Den Bovin Lung i biomedicinsk forskning: Visuellt Guidad Bronkoskopi, intrabronkial Ympning och

Medicine
 

Summary

Den här artikeln beskrivs bronkoskopiska tekniker inom nötkreaturs lunga under experimentella förhållanden, dvs bronchoscopically guidade ympning, lungsköljning, bronkial borstning och transbronchial lungbiopsi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det finns en pågående sökande efter alternativa djurmodeller inom forskning av respiratorisk medicin. Beroende på målet med forskningen, stora djur som modeller för lungsjukdom ofta liknar situationen för den mänskliga lungan mycket bättre än möss gör. Att arbeta med stora djur ger också möjlighet att prova på samma djur flera gånger under en viss tiden, vilket gör att långtidsstudier utan att offra djuren.

Syftet var att etablera in vivo provtagningsmetoder för användning i en nötkreaturs modell av en respiratorisk Chlamydia psittaci infektion. Provtagningen bör utföras vid olika tidpunkter i varje djur under studien, och proverna bör vara lämpliga att studera värdsvaret, samt patogenen under experimentella förhållanden.

Bronkoskopi är ett värdefullt diagnostiskt verktyg inom human-och veterinärmedicin. Det är en säker och minimalt invasiv förfarande. Denna article beskriver intrabronkial inympning av kalvar samt provtagningsmetoder för de nedre luftvägarna. Videoendoscopic leder intrabronkial ympning att mycket konsekvent kliniska och patologiska fynd i alla inokulerade djur och är därför väl lämpad för användning i modeller av smittsam lungsjukdom. De provtagningsmetoder som beskrivs är lungsköljning, bronkial tandborstning och transbronchial lungbiopsi. Alla dessa är värdefulla diagnostiska verktyg inom humanmedicin och skulle kunna anpassas för försöksändamål till kalvar i åldern 6-8 veckor. Proverna som erhölls var lämplig för både detektion av patogener och karakterisering av svårighetsgraden av lunginflammation i värden.

Introduction

Värdena för stora djurmodeller i biomedicinsk forskning

I modern tvärvetenskaplig biomedicinsk forskning, djurmodeller är fortfarande nödvändig för att belysa komplexa interaktioner - relaterade till hälsa eller ett sjukdomsstatus - i däggdjursorganismer. Trots 17 Nobelpris delas en forskare som studerade nötkreatur, hästar, får eller fjäderfä som modeller för biomedicinsk forskning 1, numera de allra flesta djurförsök genomförts med gnagare, medan mindre än 1% av studierna arbetar med husdjur eller boskap.

Små djur har många praktiska fördelar (dvs. lågprisflyg, genetisk formbarhet, hög kapacitet, tillgänglighet av många genetiska och immunologiska verktyg och byggsatser), och genetiskt modifierade musmodeller är allmänt accepterade för att utföra mekanistiska studier upptäcka särskilda molekylära vägar. I biomedicinsk forskning av komplexa system, than biologiska relevansen och kliniska användbarheten av musmodeller blir mer och mer betänkligt. De kan vara missvisande och bär risken för förenkling av biologisk komplexitet 2-9.

På grund av egenheter mellan arter, kommer inga enskilda djurarter helt spegla den mänskliga situationen, och att använda mer än en modell verkar vara till nytta i en tvärvetenskaplig biomedicinsk forskningsansats. Inom ramen för translationell medicin, stora djur ger möjlighet att fungera som jämförelsemodeller som ger resultat med hög biologisk relevans för dubbel användning för både människors och djurs hälsa 1. Anmärkningsvärt är det mänskliga genomet mer liknade av det bovina genomet än med genomet hos gnagare. Det har också bekräftats nyligen att, i jämförelse med annan taxa, är mycket mer ordnas 10-12 genomet hos möss.

I en komplex studiedesign, användning av djur ger unique möjlighet intraindividuella, långtidsstudier med upprepad insamling av en mängd olika prover in vivo från en-och-den-samma individuum utan att offra djuret. Därför kan funktionella, inflammatoriska och morfologiska förändringar övervakas i samma ämne under en viss tid 13.

Den Bovin Lung som en lämplig andnings modell

På grund av det stora antalet signifikanta skillnader i lung anatomi, andningsfysiologi och lung immunologi, inte möss inte reproducera många viktiga patofysiologiska aspekter av mänsklig lungsjukdom. Detta måste tas i beaktande när man använder dem som djurmodeller av luftvägssjukdom 2,9,14-16. Även om egenheter i anatomi och struktur existerar för varje däggdjurs lunga, funktionella egenskaper (t.ex. lungvolymer, luftflöden och luftvägsmekanik) är bättre jämförbar mellan vuxna människor och kalvar på grund av liknande kroppsvikt(50 till 100 kg).

De artspecifika egenskaper bovin lunga sammanfattas på följande sätt: den vänstra lungan har två lober (Lobus cranialis, som är uppdelad i två delar, och Lobus caudalis), medan den högra lungan består av fyra lober (Lobus cranialis, Lobus Medius, Lobus caudalis och Lobus accessorius). Till skillnad från lungorna anatomin hos de flesta andra däggdjur, luftrör av rätt kraniala lob grenar direkt från den högra laterala sidan av trakea. Med avseende på subgross anatomi lägger bovin lunga en hög grad av lobformighet och en hög procentandel av interstitiell vävnad 17,18 leder till en relativt låg specifik lungcompliance och en högre lungvävnadsmotståndet 19. Därför är andningsverksamhet krävs ganska hög jämfört med andra arter 20,21. Den höga graden av lobformighet leder till ett starkt oberoende av segmenten. Sålunda inflammatory processer är begränsade av bindväv septa, och sjuka och friska segment ligger ofta inom samma lob. På grund av avsaknaden av kollaterala luftvägarna, är bovin lunga särskilt lämpade att spegla obstruktiva pulmonella dysfunktioner 13. Beträffande vaskulaturen i bovin lunga, de små lungartärerna visar mycket prominenta glatta muskelskikten. Därför kan kalven också fungera som en väletablerad djurmodell av pulmonell hypertension eller vaskulär remodeling 22-24.

När det gäller luftvägsinfektioner, förekommer naturligt förekommande sjukdomar hos boskap som delar många likheter med motsvarande sjukdom hos människan. Typiska exempel är bovin tuberkulos 25, respiratory syncytial virus (RSV) infektioner hos kalvar 26-28, eller naturligt förvärvade klamydiainfektioner 29. Således behöver stora djurmodeller liknar situationen i den naturliga värden. Därför är de mest useful för att studera värd-patogen interaktioner och komplex patofysiologi av motsvarande sjukdom hos människor 30,31.

Som en biologiskt relevant modell av andnings Chlamydia psittaci infektion, var kalvar valdes eftersom nötkreatur företräda fysiska värdar för denna patogen 32-35. Den information som erhållits från denna modell, med avseende på patogenes av sjukdomen eller möjliga smittvägar mellan djur och människor, kommer att bidra till att bredda vår kunskap med effekter för både boskap och människor. Modellen kan också hjälpa till att kontrollera allmänt accepterade och alternativa terapeutiska alternativ för elimineringen av pulmonell C. psittaci-infektioner, vilket, återigen, av intresse både inom veterinär-och humanmedicin.

Teknik som används till och Prover erhållas från nötkreatursAndningsSystem

Rapporten beskriver och illustrerar den teknik och diagnostiska metoder applicable till bovin lunga och användes i vår modell för att utvärdera både bildandet av patogenet på däggdjurs lunga och effektiviteten för terapeutiskt ingripande.

Bronkoskopi har utförts inom humanmedicin sedan 1960-talet och anses vara en säker procedur 36. I kalvar, var försöks bronkoskopi som beskrivs i 1968 för första gången 37. Den intrabronkiell tillämpning av patogener föreslogs av Potgieter et al. Som en tillförlitlig metod för att producera nedre luftvägsinfektioner hos kalvar 38 och är nu en utbredd metod i nötkreatur forskning 34,39,40. Intrabronkial ympning av en definierad mängd av patogenen i videoendoscopic kontroll möjliggör selektiv placering av smittämnet i lungan. Detta leder till konsekventa kliniska och patologiska fynd i alla djur 34 och medger riktad provtagning av lungregioner som förväntas förändras på grund av patogen exponering.

bronkoalveolär sköljvätska (BALF) är en väl beskriven indikator med avseende på närvaron och svårighetsgraden av lunginflammation. Den lungsköljning (BAL) är ett standardförfarande inom humanmedicinen för diagnos av en mängd olika sjukdomar i andningsorganen 41. I levande boskap, var BAL introducerades av Wilkie och Markham i slutet av sjuttiotalet av förra seklet 42. Det ansågs vara en säker och repeterbar teknik för att studera de nedre luftvägarna hos nötkreatur. På grund av bristen på tillräckliga uppgifter om Balf parametrar i friska djur, 1988 Pringle et al. Utförde BAL på friska kalvar med en flexibel fiberoptiskt bronkoskop. Författarna påpekade också behovet av att standardisera BAL protokoll under experimentella förhållanden att förvärva jämförbara resultat 43. BAL används fortfarande som en sampling in vivo-metod i kalvar 44-46.

Bronkial borstning används ofta inom humanmedicinen som endiagnostiskt verktyg för att prova neoplastiska skador eller för mikrobiologisk analys 36. För forskningsändamål, kan primära cellkulturer av epitelceller skördas genom cytologisk borsta erhållas 47. Hos nötkreatur, har användningen av bronkial borstningar för mikrobiologisk analys har beskrivits för att karakterisera den mikrobiella miljön i lungan 43.

Transbronchial lungbiopsi ger lungvävnadsprover och är ett värdefullt diagnostiskt verktyg för diffusa lungsjukdomar hos människor. Iatrogen pneumothorax och förfarande relaterad blödning är komplikationer i samband med denna teknik. Deras förekomst rapporteras vara mindre än en procent hos människor 48. Transbronchial lungbiopsi inte är en vanlig metod för användning hos nötkreatur, på grund av de höga kostnaderna för den utrustning som krävs och den tid som behövs för att få biopsier. Istället transkutana lung biopsier är mer praktiskt under fältförhållanden 49-51.

Protocol

Ethics Uttalande
Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med europeisk och nationell lagstiftning för skötsel och användning av djur. Protokollet godkändes av kommittén för etik i djurförsök och om skydd av djur i delstaten Thüringen, Tyskland (Tillståndsnummer: 04-004/11). Alla experiment utfördes under övervakning av auktoriserad institutionell agent för djurskydd. Bronkoskopi var strikt utförs under narkos. Under studien var borgar för att minimera obehag eller lidande.

Allmänt
De beskrivna tekniker har utvecklats för kalvar ungefär 6-8 veckors ålder, väger ca 60-80 kg. För användning i andra stora djurarter eller kalvar olika i ålder och kroppsvikt, måste de tekniker som anpassas för att passa storlek och vikt och ta hänsyn till lung anatomi av de särskilda djurarter. Allautrustning som används måste vara sterila. Chlamydia psittaci är en zoonotisk bakterie som kan orsaka andnings-och allmän sjukdom hos människor. Den icke-avian C. psittaci stam DC15 som används i detta protokoll ska hanteras enligt skyddsnivå 2. Allt arbete med den patogen och med smittade djur måste utföras bära personlig skyddsutrustning, t.ex. en respirator, ett stänk vattentät overall, gummistövlar och handskar. Slitage en lämplig andningsapparat är av stor betydelse, eftersom den naturliga vägen för infektion för C. psittaci är Aerogen. Förpackning och märkning av prover måste vara desinfektionsmedel bevis eftersom allt måste behandlas med ett desinfektionsmedel som är effektivt mot chlamydia enligt tillverkarens anvisningar innan du lämnar djuret bostadshuset.

1. Förbereda djur för Bronkoskopi

  1. Bestäm vikten för kalv för dosering av anestetika.
  2. Placera en intravenös (IV) finns tillgänglig in den vänstra jugularvenen.
  3. Först långsamt injicera xylazin (0,2 mg / kg kroppsvikt) under cirka 30 sekunder, sedan, efter sedering uppträder, injicera ketamin (2,0 mg / kg kroppsvikt).
  4. Lyft upp djuret på bordet och placera den i rätt sidoliggande. När djuret är tillräckligt placerad på bordet, kontrollera om IV tillgång är fortfarande på plats och justera den om det behövs. Under anestesi, regelbundet kontrollera ögonlocksreflexen att bestämma djupet av anestesi.
  5. När djuret andas stadigt, ha någon dra tungan ut och sträcka på nacken. Placera ett metallrör speculum i djurets mun, genom att använda små roterande rörelser. Skjut spekulum framåt i sikte kontroll, med hjälp av en ficklampa, tills struphuvudet är synlig.
  6. Upprätthålla anestesi genom hela endoskopisk procedur genom injicering av en bolus av 7 mg xylazin och 70 mg ketamin som behövs.

. Två inokulering (inokulering webbplatser: Figur 1)

  • Förbered tre sprutor med inokulat, innehållande 1, 2, och 5 ml av inokulat.
  • Sätt i en Teflon slang i endoskopets arbetskanal. Röret ska inte sticka ut från endoskopet spets.
  • För in endoskopet genom metall spekulum. Små justeringar av spekulum kan vara nödvändigt för att möjliggöra bortgången av struphuvudet. Luftrör trachealis, som viker av till höger, hjälper till att rikta in bilden på skärmen.
  • Fäst sprutan med 5 ml ymp till slutet av teflonröret. Navigera röret i grenarna där ympen ska deponeras och tillämpa den önskade mängden (Höger lunga: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml och 1,0 ml, Vänster lunga: Lobus cranialis, Pars cranialis : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Fäst sprutan med 1 &# 160; ml ymp till röret, sedan navigera till luftrör trachealis och deponera inokulat (Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml). Det är bra att alltid vända sig till lokaliseringar i samma ordning.
  • Ta endoskopet och spekulum.
  • Spray 1 ml av inokulatet i varje näsborre med ett manövreringsorgan.
  • Ta djuret tillbaka till stallet och placera den i liggande ställning för att vakna upp. Lämna inte djuret utan uppsikt eller i sällskap med andra djur tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Återhämtningen stabila bör vara luftkonditionerade, eftersom djurets förmåga till värmereglering minskas under narkos.
    OBS: De första kliniska tecknen skulle inträffa om 24 till 36 timmar efter inokulering beroende på patogenen användas.
  • . 3 Provtagningsförfaranden (Sampling webbplatser: Figur 2)

    1. Förbered djuret enligt steg 1.1-1.6.
    2. Lungsköljning
      1. Placera 5 sprutor var och en innehållande 20 ml steril isoton koksaltlösning, i ett vattenbad och tillåta dem att värmas upp till cirka 38 ° C.
      2. Sätt i en lavage kateter i endoskopets arbetskanal, sedan in endoskopet i metall spekulum och navigera framåt i huvud luftrör av vänster lunga tills "kil läge" nås när endoskopet inte kan skjutas något längre fram.
      3. En efter en, bifoga sprutor med den varma NaCl lösning på lavage katetern, ingjuta vätskan och aspirera det direkt. Den lungsköljning vätska ska förvaras i silikoniserade glasflaskor och sätta på is omedelbart efter återvinning för att förhindra att de alveolära makrofager från att fästa till glasytan. Notera både mängden ingjutit saltlösning och mängden återvunna vätska.
      4. Avlägsna lavage katetern från arbetskanalen.
    3. Bronkial borstn
      1. Navigation endoskopet till önskad samplings läge, i den beskrivna protokollet så är Bifurcatio luftstrupama.
      2. Täck borsten med röret innan du sätter in endoskopets arbetskanal tills borsten tips visas på bildskärmen.
      3. Tryck borsten med plaströret framåt ca 5 cm och avslöja den från plaströret genom att trycka handtaget, sedan navigera till den plats som ska borstas.
      4. Gnid bort epitelceller samtal genom att försiktigt trycka och dra borsten fram och tillbaka när du navigerar endoskopet för att säkerställa kontakt mellan borsten och väggen i luftrör. Sluta gnugga när blödning inträffar. Täck borsten med röret innan du drar ut den ur arbetskanalen.
      5. Förbered upp till fem utstryk på objektglas genom att försiktigt rulla borsten över bilden. Fixera utstryken i kall metanol under 10 min, lufttorka och förvara vid -20 ° C.
      6. Borsten kan sköljas iolika medier, beroende på syftet med de celler som ingår i urvalet. Om du tar flera borstningar med samma pensel, se till att bara skölja det i media som inte irritera slemhinnor.
    4. Transbronchial lungbiopsi
      1. Navigation endoskopet till önskad samplings läge, i den beskrivna protokollet så är Pars caudalis av Lobus cranialis. Innan du sätter i biopsitänger i arbetskanal öppen och stänger den ett par gånger för att se till att det fungerar smidigt.
      2. Skjut biopsitänger i svans grenen av luftrör trachealis tills ett lätt motstånd uppstår. Dra tillbaka 2-3 cm, öppna pincett, driva ca 2 cm, stänga pincett, dra tillbaka och ta bort tången från arbetskanalen. Detta kräver lite övning.
      3. Ta försiktigt bort vävnad från biopsitänger, med hjälp av en nål eller liten tång. Beroende på den fortsatta användningen av vävnaden, förvara den i flytande nitrogen eller en lämplig fixeringsmedium. Detta bör ske direkt efter borttagning för att undvika autolytiska processer.
    5. Behandling efter procedur
      1. Ta djuret tillbaka till stallet och placera den i liggande ställning för att vakna upp. Lämna inte djuret utan uppsikt eller i sällskap med andra djur tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Återhämtningen stabila bör vara luftkonditionerade, eftersom djurets förmåga till värmereglering minskas under narkos.
      2. Övervaka djuret noga för tecken på pneumothorax för nästa 24 timmar. Ge foder och färskt vatten när djuret har återfått fullt medvetande.

    Representative Results

    Kurs av sjukdom

    Effekten av patogenet på djurens hälsa kan bedömas genom klinisk undersökning. I våra respiratoriska infektionsmodeller, var djuren undersöktes två gånger dagligen och kliniska observationer registrerades med hjälp av ett poängsystem. Ytterligare upplysningar fångades genom att utföra andra in vivo-provtagningsmetoder, t.ex. insamling av blod och svabbar eller lungfunktion mätning. Patologiska undersökningar utfördes vid olika tidpunkter efter ympning för att beskriva förloppet för infektionen 32-34.

    BALF återvinningsgrad

    Insamlingsgraden för den instilleras fluiden var 83,05 ± 4,58% (medelvärde ± SD).

    Detektion av patogener

    Rekultivering av patogenen kan utföras från bronkial borstningar. Dessutom kan PCR-screening av olika prover för att upptäcka patogener, t.ex. tissue biopsi, cytologi penselexemplet, Balf-celler 52 eller svalgpinne. Visualisering av patogenen är möjligt genom att utföra immunohistokemi av frysta sektioner av lungan biopsier och sedimente beredningar av BALF-celler (Figur 3). I tidigare experiment, var PCR av blodprover och kloak (konjunktival, fekal, nasal) utfördes för att karakterisera spridning och spridande av patogenen 32.

    Markörer för lokal inflammation i lungvävnad

    I BALF, kan studeras olika parametrar för lunginflammation. Den totala celler och andelen neutrofiler ökar oftast när lunginflammation är närvarande. För celldifferentiering, kan sedimente beredningar av Balf-celler färgas enligt Giemsa och differentieras med olja nedsänkning (Figur 4). Cellulära och flytande andelar av BALF separeras genom centrifugering (300 x g, 20 min). The BALF-Supernatant innehåller olika markörer som förändras vid inflammatoriska processer i lungan och kan studeras under experimentella förhållanden. Exempel är totalprotein och eikosanoider 29,34.

    En schematisk översikt av den potentiella vidare användning av de beskrivna proverna visas i figur 5.

    Figur 1
    Figur 1. Scheme av bovin lunga med ympning platser (gul). Siffrorna anger den ordning i vilken ympen administreras i de olika luftrören. R: höger; L: vänster. Höger lunga: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 Lobus caudalis: 0,5 ml och fyra 1,0 ml; Vänster lunga: Lobus cranialis, Pars cranialis: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml.

    Figur 2
    . Figur 2 Schema för bovin lunga med ympning platser (gul) och provtagningsSidor. Lungsköljning (blå), bronkial borst (grön), och lung biopsi (orange) Observera att alla prover erhålls från regioner där patogenen har deponerats tidigare. R: höger, L: vänster.

    Figur 3
    Figur 3. A) Lung biopsi från en kalv ympas med Chl amydia psittaci 4 dagar efter ympning (dpi), b) cellulär sediment av BALF från en kalv ympas med C. psittaci 9 dpi. Immunhistokemisk märkning av chlamydia. Chlamydial inklusioner (pilar) föreligger i lungorna (a) och i alveolära makrofager (B). Hematoxylin motfärg.

    Figur 4
    Figur 4. Cellular sediment av BALF från en kalv ympas med C. psittaci 9 dpi. alveolära makrofager (#) är den dominerande celltypen i BALF. Mängden av neutrofila granulocyter (*) ökar när inflammatoriska processer är närvarande. Modifierad Pappen färgning.

    es.jpg "width =" 600 "/>
    Figur 5. Möjliga metoder för provberedning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Discussion

    En bronkoskopiska metod för ympning utvecklades och olika bronkoskopiska provtagningsmetoder var anpassade för att användas i stora djur under experimentella förhållanden. De beskrivna teknikerna är lätta att lära sig, även för examinatorer med liten erfarenhet av endoskopi. Processen med bronkoskopi är minimalt invasiva och inga negativa effekter i samband med de metoder för ympning, liksom de beskrivna provtagningsmetoder (BAL, transbronchial lung biopsi, bronkial borstning), har någonsin sett i något av djuren. De komplikationer i samband med transbronchial lung biopsier hos människor blöder och pneumothorax 48, ingen av dessa sågs i vader som genomgick denna procedur. Den transbronchial lungbiopsi är mer tidskrävande och kräver mer utrustning än den transkutan metoden, men det är mindre invasiv och inte bära risken för sårinfektion.

    Den visuellt kontrolleras endoskopisk metod för inoculation tillåter deponering av en definierad mängd patogen vid specifika platser i lungan. Således resulterar det i väldigt konsekventa kliniska och patologiska fynd i alla inokulerade djur 32-34. Men det liknar inte alla funktioner i naturlig infektion hos kalvar. I en modell av en andnings C. psittaci infektion, den beskrivna tekniken med ympning ledde till lungskador i samband med platser för patogen placering 34, medan, i naturligt förvärvade infektioner kalvar brukar utveckla lunginflammation av de apikala lober. Detta faktum måste beaktas vid tolkningen av betydelsen av experimentella resultat i samband med natur förvärvade lunginfektioner hos nötkreatur.

    Videoendoscopic BAL medger provtagning ett definierat område av lungan. Experimentsyfte, är det en fördel jämfört med användning av en nasal kateter under blindförhållanden. På grund av anatomi bovin lunga, skulle blint insatt kateter vara trycked till höger diafragma lob i de flesta fall 53,54 och examinator har någon inverkan på den del av lungan som sköljs. En annan fördel med den endoskopiska BAL i bedövade kalvar i sidoliggande är den höga genomsnittliga återvinningsgraden av instilleras fluidum av mer än 80%. En jämförelse med andra studier visar att, i stående, sederade kalvar, en återhämtning av 133,3 ± 1,6 ml 46 och 127.13 ± 3,53 ml 45 efter instillation av 240 ml vätska i svans lob rapporteras. I sederade kalvar i sternala VILA 51% av den ingjutit vätskan kan återvinnas från hjärngloben och 62% från svans loben 43. Det innebär att ungefär hälften av den ingjutit vätskan kan återvinnas i upprätt läge för kalven. Beroende på mängden BALF behövs för ytterligare provberedning, kanske det inte lämnar tillräckligt med material för att utföra alla önskade experiment. BAL hos nötkreatur har använts av flera forskargrupper och mångaolika parametrar har undersökts under olika förhållanden. De flesta författare utförde lavage av basallober 43,45,46, men den mängd vätska som används för sköljning skiljer mellan forskargrupperna. Detta leder till inkonsekvens i utspädning av återvunna celler, proteiner och andra ämnen, vilket gör det svårt att jämföra resultaten från olika publikationer. Därför, för användning hos nötkreatur rekommenderas att sköljning med fem fraktioner av 20 ml (dvs. 100 ml totalt) kroppen varm, isoton saltlösning, som återvinns omedelbart efter instillation. Vid användning av ett lavage kateter med en stor diameter (dvs.> 2 mm), måste volymen av varje fraktion för att ökas något, beroende på mängden vätska som finns kvar i katetern.

    Den mycket segmenterad anatomi bovin lunga leder till en metodisk begränsning; resultat som erhållits från en del av lungan kan inte vara sant för resten av lungan. Eftersom det inte finns någonsyn kontroll över hela lungorna sonde av transbronchial biopsi och lavage, kan examinator inte veta om de områden som ingick i urvalet var friska eller sjuka. Därför är det mycket viktigt att ta prov på platser där patogenen inokulerades innan i syfte att ha en högre återvinningsgrad av patogenen och att ha en större sannolikhet för att sampla diseased lungområden. En annan begränsning är den ökade narkosrisken hos djur med dålig kliniska tillstånd. De beskrivna metoderna skall endast användas i modeller av mild till måttlig sjukdom för att hålla belastningen för de djur som är så låga som möjligt. Allmän anestesi hos idisslare bör alltid hållas så kort som möjligt, eftersom den gas utveckling i vommen ökar anestetikum risk i dessa arter. Djur skall placeras i liggande ställning direkt efter bronkoskopi för att möjliggöra utflödet av den utvecklade gasen och måste övervakas noga tills de är helt återhämtat sig från anestesi. Även de beskrivna tekniker är inte lämpligt för provtagning intervall på mindre än 24 timmar.

    Det beskrivna protokollet kan anpassas till andra infektiösa agens. Endoskopisk ympning av olika patogener har beskrivits, till exempel C. psittaci 32-34, Pasteurella haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55 och bovint virusdiarrévirus 44. Dessutom kan områden av patogen insättning i lungan vara anpassad till den önskade modellen. Vid valet av provtagningsplatser, några viktiga fakta måste beaktas: (i) provtagningsställen bör väljas utifrån placeringen av ympning och på de förväntade patologiska fynd. (Ii) När obduktion ska utföras försiktighet måste vidtas för att lämna tillräckligt unsampled lungområden för ex vivo provtagning. (Iii) Samplings site platser skall väljas så att de kan nås med utrustningen. Speciellt för transbronchial lungbiopsi, det finns begränsningar på grund av längden på biopsitänger. (Iv) Than order av provtagning är viktig, bronkial tandborstning och transbronchial lungbiopsi kan leda till mindre blödningar, vilket skulle förorena BALF. Därför måste BALF alltid erhållas först. Vid användning av protokollet i andra arter måste artspecifik lunganatomi beaktas.

    Disclosures

    Författarna har ingenting att lämna ut.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2.2 mm, working length 140 cm
    Lavage catheter Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
    Actuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
    Biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
    Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
    Cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10 working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
    iv acess Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter: 1.2 mm; length: 43 mm
    Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
    Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
    Isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
    SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
    Metal tube speculum n/a n/a diameter: 3.5 cm; length: 35 cm
    Flashlight n/a n/a
    Siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
    Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
    Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
    Sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
    Inoculum n/a dilute pathogen in 8 ml buffer

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ireland, J. J., Roberts, R. M., Palmer, G. H., Bauman, D. E., Bazer, F. W. A commentary on domestic animals as dual-purpose models that benefit agricultural and biomedical research. Journal of animal science. 86, 2797-2805 (2008).
    2. Persson, C. G. Con: mice are not a good model of human airway disease. American journal of respiratory and critical care medicine. 166, 6-7 (2002).
    3. Haley, P. J. Species differences in the structure and function of the immune system. Toxicology. 188, 49-71 (2003).
    4. Hein, W. R., Griebel, P. J. A road less travelled: large animal models in immunological research. Nature reviews. Immunology. 3, 79-84 (2003).
    5. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
    6. Elferink, R. O., Beuers, U. Are pigs more human than mice. Journal of hepatology. 50, 838-841 (2009).
    7. Jawien, J., Korbut, R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. 61, 647-650 (2010).
    8. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3507-3512 (2013).
    9. Pabst, R. Allergy and Allergic Diseases. 1, (2009).
    10. Bovine Genome, S., et al. The genome sequence of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science. 324, 522-528 (2009).
    11. Tellam, R. L., et al. Unlocking the bovine genome. BMC genomics. 10, 193 (2009).
    12. Graphodatsky, A. S., Trifonov, V. A., Stanyon, R. The genome diversity and karyotype evolution of mammals. Molecular cytogenetics. 4, 22 (2011).
    13. Kirschvink, N., Reinhold, P. Use of alternative animals as asthma models. Current drug targets. 9, 470-484 (2008).
    14. Coleman, R. A. Of mouse and man--what is the value of the mouse in predicting gene expression in humans. Drug discovery today. 8, 233-235 (2003).
    15. Kips, J. C., et al. Murine models of asthma. The European respiratory journal. 22, 374-382 (2003).
    16. Coraux, C., Hajj, R., Lesimple, P., Puchelle, E. In vivo models of human airway epithelium repair and regeneration. European Respiratory Review. 14, 131-136 (2005).
    17. McLaughlin, R. F., Tyler, W. S., Canada, R. O. A Study of the Subgross Pulmonary Anatomy in Various Mammals. American Journal of Anatomy. 149-165 (1961).
    18. Robinson, N. E. Some functional consequences of species differences in lung anatomy. Adv Vet Sci Comp Med. 26, 1-33 (1982).
    19. Lekeux, P., Hajer, R., Breukink, H. J. Effect of Somatic Growth on Pulmonary-Function Values in Healthy Friesian Cattle. Am J Vet Res. 45, 2003-2007 (1984).
    20. Veit, H. P., Farrell, R. L. The anatomy and physiology of the bovine respiratory system relating to pulmonary disease. Cornell Vet. 68, 555-581 (1978).
    21. Gallivan, G. J., McDonell, W. N., Forrest, J. B. Comparative pulmonary mechanics in the horse and the cow. Res Vet Sci. 46, 322-330 (1989).
    22. Hunter, K. S., et al. In vivo measurement of proximal pulmonary artery elastic modulus in the neonatal calf model of pulmonary hypertension: development and ex vivo validation. Journal of applied physiology. 108, 968-975 (2010).
    23. Stenmark, K. R., et al. Severe pulmonary hypertension and arterial adventitial changes in newborn calves at 4,300 m. Journal of applied physiology. 62, 821-830 (1987).
    24. Tian, L., et al. Impact of residual stretch and remodeling on collagen engagement in healthy and pulmonary hypertensive calf pulmonary arteries at physiological pressures. Annals of biomedical engineering. 40, 1419-1433 (2012).
    25. Van Rhijn, I., Godfroid, J., Michel, A., Rutten, V. Bovine tuberculosis as a model for human tuberculosis: advantages over small animal models. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 711-715 (2008).
    26. Otto, P., et al. A model for respiratory syncytial virus (RSV) infection based on experimental aerosol exposure with bovine RSV in calves. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 19, 85-97 (1996).
    27. Gershwin, L. J., et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 16, 1225-1236 (1998).
    28. Gershwin, L. J. Immunology of bovine respiratory syncytial virus infection of cattle. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 35, 253-257 (2012).
    29. Jaeger, J., Liebler-Tenorio, E., Kirschvink, N., Sachse, K., Reinhold, P. A clinically silent respiratory infection with Chlamydophila spp. in calves is associated with airway obstruction and pulmonary inflammation. Veterinary research. 38, 711-728 (2007).
    30. Martinez-Olondris, P., Rigol, M., Torres, A. What lessons have been learnt from animal models of MRSA in the lung. The European respiratory journal. 35, 198-201 (2010).
    31. Sadowitz, B., Roy, S., Gatto, L. A., Habashi, N., Nieman, G. Lung injury induced by sepsis: lessons learned from large animal models and future directions for treatment. Expert review of anti-infective therapy. 9, 1169-1178 (2011).
    32. Ostermann, C., et al. Infection, Disease, and Transmission Dynamics in Calves after Experimental and Natural Challenge with a Bovine Chlamydia psittaci Isolate. PloS one. 8, (2013).
    33. Ostermann, C., Schroedl, W., Schubert, E., Sachse, K., Reinhold, P. Dose-dependent effects of Chlamydia psittaci infection on pulmonary gas exchange, innate immunity and acute-phase reaction in a bovine respiratory model. Vet J. 196, (2012).
    34. Reinhold, P., et al. A bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection: challenge dose titration. PloS one. 7, (2012).
    35. Reinhold, P., Sachse, K., Kaltenboeck, B. Chlamydiaceae in cattle: commensals, trigger organisms, or pathogens. Vet J. 189, 257-267 (2011).
    36. Dionisio, J. Diagnostic flexible bronchoscopy and accessory techniques. Revista portuguesa de pneumologia. 18, 99-106 (2012).
    37. Hilding, A. C. Experimental bronchoscopy: resultant trauma to tracheobronchial epithelium in calves from routine inspection. Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol. 72, 604-612 (1968).
    38. Potgieter, M. M., Hopkins, F. M., Walker, R. D., Guy, J. S. Use of fiberoptic bronchoscopy in experimental production of bovine respiratory tract disease. Am J Vet Res. 45, 1015-1019 (1984).
    39. Ackermann, M. R., Kehrli Jr, M. E., Brogden, K. A. Passage of CD18- and CD18+ bovine neutrophils into pulmonary alveoli during acute Pasteurella haemolytica pneumonia. Veterinary pathology. 33, 639-646 (1996).
    40. Malazdrewich, C., Ames, T. R., Abrahamsen, M. S., Maheswaran, S. K. Pulmonary expression of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 in the acute phase of bovine pneumonic pasteurellosis. Veterinary pathology. 38, 297-310 (2001).
    41. Wells, A. U. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in diffuse parenchymal lung disease. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society. 19, 237-241 (2010).
    42. Wilkie, M. R. Sequential titration of bovine lung and serum antibodies after parenteral or pulmonary inoculation with Pasteurella haemolytica. Am J Vet Res. 40, 1690-1693 (1979).
    43. Pringle, J. K., et al. Bronchoalveolar lavage of cranial and caudal lung regions in selected normal calves: cellular, microbiological, immunoglobulin, serological and histological variables. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 52, 239-248 (1988).
    44. Silflow, R. M., Degel, P. M., Harmsen, A. G. Bronchoalveolar immune defense in cattle exposed to primary and secondary challenge with bovine viral diarrhea virus. Veterinary immunology and immunopathology. 103, 129-139 (2005).
    45. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Caswell, J. L. Alterations in the bovine bronchoalveolar lavage proteome induced by dexamethasone. Veterinary immunology and immunopathology. 118, 283-293 (2007).
    46. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Siwicky, M., Caswell, J. L. Stress alters the cellular and proteomic compartments of bovine bronchoalveolar lavage fluid. Veterinary immunology and immunopathology. 125, 111-125 (2008).
    47. Lordan, J. L., et al. Cooperative effects of Th2 cytokines and allergen on normal and asthmatic bronchial epithelial cells. J Immunol. 169, 407-414 (2002).
    48. Tukey, M. H., Wiener, R. S. Population-based estimates of transbronchial lung biopsy utilization and complications. Respiratory medicine. 106, 1559-1565 (2012).
    49. Braun, U., Estermann, U., Feige, K., Sydler, T., Pospischil, A. Percutaneous lung biopsy in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association. 215, 679-681 (1999).
    50. Burgess, B. A., et al. The development of a novel percutaneous lung biopsy procedure for use on feedlot steers. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 75, 254-260 (2011).
    51. Sydler, T., Braun, U., Estermann, U., Pospischil, A. A comparison of biopsy and post-mortem findings in the lungs of healthy cows. Journal of veterinary medicine. A, Physiology, pathology clinical medicine. 51, 184-187 (2004).
    52. Voigt, K., et al. PCR examination of bronchoalveolar lavage samples is a useful tool in pre-clinical diagnosis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte). Research in Veterinary Science. 83, 419-427 (2007).
    53. Caldow, G. Bronchoalveolar lavage in the investigation of bovine respiratory disease. In Practice. 1, 41-43 (2001).
    54. Heilmann, P., Müller, G., Reinhold, P. Bronchoscopy and Segmental Bronchoalveolar Lung Lavage of Anesthetised Calf. Monatsh. Veterinärmed. 43, 79-84 (1988).
    55. Gogolewski, R. P., et al. Protective ability and specificity of convalescent serum from calves with Haemophilus somnus pneumonia. Infection and immunity. 55, 1403-1411 (1987).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics