingen. d) Bevestig de vloeibare kamer op een metalen frame passen vloeibare holes. e) een driekanaals kamer aangesloten leidingen stromen. Het centrale kanaal wordt gebruikt voor het trekken RNA. De bovenste (blauw) en onderste (groene) kanalen worden gebruikt voor het leveren beads. De experimentele regio wordt aangegeven met een rood vierkant.

Figuur 8
Figuur 8 Force oprit. a) Een kracht-extensie curve van mechanisch ontvouwen van een haarspeld. Trekken wordt weergegeven in blauw en ontspanning in het rood. De ontplooiing / hervouwing van de haarspeld worden aangegeven door de pijlen. B) Verdelingen van ontvouwing (blauw) en opnieuw vouwen (rood) krachten van de haarspeld. De figuur is een bewerking van een manuscript ingediend 39.


Figuur 9 Een RNA haarspeld onder constante kracht. a) Diagram van experiment. De positie van de val wordt veranderd door middel van feedback om zo een constante kracht op de hairpin. B onderhouden) Kracht en de positie ten opzichte van de tijd voor de hairpin un / vouwen. Aangezien de kracht constant wordt gehouden, de positie van de val schommelt tussen twee waarden geeft bistabiliteit van de haarspeld aan de kracht. De binomiale verdeling van de val distributie levert de uitbreiding verandering na de hairpin ontvouwen van 19,4 ± 0,2 nm. De figuur is een bewerking van een manuscript ingediend 39.

Figuur 10
Figuur 10 passieve modus van een haarspeld. a) B) Kracht en uitbreiding versus tijd van een haarspeld onder passieve modus.

Figuur 11
Figuur 11 Force helling van de twee baseparen kussen RNA. a) Hiërarchische vouwen van een twee-base-paar kussen RNA onder mechanische spanning. b) kracht-verlenging kromme. Structurele overgangen worden aangegeven met pijlen. C) Kracht-extensie curve wanneer de laagste kracht wordt vastgesteld op 10 pN om de zoenen interactie te voorkomen. De figuur is aangepast met toestemming van Journal of American Chemical Society 34.

Figuur 12
Figuur 12 Force sprong van de twee baseparen kussen RNA. a) Een kracht jump / drop fiets naar unkissing en zoenen levens op twee verschillende krachten te meten. Het bovenste paneel toont de tijd sporen van geweld. Het onderste paneel toont de relatieve verlenging van de molecule. De kracht is de eerste sprong van 3 pN tot 22 pN om de levensduur van het kussen complex te meten bij 22 pN. De unkissing wordt aangegeven door een snelle toename van uitbreiding bij ~ 30 nm, waarin de gehele RNA wordt uitgevouwen tot een enkele streng. Op ontspanning, is kracht opgevoerd tot 14 pN om de twee haarspeldbochten naar refold. De kracht wordt dan gedaald tot 8 pN. Vorming van het kussen interactie wordt aangegeven door afname van uitbreiding van ~ 7-8 nm b.)Aangezien kracht sprong 16 pN, de tijd-extensie tracering toont dat het duurt enkele seconden voor het kussen complex en zeven basenpaar haarspeld ontvouwen, waarna de haarspeld ontvouwt en refolds snel. C) Het gehele kussen complex is ontvouwde zich tot een enkele streng een paar seconden na het van kracht is gestegen tot 17,7 pN. De resterende trace geeft de bistabiliteit van de 11 baseparen haarspeld. Elk van de structurele overgangen in het ontvouwen van de zoenen RNA toont kenmerkende X. Het cijfer is aangepast met toestemming van Proceedings van de National Academy of Sciences 28.

Reagens pi
Plasmide (10 ng / mL) 10
Primer T7F (100 mM) 10
Primer Br (100 mM) 10
dNTP mix (25 mM elk) 10
10xPCR buffer 100
H2O 850
Taq DNA polymerase 10
Totaal 1.000

Opmerking: Een typische thermische cyclus voor het synthetiseren van 3 kbp DNA is: 95 ° C 45 seconden, 53 ° C 1 minuut, 72 ° C 3 minuten.

Tabel 1 Een voorbeeld van PCR voor het synthetiseren van transcriptie template.

Reagens pi
template (> 200 ng / mL) 8
NTP 8 (2 ml elk)
10x reactie buffer 2
T7 RNA polymerase 2
Totaal 20

Opmerking: Incubeer de reactie bij 37 ° C overnight.

Tabel 2 In vitro transcriptie.

Reagens pi
Handvat A (~ 10 mg) 50
Biotine-11UTP 5
T4 pol reactiebuffer 5
BSA oplossing 1
T4 DNA polymerase 5
Totaal 66

Opmerking: Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Inactivatie van het enzym door verwarmen bij 70 ° C gedurende 20 minuten, gevolgd door langzaam afkoelen tot kamertemperatuur.

Tabel 3 primerverlengingsreactie.

Reagens pi
Formamide 800
EDTA (0,5 M, pH 8,0) 2
Leidingen (1 M, pH 6,3) 40
NaCl (5M) 80
Totaal 922

Tabel 4 Recept van het gloeien buffer.

Reagens
Biotine-HA 1.000 ng
Dig-HB 1.000 ng
RNA 1.000 ng
Gloeien buffer 80 mL

Opmerking: Een typische thermische cyclus is annealing: 95 ° C 10 minuten, 62 ° C 1 uur, 52 ° C 1 uur, gevolgd door verhoging tot 4 ° C.

Tabel 5 Anneal RNA met handgrepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modificatie en probleemoplossing in voorbereiding van Uittrekkende Monsters

Keuze van Klonen Vector. Hoewel de opzet beschreven (figuur 3) geen speciale kloneringsvector vergen, de vector voorkeur intrinsieke T7 of T3-promotor te hebben voor het gemak van transcriptie, zodat een promoter via PCR kan worden geïntroduceerd op gewenste posities.

Volgorde en de lengte van de handgrepen. Er is geen specifieke sequentie vereiste voor de handgrepen. Maar een dicht GC AT verhouding voorkeur dat homopolymere en zeer herhaalde sequenties worden vermeden. In gepubliceerde werken, worden de twee handvatten gehouden als soortgelijke lengtes zodat de RNA structuur plaats ruwweg in het midden. Contract blijkt dat de totale lengte van de handgrepen varieerde van 500 tot 10.000 baseparen subtiel beïnvloedt de gemeten kinetiek 46,47.

ve_content "> Kwaliteitscontrole en Kwantificering van de gegloeide mengsel. Naast de beoogde RNA met handgrepen, bevat het eindproduct ook ongegloeide DNA handgrepen RNAs, en anderen. Het is moeilijk en oneconomisch de pincet moleculen te zuiveren. In plaats daarvan uitgegloeid mengsel kan direct worden gebruikt voor pincet, omdat alleen de correct gehybridiseerde nucleïnezuren worden aangebonden twee oppervlak beklede korrels. juiste gegloeide product is ook moeilijk te onderscheiden van de handgrepen en RNA op agarose gelelektroforese. Beste manier om te testen de kwaliteit en de concentratie van het gegloeide product kwantificeren is te testen op de pincet. Het is echter nuttig om te controleren en te kwantificeren van de transcriptie en PCR producten in elke stap met verschillende moleculaire biologische technieken.

Alternatieve benaderingen van Tether RNA naar Beads. Er zijn vele manieren denkbaar om RNA-moleculen te verbinden met oppervlakken covalent of niet-covalent 48

Single versus Multiple-molecuul Tether. Een paar Strep- en dig-kralen kunnen worden gekoppeld door meerdere moleculen. Om plagen uit een dergelijke mogelijkheid van meerdere moleculen tethering de kraal, moet de kracht-afstand curves om nader te worden onderzocht. Single-molecule tether weer een worm-achtige keten elasticiteit 4, dat is over het algemeen onzichtbaar in multi-molecuul aanbinden. Extra controle-experimenten die specifiek zijn voor elk systeem kan nodig zijn voor het bevestigen van de single-molecule tether.

Verbeteringen van de Minitweezers

Snel en Langzaam gegevensregistratie. De Minitweezers heeft een ingebouwde data acquisitie die opneemt met 21 instrumentele parameters met een snelheid van 200 Hz in een computer, die zal worden aangeduid als het computerprogramma in dit werk. Sommige toepasons en kalibraties vereisen een snelle data-acquisitie tarief. Daartoe worden de elektronische signalen kracht en afstand gesplitst worden geregistreerd in een nieuwe computer, de "fast-recording" computer, naast de data voor de besturingscomputer. De fast-opname computer gegevens leest via een aparte data-acquisitie-kaart en software, die meerdere kanalen kunnen tot 1 MHz. De nieuwe computer en data acquisitie niet interfereert met de werking van het instrument, die uitsluitend wordt bestuurd door de besturingscomputer. In een experiment, zijn data simultaan opgeslagen op beide computers met verschillende snelheden. Tijd synchronisatie wordt uitgevoerd tijdens de data-analyse door het vergelijken van de bijbehorende gegevensbestanden.

Video Recording. Een videokaart en imaging software zijn geïnstalleerd op de fast-opname computer om live beelden van de reactie vast te leggen en om videobeelden te analyseren. Deze ontwikkeling maakt het mogelijk om uit te voeren thij pixelgrootte en afstand kalibraties hierboven beschreven.

Beperkingen en toekomstige toepassingen van de methode

Werkwijzen nauwkeurig manipuleren en meten conformatieveranderingen van een RNA-molecuul zijn besproken. Dergelijke mogelijkheden maken het mogelijk om structurele herschikking van een RNA-streng in real time. Bovendien kan kracht worden aangegrepen om het RNA structuur en vouwingspaden, waardoor zeldzame en / of minder dan optimale structuren worden gevouwen.

Er zijn echter beperkingen van de mechanische benadering. Belangrijker, de uitbreiding, die wordt gebruikt om conformationele veranderingen te interpreteren, is een een-dimensionale projectie van de drie-dimensionale structuren. Het is mogelijk dat sommige conformatieveranderingen niet meetbaar 49-52 en / of kinetische barrières verborgen observatie 53. Er zijn ook diverse instrumentale effecten en beperkingen die mogelijk eenffect de waargenomen thermodynamica en kinetiek 44,46,47.

De optische pincetten zijn toegepast op een beperkt aantal RNA structuren, vergeleken met talrijke transcripten voorgesteld door genoom-breed onderzoek 54. De techniek wordt gebruikt om verschillende structurele motieven en grote RNAs bestuderen. Bovendien zal de werkwijze nieuwe toepassingen RNA onderzoek voorbeeld. Bijvoorbeeld, RNA-bindende ligand en eiwitten kunnen stabiliseren of de RNA structuur, die kan worden gemeten met de mechanische benadering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77, (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics