Nanomanipulation av Enkelt RNA-molekyler ved optisk pinsett

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stor del av det humane genom blir transkribert, men ikke oversettes. I dette innlegget genomiske æra, regulatoriske funksjoner av RNA vist seg å bli stadig viktigere. Som RNA funksjonen ofte avhengig av dets evne til å adoptere alternative konstruksjoner, er det vanskelig å forutsi RNA tredimensjonale strukturer direkte fra sekvens. Single-molekyl nærmer vis potensialer for å løse problemet med RNA strukturell polymorfisme ved overvåking av molekylære strukturer ett molekyl på en gang. Dette arbeidet presenterer en metode for å nettopp manipulere folding og struktur av enkle RNA-molekyler som bruker optisk pinsett. Først, metoder for å syntetisere molekyler egnete for én-molekyl mekanisk arbeid, er beskrevet. Neste, ulike kalibreringsprosedyrer for å sikre riktig drift av optiske pinsett blir diskutert. Deretter blir ulike eksperimenter forklart. For å demonstrere nytten av teknikken, resultatet av mekanisk utfolder RNA hårnåler og en enkelt RNA kissing kompleks ble anvendt som bevis. I disse eksemplene ble den nanomanipulation teknikk som brukes til å studere folding av hver strukturell domene, blant sekundære og tertiære, uavhengig av hverandre. Til slutt, er begrensningene og fremtidige anvendelser av metoden omtalt.

Introduction

Utviklingen av den optiske pinsett teknikk har lenge vært ledsaget med dens anvendelse i biologisk forskning. Når den optiske fangst effekten ble først oppdaget, observerte Arthur Ashkin at bakterier i forurenset vann kan bli fanget på laser fokus 1. Siden da bakterier fangst har blitt en utilsiktet, morsomt eksperiment for generasjoner av biofysikk studenter så vel som en seriøs forskning verktøy for å studere mikrobiell fysiologi 2,3. Den optiske overlappings teknikk benytter fokusert laserstråle til å immobilisere et mikroskopisk objekt 1. Praktisk talt, en laser felle fungerer som en optisk fjær, som også måler kraft (F) på den innfangede objekter ved sin forskyvning fra sentrum av fellen (ΔX). Innen kort rekkevidde, F = κ x ΔX, i κ er våren konstant av fellen. Den optiske felle kan anvendes for å utøve kraft i picoNewton (pN) presisjonen til en mikroerCopic objekt og måle sin posisjon med nanometer (nm) nøyaktighet. I de siste to tiårene, har optisk pinsett blitt en av de mest brukte single-molekyl teknikker i biofysikk. Teknikken har vært ansatt for å studere folding og mekanikken i DNA 4-6, RNA 7-9, og proteiner 10,11. Optiske pinsett har også blitt brukt til å observere DNA-replikasjon 12, RNA-transkripsjon 13, og proteinsyntese 14,15, så vel som mange andre arrangementer biomolekylære 16-18.

Single-molekyl tilnærminger er ansatt i RNA strukturelle forskning hovedsakelig for å utforske den robuste folding energi landskapet i RNA. En RNA sekvens kan vanligvis kaste inn flere stabile, gjensidig utelukkende strukturer, skyldes det enkle kjemiske sammensetning og basen paring regler for RNA. Det har lenge vært kjent at RNA strukturell polymorfisme, slik som det som forekommer i riboswitches 19,20, spiller en viktig rolle for genregulering. En recent genom-wide undersøkelse har avdekket at temperaturvariasjoner så liten som noen få grader i stor grad påvirke struktur og protein syntese av en stor del av mobilnettet transcriptome 21. Dette eksemplet hint om at den biologiske rollen alternativ RNA folding er kanskje mer viktig og gjennomgripende enn tidligere antatt. Strukturell polymorfisme imidlertid en utfordring for de tradisjonelle biokjemiske og biofysiske tilnærminger, som undersøker gjennomsnitts egenskapene til mange molekyler. For eksempel, "på" og "off" konformasjonen av en riboswitch er gjensidig utelukkende. Et gjennomsnitt struktur avledet fra heterogene strukturer er ikke sannsynlig å ligne en av de biologisk relevante conformers. Videre utranslatert RNA og mRNA vanligvis danne strukturer. Deres interaksjon med proteiner og regulatoriske RNA vanligvis krever utfoldelsen av eksisterende strukturen som en del av samspillet. Derfor studerer RNA utfolder / refolding blir en relevantutstedelse av RNA biologi. For å møte en slik utfordring, har enkelt-molekyl tilnærming blitt ansatt for å løse RNA strukturell polymorfisme ved å studere ett molekyl av gangen 22-27.

I forhold til den populære enkelt-molekyl fluorescens-metoden, pinsett basert mekanisk utfolding tilbyr en fordel at konformasjonen av enkeltmolekyler kan bli manipulert av anvendt kraft, og måles med nanometerpresisjon. Denne nanomanipulation evnen kan utnyttes til å overvåke utfolding / folding av individuelle strukturelle domener slik at den hierarkiske folding av et stort RNA kan bli dissekert 28. Alternativt kan en enkelt tråd bli dirigert til å folde inn i en av flere conformers; eller en eksisterende struktur kan være mekanisk indusert til bretter inn i en annen 29 konformasjon. Under biologiske tilstander, kan en RNA struktur endres ved temperaturendring eller ligandbinding. Mulighet for direkte manipulere molekylære structure åpner en ny arena for RNA strukturelle studie. I prinsippet andre mekaniske teknikker, slik som atommikroskop og magnetiske pinsett, kan også brukes til å studere folding av enkelt-RNA molekyler. Imidlertid er slike anvendelser begrenses i stor grad på grunn av den relativt lave oppløsning i 30.

Ansettelse av optiske pins tillater RNA strukturer for å foldes ved mekanisk kraft.

Fordelen med mekanisk utfolding er flere fold. Kraft kan brukes til å utfolde seg både sekundære og tertiære strukturer, mens metallioner og ligand indusert folding er hovedsakelig begrenset til tertiære strukturer. Temperatur og denaturant kan påvirke virksomheten til vann og oppløste stoffer betydelig. I motsetning til dette blir kraft påført lokalt å forstyrre molekylære strukturer; virkningen av kraft på det omkringliggende miljø er neglisjerbar. I tillegg er termisk smelting best brukt til å studere foldetermodynamikk av små RNA-strukturer,mens optisk pinsett har blitt brukt til å studere RNA strukturer med ulike størrelser, alt fra en syv-base-par tetraloop hårnål 28 til en 400-nukleotid Ribozyme 31. Videre kan RNA-strukturer være mekanisk utfoldet ved mesofile temperaturer. I kontrast til å utfolde RNAer i en termisk smelte eksperiment, er temperaturen typisk hevet godt over fysiologiske temperaturer, noe som i betydelig grad øker RNA hydrolyse, spesielt i nærvær av Mg 2 +-ioner.

Det er viktig å merke seg at den mekaniske virkning av kraften avhenger av hvor den er anvendt på en struktur. Den anvendt kraft tilter folding energi landskapet. For eksempel, når kraften blir påført på en hårnål, basepar er sekvensielt brutt, en av gangen (Figur 1a). Den rive gaffel skrider frem langs den skruelinjeformede aksen, som er vinkelrett i forhold til den anvendte kraft. I motsetning til dette når en minimal Kissing komplekset er under spenning, de to kyssingbasepar, som er parallell med den anvendte kraft, deler den kraft lasten (Figur 1b). De forskjellige geometrier av hårnål og kyssing kompleks i forhold til den tilførte kraft resultat i sin annen mekanisk respons, som kan utnyttes til å skille sekundær og tertiær folding 28,32. Den teoretiske aspektet av mekanisk utfolder har tidligere blitt anmeldt 8,9,30. Dette arbeidet beskriver de grunnleggende tilnærminger til å sette opp og utføre en enkelt-molekyl mekanisk utfolder analysen.

Eksperimentelle oppsettet. I vår mekanisk trekking eksperiment, den RNA-prøven for tweezing består av RNA av interesse flankert av to dobbelt-trådede DNA / RNA-håndtak (figur 2) 7. Hele molekylet kan være bundet til to overflatebelagte mikron-størrelse perler (Spherotech) via streptavidin-biotin og digoxigenin-anti-digoxigenin-antistoffinteraksjoner, henholdsvis. En perle er holdt av en kraft-måling optisk trap, mens den andre holdes på spissen av en mikropipette. Den relative avstand mellom perlene kan endres ved enten å styre fellen eller beveger mikropipette. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan en enkelt RNA molekyl tethering perler strekkes og avslappet.

Preparering av prøver. Syntesen av RNA-prøver for tweezing omfatter et par trinn (figur 3). Først blir DNA-sekvens som korresponderer med RNA av interesse først klonet inn i en plasmidvektor. Deretter blir tre PCR-reaksjoner utført for å generere de to håndtak og en mal for transkripsjon. Transkripsjonen malen omfatter håndtaket regioner og de innskutte sekvensene. Den fulle lengde RNA syntetisert ved in vitro transkripsjon. Siste, er RNA og kjemisk modifiserte håndtak glødet sammen for å generere molekylene for tweezing.

Kalibrering og drift av pinsett. Den grunnleggende utformingen av Minitweezers brukd i dette arbeidet følger det av dobbel bredde optiske pinsetter 33. Med mange forbedringer, de Minitweezers vise ekstraordinære stabilitet i forhold til første generasjon optiske pinsett. En rekke forskningsgrupper i flere land bruker Minitweezers i sin single-molekyl forskning 14,15,34-37. Detaljene i konstruksjon, kalibrering og drift av enheten, inkludert instruksjon videoer, er tilgjengelig på "Pinsett Lab" nettsted (http://tweezerslab.unipr.it). Her blir forbedringer og kalibreringsprosedyrer som må utføres på daglig baser beskrives i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av RNA-molekyler for Single-molekyl Tweezing

  1. Kloning av sekvensen av interesse. Klone DNA-sekvensen som svarer til den RNA-struktur inn i en vektor.
  2. Syntese og rensing av transkripsjon malen. Syntetisere en transkripsjon mal ved PCR. [Sted tabell 1 her] Neste, rense PCR produktene ved hjelp av en PCR rensing kit, og konsentrere prøven til> 200 ng / mL. Fordi det rensede DNA blir brukt for transkripsjon, bør RNase fritt vann bli brukt i de eluering og konsentrering.
  3. In vitro transkripsjon. Syntetisere RNA ved in vitro transkripsjon ved 37 ° C over natten for å maksimere utbyttet RNA. [Sted tabell 2 her] Etter transkripsjon, tilsett 1 pl DNase I til å fordøye DNA-templat i 15 min ved 37 ° C. Rense-RNA ved hjelp av en silika spinn kolonne.
  4. Syntese av det biotinylerte håndtaket A. Først produsere den umodifiserte håndtaket A ved hjelp av PCR ved bruk av primere Af og Ar og konsentrate den forsterkede DNA til> 200 ng / mL. Deretter innlemme biotin endringene til PCR-produkt med en primer extension reaksjon. [Sted tabell 3 her] MERK: biotinylated håndtak A (biotin-HA) kan brukes direkte i annealing uten rensing. Som biotin-HA er å bindes med RNA, er det viktig å bruke RNase fritt vann i begge trinn.
  5. Syntese av digoxigenin-modifisert håndtak B. Syntetisere digoxigenin endret håndtak B (dig-HB) ved PCR ved hjelp av primer Bf og digoxigenin modifisert oligo Dig-Br (figur 3). Deretter rense PCR-produktet og konsentrere prøven til> 200 ng / mL.
  6. Annealing RNA til håndtakene. Anneal RNA med håndtak. [sted tabellene 4 og 5 her]
  7. Rens glødet prøven. Tilsett 3 volumer etanol av herdet prøve og bland godt. Oppbevar blandingen ved -70 ° C i minst 1 time. Spinn ned på 15 800 xg og kast supernatanten. Tørk pellet ved hjelp av en fryse-tørreren. Oppløs pelleten i100 pl RNase fritt vann. MERK: Prøven er nå klar til bruk og kan lagres ved -20 ° C.

2. Kalibrering og drift av optiske pinsetter

  1. Kalibrere pikselstørrelse på Videomonitor
    1. Bruke den optiske felle å felle en perle med kjent diameter (størrelse standard).
    2. Ta bilder av en fanget perle ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer (figur 4).
    3. Bestem diameteren av vulsten ved hjelp av bildebehandling basert på det geometriske tyngdepunkt-metoden.
    4. Gjenta denne fremgangsmåten for å bestemme diameteren av perler av forskjellig størrelse.
    5. Monter de målte og kjente diametre på kulene ved en lineær regresjon for å oppnå den fysiske størrelsen på en piksel.
  2. Bekreft Avstand Kalibrering
    1. Bruke den optiske felle å felle en perle.
    2. Bestem pixel posisjonen sin Tyngdepunktet av image fange programvare og registrere sin posisjon ved hjelp av Minitweezers.
    3. Styr perle å diffe leie stillinger og gjenta posisjonsbestemmelse.
    4. Konverter X og Y-posisjonene til vulsten fra piksler til m enheten ved hjelp av den kalibrerte pikselstørrelse.
    5. Sammenlign X og Y mellom posisjonene, målt ved video og ved Minitweezers. De to settene med verdiene skal bli enige. Som bildeoppløsningen er> 0,1 mikrometer, flytte perlen over 1 mikrometer mellom målinger for å sikre nøyaktighet. Hvis avstanden kalibrering ikke er sammenlignbare med den som er lagret i de Minitweezers, kalibrere instrumentet.
  3. Trap Stivhet Kalibrering
    1. Fang en perle ved hjelp av den optiske felle og holder det fortsatt.
    2. Noter kraft av fellen ved hjelp av en bypass rask datainnsamling med en hastighet> 5 kHz for 3 sek.
    3. Generere en strøm spekteret fra innspillingen av perlen bevegelse ved hjelp av programvare. Monter effektspekteret til en Lorentzian (figur 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
      hvor S (f) er kraften ved frekvensen f, er ​​f c sone frekvens, og S 0 er den asymptotiske kraft. Den knekkfrekvens, f c, er den frekvens hvor strømmen av termisk bevegelse er redusert til halvparten av den asymptotiske verdi. Som f c varierer med laser makt og perle størrelse, kalibrere hver fanget perle individuelt.
    4. Beregn fjærkonstanten av fellen, κ, fra f c:
      Formel 2 (Eq. 2)
      hvori γ er luftmotstandskoeffisient på vulsten (Eq. 3). Bruk fjærkonstant for å bestemme endringer i forlengelsen av en RNA fra kraft endring.
  4. Stokes 'lov Test
    1. Fang en perle ved hjelp av den optiske fellen. Flytt perle back-og-kraft til ulik hastighet.
    2. Noter bevegelse av vulsten og tvinge ved hjelp Minitweezers.
    3. Beregn radius av perlen.
      MERK: friksjonskraft, F d, genereres ved bevegelsen av en sfærisk partikkel i et fluid kan beskrives ved Stokes 'lov:
      Ligning 3 (Eq. 3)
      hvor r er radien av sfæren, v er hastigheten, og h er den dynamiske viskositeten av fluidet, noe som kan finnes i referansetabeller. Ved hjelp av den målte kraft F d, kan radien av vulsten bli beregnet ved hjelp av Eq. 3 (figur 6) og må bli enige med det bestemmes av bildeinnlastingen programvare. Stokes 'lov test effektivt tester de samlede kalibreringer og ytelsen til instrumentet.

3. Nanomanipulation av Enkelt RNA-molekyler

  1. Making lufthåndtering.
    1. Bore seks hull (2 mm diameter hver) på en nr to cover glass (figur 7a) og skar tre åpninger (2 mm bredde) inn tosidige polyimide tape (figur 7b) ved hjelp av en laser gravør.
    2. Lag en flyt kammeret ved sandwiching to dekkglass med to lag tosidige Kapton tape. Sett inn en mikropipette og to bypass rør mellom tape (figur 7c).
    3. Monter strømningskammeret på en metallramme ved å matche fluidic hull (figur 7d).
    4. Forbind fluidic kanaler av kammeret til 10 ml sprøyter som er fylt med buffer av valg via polyetylen produksjonsrør (figur 7e).
    5. Monter hele kammeret på de optiske pinsett mellom de to målene. Sørge for at den fremre side av kammeret med fluidumsforbindelsene kanalene vender mot høyre. Trekk riktig objektiv og plugge messing pins av rammen (figur 7e) til monteringshullene på than pinsett. Stram skruene for å fikse kammeret posisjon.
  2. Blanding herdet prøven og perler. Bland prøven herdet med anti-digoxigenin-belagte perler (dig-perler), og la blandingen for å holde ved romtemperatur i 5-10 min. Typisk blir 1 pl av glødet prøve blandet med 5 mL Dig-perler i 1 ml buffer. MERK: Mengden av perlene som skal lastes inn i strømningskammeret bør velges for å sikre en rimelig mengde av perlene som skal leveres fra forbirøret. Forholdet av herdet prøve til perlene kan ikke lett bli kvantifisert. I et ideelt tilfelle, de fleste perler har ingen RNA slik at bare en liten brøkdel av perler, kan ha bare én RNA-molekyl per perle. Som glødet prøver og vulsten suspensjon er vanskelig å kvantifisere, og bare den beste måten for tiden er å variere blandingsforholdet og teste blandingen på pinsett.
  3. Lever perler til reaksjonsstedet i strømningskammeret (dvs. noen få mikrometer på toppen av micropipette tips, figur 7c).
    1. Legg i en suspensjon av streptavidin-belagt perler (strep-perler) i en 1 ml sprøyte.
    2. Koble sprøyten til fluidic rør som fører til bunnen av kanalen i strømningskammeret (figur 7a).
    3. Press sprøyten å strømme strep-perler inn i kammeret.
    4. Beveg hele kammeret ved hjelp av motorstyreprogramvaren til å plassere den optiske felle nær åpningen av den nedre bypassrøret (figur 7b). Deretter bruke optisk felle av en styrekulen for å fange en strep-perle.
    5. Beveg vulsten nær tuppen av mikropipette ved hjelp av motorstyreprogramvaren.
    6. Trekk sprøyten er koblet til å suge mikropipette vulsten på mikropipette.
    7. Påfør flyt forsiktig ved å trykke sprøyten til midten kanal for å skylle ut ekstra strep-perler.
    8. På samme måte leverer blandingen av prøve og de Dig-perler (se trinn 3.2) til den øvre kanalen i kammeret.
    9. Fang en grave-perle og bringe den nær strep-perle ved hjelp av den optiske fellen.
    10. Rengjør midten kanal ved å bruke flyt. MERK: strep- og grave-perler blir valgt til å være forskjellige størrelser, slik at de kan skilles visuelt under mikroskopisk vis (figur 4).
  4. Fiske "en enkelt-molekyl-tilknytning mellom et par av perler.
    1. Plasser grave-perle vertikalt på toppen av strep-perle (figur 4).
    2. Flytt dig-perle ned mot strep-perle ved å styre fellen. Åpne en kraft-avstand tomt vindu på datamaskinen for å visualisere kraft endringer.
    3. Ved kontakt mellom to perler, flytte grave-perle vertikalt bort fra strep-perle.
    4. Hvis ingen spesifikk kontakt er gjort, gjenstår kraften nesten null. Hvis de to perler er forbundet med molekyler, styrke øker vesentlig når de to perler skilles. Denne prosedyren, vanligvis referert til som "fisking", er det ofte performed flere ganger på hvert par av perlene for å finne en effektiv enkelt-molekyl tether.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Begrenset av plass, er nanomanipulation av enkelt RNA-molekyler demonstrert ved å vise bare mekaniske utfolder eksempler på RNA hårnåler og en RNA med tertiær struktur.

Manipulere Enkelt hårnål Molekyler

Når en tjore er etablert mellom perlene, kan forlengelse av og kraft på tjore manipuleres ved hjelp av en brukerdefinert protokoll. Fire vanlige manipulasjon protokoller blir ofte brukt.

Force-rampe Experiment. Den mest intuitive og vanlig eksperiment for å manipulere en enkelt RNA er til gjentatte ganger å strekke og slappe av molekylet i retning av den skruelinjeformede aksen av håndtakene (vertikalt som vist på figur 4). Den kraft, F, og felle stilling, Y, blir registrert som en funksjon av tiden. Forlengelsen av molekylet, e, kan beregnes ved e = Y - F / κ, hvori er fjærkonstanten til trap. Den trekke Resultatet kan vises som en forlengelseskraft-kurven (figur 8a). Strekking av de doble-strandet håndtak er vist ved den stigende kurve med positiv helning. Den avslapning kurve av håndtakene retraces at den strekker. Den strukturelle overgangen av en enkel, to-stats-folding hårnål viser en "rip" med negativ helling, noe som indikerer en enkelt, samarbeidsvillig utfolder overgangen 39. Den refolding av hårnål er angitt med en "zip" på forlengelse kraft-kurve. Viktigere, kan det samme molekylet foldes ut og refolded ved forskjellige krefter hver gang. En slik trend er tydelig på distribusjoner av overgangs krefter (figur 8b). Vanligvis blir den kraft som endres som en lineær funksjon av tid, dvs. med en fast lasting / lossing hastighet. Under en konstant lasting / lossing rate, kan styrke avhengige kinetikk være hentet fra fordelinger av overgangsstyrkene 40-42.

Constant Force Experiment. Under konstant kraft modus benytter apparatet en feedback-mekanisme for å kompensere styrke avvik fra en innstilt verdi. Utvidelsen av et RNA-molekyl er registrert som en funksjon av tid (figur 9). Innstilling av kraft ved eller i nærheten av overgangen styrken til den aktuelle RNA molekyl overgangs tillater observasjon og kvantifisering av molekylære extensional tilstander. Levetiden av molekylet på hver stat kan samles sammen for å beregne kinetikken av strukturell overgang 7. Den konstante kraft eksperimentet blir brukt til å overvåke reversibel folding, slik som de av hårnåler 7,28.

Force Jump Experiment. I en kraft hopp eksperiment, er den kraft som hurtig endres til en annen verdi og holdes konstant; levetiden av den første overgang er overvåket 43. Kraften hopp er spesielt nyttig for å karakterisere de kinetikkenirreversible prosesser, fordi levetiden for fremover og bakover reaksjoner kan måles direkte separat på forskjellige styrker. Ved hver kraft hopp / drop, er bare ett liv observert. Derfor, flere runder med slike eksperimenter må utføres for å samle inn tilstrekkelige observasjoner for å trekke kinetikk.

Passive eksperimenter. Under den passive modus, blir posisjonene til fellen og mikropipette både fast (figur 10). En hårnål viser to stater som tilsvarer utbrettet og brettet RNA nær sine overgangsstyrkene. I motsetning til den konstante kraft eksperimentet, både kraft og forlengelse av molekylet endring ved den strukturelle overgangen. Eliminere feedback kontroll lar molekylære overganger som skal overvåkes direkte uten ytre forstyrrelser. Imidlertid er det vanskelig å opprettholde konstant kraft under passiv modus avslører. Som fanget vulsten diffus i det optiske felle, styrke endres tilsvarende. The passiv modus er uegnet for måling av molekyl tilstander med lang holdetid, hvor kraften er i vesentlig grad. Fordeler og ulemper med konstant kraft og passive modusene har blitt grundig studert og diskutert 44.

Greie Folding av sekundære og tertiære Structures

Mekanisk utfoldelsen av en to-base-par kyssing RNA dannet av to koblede GACG tetraloop hårnåler brukes som et eksempel her (figur 11a). Både hårnåler en 9-base-par stammen, selv om stammen sekvenser er forskjellige. Den mekaniske utfolding banen til RNA (Figur 11a) har blitt karakterisert ved tvang rampe metoder 34. Når kraften er hevet, er kyssing komplekse først brutt, etterfulgt av sekvensiell utfoldelse av hårnåler. På refolding, hårnåler kaste først, etterfulgt av en kyss samhandling på lav styrke. Disse overgangene er synlige på forlengelse kraft-kurve (Figur11b). For å bekrefte tilordningen av hårnål overganger, kan hver av hårnåler være individuelt undersøkt. Tildelingen av de unkissing / kissing overganger kan verifiseres ved å studere en mutant RNA, der tetraloops er mutert for å hindre dannelsen av kyssing interaksjon 28. Alternativt kan den laveste styrken settes til 10 PN høyere enn kyssing styrker. Som forventet, viser forlengelse kraft-kurve under slike forhold bare utfoldelsen / refolding av hårnåler (Figur 11C) 34. Derfor er det mulig å undersøke folding kyssing interaksjon og hver av de to hårnåler uavhengig av hverandre på forskjellige styrker.

Det er merkbart at folding av de to hårnåler er reversible, mens kyssing samhandlingen er svært irreversible, som tydelig av svært forskjellig unkissing og kyssing styrker, og ved stor hysterese. Derfor kan de sammenleggbare kinetikk av hårnåler bli studert directly ved hjelp av den konstante kraft eksperimenter. Kinetikken til interaksjonen kyssing, må imidlertid måles ved hjelp av den kraft som hoppe-metoden. Den Figur 12a viser en typisk kraft hopp eksperiment 28. Ved 3 PN, er hele RNA brettet. Kraften blir deretter heves raskt til 22 pN og holdt konstant. Etter noen få sekunder, er hele RNA utfoldet til en enkelt tråd, som fremgår ved en plutselig økning i forlengelse av ~ 30 nm. Kraften blir deretter hevet til 30 pN for ytterligere å strekke RNA, før den blir senket til 13 pn. Etter folding av hårnåler, er kraften raskt falt til 8 pn. Dannelsen av komplekset kyssing indikeres ved å korte av forlengelsen ved ~ 7-8 nm. Ved å samle mange av disse levetid målinger, unkissing og kyssing kinetikk ved konstant krefter kan beregnes.

Under alle eksperimentelle forhold, er kyssing kompleks alltid utfoldet først. På krefter som de hårnåler er ustabile av seg selv, kyssing interaction beskytter hårnål strukturer fra utfoldelse. Et slikt hastighetsbegrensende effekt er også avslørt av kraft jump eksperimenter. Som vist i figur 12b 28, når kraften blir hoppet til 16 pN, utvidelse av molekylet i det vesentlige uendret i noen få sekunder, fulgt av en utfoldelse øke forlengelse ved ~ 20 nm. Endringene i forlengelsen indikerte svakere syv-base-par hårnål er utfoldet rett etter forstyrre av kyssing kompleks. Den metastability av hårnål er tydelig ved levetid. Når kyssing er brutt, transporter hårnål raskt mellom brettet og brettet stater; livene er mindre enn 1 sek. I hovedsak er denne observasjonen en konstant kraft eksperiment for utfoldelse hårnål. I motsetning til dette tar det mer enn 10 sekunder for å bryte Kissing kompleks sammen med hårnål. Likeledes er kraften hoppet til 17,7 pN (figur 12c), ved hvilken hele RNA er utfoldet til en enkelt tråd, som fremgår av inkrøll i forlengelsen av ~ 30 nm. Den bistability av den store, 11-base-par hårnål kan sees som en forlengelse hopp mellom to verdier. Igjen, de korte levetid av hårnål er i skarp kontrast til den lange levetiden i metastabil tilstand. Ved hjelp av en kombinasjon av kraft rampe og kraft hoppe eksperimenter, termodynamikk og kinetikk av enkelte utfolder / folding trinn kan måles 28. Direkte observasjoner av breaking og dannelse av kyssing kompleks gjør oss i stand til å analysere energiske bidrag flankerer baser til minimal kyssing kompleks 34 og å måle salt avhengighet av kyssing interaksjon 45.

Figur 1
Figur 1. RNA-strukturer i forhold til den anvendte kraft. a) En hårnål under spenning. b) Trekke en to-base-pair kyssing kompleks. De to krappe looper er farget i rødt og gult.

Figur 2
Figur 2. eksperimentelle oppsettet. RNA struktur er flankert av to DNA / RNA-håndtak. Gjennom de kjemiske modifikasjoner på endene av håndtakene, kan hele molekylet være koblet til et par av protein belagte mikron-størrelse perler. En av vulstene er holdt av et styrbart, kraft-måle optisk felle. Den andre er plassert på en mikropipette, som drives av en piezoelektrisk flexture stadium. Tegningen er ikke i målestokk.

Figur 3
Figur 3. En generell ordning for å syntetisere RNA-molekyler med håndtak. Håndtaket A, håndtere B, og transcription malen er generert ved hjelp av PCR fra et plasmid med RNA-sekvensen klonet. Håndtaket A er endret av digoxigenins (dig) på 3 'endene. Håndtaket B har et biotin modifikasjon på 5'-enden av en tråd. Den fulle lengde RNA er transkribert fra transkripsjons-mal. RNA og modifiserte håndtak er blandet og glødet. De ordentlig molekyler kan være bundet til et par kuler belagt med streptavidin og anti-digoxigenin antistoff. Tegningen er ikke i målestokk.

Figur 4
Figur 4. bilder fra en enkelt fiske-molekyl mellom to perler fanges opp av skjermkortet. Ene vulsten er plassert på tuppen av en mikropipette ved suging. Den andre er holdt og styrt av en kraft-måling optisk felle. Retningene av fellen bevegelser er vist med piler. De fanget perle første trekkvertikalt mot vulsten på mikropipette. Ved kontakter, flyttes fanget perle opp. Dersom et tether etableres mellom perlene, separasjon av perlene trekker på molekylet og styrkeøkninger som molekylet er utvidet. Hvis to perler ikke er forbundet med noen molekyl, genererer retur bevegelse ingen kraft.

Figur 5
Figur 5. En kraft spekteret av den Brownske bevegelse av en innestengt vulsten. Heltrukken kurve er en tilpasning til Lorentzian ligning (Eq. 1), vist i innsatsen. Den fjærkonstanten av fellen kan beregnes fra den hjørnefrekvens (Eq. 2).

Figur 6
Figur 6. Et eksempel på Stokes 'lov test.

Figur 7
Figur 7. En strøm kammer for tweezing. a) Seks hull, hver med en diameter på 2 mm, er boret inn i en nr to cover glass ved hjelp av en laser gravør. b) Tre 2 mm brede slisser er kuttet i tosidige polyamid kassetter. c) En nærmere titt ved den eksperimentelle region innehold mikropipette og to bypass-rør. Perlene fra topp og bunn kanaler traversere gjennom sine respektive bypass rør (blå og grønn) til CENtral kanal i de retninger som er angitt ved piler. d) Monter fluidic kammeret på en metallramme ved å matche fluidic hull. e) En tre-kanalkammer som er koblet til strømningsrørene. Den sentrale kanal blir brukt til å trekke RNA. Toppen (blå) og bunn (grønne) kanaler blir brukt til å levere kulene. Den eksperimentelle regionen er angitt med en rød firkant.

Figur 8
Figur 8. Force rampe. a) kraft forlengelse-A kurve av mekanisk utfoldelsen av en hårnål. Trekke er vist i blått og avslapning i rødt. Den utfolding / refolding av hårnål er indikert med pilene. B) Fordeling av utfolding (blå) og refolding (rød) kreftene hårnål. Figuren er tilpasset fra en innsendt manuskript 39.


Figur 9. En RNA hårnål under konstant kraft. a) Diagram av eksperimentet. Posisjonen av fellen blir endret gjennom tilbakemelding slik at det opprettholdes en konstant kraft på hårnål. B) styrke og posisjon i forhold til tiden for hårnål un / folding. Ettersom kraften holdes konstant, posisjonen av fellen varierer mellom to verdier, som viser bistability av hårnål på styrken. Binomial fordeling av fellen distribusjon gir den utvidelse på hårnål utfoldelsen av 19,4 ± 0,2 nm. Figuren er tilpasset fra en innsendt manuskript 39.

Figur 10
Figur 10. passiv modus av en hårnål. a) B) styrke og forlengelse i forhold til tiden for en hårnål i henhold til passiv modus.

Figur 11
Figur 11. Force rampe av de to-base-par kyssing RNA. a) Hierarkisk folding av en to-base-par kyssing RNA henhold mekanisk spenning. b) forlengelseskraft-kurven. Strukturelle overganger er indikert med piler. C) forlengelseskraft-kurven når den laveste kraft er innstilt ved 10 pN å hindre kyssing interaksjon. Det figur er tilpasset med tillatelse fra Journal of American Chemical Society 34.

Figur 12
Figur 12. Force hoppe av de to-base-par kyssing RNA. a) En kraft hopp / slipp syklus for å måle unkissing og kyssing levetid på to forskjellige styrker. Den øverste panelet viser tids spor av kraft. Bunnpanelet viser den relative forlengelse av molekylet. Styrken er først hoppet fra tre PN til 22 pN å måle levetiden på kyssing kompleks ved 22 pn. Den unkissing er angitt med en rask økning i forlengelse av ~ 30 nm, noe som indikerer hele RNA er utfoldet i en enkelt tråd. På avslapping, er kraft trappet ned til 14 pN å la de to hårnåler til refold. Kraften blir deretter falt til 8 pn. Dannelse av kyssing interaksjon er indikert ved reduksjon i forlengelsen av 7-8 nm ~ b.)Som force er hoppet til 16 PN, viser forlengelse tid-spor som det tar flere sekunder for kyssing komplekse og de ​​syv-base-par hårnål å utfolde seg, hvoretter hårnål utfolder seg og refolds raskt. C) Hele kyssing komplekset er utfoldet i en enkelt strand noen få sekunder etter kraft er hoppet til 17,7 pn. De resterende spor viser bistability av 11-base-par hårnål. Hver av de strukturelle overganger i utfolder kyssing RNA viser karakteristiske X. Figuren er tilpasset med tillatelse fra Proceedings of National Academy of Sciences 28.

Reagens mL
Plasmid (10 ng / ml) 10
Primer T7f (100 mm) 10
Primer Br (100 mM) 10
dNTP mix (25 mm hver) 10
10xPCR buffer 100
H 2 O 850
Taq DNA polymerase 10
Total 1000

Merk: En typisk termisk syklus for å syntetisere tre kbp DNA er: 95 ° C 45 sekunder, 53 ° C 1 minutt, 72 ° C i 3 minutter.

Tabell 1. Et eksempel på PCR for å syntetisere transkripsjon mal.

Reagens mL
sjablon (> 200 ng / ml) 8
NTPs 8 (2 ml hver)
10x reaksjonsbuffer 2
T7 RNA polymerase 2
Total 20

Merk: Inkuber reaksjonen ved 37 ° C overnight.

Tabell 2. In vitro-transkripsjon.

Reagens mL
Håndter A (~ 10 mg) 50
Biotin-11UTP 5
T4 pol reaksjon buffer 5
BSA løsning 1
T4 DNA-polymerase 5
Total 66

Merk: Inkuber reaksjonen ved romtemperatur i 20 minutter. Inaktivere enzymet ved oppvarming ved 70 ° C i 20 minutter, etterfulgt av langsom avkjøling til romtemperatur.

Tabell 3. Primer forlengelsesreaksjon.

Reagens mL
Formamide 800
EDTA (0,5 M, pH 8,0) 2
Rør (1 M, pH 6,3) 40
NaCl (5M) 80
Total 922

Tabell 4. Oppskrift av anneal buffer.

Reagens
Biotin-HA 1000 ng
Dig-HB 1000 ng
RNA 1000 ng
Annealing buffer 80 mL

Merk: Et typisk termisk syklus for annealing er: 95 ° C 10 minutter, 62 ° C i 1 time, 52 ° C i 1 time, etterfulgt av gradvis til 4 ° C.

Tabell 5. anneal RNA med håndtak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modifikasjon og feilsøking i Utarbeidelse av tweezing Samples

Valget av Cloning Vector. Selv om den generelle ordning som er beskrevet her (Figur 3) krever ikke et spesielt kloningsvektor, er vektoren foretrukket ikke å ha iboende T7 eller T3-promoteren for enkel transkripsjonen slik at en promoter kan innføres via PCR ved ønskede posisjoner.

Sekvens og lengder av håndtakene. Det er ingen spesifikk sekvens krav om håndtakene. Imidlertid er en nær GC til AT-forhold foretrekkes, mens homopolymeric og sterkt gjentatte sekvenser bør unngås. I publiserte arbeider, er de to håndtakene holdes så lignende lengder slik at RNA strukturen av interesse er plassert omtrent i midten. Tidligere arbeid viser at den totale lengden av håndtakene varierte fra 500 til 10 000 basepar diskret påvirker de målte kinetikk 46,47.

ve_content "> kontroll og kvantifisering av Glødet blandingen. Foruten den tilsiktede RNA med håndtak, inneholder det endelige produktet også unannealed DNA håndtak og RNA, så vel som andre. det er vanskelig og uøkonomisk å rense pinsett molekyler. stedet herdet blandingen kan brukes direkte for tweezing, fordi bare skikkelig glødet nukleinsyrer kan være bundet til to overflatebelagte perler. riktig herdet produkt er også vanskelig å skilles fra håndtakene og RNA på agarosegelelektroforese. den beste måten for å teste kvaliteten, og for å kvantifisere konsentrasjonen av herdet produkt, er å teste den på pinsett. Imidlertid er det nyttig å kontrollere og kvantifisere PCR og transkripsjonsprodukter på hvert trinn ved hjelp av forskjellige molekylærbiologiske teknikker.

Alternative tilnærminger til Tether RNA til perler. Det finnes mange tenkelige fremgangsmåter for å knytte RNA-molekyler til overflater kovalent eller ikke-kovalent 48

Single- vs Multiple-molekyl Tether. Et par strep- og grave-perler kan knyttes av flere molekyler. For å lokke ut slik mulighet for multiple molekyler deling vulsten, er kraft-avstandskurvene må være nøye kontrollert. Single-molekyl tjore vise en orm-lignende-kjeden elastisitet 4 som er generelt usett i multi-molekyl stagene. Ytterligere eksperimenter er spesifikke for hver systemkontroll kan være nødvendig for å bekrefte den enkelt-molekyl tether.

Forbedringer av Minitweezers

Rask og Slow Data opptak. Den Minitweezers har en innebygd datainnsamling som registrerer opp til 21 instrumentelle parametere ved en hastighet på 200 Hz i en datamaskin, som vil bli betegnet som drifts datamaskinen i dette arbeidet. Men noen applications og kalibreringer krever en rask datainnsamling rate. For dette formål, blir de elektroniske signaler av kraft og avstand delt for å bli registrert i en annen datamaskin, "hurtig-opptak" maskin, i tillegg til den datainnsamling i drifts datamaskin. Den raskt opptak maskinen leser data gjennom en egen innsamling kort og programvare, som gjør at flere kanaler på opptil 1 MHz. Den nye maskin og datainnsamling ikke forstyrre driften av apparatet, som utelukkende styres av betjenings datamaskin. I et eksperiment, er data samtidig registrert på begge datamaskinene til ulike priser. Tidssynkronisering er utført i løpet av dataanalyse ved å sammenligne de tilsvarende datafiler.

Video bildeopptak. Et skjermkort og bildebehandlingsprogrammer er installert på fast-opptak datamaskin til å fange levende bilder av reaksjonen og å analysere videobilder. Denne utviklingen gjør det mulig å gjennomføre than pikselstørrelse og avstand kalibreringer beskrevet ovenfor.

Begrensninger og fremtidige anvendelser av metoden

Fremgangsmåter for å manipulere og nøyaktig måle konformasjonsendringer av et enkelt RNA-molekyl er blitt diskutert. Slike egenskaper gjør det mulig å overvåke struktur omleiring av et RNA-tråd i sanntid. Videre kan kraft brukes til å påvirke RNA-struktur og folde trasé, slik sjeldne og / eller mindre enn optimale strukturer for å bli brettet.

Det er imidlertid begrensninger i de mekaniske tilnærming. Det viktigste er at utvidelsen, som brukes til å tolke konformasjonsendringer, er en en-dimensjonal fremvisning av tre-dimensjonale strukturer. Det er mulig at noen konformasjonsendringer ikke kan måles 49-52, og / eller kinetiske barrierer er skjult observasjon 53. Det finnes også ulike instrumentale effekter og begrensninger som kan enffect de observerte termodynamikk og kinetikk 44,46,47.

De optiske pinsetter har blitt brukt til å studere et begrenset antall RNA strukturer, sammenlignet med mange transkripsjoner foreslått av genomundersøkelser 54. Den teknikk som vil bli brukt til å studere forskjellige strukturelle motiver og store RNAer. I tillegg vil fremgangsmåten finne nye anvendelser innen forskning RNA. For eksempel RNA-bindende ligand og proteiner kan stabilisere eller endre RNA-struktur, noe som kan måles ved hjelp av den mekaniske tilnærming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77, (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics