Nanomanipulation av Single-RNA-molekyler med optisk pincett

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stor del av det mänskliga genomet transkriberas men översätts inte. I det här inlägget genomiska eran, har reglerande funktioner av RNA visat sig vara allt viktigare. Som RNA funktion beror ofta på dess förmåga att anta alternativa strukturer, är det svårt att förutsäga RNA tredimensionella strukturer direkt från sekvens. Single-molekyl närmar show potentialer för att lösa problemet av RNA strukturell polymorfism genom att övervaka molekylstrukturer en molekyl i taget. Detta arbete presenterar en metod för att exakt manipulera vikning och struktur av enskilda RNA-molekyler med användning av en optisk pincett. För det första att metoder syntetisera molekyler som är lämpliga för enda molekyl mekaniskt arbete beskrivs. Nästa, olika kalibreringsprocedurer för att säkerställa en väl verksamheten i optisk pincett diskuteras. Därefter olika experiment förklaras. För att demonstrera användbarheten av tekniken, resultat av mekaniskt utspelas RNA hårnålar och en enda RNA Kissing komplex används som bevis. I dessa exempel var den nanomanipulation teknik som används för att studera veckningen av varje strukturdomänen, inklusive sekundär och tertiär, oberoende av varandra. Slutligen är de begränsningar och framtida tillämpningar av metoden diskuteras.

Introduction

Utvecklingen av den optiska pincetten teknik har länge varit åtföljd med dess tillämpning inom biologisk forskning. När den optiska infångningseffekt först upptäcktes, konstaterade Arthur Ashkin att bakterier i förorenat vatten kan fastna vid laserfokus 1. Sedan dess fångstmetoder bakterier har blivit en oavsiktlig, roliga experiment för generationer av biofysik studenter samt en seriös forskning verktyg för att studera mikrobiell fysiologi 2,3. Den optiska fångst tekniken använder fokuserad laserstråle för att immobilisera en mikroskopisk objekt 1. Praktiskt, en laser fälla fungerar som en optisk våren, som också mäter kraften (F) på fångade objektet genom dess förskjutning från mitten av fällan (AX). Inom en kort intervall, F = κ x AX, i κ är fjäderkonstanten i fällan. Den optiska fällan kan användas för att utöva kraft i picoNewton (PN) precision till en microsCOPIC-objekt och mäta sin position med nanometer (nm) noggrannhet. Under de senaste två decennierna har optisk pincett blivit en av de mest använda enda molekyl tekniker inom biofysik. Tekniken har använts för att studera vikning och mekanik av DNA 4-6, RNA 7-9, och proteiner 10,11. Optiska pincetter har också använts för att observera DNA-replikation 12, RNA-transkription 13 och proteinsyntes 14,15, såväl som många andra biomolekylära händelser 16-18.

Enda molekyl metoder används i RNA strukturell forskning främst för att utforska den oländiga fällbara energiområdet inför RNA. En RNA-sekvens kan oftast vika i flera stabila, ömsesidigt uteslutande strukturer, på grund av de enkla kemiska sammansättning och bas paring regler RNA. Det har länge varit känt att RNA strukturell polymorfism, såsom den som förekommer i riboswitches 19,20, spelar en viktig roll i genreglering. En recent genomet hela undersökningen har visat att temperaturvariationer så liten som några grader kraftigt påverka struktur och proteinsyntes av en stor del av den cellulära transkriptom 21. Detta exempel antyder att den biologiska rollen av alternativ RNA-veckning är kanske viktigare och genomträngande än tidigare antagits. Struktur polymorfism, dock innebär en utmaning för de traditionella biokemiska och biofysiska metoder, som tar upp de genomsnittliga egenskaperna hos många molekyler. Till exempel "på" och "off" konformationer av en riboswitch är ömsesidigt uteslutande. Ett genomsnitt struktur härrör från heterogena strukturer är inte troligt att likna något av biologiskt relevanta konforma. Dessutom oöversatt RNA och mRNA bildar oftast strukturer. Deras samspel med proteiner och regulatoriska RNA kräver ofta utspelas i befintlig struktur, som en del av interaktionen. Därför studerar RNA utspelas / återveck blir en relevantutfärdandet av RNA biologi. För att möta en sådan utmaning har enda molekyl tillvägagångssätt använts för att reda ut RNA strukturell polymorfism genom att studera en molekyl i taget 22-27.

Jämfört med den populära enda molekyl fluorescens-metoden, pincett baserade mekanisk utspelas erbjuder en fördel att konformationer av enskilda molekyler kan manipuleras av applicerad kraft och mätas med nanometerprecision. Denna nanomanipulation förmåga kan utnyttjas för att övervaka den pågående / vikning av individuella strukturella domäner sådana att den hierarkiska vikning av ett stort RNA kan dissekeras 28. Alternativt kan en enkel sträng vara inriktad på att vika in i en av flera konformerer; eller en befintlig struktur kan mekaniskt förmås att återvecka till en annan konforma 29. Under biologiska förhållanden, kan en RNA-struktur ändras vid temperaturförändringar eller ligandbindning. Möjligheten att direkt manipulera molekylära sTRUKTUR öppnar en ny mötesplats för RNA strukturell studie. I princip andra mekaniska tekniker, såsom atomkraftsmikroskop och magnetiska pincett, kan också användas för att studera veckningen av enstaka RNA-molekyler. Dock är sådana ansökningar begränsas till stor del på grund av den relativt låga rumsupplösning 30.

Anställning av optisk pincett gör RNA strukturer som skall vikas genom mekanisk kraft.

Fördelen med mekaniska utspelas är flerfaldigt. Force kan användas för att utvecklas både sekundära och tertiära strukturer, medan metalljoner och ligand inducerad vikning är huvudsakligen begränsade till tertiära strukturer. Temperatur och denatureringsmedel kan väsentligt påverka verksamheten i vatten och lösta ämnen. I motsats härtill är kraften som appliceras lokalt för att störa molekylära strukturer; effekten av kraften på den omgivande miljön är försumbar. Dessutom är värmesmält bäst används för att studera fällbara termodynamiken för små RNA-strukturer,medan optisk pincett har använts för att studera RNA-strukturer med olika storlekar, från en sju baspars tetraloop hårnål 28 till en 400-nukleotid-ribozym 31. Dessutom kan RNA-strukturer mekaniskt vikas vid mesofil temperatur. Däremot att veckla RNA i en termisk smältexperiment, är temperaturen normalt höjs långt över fysiologiska temperaturer, vilket avsevärt ökar RNA hydrolys, speciellt i närvaro av Mg 2 + joner.

Det är viktigt att notera att den mekaniska effekten av kraft beror på hur den appliceras på en struktur. Den pålagda kraften lutar fällbara energilandskapet. Till exempel, när kraft anbringas på en hårnål, basparen är sekventiellt bruten, en i taget (Figur 1a). Den krusning gaffel skrider längs den spiralformade axeln, som är vinkelrät mot den anbringade kraften. Däremot när en minimal kissing komplex är under spänning, det två kissingbaspar, som är parallell med den pålagda kraften, dela kraften last (figur 1b). De olika geometrier av hårnålen och kyss komplex i förhållande till den anbringade kraften resultatet i deras olika mekanisk respons, som kan utnyttjas för att särskilja sekundär och tertiär vikning 28,32. Den teoretiska aspekten av mekanisk utspelas har tidigare granskats 8,9,30. Detta arbete beskriver de grundläggande metoder för att ställa upp och utföra en enda molekyl mekanisk utspelas analys.

Experimentell Setup. I vår mekanisk dragning experiment RNA-provet för tweezing består av RNA av intresse flankerad av två dubbelsträngade DNA / RNA-handtag (figur 2) 7. Hela molekylen kan bindas till två ytbelagda micron stora kulor (Spherotech) via streptavidin-biotin och digoxigenin-anti-digoxigenin interaktioner antikropp, respektive. En pärla hålls av en kraftmätning optisk trap, medan den andra hålls på spetsen av en mikropipett. Det relativa avståndet mellan pärlorna kan ändras genom att antingen styra den fällan eller flytta mikropipetten. Med hjälp av denna metod kan en enda RNA-molekyl tjudra pärlorna sträckas och avslappnad.

Framställning av prover. Syntesen av RNA-prover för tweezing innehåller några steg (Figur 3). För det första är den DNA-sekvens som motsvarar det RNA av intresse först klonas in i en plasmidvektor. Därefter tre PCR-reaktioner utfördes för att generera de två handtagen och en mall för transkription. Transkriptionen mall omfattar handtaget regionerna och de insatta sekvenserna. Fullängds-RNA syntetiseras genom transkription in vitro. Slutligen är RNA och kemiskt modifierade handtag glödgas tillsammans för att skapa molekyler för tweezing.

Kalibrering och användning av pincett. Den grundläggande designen av Minitweezers användningd i detta arbete följer att de dubbla balk optisk pincett 33. Med många förbättringar, de Minitweezers visa extra stabilitet jämfört med första generationen optisk pincett. Flera forskargrupper i flera länder använder Minitweezers i deras enda molekyl forskning 14,15,34-37. Detaljerna i konstruktionen, kalibrering och drift av enheten, inklusive instruktionsvideor, finns på "pincett Lab" hemsida (http://tweezerslab.unipr.it). Här är förbättringar och kalibreringsprocedurer som behöver utföras på daglig basis beskrivs i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Beredning av RNA-molekyler för enda molekyl Tweezing

  1. Kloning av sekvensen av intresse. Klona den DNA-sekvens som motsvarar det RNA struktur i en vektor.
  2. Syntes och rening av transkriptions mall. Syntetisera en transkriptionsmall med PCR. [Ort tabell 1 här] Därefter rena PCR-produkter med hjälp av en PCR-rening kit, och koncentrera provet till> 200 ng / l. Eftersom det renade DNA används för transkription, bör RNas fritt vatten användas i eluerings-och koncentrationssteg.
  3. In vitro-transkription. Syntetisera RNA genom transkription in vitro vid 37 ° C över natten för att maximera RNA utbyte. [Ort tabell 2 här] Efter transkription, tillsätt 1 l DNas I att smälta DNA-mallen under 15 minuter vid 37 ° C. Rena den RNA med användning av en kiseldioxid-spinnkolonn.
  4. Syntes av biotinylerade handtaget A. Första, producerar den omodifierade handtaget A med PCR med användning av primers Af och Ar och koncEntrate det amplifierade DNA: t till> 200 ng / ul. Härnäst införliva biotin modifieringar i PCR-produkten med användning av en primer-förlängningsreaktion. [Ort tabell 3 här] OBS! Biotinylerade handtag A (biotin-HA) kan användas direkt i glödgning utan rening. Eftersom biotin-HA skall glödgas med RNA, är det kritiskt att använda RNas-fritt vatten i båda stegen.
  5. Syntes av digoxigenin-modifierade handtaget B. Synthe digoxigenin modifierat handtag B (dig-HB) genom PCR med användning av primer Bf och digoxigenin-modifierade oligo Dig-Br (Figur 3). Härnäst rena PCR-produkten och koncentrera provet till> 200 ng / ul.
  6. Annealing RNA till handtagen. Glödga RNA med handtag. [place tabeller 4 och 5 här]
  7. Rena glödgad prov. Lägg 3 volymer etanol av det glödgade provet och blanda väl. Förvara blandningen vid -70 ° C under minst en timme. Spinn ner vid 15.800 xg och kassera supernatanten. Torka pelleten med hjälp av en lyofiliseringsanordning. Upplös pelleten i100 ^ il RNas-fritt vatten. OBS: Provet är redo att användas och kan lagras vid -20 ° C.

2 Kalibrering och användning av optisk pincett

  1. Kalibrera Pixelstorlek Video Monitor
    1. Använd den optiska fällan för att fånga en kula med känd diameter (storleksstandard).
    2. Ta bilder av en instängd pärla med hjälp av bildbehandlingsprogram (Figur 4).
    3. Bestäm diametern av vulsten med hjälp av bildprogram baserat på den centroid metod.
    4. Upprepa denna procedur för att fastställa diametrar pärlor av olika storlek.
    5. Montera de uppmätta och kända diametrar av pärlorna genom en linjär regression för att erhålla den fysiska storleken på en pixel.
  2. Verifiera Avstånd Kalibrering
    1. Använd den optiska fällan för att fånga en kula.
    2. Bestäm pixelposition sin tyngdpunkt med bildbehandlingsprogrammet och spela in sin position med hjälp av Minitweezers.
    3. Styr pärlan att diffe hyr positioner och upprepa positionsbestämning.
    4. Konvertera X och Y positionerna för pärla från pixlar till m enhet med hjälp av kalibrerade pixelstorleken.
    5. Jämför den X och Y mellan positioner uppmäts av video och genom de Minitweezers. De två uppsättningarna av värderingar bör komma överens. Eftersom bildupplösningen är> 0,1 | im, flytta vulsten över en xm mellan mätningarna för att säkerställa noggrannheten. Om avståndet kalibreringen inte är jämförbar med den som lagras i Minitweezers, kalibrera instrumentet.
  3. Trap Styvhet Kalibrering
    1. Fånga en pärla med den optiska fällan och håll den stilla.
    2. Anteckna kraft fällan med hjälp av en förbi snabb datainsamling med en hastighet> 5 kHz i 3 sek.
    3. Generera ett effektspektrum från inspelningen av pärlan rörelse med hjälp av programvara. Montera effektspektrum till en Lorentz (figur 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
      där S (f) är kraften vid frekvensen f är f c hörnfrekvens, och S 0 är den asymptotiska makten. Hörn frekvens, f c, är frekvensen där kraften i värmerörelser har minskat till hälften av det asymptotiska värdet. Som f c varierar med lasereffekt och pärlstorlek, kalibrera varje fångade pärla för sig.
    4. Beräkna fjäderkonstant fällan, κ, från f c:
      Ekvation 2 (Ekv. 2)
      där γ är luftmotståndskoefficient på pärlan (Eq. 3). Använd fjäderkonstanten för att bestämma förlängnings förändringarna hos en RNA från kraft förändring.
  4. Stokes lag Test
    1. Fånga en pärla med den optiska fällan. Flytta vulsten fram-och-kraft vid annan hastighet.
    2. Spela rörelse pärlan och tvingar med hjälp av Minitweezers.
    3. Beräkna radien för pärlan.
      OBS: friktionskraften, F d, som genereras av rörelsen hos en sfärisk partikel i en vätska kan beskrivas med Stokes lag:
      Ekvation 3 (Ekv. 3)
      i vilken r är radien av sfären, v är hastigheten, och h är den dynamiska viskositeten hos vätskan, som kan hittas i referenstabeller. Använda uppmätta kraft som F d, kan radien hos vulsten beräknas med hjälp av Ekv. 3 (Figur 6) och bör hålla med om det bestäms av bilden förvärvet programvara. Den Stokes lag testet testar effektivt de övergripande kalibreringar och prestanda hos instrumentet.

3 Nanomanipulation av Single-RNA-molekyler

  1. Making flödeskunskap.
    1. Borra sex hål (2 mm diameter vardera) på en nr 2 täckglas (figur 7a) och skär tre skåror (2 mm bredd) i dubbelsidig polyimidtejp (figur 7b) med hjälp av en laser gravör.
    2. Gör en flödeskammare med sandwich två täckglas med två lager av dubbelsidig Kapton tejp. Sätt i en mikropipett och två förbirören mellan tejpen (figur 7c).
    3. Montera flödeskammaren på en metallram genom att matcha fluid hål (figur 7d).
    4. Anslut fluidic kanaler kammaren till 10 ml sprutor fyllda med buffert av val via polyetenslangar (figur 7e).
    5. Montera hela kammaren på de optiska pincetten mellan de båda målen. Se till att den främre sidan av kammaren med de fluidiska kanaler är vänd åt höger. Dra rätt objektiv och anslut mässingsstift på ramen (figur 7e) till monteringshålen på than pincett. Dra åt skruvarna för att fixera kammarläget.
  2. Blanda det glödgade provet och pärlor. Blanda det glödgade provet med anti-digoxigenin-belagda pärlor (DIG-pärlor), och låt blandningen stanna vid rumstemperatur under 5-10 min. Typiskt är ett pl av glödgade prov blandades med 5 | il pik-pärlor i 1 ml buffert. OBS: Storleken på pärlorna som ska laddas in i flödet kammaren bör väljas för att säkerställa en rimlig mängd pärlorna som skall levereras från kringgående röret. Förhållandet av den glödgade provet till pärlorna inte lätt kan kvantifieras. I ett idealfall, de flesta kulor har ingen RNA så att endast en liten del av pärlor kan ha endast en RNA-molekyl per pärla. Eftersom de glödgade proverna och pärlan fjädring är svåra att kvantifiera, är det bästa och enda sättet för närvarande att variera blandningsförhållandet och testa blandningen på pincetten.
  3. Deliver pärlor till reaktionsstället i flödeskammaren (dvs några få mikrometer på toppen av micropipette spets, fig 7c).
    1. Ladda en suspension av streptavidinbelagda pärlor (strep-pärlor) i en 1 ml spruta.
    2. Anslut sprutan till fluidic slang som leder till den undre kanalen i flödeskammaren (figur 7a).
    3. Skjut på sprutan att strömma Strep-pärlor in i kammaren.
    4. Flytta hela kammaren med hjälp av programvara motorstyrning för att placera den optiska fällan nära öppningen av botten förbiledningsrör (figur 7b). Sedan fungerar den optiska fällan med en styrkula för att fånga en streptokock-pärla.
    5. Flytta vulst nära spetsen av mikropipetten med användning av motorstyrprogram.
    6. Drag sprutan ansluten till mikropipett att suga pärla på mikropipetten.
    7. Applicera flödet försiktigt genom att trycka på sprutan till mittkanalen för att spola ut extra strep-pärlor.
    8. Likaså leverera blandningen av provet och de pik-pärlor (se steg 3.2) till den översta kanalen av kammaren.
    9. Fånga en gräva-pärla och föra den nära till strep-pärlan med hjälp av optiska fällan.
    10. Rengör mitten kanal genom att tillämpa flöde. OBS: strep- och DIG-pärlor är valda för att vara olika storlekar, så att de kan särskiljas visuellt under mikroskopisk vy (figur 4).
  4. Fiske "en enda molekyl tjudra mellan ett par kulor.
    1. Placera pik-bead vertikalt på toppen av strep-vulst (Figur 4).
    2. Flytta ner mot strep-pärlan utgrävningen-pärlan genom att styra fällan. Öppna en kraft-distans tomt fönster på datorn för att visualisera kraftförändringar.
    3. Vid kontakt av de två kulorna flyttar pik-bead vertikalt bort från strep-pärlan.
    4. Om ingen specifik kontakt sker, förblir den kraft nästan noll. Om de två pärlorna är anslutna med molekyler, kraften ökar signifikant när de två pärlorna separera. Detta förfarande, som vanligtvis kallas "fiske", ofta är performed flera gånger på varje par av pärlor att hitta en effektiv enda molekyl tjuder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Begränsad av rymden, är nanomanipulation av enstaka RNA-molekyler demonstreras genom att visa endast mekaniska utspelas exempel på RNA hårnålar och en RNA med tertiär struktur.

Manipulera Enkel hårnål Molekyler

När ett tjuder är etablerad mellan pärlorna, kan förlängning av och kraft tjudret manipuleras med användning av en användardefinierad protokoll. Fyra vanliga manipulationsprotokoll är vanligt förekommande.

Force-ramp Experiment. Den mest intuitiva och gemensamt experiment för att manipulera en enda RNA är att upprepat sträckas och slappna av molekylen i riktningen av spiralaxeln av handtagen (vertikalt såsom visas i figur 4). Den kraft, F och fälla ställning, Y, registreras som en funktion av tiden. Förlängningen av molekylen, e, kan beräknas med e = Y - F / κ, där är fjäderkonstanten för trasid. Drag Resultatet kan visas som kraft-förlängningskurvan (figur 8a). Sträckningen av de dubbelsträngade handtag visas av stigande kurva med positiv lutning. Uppmjukningen kurva av handtagen retraces den för sträckning. Den strukturella omvandling av en enkel, två-state-vikning hårnål visar en "rip" med negativ lutning, vilket tyder på en enda, kooperativ utspelas övergången 39. Den återveckning av hårnålen indikeras med ett "blixtlås" på kraft-förlängning kurvan. Viktigt kan samma molekyl vikas ut och återveckas vid olika krafter varje gång. En sådan trend är tydlig på fördelningar av övergångskrafter (figur 8b). Vanligen är den kraft som ändras som en linjär funktion av tiden, dvs vid en fast lastning / lossningstakt. Under en konstant lastning / lossning hastigheten, kan kraftberoende kinetik utvinnas ur fördelningar av de övergångskrafter 40-42.

Constant Force Experiment. Under konstant kraft läge instrumentet använder en återkopplingsmekanism för att kompensera kraft avvikelserna från ett inställt värde. Utvidgningen av en RNA-molekyl registreras som en funktion av tiden (figur 9). Inställning av kraften vid eller nära övergången kraft den speciella RNA-molekylen övergång möjliggör observation och kvantifiering av molekylära tensional stater. De livstider av molekylen vid varje stat kan sammanföras för att beräkna kinetiken av strukturomvandling 7. Den konstant kraft experiment används för att övervaka reversibel vikning, såsom de av hårnålar 7,28.

Force Jump Experiment. I en kraft hopp experiment är den kraft snabbt ändras till ett annat värde och hålls konstant; livslängden för den första övergången övervakas 43. Kraften hoppet är särskilt användbar för att karakterisera kinetiken hosirreversibla processer, eftersom livstid framåt och bakåt reaktioner direkt kan mätas separat vid olika krafter. Vid varje force jump / drop endast en livstid observerats. Därför flera omgångar av sådana försök måste göras för att samla in tillräckligt med observationer för att extrahera kinetik.

Passiva experiment. Enligt passivt läge, lägena för fällan och mikropipett är både fast (Figur 10). En hårnål uppvisar två stater som motsvarar ovikt och vikta RNA nära dess övergångskrafter. Till skillnad från den konstanta kraft experiment, både kraft och förlängning av molekylen förändring vid den strukturella övergången. Eliminera återkopplingskontroll tillåter molekylära övergångar som direkt övervakas utan yttre inblandning. Det är dock svårt att upprätthålla konstant kraft under passivt läge avslöjar. Som fångade pärla diffusa i den optiska fällan, kraft ändras i enlighet därmed. The passivt läge är olämpligt för mätning av molekylär stater med lång uppehållstid, under vilken kraft är signifikant. För-och nackdelar av konstant kraft och passiva lägen har studerats och diskuterats 44.

Unravel Folding av sekundära och tertiära strukturer

Mekanisk uppveckling av en två baspars kissing RNA som bildas av två kopplade GACG tetraloop hårnålar används som ett exempel här (figur 11a). Både hårnålar en nio baspars stam, även stjälk sekvenserna är olika. Den mekaniska utspelas väg RNA (Figur 11a) har präglats av våld rampmetoder 34. När kraften höjs, är det kysser komplexet först bruten, följt av sekventiell utspelas av hårnålar. På återveck, de hårnålar viker först, följt av en kyss interaktion vid låg kraft. Dessa övergångar är synliga på kraft-förlängningskurvan (figur11b). För att bekräfta tilldelningen av hårnåls övergångar, var och en av hårnålar kan individuellt studeras. Tilldelningen av unkissing / kyssas övergångar kan verifieras genom att studera en mutant RNA, där tetraloops muteras för att förhindra bildandet av kyss interaktionen 28. Alternativt kan den lägsta kraft ställas in på 10 PN, högre än de kissing krafterna. Som väntat, kraft-förlängningskurva under sådana förhållanden den visar bara den pågående / veckning av hårnålar (Figur 11c) 34. Därför är det möjligt att undersöka vikning av kyss interaktion och vardera av de två hårnålar oberoende vid olika krafter.

Det märks att vikningen av de två hårnålar är reversibel, medan kyssas interaktionen är mycket irreversibel, så uppenbart av mycket olika unkissing och kyssas krafter och genom stora hysteres. Därför kan studeras de fällbara kinetiken av hårnålar directly med hjälp av de konstanta kraft experiment. Kinetiken för kyss interaktionen måste dock mätas med den kraften hoppmetoden. Figuren 12a visar en typisk force hopp experiment 28. Vid 3 pN är hela RNA vikta. Kraften sedan snabbt höjs till 22 PN och hålls konstant. Efter några sekunder är hela RNA uppvikt i en enda sträng, som framgår av en plötslig ökning av förlängning av ~ 30 nm. Kraften höjs sedan till 30 pN att ytterligare sträcka ut RNA, innan den sänks till 13 pN. Efter vikning av hårnålar, är den kraft snabbt sjunkit till 8 pN. Bildandet av den kyssande komplexet indikeras genom att korta av förlängningen av ~ 7-8 nm. Genom att samla många av dessa livstidsmätningar, unkissing och kysser kinetik i fasta krafter kan beräknas.

Under alla experimentella förhållanden, är det kysser komplexet alltid ovikta först. Vid krafter att hårnålar är instabila i sig själva, de kysser samverkarion skyddar hårnålsstrukturerna från utspelas. En sådan hastighetsbegränsande effekt också avslöjas med våld hoppförsök. Såsom visas i fig 12b 28, när kraften hoppat till 16 pN, förlängning av molekylen förblir i stort sett oförändrad under ett par sekunder, följt av en utfällning att öka förlängningen vid ~ 20 nm. Förändringarna i förlängningen visade den svagare sju baspar hårnålen ovikta direkt efter störa den kyssande komplexet. Den metastabilitet av hårnålen framgår av livstid. När kyssar är trasig, transit hårnålen snabbt mellan vikta och ovikta stater; de livstider är mindre än 1 sekund. I grunden är denna observation en konstant kraft experiment för utfällning av hårnålen. Däremot tar det över 10 sekunder att bryta kyss komplexet tillsammans med hårnålen. På motsvarande sätt är kraft hoppat till 17,7 pN (Figur 12c), vid vilken hela RNA är ovikta i en enda sträng, såsom framgår av den iveck i förlängningen av ~ 30 nm. Den bistabilitet av den stora, 11 baspars hårnål kan ses som en förlängning av humle mellan två värden. Återigen, de korta livstid hårnålen är i skarp kontrast till sin långa livslängd i metastabila tillstånd. Med en kombination av kraft ramp och kraft hoppförsök, termodynamik och kinetik enskilda utspelas / hopfällbara stegen kan mätas 28. Direkta observationer av brytandet och bildning av kissing komplex ger oss möjlighet att analysera energirika bidrag från flankerande baser till den minimala kissing komplex 34 och för att mäta saltberoendet hos kissing interaktion 45.

Figur 1
Figur 1. RNA-strukturer i förhållande till den pålagda kraften. a) En hårnål spänd. b) Att dra en två-bas-par kissing komplex. De två hårnålsslingor är färgade i rött och gult.

Figur 2
Figur 2. Experimental setup. RNA struktur är flankerad av två DNA / RNA-handtag. Genom de kemiska modifieringar på ändarna av handtagen kan hela molekylen vara ansluten till ett par av proteinbelagd mikronstora kulor. En av pärlorna hålles av ett styrbart, kraftmätnings optisk fälla. Den andra är placerad på en mikropipett, vilken drivs av en piezoelektrisk flexture skede. Ritningen är inte skalenlig.

Figur 3
Figur 3 Ett allmänt system för att syntetisera RNA-molekyler med handtag. Handtaget A, handtag B, och transcription mall genereras genom PCR från en plasmid med RNA-sekvensen klonas. Handtaget A modifieras genom digoxigenins (DIG) vid 3 'ändarna. Handtaget B har en biotin modifiering vid 5'-änden av en sträng. Fullängds-RNA transkriberas från transkriptionen mall. RNA och modifierade handtag blandas och glödgas. De ordentligt molekylerna kan vara bundna till ett par kulor belagda med streptavidin och anti-digoxigenin antikropp. Ritningen är inte skalenlig.

Figur 4
Figur 4. Bilder av fiske en enda molekyl mellan två kulor fångas av grafikkortet. Är en pärla placerad på toppen av en mikropipett genom sugning. Den andra hålls och styrs av en kraft-mätning optisk fälla. Riktningarna för fäll rörelser indikeras med pilar. De fångade pärla första stegenvertikalt mot vulsten på mikropipetten. Vid kontakter, flyttar instängda pärla upp. Om ett tjuder är etablerad mellan pärlorna, separation av pärlorna drar på molekylen och kraften ökar eftersom molekylen är utsträckt. Om två kulor inte är förenade genom någon molekyl, genererar indragningsrörelse ingen kraft.

Figur 5
Figur 5 En effektspektrumet för Brownsk rörelse av en instängd pärla. Den fasta kurvan är en passning till Lorentz ekvation (Ekv. 1), som visas i insatsen. Fjäderkonstanten av fällan kan beräknas från hörnfrekvensen (Ekv. 2).

Figur 6
Figur 6 Ett exempel på Stokes lag test.

Figur 7
Figur 7 En flödeskammare för tweezing. a) Sex hål, vardera med en diameter på 2 mm, borras in i en nr 2 täckglas med hjälp av en laser gravör. b) Tre 2 mm breda slitsar skärs i dubbelsidiga polyimid band. c) En närmare titt på experiment region som innehåller mikropipett och två förbirören. Kulorna från de övre och nedre kanaler färdas genom sina respektive bypass rör (blå och grön) till central kanal i de riktningar som anges med pilar. d) Montera fluidkammaren på en metallram genom att matcha fluid hål. e) En tre-kanals kammare kopplad till flödesrören. Den centrala kanalen används för att dra RNA. Toppen (blå) och botten (grön)-kanaler används för att leverera pärlorna. Den experimentella region indikeras av en röd fyrkant.

Figur 8
Figur 8 Force ramp. a) En kraft-förlängningskurva mekaniskt utspelas i en hårnål. Dra visas i blått och avkoppling i rött. Den utspelas / återveck av hårnålen anges med pilarna. B) Fördelningen av utspelas (blå) och återveckning (röd) krafter hårnålen. Figuren är anpassad från ett lämnat manuskript 39.


Figur 9 En RNA hårnål under konstant kraft. a) Diagram över experimentet. Placeringen av fällan ändras genom feedback för att upprätthålla en konstant kraft hårnålen. B) Kraft och position mot tid för hårnål un / vikning. Eftersom kraften hålls konstant fluktuerar position fällan mellan två värden, visar bistabilitet av hårnålen i kraft. Den binomial fördelning av fällan fördelningen ger förlängningen förändringen på hårnål utspelas på 19,4 ± 0,2 nm. Figuren är anpassad från ett lämnat manuskript 39.

Figur 10
Figur 10 passivt en hårnål. a) B) Kraft och förlängning mot tiden för en hårnål i passivt läge.

Figur 11
Figur 11 Force ramp av den två baspar kyssas RNA. a) Hierarkisk vikning av en två-baspar kyssa RNA under mekanisk spänning. b) Kraft-förlängningskurva. Strukturella övergångar markeras med pilar. C) Kraft-extension kurva när den lägsta kraften är 10 pN att förhindra att kyssa interaktion. Det figur är anpassad med tillstånd från Journal of American Chemical Society 34.

Figur 12
Figur 12 Force hoppa av två baspar kyssas RNA. a) En kraft jump / drop cykel för att mäta unkissing och kyssas livstider på två olika krafter. Den övre panelen visar tids spår av våld. Den nedre panelen visar den relativa förlängningen av molekylen. Kraften är först hoppade från 3 pN till 22 pN att mäta livslängden för kyss komplexet vid 22 pN. Den unkissing indikeras av en snabb ökning av förlängningen av ~ 30 nm, vilket indikerar hela RNA uppvikt till en enda sträng. På avkoppling, är kraften rampas ned till 14 pN att låta de två hårnålar för att återvecka. Kraften därefter sjunkit till 8 pN. Bildandet av kyss interaktionen indikeras av minskad förlängning av ~ 7-8 nm miljarder.)Som kraft hoppat till 16 pN, visar tidsförlängnings spår att det tar flera sekunder innan kyssas komplexa och de sju-baspar hårnål att veckla ut, varefter hårnålen utvecklar och refolds snabbt. C) Hela kyssar komplexet är uppvikt i en enda sträng några sekunder efter kraft hoppade till 17,7 pN. Resterande spår visar bistabilitet av 11-baspar hårnål. Var och en av de strukturella övergångar i utspelas kysser RNA visar distinkt X. Figuren är anpassad med tillstånd från Proceedings of National Academy of Sciences 28.

Reagens il
Plasmiden (10 ng / ml) 10
Primer T7f (100 mM) 10
Primer Br (100 mM) 10
dNTP-blandning (25 mM vardera) 10
10xPCR-buffert 100
H2O 850
Taq DNA-polymeras 10
Totalt 1000

Anmärkning: En typisk termisk cykel för syntetisering av 3 kbp DNA är: 95 ° C 45 sekunder, 53 ° C 1 minut, 72 ° C 3 minuter.

Tabell 1 Ett exempel på PCR för syntes av transkription mall.

Reagens il
mall (> 200 ng / ml) 8
NTP 8 (2 ml vardera)
10x reaktionsbuffert 2
T7 RNA-polymeras 2
Totalt 20

Anm: Inkubera reaktionen vid 37 ° C overnight.

Tabell 2 In vitro-transkription.

Reagens il
Handtag A (~ 10 mg) 50
Biotin-11UTP 5
T4-pol-reaktionsbuffert 5
BSA-lösning 1
T4 DNA-polymeras 5
Totalt 66

Anm: Inkubera reaktionen vid rumstemperatur under 20 minuter. Inaktivera enzymet genom upphettning vid 70 ° C under 20 minuter, följt av långsam kylning till rumstemperatur.

Tabell 3. primerförlängningsreaktion.

Reagens il
Formamid 800
EDTA (0,5 M, pH 8,0) 2
RÖR (1 M, pH 6,3) 40
NaCl (5M) 80
Totalt 922

Tabell 4 Recept för glödgning bufferten.

Reagens
Biotin-HA 1.000 ng
Dig-HB 1.000 ng
RNA 1.000 ng
Glödgning buffert 80 ml

Anmärkning: En typisk termisk cykel för glödgning är: 95 ° C 10 minuter, 62 ° C 1 timme, 52 ° C 1 timme, följt av ramp till 4 ° C.

Tabell 5 Anneal RNA med handtag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Modifiering och felsökning i framställning av tweezing prover

Val av kloningsvektor. Även om den allmänna ordningen som beskrivs här (figur 3) inte kräver en speciell kloningsvektor är vektorn föredraget att inte ha inneboende T7 eller T3-promotorn för den lätthet av transkription så att en promotor kan införas via PCR vid önskade positioner.

Sekvens och längder av handtagen. Det finns ingen specifik sekvens krav på handtagen. Emellertid är en nära GC till AT-förhållande föredrages, medan homopolymera och starkt upprepade sekvenser bör undvikas. I publicerade verk är de två handtagen hållas så likartade längder så att RNA-strukturen av intresse placeras ungefär i mitten. Tidigare arbete visar att den totala längden på handtagen varierade från 500 till 10.000 baspar subtilt påverkar de uppmätta kinetik 46,47.

ve_content "> Kvalitetskontroll och kvantifiering av den glödgade blandningen. Förutom den avsedda RNA med handtag, den slutliga produkten innehåller även oglödgade DNA handtag och RNA, såväl som andra. Det är svårt och oekonomiskt att rena de tweezing molekyler. Istället den glödgade blandningen kan användas direkt för tweezing, eftersom endast de riktigt glödgade nukleinsyror kan bindas till två ytbelagda pärlor. Korrekt glödgad produkt är också svårt att skiljas från handtagen och RNA på agarosgelelektrofores. Det bästa sättet att testa kvaliteten och för att kvantifiera koncentrationen av den glödgade produkten är att testa den på pincetten. Det är dock till hjälp att kontrollera och kvantifiera PCR och transkriptionsprodukter i varje steg med hjälp av olika molekylärbiologiska tekniker.

Alternativa strategier för Tether RNA till pärlor. Det finns många tänkbara metoder för att länkar RNA-molekyler till ytor kovalent eller icke-kovalent 48

Single- kontra Multiple-molekylen Tether. Ett par strep- och gräva-pärlor kan kopplas av flera molekyler. För att locka fram en sådan möjlighet för flera molekyler tjudra pärlan, den kraft-avståndskurvor måste noga undersökas. Enda molekyl tjuder visa ett maskliknande kedja elasticitet 4 som är allmänt osynliga i flera molekyl tjuder. Ytterligare kontrollexperiment specifika för varje system kan krävas för att bekräfta enda molekyl tjuder.

Förbättringar av Minitweezers

Snabb och långsam datainsamling. Den Minitweezers har en inbyggd datainsamling som registrerar upp till 21 instrumentella parametrar med en hastighet av 200 Hz i en dator, som skall benämnas som drifts datorn i detta arbete. Men vissa applications och kalibreringar kräver en snabb datainsamling takt. För detta ändamål är de elektroniska signaler om våld och distans delas för att föras in i en ny dator, den "snabba-inspelning" dator, förutom datainsamling i driftdatorn. Den snabba inspelnings datorn läser data genom en separat datainsamling kort och mjukvara, vilket gör att flera kanaler med upp till 1 MHz. Den nya datorn och datainsamling stör inte driften av instrumentet, som enbart styrs av manöverdatorn. I ett experiment, är data samtidigt registreras på båda datorerna i olika takt. Tidssynkronisering utförs under dataanalys genom att jämföra motsvarande datafiler.

Videobildinspelning. Ett grafikkort och bildbehandlingsprogram är installerade på den snabbinspelningsdator för att fånga levande bilder av reaktionen och för att analysera videobilder. Denna utveckling gör det möjligt att genomföra tHan pixelstorlek och avstånd kalibreringar som beskrivs ovan.

Begränsningar och framtida tillämpningar av metoden

Metoder för att exakt manipulera och mäta konformationsförändringar av en enda RNA-molekyl har diskuterats. Sådana förmågor gör det möjligt att övervaka strukturell omlagring av en RNA-sträng i realtid. Dessutom kan kraften användas för att påverka RNA struktur och fällbara vägar, vilket gör sällsynta och / eller mindre än optimala strukturer som skall vikas.

Det finns emellertid begränsningar i den mekaniska tillvägagångssätt. Viktigast förlängningen, vilken används för att tolka konformationsförändringar, är en en-dimensionell projektion av de tre-dimensionella strukturer. Det är möjligt att vissa strukturförändringar inte kan mätas 49-52, och / eller kinetiska hinder är dolda observation 53. Det finns också olika instrumentella effekter och begränsningar som får enffect de observerade termodynamik och kinetik 44,46,47.

De optisk pincett har tillämpats för att studera ett begränsat antal RNA-strukturer, i jämförelse med många avskrifter föreslagits av genomet hela undersökningar 54. Tekniken kommer att användas för att studera olika strukturella motiv och stora RNA. Dessutom kommer metoden hitta nya tillämpningar inom RNA-forskningen. Exempelvis RNA-bindande liganden och proteiner kan stabiliseras eller ändra RNA-struktur, som kan mätas med hjälp av den mekaniska tillvägagångssätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77, (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics