Nanomanipulation af Single RNA-molekyler af Optisk Pincet

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stor del af det humane genom er transkriberet, men ikke oversat. I dette indlæg genomisk æra, har regulerende funktioner RNA vist sig at være stadig vigtigere. Da RNA-funktion ofte afhænger af dens evne til at vedtage alternative strukturer, er det vanskeligt at forudsige RNA tredimensionale strukturer direkte fra sekvens. Single-molekyle tilgange viser potentialer til at løse problemet af RNA strukturel polymorfi ved overvågning af molekylære strukturer et molekyle ad gangen. Dette arbejde viser en metode til præcist at manipulere foldning og struktur af enkelt RNA-molekyler, der anvender optiske pincet. For det første at metoder syntetisere molekyler er egnede til enkelt-molekyle mekanisk arbejde er beskrevet. Dernæst forskellige kalibreringsprocedurer at sikre en korrekt drift af den optiske pincet diskuteres. Dernæst forskellige eksperimenter forklaret. For at demonstrere anvendeligheden af ​​teknikken, resultaterne af mekanisk udfolder RNA hårnåle og en enkelt RNA kissing kompleks anvendes som bevismateriale. I disse eksempler blev nanomanipulation teknik, der anvendes til at undersøge foldning af hver strukturelle område, herunder sekundære og tertiære uafhængigt. Endelig er de begrænsninger og fremtidige anvendelser af metoden diskuteret.

Introduction

Udviklingen af ​​den optiske pincet teknik har længe været ledsaget af dens anvendelse i biologisk forskning. Når den optiske fældefangst effekt først blev opdaget, Arthur Ashkin observeret, at bakterier i forurenet vand kan være fanget på laseren fokus 1. Siden da, fældefangst bakterier er blevet en utilsigtet, sjov eksperiment for generationer af biofysik studerende samt en seriøs forskning værktøj til at studere mikrobiel fysiologi 2,3. Den optisk indfangning teknik bruger fokuseret laserstråle til at immobilisere en mikroskopisk objekt 1. Næsten en laser fælde fungerer som en optisk fjeder, der også måler kraft (F) på den fanget objekt ved dets forskydning fra centrum af fælden (AX). Inden for en kort rækkevidde, F = κ x AX, i κ er fjederkonstanten af fælden. Den optiske fælde kan bruges til at lægge kræfter i piconewton (PN) præcision til en mikroerCopic objekt og måle dens position med nanometer (nm) nøjagtighed. I de seneste to årtier har optisk pincet blevet en af ​​de mest anvendte enkelt-molekyle teknikker i biofysik. Teknikken er blevet anvendt til at undersøge foldning og mekanik DNA 4-6, RNA 7-9, og proteiner 10,11. Optiske pincetter er også blevet anvendt til at observere DNA-replikation 12 RNA-transkription 13 og proteinsyntese 14,15, såvel som mange andre biomolekylære arrangementer 16-18.

Single-molekyle tilgange er ansat i RNA strukturel forskning primært at udforske den barske foldning energi landskab af RNA. En RNA-sekvens kan normalt foldes i flere stabile gensidigt udelukker strukturer, på grund af den simple kemiske sammensætning og base skrælle regler RNA. Det har længe været kendt, at RNA-strukturel polymorfi, såsom der forekommer i riboswitches 19,20, spiller en vigtig rolle i genregulering. En recent genom-undersøgelse har vist, at temperaturvariationer så små som et par grader stor indflydelse struktur og protein syntese af en stor del af den cellulære transkriptomet 21. Dette eksempel antyder, at den biologiske rolle alternativ RNA-foldning er måske vigtigere og gennemgribende end tidligere antaget. Strukturel polymorfi, udgør imidlertid en udfordring for de traditionelle biokemiske og biofysiske metoder, der undersøger gennemsnitlige egenskaber af mange molekyler. For eksempel "on" og "off" konformationer af en riboswitch gensidigt udelukker hinanden. Et gennemsnit struktur afledt fra heterogene strukturer er ikke sandsynligt, at ligne en af ​​de biologisk relevante konformere. Desuden utranslateret RNA og mRNA sædvanligvis strukturer. Deres interaktion med proteiner og regulatoriske RNA'er almindeligvis kræver udfoldelse af eksisterende struktur som en del af interaktionen. Derfor studerer RNA udfoldning / refoldning bliver et relevantudstedelse af RNA biologi. For at imødekomme en sådan udfordring er enkelt molekyle tilgang blevet anvendt til at optrævle RNA strukturel polymorfi ved at studere et molekyle ad gangen 22-27.

I forhold til den populære single-molekyle fluorescens metode, pincet baseret mekanisk udfoldning giver en fordel, at konformationer af enkelte molekyler kan manipuleres ved påførte kraft og måles med nanometer præcision. Denne nanomanipulation kapacitet kan udnyttes til at overvåge udfoldning / foldning af individuelle strukturelle domæner sådan at den hierarkiske foldning af et stort RNA kan dissekeres 28. Alternativt kan en enkelt streng rettes til at folde i en af ​​flere konformere; eller en eksisterende struktur mekanisk kan induceres til at foldes ind i en anden konformation 29. Under biologiske betingelser, kan et RNA-struktur ændres ved temperaturændring eller ligandbinding. Evnen til direkte manipulere molekylære filtreSTRUKTUR åbner en ny mødested af RNA strukturel undersøgelse. I princippet andre mekaniske teknikker, såsom atomic force mikroskop og magnetiske pincet, kan også anvendes til at undersøge foldning af en enkelt RNA-molekyler. Imidlertid er sådanne ansøgninger stort set begrænset på grund af den relativt lave rumlig opløsning 30.

Beskæftigelsen af ​​optiske pincet tillader RNA strukturer, som skal udfoldes ved mekanisk kraft.

Fordelen ved mekanisk udfoldning er adskillige gange. Kraft kan bruges til at udfolde både sekundære og tertiære strukturer, mens metalioner og liganden induceret foldning hovedsagelig er begrænset til tertiære strukturer. Temperatur og denatureringsmiddel kan have stor indflydelse aktiviteterne i vand og opløste stoffer. I modsætning hertil påføres lokalt kraft at forurolige molekylære strukturer; virkningen af ​​kraft på det omgivende miljø er ubetydelig. Desuden er termisk smeltning bedst anvendes til at undersøge folde termodynamik små RNA-strukturer,henviser optisk pincet er blevet brugt til at studere RNA strukturer med forskellige størrelser, der spænder fra en syv basepar tetraloop hårnål 28 til et 400-nukleotid ribozym 31. Endvidere kan RNA-strukturer mekanisk foldet ved mesofile temperaturer. I modsætning til at udfolde RNA'er i en termisk smeltende eksperiment, er temperaturen typisk hævet et godt stykke over fysiologiske temperaturer, hvilket øger RNA hydrolyse, især i nærværelse af Mg 2 + ioner.

Det er vigtigt at bemærke, at den mekaniske effekt af kraft afhænger af, hvordan den anvendes på en struktur. Den påførte kraft vipper folde energi landskab. For eksempel, når kraft påføres en hårnål, baseparrene sekventielt brudt, en ad gangen (figur 1a). Ripping gaffel frem langs den spiralformede akse, som er vinkelret på den påførte kraft. I modsætning hertil, når en minimal kissing komplekset er under spænding, de to kissingbasepar, som er parallelle med den påførte kraft, deler kraftpåvirkning (figur 1b). De forskellige geometrier af hårnålen og kissing kompleks i forhold til den påførte kraft resulterer i deres forskellige mekaniske svar, som kan anvendes til at skelne mellem sekundær og tertiær foldning 28,32. Den teoretiske del af mekanisk udfoldning tidligere er blevet revideret 8,9,30. Dette arbejde omhandler de grundlæggende tilgange til at etablere og udføre en enkelt molekyle mekanisk udfoldelse assay.

Eksperimentel opsætning. I vores mekaniske trække eksperiment RNA-prøven til pincet består af RNA af interesse flankeret af to dobbeltstrengede DNA / RNA-håndtag (figur 2) 7. Hele molekyle kan være bundet til to overfladebelagte micron størrelse perler (SPHEROTECH) via streptavidin-biotin og digoxigenin-anti-digoxigenin-antistof-interaktioner, hhv. En perle er i besiddelse af en kraft-måling af optisk trAP, mens den anden afholdes på spidsen af ​​en mikropipette. Den relative afstand mellem perlerne kan ændres ved enten at styre fælden eller flytning af mikropipetten. Med denne fremgangsmåde kan en enkelt RNA-molekyle tethering perlerne strækkes og afslappet.

Forberedelse af prøver. Syntesen af RNA-prøver til tweezing indeholder et par trin (Figur 3). Først er den DNA-sekvens, der svarer til RNA af interesse først klonet ind i en plasmidvektor. Desuden er der tre PCR-reaktioner udført for at generere de to håndtag og en skabelon for transkription. Den transskription skabelon omfatter håndtaget regionerne og de indsatte sekvenser. Den fulde længde RNA syntetiseres ved in vitro-transkription. Sidst, er RNA og kemisk modificerede håndtag glødede sammen for at generere molekyler pincet.

Kalibrering og drift af pincet. Det grundlæggende design af Minitweezers brugd i dette arbejde følger, at de dual-beam optisk pincet 33. Med mange forbedringer, de Minitweezers vise ekstraordinær stabilitet i forhold til den første generation af optiske pincet. En række forskergrupper i flere lande bruger Minitweezers i deres single-molekyle forskning 14,15,34-37. Detaljerne i byggeri, kalibrering og drift af enheden, herunder instruktionsvideoer, findes på "Pincet Lab" hjemmeside (http://tweezerslab.unipr.it). Her bliver forbedringer og kalibreringsprocedurer, der skal udføres på daglig baser beskrevet i detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af RNA-molekyler til Single-molekyle Tweezing

  1. Kloning sekvensen af ​​interesse. Klone DNA-sekvens, der svarer til RNA-struktur i en vektor.
  2. Syntese og oprensning af transkription skabelon. Syntetisere en transskription skabelon ved PCR. [Sted tabel 1 her] Dernæst oprense PCR-produkter under anvendelse af et PCR-oprensningskit, og koncentrere prøven til> 200 ng / pl. Da det oprensede DNA anvendes til transkription bør RNase frit vand anvendes i elueringsbetingelserne og koncentrering.
  3. In vitro-transkription. Syntetisere RNA ved in vitro-transskription ved 37 ° C natten over for at maksimere RNA-udbytte. [Sted tabel 2 her] Efter transkription, tilsættes 1 ul DNase I til at fordøje DNA-skabelonen i 15 min ved 37 ° C. Renses RNA ved anvendelse af en silica-spinkolonne.
  4. Syntese af det biotinylerede håndtag A. Første, producerer den umodificerede håndtaget A ved PCR under anvendelse af primere Af og Ar og koncentreretEntrate det amplificerede DNA til> 200 ng / pl. Dernæst inkorporere biotin ændringer i PCR-produktet ved hjælp af en primerforlængelsesreaktion. [Sted tabel 3 her] BEMÆRK: biotinylerede håndtag A (biotin-HA) kan anvendes direkte i udglødning uden oprensning. Da biotin-HA er at anneales med RNA, er det vigtigt at anvende RNase frit vand i begge trin.
  5. Syntese af digoxigenin-modificerede håndtag B. syntetisere digoxigenin modificeret håndtag B (grave-HB) ved PCR under anvendelse af primer Bf og digoxigenin-modificerede oligo Dig-Br (figur 3). Dernæst oprense PCR-produktet og koncentrere prøven til> 200 ng / pl.
  6. Annealing RNA til håndtagene. Anneale RNA med håndtag. [Læg tabeller 4 og 5 her]
  7. Rense udglødet prøve. Tilsæt 3 volumener ethanol af den annealede prøve, og bland godt. Opbevar blandingen ved -70 ° C i mindst 1 time. Spin ned på 15.800 xg og kassér supernatanten. Tør pellets ved anvendelse af en frysetørrer. Pellet opløses i100 pi RNase frit vand. BEMÆRK: Prøven er klar til brug og kan opbevares ved -20 ° C.

2. kalibrering og drift af den optiske pincet

  1. Kalibrere pixelstørrelse på videoovervågning
    1. Brug den optiske fælde til fælde en kugle med kendt diameter (størrelse standard).
    2. Tag billeder af en fanget kugle ved hjælp af imaging software (Figur 4).
    3. Bestem diameteren af ​​perlen ved hjælp af billedbehandling software baseret på centroid metode.
    4. Gentag denne procedure for at bestemme diametre på perler af forskellig størrelse.
    5. Monter de målte og kendte diametre af perlerne ved en lineær regression for at opnå den fysiske størrelse på en pixel.
  2. Bekræft Afstand kalibrering
    1. Brug den optiske fælde til fælde en vulst.
    2. Bestem pixelposition sit tyngdepunkt ved billedoptagelse software og registrerer sin position ved hjælp af Minitweezers.
    3. Steer perlen sig forskellige leje positioner og gentag positionen.
    4. Konverter X og Y positioner perlen fra pixel til m enhed ved hjælp af den kalibrerede pixelstørrelse.
    5. Sammenlign X og Y mellem positioner målt ved video og af Minitweezers. De to sæt af værdier bør blive enige. Som billedopløsningen er> 0,1 um, flytte vulsten over 1 um mellem målinger for at sikre nøjagtighed. Hvis kalibreringen afstanden ikke kan sammenlignes med den, der er gemt i de Minitweezers, kalibrere instrumentet.
  3. Trap Stivhed kalibrering
    1. Fang en perle med den optiske fælde og holde det stadig.
    2. Optag kraft af fælden ved hjælp af en erhvervelse hurtig dataoverførsel bypass med en hastighed> 5 kHz for 3 sek.
    3. Generer en magt spektrum fra optagelsen af ​​perlen bevægelse ved hjælp af software. Monter effektspektret til en Lorentz (figur 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (EQ. 1)
      hvor S (f) er kraften på hyppigheden af F, f c er hjørne frekvens, og S 0 er den asymptotiske magt. Hjørnet frekvens, f c, er den frekvens, hvor magten af termisk bevægelse er faldet til halvdelen af den asymptotiske værdi. Som f c varierer med laser magt og perle størrelse, kalibrere hver fanget perle individuelt.
    4. Beregn fjederkonstanten af fælden, κ, fra f c:
      Ligning 2 (EQ. 2)
      hvor γ er luftmodstanden af ​​vulsten (ækv. 3). Brug fjederkonstanten at bestemme extension ændringer i en RNA fra kraft forandring.
  4. Stokes 'lov Test
    1. Fang en perle med den optiske fælde. Flyt perlen og tilbage kraft ved forskellige hastigheder.
    2. Optag bevægelsen af ​​perlen og tvinge hjælp af Minitweezers.
    3. Beregn radius af perlen.
      BEMÆRK: friktionskraft F d, genereret af bevægelsen af en sfærisk partikel i en væske kan beskrives ved Stokes 'lov:
      Ligning 3 (Ækv. 3)
      hvor r er radius af den kugle, v er hastigheden, og h er den dynamiske viskositet af den væske, som kan findes i reference tabeller. Brug af den målte kraft F d, kan radius af perlen beregnes ved anvendelse af ligning. 3 (figur 6), og bør være enige med det bestemmes af billedet erhvervelse software. Stokes 'lov test effektivt tester de overordnede kalibreringer og ydeevne af instrumentet.

3. Nanomanipulation af Single RNA molekyler

  1. Making fluidik.
    1. Bor seks huller (2 diameter mm hver) på en nr 2 dækglas (figur 7a) og skære tre slidser (2 mm bredde) i dobbeltsidet polyimid tape (figur 7b) ved hjælp af en laser gravør.
    2. Lav et flow kammer ved sandwiching to dækglas med to lag af dobbeltsidet Kapton tape. Indsæt en mikropipette og to bypass rør mellem båndet (figur 7c).
    3. Monter strømningskammeret på en metalramme ved at matche fluidiske huller (figur 7d).
    4. Slut fluidumydelse kanaler i kammeret til 10 ml sprøjter fyldt med buffer på valg via polyethylen slanger (figur 7e).
    5. Monter hele kammeret på den optiske pincet mellem de to mål. Sørg for, at forsiden af ​​kammeret med fluidumydelse kanaler står til højre. Træk højre objektiv og sæt messing stifter af rammen (figur 7e) til monteringshuller på than pincet. Spænd skruerne til at fastgøre positionen kammer.
  2. Blanding udglødet prøven og perlerne. Bland den annealede prøve med anti-digoxigenin-belagte kugler (DIG-perler), og lad blandingen at bo ved stuetemperatur i 5-10 min. Typisk 1 pi udglødet prøve blandet med 5 pi grave-perler i 1 ml puffer. BEMÆRK: Mængden af ​​perlerne, der skal lastes i strømningskammeret bør vælges for at sikre en rimelig mængde af perlerne, der skal leveres fra omgåelse røret. Forholdet mellem den annealede prøve til perlerne ikke let kan kvantificeres. I et ideelt tilfælde fleste perler har ingen RNA, at kun en lille del af perlerne kan kun have en RNA-molekyle pr kugle. Som de annealede prøver og perlesuspensionen er vanskelige at kvantificere den bedste og eneste måde i øjeblikket er at variere blandingsforholdet og teste blandingen på pincetten.
  3. Lever perler reaktionen sted i strømningskammeret (dvs. nogle få mikrometer på toppen af micropipette spids, figur 7c).
    1. Indlæs en suspension af streptavidinovertrukne perler (strep-perler) i en 1 ml sprøjte.
    2. Forbind sprøjten med den fluide slange fører til den nederste kanal strømningskammeret (figur 7a).
    3. Skub sprøjten til at flyde Strep-perler ind i kammeret.
    4. Flyt hele kammeret ved hjælp af motorstyring software til at placere den optiske fælde nær åbningen af bunden bypass-røret (figur 7b). Så betjene den optiske fælde med en trackball til at indfange en Strep-kugle.
    5. Flyt vulst tæt på spidsen af ​​mikropipette brug af motoren styresoftware.
    6. Træk sprøjten tilsluttet mikropipetten at suge perle på mikropipetten.
    7. Påfør strømning forsigtigt ved at trykke sprøjten til den midterste kanal til at skylle ud ekstra strep-beads.
    8. Ligeledes leverer blandingen af ​​prøven og grave-perler (se trin 3.2) til toppen kanal af kammeret.
    9. Optag en grave-perle og bringe den tæt på Strep-perlen med den optiske fælde.
    10. Rens den midterste kanal ved anvendelse af flow. BEMÆRK: strep- og grave-perler er valgt til at være forskellige størrelser, så de kan skelnes visuelt under mikroskopisk billede (Figur 4).
  4. Fiskeri "et enkelt molekyle tethering mellem et par perler.
    1. Placer grave-perle lodret oven på Strep-perle (figur 4).
    2. Flyt dig-perlen ned mod strep-perlen ved at styre fælden. Åbn en kraft-afstand plot vindue på computeren for at visualisere kraft ændringer.
    3. Ved kontakt af de to kugler, skal du flytte dig-perlen lodret væk fra Strep-perlen.
    4. Hvis der ikke specifik kontakt, kraften forbliver næsten nul. Hvis de to perler er forbundet med molekyler, kraften stiger betydeligt, når de to perler adskilt. Denne procedure, der almindeligvis omtales som "fiskeri", er ofte performed flere gange på hvert par af perler at finde en effektiv enkelt molekyle tøjr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Begrænset af rummet, er nanomanipulation af enkelte RNA-molekyler demonstreret ved at vise kun mekaniske udfolder eksempler på RNA hårnåle og et RNA med tertiær struktur.

Manipulere Single Hårnål Molekyler

Når en tøjret etableres mellem perlerne, kan udvidelse og kraft tøjret manipuleres under anvendelse af et bruger-defineret protokol. Fire fælles manipulation protokoller er almindeligt anvendt.

Kraft-rampe eksperiment. Den mest intuitive og fælles eksperiment for at manipulere en enkelt RNA til gentagne gange at strække og slappe af molekylet i retning af den spiralformede akse af håndtagene (lodret som vist i figur 4). Kraften, F og fælde position Y, registreres som en funktion af tiden. Udvidelsen af molekylet, e, kan beregnes ved e = Y - F / κ, hvori er fjederkonstanten af tras. Den trækker Resultatet kan vises som den kraft-udvidelse kurve (figur 8a). Den strækning af dobbeltstrengede håndtag er vist ved den stigende kurve med positiv hældning. Lempelsen kurve af håndtagene retraces at den stretching. Den strukturelle overgang en simpel, to-stats-foldning hårnål viser en "rip" med negativ hældning, hvilket indikerer en enkelt kooperativ udfoldningsovergangen 39. Den genfoldning af hårnålen er angivet med en "lynlås" på kraft-forlængelse kurven. Vigtigere er det, kan det samme molekyle blive udfoldet og refoldes ved forskellige kræfter hver gang. En sådan tendens er tydelig på fordelingerne af overgangen kræfter (figur 8b). Almindeligvis er den kraft, ændres som en lineær funktion af tiden, dvs på et fast lastning / losning sats. Under en konstant belastning / tømmehastighed kan kraften afhængige kinetik udvindes fra fordelinger af overgangen kræfter 40-42.

Constant Force eksperiment. Under konstant kraft tilstand, instrument anvender en feedback-mekanisme til at kompensere kraften afvigelser fra en indstillet værdi. Udvidelsen af et RNA-molekyle registreres som en funktion af tiden (figur 9). Indstilling af kraft ved eller nær overgangen kraft af den særlige RNA-molekyle overgang tillader observation og kvantificering af molekylære ekstensionelle stater. Levetider af molekylet ved hver tilstand kan samles sammen til at beregne kinetikken af strukturel overgang 7. Den konstante kraft eksperiment anvendes til at overvåge reversibel foldning, såsom de hårnåle 7,28.

Kraft Jump eksperiment. I en kraft hoppe eksperiment, er den kraft hurtigt ændret til en anden værdi og konstant; levetid af den første overgang overvåges 43. Kraften spring er især nyttig til at karakterisere kinetikkenirreversible processer, fordi levetider for forlæns og baglæns reaktioner kan direkte måles separat ved forskellige kræfter. Ved hver kraft jump / slip, observeres kun én levetid. Derfor skal udføres for at indsamle tilstrækkelige observationer til at udtrække kinetik flere runder af sådanne forsøg.

Passive eksperimenter. Under passiv tilstand, er positionerne af fælden og mikropipetten både faste (figur 10). En hårnål udviser to tilstande, svarende til udfoldede og foldede RNA nær dens overgang kræfter. I modsætning til den konstant kraft eksperiment både kraften og udvidelse af molekylet ændring af den strukturelle overgang. Eliminering feedback kontrol tillader molekylære overgange at være direkte overvåget uden ekstern indblanding. Det er imidlertid vanskeligt at opretholde en konstant kraft under passiv tilstand afslører. Da de fangne ​​perle diffus i den optiske fælde, tvinger ændringer i overensstemmelse hermed. The passiv tilstand er uegnet til måling af molekylære tilstande med lang opholdstid, hvorunder tvinge ændres væsentligt. Fordele og ulemper ved konstant kraft og passive transportformer er blevet grundigt undersøgt og drøftet 44.

Løs Foldning af sekundære og tertiære strukturer

Mekanisk udfoldning af en to-basepar kissing RNA dannet af to forbundne GACG tetraloop hårnåle anvendes som et eksempel her (figur 11a). Begge hårnåle en 9 basepar stamceller, selvom stamceller sekvenser er forskellige. Den mekaniske udfoldning sti af RNA (figur 11a) har været præget af kraft ramp metoder 34. Når kraft er hævet, er det kysse kompleks først brudt, efterfulgt af sekventiel udfoldelse af hårnåle. På genfoldning hårnåle fold først, efterfulgt af en kissing interaktion ved lav kraft. Disse overgange er synlige på kraft-udvidelse kurve (figur11b). For at bekræfte overdragelse af hairpin overgange hver af hårnåle kan individuelt undersøgt. Tildelingen af unkissing / kysse overgange kan verificeres ved at studere en mutant-RNA, hvor tetraloops er muteret til at forhindre dannelsen af kysse interaktion 28. Alternativt kan den laveste kraft fastsættes til 10 PN, højere end kysse kræfter. Som forventet, kraft-forlængelse kurven under sådanne betingelser kun viser udfoldelsen / genfoldningen af hårnåle (figur 11c) 34. Derfor er det muligt at undersøge foldning kissing interaktion og hver af de to hårnåle uafhængigt ved forskellige kræfter.

Det er bemærkelsesværdigt, at foldningen af ​​de to hårnåle er reversibel, mens kysse interaktion er yderst irreversibel, som tydeligt ved meget forskellige unkissing og kysse kræfter og ved stor hysterese. Derfor kan folde kinetik hårnåle undersøges directly ved hjælp af konstant kraft eksperimenter. Kinetik kysse interaktion, dog skal måles ved hjælp af den kraft jump-metode. Figuren 12a viser en typisk kraft hoppe eksperiment 28. Ved 3 PN, er hele RNA foldet. Kraften derefter hurtigt hævet til 22 PN og holdes konstant. Efter nogle få sekunder, er hele RNA foldes ud til en enkelt streng, som tydeligt ved en pludselig stigning i forlængelse af ~ 30 nm. Kraften øges derefter til 30 pN yderligere strække RNA, før den sænkes til 13 pN. Efter foldning af hårnåle, er den kraft, faldt hurtigt til 8 pN. Dannelsen af ​​kysse kompleks indikeres ved at forkorte en forlængelse på ~ 7-8 nm. Ved at samle mange af disse levetid målinger unkissing og kysse kinetik i faste kræfter kan beregnes.

Under alle forsøgsbetingelser, er kysse kompleks altid udfoldet først. På kræfter, hårnåle er ustabile ved selv, kysse interagererion beskytter hårnålestrukturer fra udfoldning. Et sådant hastighedsbegrænsende effekt afsløres også af kraft jump eksperimenter. Som vist i figur 12b 28, når kraften er sprunget til 16 pN, udvidelse af molekylet forbliver stort set uændret i nogle få sekunder, efterfulgt af en udfoldning øge forlængelse af ~ 20 nm. Ændringerne i forlængelsen indikerede svagere syv basepar hårnål udfoldes lige efter forstyrre af kysse kompleks. Den metastabilitet af hårnålen er tydeligt af levetider. Når kysse er brudt, hårnålen hurtigt transitter mellem foldede og udfoldede tilstande; levetider er mindre end 1 sek. Væsentlige, denne observation er en konstant kraft eksperiment til udfoldning hårnålen. I modsætning hertil tager over 10 sek at bryde kissing kompleks sammen med hårnål. Tilsvarende er gældende sprang til 17,7 pN (figur 12c), hvor hele RNA foldes ud til en enkelt streng, som det fremgår af den istigning i forlængelse af ~ 30 nm. Den bistabilitet af det store, 11-basepar hårnål kan ses som en udvidelse humle mellem to værdier. Igen, de korte levetid af hårnålen er i skarp kontrast til sin lange levetid i metastabile tilstand. Kan måles 28 Brug af en kombination af kraft rampe og kraft jump eksperimenter, termodynamik og kinetik enkelte udspiller / folde trin. Direkte observationer af brydning og dannelse af kysse komplekset gør os i stand til at analysere energiske bidrag flankerende baser til den minimale kysse kompleks 34 og til at måle salt afhængighed af kysse interaktion 45.

Figur 1
Figur 1. RNA-strukturer i forhold til den påførte kraft. a) En hårnål under spænding. b) at trække en to-base-par kysse kompleks. De to hårnåleløkker er farvet i rødt og gult.

Figur 2
Figur 2. Eksperimentel opsætning. RNA struktur er flankeret af to DNA / RNA-håndtag. Gennem kemiske modifikationer på enderne af håndtagene kan hele molekylet være forbundet med et par af protein overtrukket mikrometerstore perler. En af perlerne er i besiddelse af en styrbar, kraft-måling af optisk fælde. Den anden er placeret på en mikropipette, som drives af en piezoelektrisk flexture fase. Tegningen er ikke i målestoksforhold.

Figur 3
Figur 3. En generel ordning til at syntetisere RNA-molekyler med håndtag. Håndtaget A, håndtag B, og transcription skabelon genereres ved PCR fra et plasmid med RNA-sekvensen klonet. Håndtaget A er modificeret ved digoxigenins (grave) ved 3'-enderne. Håndtaget B har en biotin modifikation ved 5'-enden af ​​en streng. Den fulde længde RNA transkriberet fra transskription skabelon. RNA og modificerede håndtag er blandet og afhærdet. De korrekt molekyler kan være bundet til et par af perler overtrukket med streptavidin og anti-digoxigenin-antistof. Tegningen er ikke i målestoksforhold.

Figur 4
Figur 4. Billeder af fiskeri et enkelt molekyle mellem to perler fanget af skærmkortet. Én perle er placeret på spidsen af en mikropipette ved sugning. Den anden holdes og styres af en kraft-måling af optisk fælde. De retninger af trap bevægelser er angivet med pile. De fanget perle første skridtvertikalt mod vulst på mikropipette. Efter kontakter, de fangne ​​perle bevæger sig op. Hvis der etableres et tøjr mellem perlerne, adskillelse af perler trækker på molekylet og kraften stiger molekylet forlænges. Hvis to kugler ikke er forbundet med nogen molekyle, den tilbagetrukne bevægelse genererer ingen kraft.

Figur 5
Figur 5. En magt spektrum af den Brownske bevægelse fangne ​​perle. Den solide kurve er en tilpasning til Lorentz ligning (ligning. 1), der er vist i indsatsen. Fjederkonstanten af ​​fælden kan beregnes fra hjørnet frekvens (EQ. 2).

Figur 6
Figur 6. Et eksempel på Stokes 'lov testen.

Figur 7
Figur 7. En strøm kammer til pincet. a) seks huller, hver med en diameter på 2 mm, er boret ind i en nr 2 dækglas ved hjælp af en laser gravør. b) tre 2 mm brede slidser skæres i dobbeltsidede polyimid bånd. c) Et tæt kig på forsøgsstadiet region indeholdende mikropipetten og to bypass rør. Perlerne fra de øverste og nederste kanaler krydse gennem deres respektive bypass rør (grønne og blå) til centrale kanal i retningerne angivet med pile. d) Monter strømningstekniske kammer på en metalramme ved at matche strømningstekniske huller. e) Et tre-kanal kammer forbundet til strømme rør. Den centrale kanal anvendes til at trække RNA. Den øverste (blå) og bunden (grøn) kanaler anvendes til at levere perler. Den eksperimentelle område er angivet med en rød firkant.

Figur 8
Figur 8. Kraft rampe. a) En kraft-udvidelse kurve for mekanisk udfoldning af en hårnål. Trække er vist i blåt og afslapning i rødt. Udfoldelse / refoldning af hårnålen er angivet med pile. B) Fordelingen af udfoldning (blå) og refoldning (rød) kræfter hårnålen. Figuren er tilpasset fra en indsendt manuskript 39.


Figur 9. En RNA hårnål under konstant kraft. a) Diagram af eksperimentet. Positionen af fælden ændres gennem tilbagemelding således at opretholde en konstant kraft på hårnål. B), Kraft og position versus tid for hårnål un / foldning. Som det er holdt kraft konstant positionen af ​​fælden svinger mellem to værdier, der viser bistabilitet af hårnålen på styrken. Binomialfordelingen af ​​fælden fordeling giver forlængelsen ændring på hårnålen udfoldelse af 19,4 ± 0,2 nm. Figuren er tilpasset fra en indsendt manuskript 39.

Figur 10
Figur 10. passiv tilstand af en hårnål. a) B), styrken og forlængelse versus tid af en hårnål i passiv tilstand.

Figur 11
Figur 11. Kraft rampe af de to basepar kissing RNA. a) Hierarkisk foldning af et to-basepar kysse RNA under mekanisk spænding. b), Force-udvidelse kurve. Strukturelle overgange er angivet med pile. C) Force-forlængelse kurven, når den laveste kraft er fastsat til 10 pN at forhindre kysse interaktion. Den figur er tilpasset med tilladelse fra Journal of American Chemical Society 34.

Figur 12
Figur 12. Kraft hoppe af to-basepar kissing RNA. a) En kraft spring / drop cyklus til at måle unkissing og kysse levetider på to forskellige kræfter. Det øverste panel viser den tid spor af kraft. Det nederste panel viser den relative forlængelse af molekylet. Kraften første sprang fra 3 pN 22 pN at måle levetid kissing kompleks ved 22 pN. Den unkissing er angivet ved en hurtig stigning i forlængelse af ~ 30 nm, hvilket indikerer hele RNA foldes ud til en enkelt streng. Ved afslapning, er kraft rampes ned til 14 pN så de to hårnåle at refolde. Kraften faldt derefter til 8 pN. Dannelse af kysse interaktionen er indikeret med fald i forlængelse af ~ 7-8 nm B).Da kraft sprang til 16 PN, den tid-forlængelse spor viser, at det tager flere sekunder for kysse komplekset og syv basepar hårnål til at folde sig ud, hvorefter hårnålen udfolder og refoldes hurtigt. C) Hele kysse komplekset er foldes ud til en enkelt streng et par sekunder efter, kraft sprang til 17,7 pN. De resterende spor viser bistabilitet af 11 basepar hårnål. Hver af de strukturelle overgange i udfoldning kysse RNA viser karakteristisk X. Figuren er tilpasset med tilladelse fra Proceedings of National Academy of Sciences 28.

Reagens pi
Plasmidet (10 ng / mL) 10
Primer T7f (100 mM) 10
Primer Br (100 mM) 10
dNTP-blanding (25 mM hver) 10
10xPCR-buffer 100
H2O 850
Taq-DNA-polymerase 10
Samlet 1.000

Bemærk: En typisk termisk cyklus til at syntetisere 3 kbp DNA er: 95 ° C 45 sekunder 53 ° C 1 minut, 72 ° C 3 minutter.

Tabel 1. Et eksempel på PCR for at syntetisere transkription skabelon.

Reagens pi
skabelon (> 200 ng / ml) 8
NTP'er 8 (2 ml hver)
10x reaktionsbuffer 2
T7-RNA-polymerase 2
Samlet 20

Bemærk: Inkubér reaktionen ved 37 ° C overniGHT.

Tabel 2. In vitro-transskription.

Reagens pi
Håndtag A (~ 10 mg) 50
Biotin-11UTP 5
T4 pol reaktionsbuffer 5
BSA-opløsning 1
T4 DNA-polymerase 5
Samlet 66

Bemærk: Inkubér reaktionen ved stuetemperatur i 20 minutter. Inaktivere enzymet ved opvarmning til 70 ° C i 20 minutter, efterfulgt af langsom afkøling til stuetemperatur.

Tabel 3. primerforlængelsesreaktion.

Reagens pi
Formamid 800
EDTA (0,5 M, pH 8,0) 2
PIPES (1 M, pH 6,3) 40
NaCl (5M) 80
Samlet 922

Tabel 4. opskrift udglødningen puffer.

Reagens
Biotin-HA- 1.000 ng
Dig-HB 1.000 ng
RNA 1.000 ng
Annealingpuffer 80 ml

Bemærk: En typisk termisk cyklus til annealing er: 95 ° C 10 minutter, 62 ° C 1 time 52 ° C 1 time efterfulgt af rampe til 4 ° C.

Tabel 5. Anneal RNA med håndtag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ændring og fejlfinding i Udarbejdelse af pincet prøver

Valg af Kloning Vector. Selv om den generelle ordning beskrevet her (figur 3), ikke kræver en speciel kloningsvektor vektoren foretrukket ikke at have iboende T7 eller T3-promotor for at lette transskription sådan, at en promotor kan indføres via PCR ved ønskede positioner.

Sekvens og Længder af håndtagene. Der er ingen specifik sekvens krav om håndtagene. Imidlertid er en tæt GC til AT-forhold foretrækkes, mens homopolymere og meget gentagne sekvenser bør undgås. I udgivne værker, er de to håndtag holdes så tilsvarende længder, således at RNA-struktur af interesse er placeret omtrent i midten. Tidligere arbejde viser, at den samlede længde af håndtagene varierede fra 500 til 10.000 basepar subtilt påvirker de målte kinetik 46,47.

ve_content "> Kvalitet Check og Kvantificering af den annealede blanding. Udover den tilsigtede RNA med håndtag, indeholder slutproduktet også uglødet DNA håndtag og RNA'er, såvel som andre. Det er svært og uøkonomisk at rense tweezing molekyler. stedet udglødet Blandingen kan anvendes direkte til tweezing, fordi kun korrekt udglødet nukleinsyrer kan være bundet til to overflade-belagte kugler. Korrekt glødede produkt er også svært at skelne fra håndtag og RNA på agarosegelelektroforese. Den bedste måde at teste kvaliteten og kvantificere koncentrationen af ​​det udglødede produkt er at teste den på pincetten. Det er imidlertid nyttigt at kontrollere og kvantificere PCR og transskription produkter i hvert trin ved hjælp af forskellige molekylærbiologiske teknikker.

Alternative tilgange til Tether-RNA til perler. Der er mange tænkelige metoder til at forbinde RNA-molekyler til overflader kovalent eller ikke-kovalent 48

Single- vs Multiple-molekyle Tether. Et par strep- og grave-perler kan knyttes af flere molekyler. At drille en sådan mulighed for flere molekyler tøjring perlen, skal nøje undersøges kurverne kraft-distance. Single-molekyle tøjr vise en orm-lignende kæde elasticitet 4, der generelt er usynlige i multi-molekyle bindsler. Der kan kræves yderligere kontrol eksperimenter specifikke for hvert system til bekræftelse af enkelt-molekyle tøjr.

Forbedringer af Minitweezers

Hurtig og Langsom dataregistrering. Den Minitweezers har en indbygget i datafangst, der optager op til 21 instrumentale parametre med en hastighed på 200 Hz i en computer, som vil blive omtalt som operativsystem computeren i dette arbejde. Men nogle applications og kalibreringer kræver en hurtig datafangst sats. Til dette formål er de elektroniske signaler force og afstand split skal registreres i en ny computer, "hurtig-optagelse" computer, foruden datafangst på operationsstuen computer. Den hurtige optagelse computeren læser data via en separat datafangst kortet og software, der tillader flere kanaler på op til 1 MHz. Den nye computer og data erhvervelse ikke interfererer med driften af ​​instrumentet, som udelukkende styres af operativsystemet computeren. I et eksperiment, samtidig registrerede data på begge computere på forskellige satser. Tidssynkronisering udføres under dataanalysen ved at sammenligne de tilsvarende datafiler.

Video Image optagelse. En video card og imaging software er installeret på den hurtige optagelse computer til at fange levende billeder af reaktionen og til at analysere videobilleder. Denne udvikling gør det muligt at gennemføre than pixelstørrelse og afstand kalibreringer beskrevet ovenfor.

Begrænsninger og fremtidige anvendelser af metoden

Metoder til præcist at manipulere og måle konformationelle ændringer af et enkelt RNA-molekyle er blevet diskuteret. Sådanne evner gør det muligt at overvåge strukturel omlejring af en RNA-streng i realtid. Endvidere kan der anvendes kraft til at påvirke RNA-struktur og folde veje, så sjældne og / eller mindre end optimale strukturer til at blive foldet.

Der er dog begrænsninger i den mekaniske fremgangsmåde. Vigtigst udvidelse, der anvendes til at fortolke konformationelle ændringer, er en endimensional projektion af tredimensionale strukturer. Det er muligt, at der ikke kan måles nogle konformationelle ændringer 49-52, og / eller kinetiske barrierer er skjult fra iagttagelse 53. Der er også forskellige instrumentale effekter og begrænsninger, der kan enffect de observerede termodynamik og kinetik 44,46,47.

De optiske pincet er blevet anvendt til at undersøge et begrænset antal RNA-strukturer i forhold til talrige transkripter foreslået af genom-dækkende undersøgelser 54. Teknikken vil blive anvendt til at undersøge forskellige strukturelle motiver og store RNA'er. Desuden vil fremgangsmåden finde nye anvendelser i RNA-forskning. For eksempel RNA-bindende ligand og proteiner kan stabilisere eller ændre RNA-struktur, som kan måles ved anvendelse af den mekaniske fremgangsmåde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77, (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics