Den Bovine Lung i biomedicinsk forskning: Visuelt Guided bronkoskopi, intrabronchial Podning og

Medicine
 

Summary

Denne artikel beskriver bronkoskopiske teknikker i den bovine lunge under eksperimentelle betingelser, dvs bronchoscopically guidet podning, bronchoalveolær lavage, bronchiale børstning og transbronkial lunge biopsi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Prohl, A., Ostermann, C., Lohr, M., Reinhold, P. The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques. J. Vis. Exp. (89), e51557, doi:10.3791/51557 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Der er en igangværende søgen efter alternative dyremodeller i forskning af respiratorisk medicin. Afhængig af målet med forskningen, store dyr som modeller for lungesygdom ofte ligner situationen for den menneskelige lunge meget bedre end mus gør. Arbejde med store dyr giver også mulighed for at prøve det samme dyr gentagne gange over en vis løbet af tiden, hvilket giver mulighed for langsigtede undersøgelser uden at ofre dyrene.

Formålet var at etablere in vivo-metoder prøveudtagning til brug i en kvæg-model af en respiratorisk Chlamydia psittaci infektion. Prøverne udtages på forskellige tidspunkter i hvert dyr i løbet af undersøgelsen, og prøverne skal være egnet til at studere værtens respons, samt patogenet under eksperimentelle betingelser.

Bronkoskopi er et værdifuldt diagnostisk redskab i human-og veterinærmedicin. Det er en sikker og minimalt invasiv procedure. Denne Article beskriver intrabronkial podning af kalve samt prøveudtagnings til de nedre luftveje. Videoendoscopic, intrabronkiale podning fører til meget konsistente kliniske og patologiske fund i alle inokulerede dyr, og er derfor velegnet til brug i modeller af smitsom lungesygdom. De prøveudtagningsmetoder beskrevne bronchoalveolær udskylning, bronkial børstning og transbronkial lunge biopsi. Alle disse er værdifulde diagnostiske værktøjer i human medicin og kunne tilpasses til eksperimentelle formål til kalve 6-8 uger. De opnåede prøver var velegnet til både påvisning af patogener og karakterisering af sværhedsgraden af ​​lungebetændelse i værten.

Introduction

Værdierne af Heste Modeller i biomedicinsk forskning

I moderne tværfaglig biomedicinsk forskning, dyremodeller er stadig nødvendig for at belyse komplekse interaktioner - relateret til sundhed eller en sygdom status - inden pattedyrorganismer. Trods 17 Nobelpriser bliver uddelt til forskere, der undersøgte kvæg, heste, får eller fjerkræ som modeller for biomedicinsk forskning 1, er i dag langt størstedelen af dyreforsøg foretaget med gnavere, mens mindre end 1% af studierne arbejder med husdyr eller husdyr.

Små dyr giver mange praktiske fordele (dvs. lave omkostninger, genetisk formbarheds, high throughput, tilgængelighed af talrige genetiske og immunologiske værktøjer og sæt), og genetisk modificerede murine modeller er generelt accepteret at udføre mekanistiske undersøgelser opdage bestemte molekylære veje. Biomedicinsk forskning af komplekse systemer, than biologisk relevans og kliniske anvendelighed af musemodeller bliver mere og mere tvivlsom. De kunne være vildledende og bærer risikoen for oversimplificering af biologisk kompleksitet 2-9.

Grundet mellem arterne særheder, vil ingen enkelt dyrearter helt afspejle den menneskelige situation, og brugen af ​​mere end én model synes at være gavnligt i en tværfaglig biomedicinsk forskning tilgang. I forbindelse med translationel medicin, store dyr giver mulighed for at fungere som sammenlignende modeller leverer resultater med høj biologisk relevans af dobbelt anvendelse for både menneskers og dyrs sundhed 1.. Bemærkelsesværdigt er det humane genom mere lignede den bovine genom end genomet af gnavere. Det har også for nylig blevet bekræftet, at sammenlignet med andre taxa genomet af mus er meget mere omarrangeret 10-12.

I en kompleks undersøgelse design, brug af husdyr tilbyder unique mulighed for intra-individuelle, langsigtede undersøgelser af gentagen samling af en række prøver i vivo, fra en-og-the-samme individ, uden at ofre dyret. Derfor kan funktionelle, inflammatoriske og morfologiske ændringer overvåges i det samme emne i løbet af en vis periode 13.

Den Bovine Lung som en egnet åndedrætsværn Model

På grund af det høje antal af betydelige forskelle i lunge anatomi, respirationsfysiologi, og pulmonal immunologi, behøver mus ikke reproducere mange vigtige patofysiologiske aspekter af den menneskelige lungesygdom. Dette skal tages i betragtning, når du bruger dem som dyremodeller for respiratorisk sygdom 2,9,14-16. Selvom særegenheder anatomi og struktur findes for hver pattedyr lunge, funktionelle egenskaber (dvs. lungevolumener, luftmængder og respiratoriske mekanik) er bedre sammenlignelige mellem voksne mennesker og kalve skyldes lignende kropsvægt(50-100 kg).

De artsspecifikke karakteristika kvæglunger er opsummeret som følger: venstre lunge består af to lapper (lobus cranialis, som er opdelt i to segmenter, og lobus caudalis), mens den højre lunge består af fire lapper (lobus cranialis, lobus medius lobus caudalis og lobus accessorius). I modsætning til lunge anatomi fleste andre pattedyr, bronkie de rigtige kraniale lap grene direkte fra højre laterale side af luftrøret. Med hensyn til subgross anatomi bovin lunge viser en høj grad af lobulation og en høj procentdel af interstitiel væv 17,18, der fører til en relativt lav specifik lungeeftergivelighed og en højere pulmonic vævsmodstand 19. Derfor krævede vejrtrækning aktivitet er temmelig højt i forhold til andre arter 20,21. Den høje grad af lobulation fører til et stærkt uafhængighed segmenter. Således inflammatory processer er begrænset af bindevæv septa, og syge og sunde segmenter ofte ligge inden for samme lap. På grund af manglende sikkerhedsstillelse luftveje er den bovine lunge særligt velegnet til at afspejle obstruktiv lunge dysfunktioner 13. Vedrørende vaskulaturen i bovin lunge, de små pulmonale arterier viser meget fremtrædende glatte muskellag. Derfor kan kalven også tjene som en veletableret dyremodel for pulmonal hypertension eller vaskulær remodellering 22-24.

Med hensyn til luftvejsinfektioner, findes naturligt forekommende sygdomme hos husdyr, som deler mange ligheder med den tilsvarende sygdom hos mennesket. Typiske eksempler er kvægtuberkulose 25, respiratorisk syncytialvirus (RSV) infektioner hos kalve 26-28, eller naturligt erhvervet Chlamydia-infektioner 29. Således behøver store dyremodeller ligner situationen i den naturlige vært. Derfor er de fleste useful for at studere vært-patogen interaktioner og komplekset patofysiologi den tilsvarende sygdom hos mennesker 30,31.

Som en biologisk relevant model for respiratorisk Chlamydia psittaci infektion blev kalve valgt, fordi kvæg udgør naturlige værter for denne patogen 32-35. Oplysninger fra denne model med hensyn til patogenese af sygdommen eller mulige smitteveje mellem dyr og mennesker, vil bidrage til at udvide vores viden med virkning for både kvæg og mennesker. Modellen kan også hjælpe med at kontrollere generelt accepterede og alternative behandlingsmuligheder for afskaffelse af pulmonal C. psittaci infektioner, som er igen af interesse i både veterinær-og humanmedicin.

Teknikker, der anvendes til og Enheder fås fra Bovine Respiratory System

Dette papir beskriver og illustrerer de teknikker og diagnostiske metoder applicable til bovin lunge og anvendt i vores model til evaluering af både effekterne af patogenet på pattedyrs lunger og effektiviteten af ​​terapeutisk intervention.

Bronkoskopi er blevet udført i human medicin siden 1960'erne og betragtes som en sikker procedure 36.. Hos kalve blev eksperimentel bronkoskopi beskrevet i 1968 for første gang 37.. Den intrabronkial anvendelse af patogener blev foreslået af Potgieter et al. Som en pålidelig metode til at producere nedre luftveje sygdom hos kalve 38 og er nu en udbredt metode i kvæg forskning 34,39,40. Intrabronkial podning af en defineret mængde af patogenet under videoendoscopic kontrol giver mulighed for selektiv placering af smitstoffet i lungen. Dette fører til konsistente kliniske og patologiske fund i alle dyr 34 og tillader målrettet prøveudtagning af lunge regioner, som forventes at blive ændret som følge af patogen eksponering.

bronkoalveolærvaskevæsken (BALF) er en velbeskrevet indikator for tilstedeværelsen og sværhedsgraden af lungeinflammation. Bronchoalveolar lavage (BAL) er en standard procedure i human medicin til diagnose af en række luftvejssygdomme 41. I levende kvæg blev BAL introduceret af Wilkie og Markham i slutningen af halvfjerdserne i forrige århundrede 42.. Det blev betragtet som en sikker og reproducerbar teknik til at undersøge de nedre luftveje af kvæg. På grund af mangel på tilstrækkelige data om BALF parametre i sunde dyr i 1988 Pringle et al. Udførte BAL om sund kalve med en fleksibel fiberoptisk bronkoskop. Forfatterne påpegede også behovet for at standardisere BAL protokoller under eksperimentelle betingelser for at erhverve sammenlignelige resultater 43. BAL bruges stadig som en in vivo prøveudtagningsmetode i kalve 44-46.

Bronkial børstning er almindeligt anvendt i human medicin som endiagnostisk værktøj til at prøve neoplastiske læsioner eller til mikrobiologisk analyse 36. Til forskningsformål, kan primære cellekulturer af epitelceller høstet ved cytologisk børstning opnås 47. Hos kvæg er brugen af bronchiale tandbørstningerne til mikrobiologisk analyse er blevet beskrevet til at karakterisere mikrobielle miljø i lungen 43.

Transbronchial lunge biopsi giver lung vævsprøver og er et værdifuldt diagnostisk redskab for diffuse lungesygdomme hos mennesker. Iatrogen pneumothorax og procedure-relateret blødning er komplikationer forbundet med denne teknik. Deres forekomst er rapporteret til at være mindre end én procent i menneskelige patienter 48. Transbronkial lunge biopsi er ikke en fælles metode til brug i kvæg, på grund af de høje udgifter til det nødvendige udstyr og den nødvendige tid til at opnå biopsier. I stedet transkutane lunge biopsier er mere praktisk under feltforhold 49-51.

Protocol

Etiske retningslinjer
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med europæisk og national lovgivning til pleje og anvendelse af dyr. Protokollen blev godkendt af Udvalget om Etik af dyreforsøg og beskyttelse af dyr i delstaten Thüringen, Tyskland (Tilladelsens nummer: 04-004/11). Alle forsøg blev udført under tilsyn af den autoriserede institutionelle Agent for Animal Protection. Bronkoskopi var strengt udføres under generel anæstesi. I løbet af undersøgelsen, blev alle bestræbelser på at minimere ubehag eller lidelse.

Generelle bemærkninger
De beskrevne teknikker er blevet udviklet til kalve med ca 6-8 uger gamle, vejer omkring 60-80 kg. Til brug i andre store dyrearter eller kalve forskellige i alder og legemsvægt skal teknikkerne tilpasses til størrelse og vægt og tage hensyn til lungen anatomi bestemte dyrearter. Alleudstyr, der anvendes, skal være sterile. Chlamydia psittaci er en zoonotisk bakterie, som kan forårsage respiratoriske og almindelige sygdom hos mennesker. Den ikke-aviær C. psittaci stamme DC15 anvendt i denne protokol, skal håndteres under biosikkerhed niveau 2. Alt arbejde med patogenet og med inficerede dyr skal udføres iført personlige værnemidler, såsom en respirator, et stænk vandtæt jumpsuit, gummistøvler og handsker. Bære en passende respirator er af stor betydning, idet den naturlige rute for infektion for C. psittaci er AeroGen. Emballering og mærkning af prøver skal være desinficeringsikkert da alle ting skal behandles med et desinfektionsmiddel effektiv mod chlamydia i henhold til fabrikantens anvisninger, før de forlader stalde enhed.

1.. Forberedelse af Animal for bronkoskopi

  1. Bestemme vægten af ​​læggen for dosering af anæstetika.
  2. Placer en intravenøs (IV) til rådighed in venstre halsvene.
  3. Først langsomt injicere xylazin (0,2 mg / kg legemsvægt) i løbet af ca 30 sekunder, så efter sedation forekommer, injiceres ketamin (2,0 mg / kg legemsvægt).
  4. Løft dyret på bordet og placere den i højre sideleje. Når dyret er tilstrækkeligt placeret på bordet, kontrollere, om IV-adgang er stadig på plads og juster den om nødvendigt. Under anæstesi, regelmæssigt kontrollere øjenlåget refleks at bestemme dybden af ​​anæstesi.
  5. Når dyret trækker vejret støt, har nogen trække tungen ud og strække halsen. Placer et metalrør spekulum i dyrets mund, ved hjælp af små roterende bevægelser. Skub spekulum fremad under synet kontrol, ved hjælp af en lommelygte, indtil strubehovedet er synlig.
  6. Opretholde anæstesi hele endoskopisk procedure ved injektion af en bolus 7 mg xylazin og 70 mg ketamin efter behov.

. 2. indsprøjtning (podning Sites: Figur 1)

  • Forbered 3 sprøjter med inokulum, der indeholder 1, 2, og 5 ml inoculum.
  • Indsæt en Teflon slange i endoskopets arbejder kanal. Røret må ikke rage ud fra endoskopets spids.
  • Sæt endoskopet gennem metal speculum. Let justering af spekulum kan være nødvendigt at muliggøre vedtagelsen af ​​strubehovedet. Bronkie trachealis, som grene ud til højre side, hjælper med at tilpasse billedet på skærmen.
  • Sæt sprøjten med 5 ml inokulum til udgangen af ​​Teflon røret. Naviger røret i grenene hvor inokulum deponeres og anvende den ønskede mængde (højre lunge: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml og 1,0 ml Venstre lunge: Lobus cranialis, Pars cranialis : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Sæt sprøjten med 1 &# 160; ml inokulum til røret, derefter navigere til Bronkie trachealis og deponere inoculum (Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml). Det er nyttigt at altid henvende sig lokaliseringer i samme rækkefølge.
  • Fjern endoskopet og speculum.
  • Spray 1 ml inoculum i hvert næsebor med en aktuator.
  • Bring dyret tilbage til stalden og placere den i bugleje til at vågne op. Lad ikke dyret uden opsyn eller i selskab med andre dyr, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Opsvinget stabilt bør være air-condition, da dyrets evne til varmeregulering er faldet under generel anæstesi.
    BEMÆRK: De første kliniske tegn bør ske omkring 24-36 timer efter podning, afhængig af patogenet anvendes.
  • . 3 PRØVETAGNINGSMETODER (prøveudtagningssteder: Figur 2)

    1. Forbered dyret som beskrevet i trin 1,1-1,6.
    2. Bronchoalveolær lavage
      1. Sæt 5 sprøjter hver indeholder 20 ml sterilt isotonisk saltvand, i et vandbad, og give dem mulighed for at varme op til ca 38 ° C.
      2. Indsæt en udskylning kateter ind endoskopets arbejder kanal, derefter indsætte endoskopet ind i metallet spekulum og navigere frem til det vigtigste bronkier af venstre lunge, indtil "kile position" er nået, når endoskopet ikke kan skubbes yderligere forude.
      3. Den ene efter den anden, vedhæfte sprøjter med den varme NaCl-opløsning til udskylning kateter, indgyde væsken og opsug det direkte. Bronkoalveolærvaskevæsken skal opbevares i siliconiserede glasflasker og lagt på is straks efter opsving til at forhindre, at de alveolære makrofager at binde sig til glasoverfladen. Bemærk både mængden af ​​inddryppet saltvand, og mængden af ​​opsamlede fluid.
      4. Fjern udskylning katetret arbejdskanalen.
    3. Bronkial børstning
      1. Navigere endoskopet til den ønskede placering prøveudtagning, i den beskrevne protokol er dette Bifurcatio tracheae.
      2. Dæk børsten med røret, inden du sætter den ind i endoskopets arbejder kanal, indtil børsten tip vises på skærmen.
      3. Skub børsten med plastrøret fremad omkring 5 cm og afdække det fra plastrør ved at skubbe håndtaget, derefter navigere til det sted, som er at blive børstet.
      4. Gnid off epitelial opkald ved forsigtigt at skubbe og trække penslen frem og tilbage, mens du navigerer endoskopet for at sikre kontakt mellem børsten og væggen af ​​bronkie. Stop gnide når der opstår blødning. Dæk børsten med røret, inden du trækker det ud af den arbejdende kanal.
      5. Forbered op til fem udstrygninger på objektglas ved forsigtigt at rulle penslen hen over diaset. Fiksere udstrygninger i kold methanol i 10 min, lufttørring og opbevares ved -20 ° C.
      6. Børsten kan skylles iforskellige medier, afhængigt af formålet af cellerne i stikprøven. Hvis du tager flere tandbørstningerne med den samme pensel, skal du sørge for kun at skylle det i medierne, som ikke irriterer slimhinden.
    4. Transbronkial lunge biopsi
      1. Naviger endoskopet til den ønskede placering prøvetagning, i den beskrevne protokol er dette Pars caudalis af Lobus cranialis. Før du sætter biopsitang i arbejdsmiljøet kanal åbner og lukker det et par gange for at sikre, at det fungerer gnidningsløst.
      2. Skub biopsitang i de caudale gren af bronkie trachealis indtil en svag modstand opstår. Træk tilbage 2-3 cm, åbne pincet, skub ca 2 cm, luk pincet, trække sig tilbage og fjerne tang fra den arbejdende kanal. Det kræver en del træning.
      3. Fjern forsigtigt væv fra biopsi pincet, ved hjælp af en nål eller små pincet. Afhængig af den videre anvendelse af vævet, skal den opbevares i flydende nitrogen eller en passende fiksering medium. Dette bør ske lige efter fjernelse for at forhindre autolytisk processer.
    5. Post-proceduremæssige behandling
      1. Bring dyret tilbage til stalden og placere den i bugleje til at vågne op. Lad ikke dyret uden opsyn eller i selskab med andre dyr, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Opsvinget stabilt bør være air-condition, da dyrets evne til varmeregulering er faldet under generel anæstesi.
      2. Overvåg dyret nøje for tegn på pneumothorax for de næste 24 timer. Giv foder og frisk vand, når dyret har genvundet fuld bevidsthed.

    Representative Results

    Sygdomsforløb

    Effekten af ​​patogenet på dyrenes sundhed kan vurderes ved klinisk undersøgelse. I vores luftvejsinfektion modeller blev dyrene undersøgt to gange dagligt, og kliniske observationer blev registreret ved hjælp af et pointsystem. Yderligere oplysninger blev taget til fange ved at udføre andre in vivo prøvetagningsmetoder, fx indsamling af blod og vatpinde eller lungefunktion måling. Patologiske undersøgelser blev udført på forskellige tidspunkter efter podning til at beskrive forløbet af infektionen 32-34.

    BALF Recovery Rate

    Genfindelsesprocenten af ​​indpodet væske var 83,05 ± 4,58% (gennemsnit ± SD).

    Patogen Detection

    Genopdyrkning af patogenet kan udføres fra bronchiale tandbørstningerne. Også, PCR-screening af forskellige prøver er muligt at detektere patogenet, fx tissue biopsi, cytologi penseleksemplet, BALF-celler 52 eller svælg podning. Visualisering af patogenet er mulig ved at udføre immunohistokemi af frosne sektioner af lunge biopsier og sedimentation forberedelsen af BALF-celler (figur 3). I tidligere forsøg blev PCR af blodprøver og podninger (konjunktival, fækal, nasale), udført for at karakterisere spredning og afgivelse af patogenet 32.

    Markører for lokal inflammation af lungevæv

    I BALF kan forskellige parametre for lungeinflammation undersøges. Den totale celletælling og andelen af ​​neutrofiler normalt øges, når lunge inflammation er til stede. For celledifferentiering kan bundfældningstanke præparater af BALF-celler farves efter Giemsa og differentieret bruge olie nedsænkning (Figur 4). Cellulære og flydende andele af BALF adskilles ved centrifugering (300 x g, 20 min.) Den BALF-Supernatant indeholder forskellige markører, der skifter i løbet af inflammatoriske processer i lungerne og kan studeres under eksperimentelle betingelser. Eksempler er total protein og eicosanoids 29,34.

    En skematisk oversigt over potentielle yderligere anvendelse af de beskrevne prøver, er vist i figur 5.

    Figur 1
    Figur 1.. Scheme af kvæg lunge med podning sites (gul). Tallene angiver den rækkefølge, som inokulum administreres i de forskellige bronkier. R: højre; L: venstre. Højre lunge: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 Lobus caudalis: 0,5 ml og 4 1,0 ml; Venstre lunge: Lobus cranialis, Pars cranialis: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml.

    Figur 2
    . Figur 2. Skema af kvæg lunge med podning sites (gul) og prøveudtagningssteder: bronchoalveolær lavage (blå), bronkial børstning (grøn) og lunge biopsi (orange) Bemærk, at alle prøverne tages fra regioner, hvor patogenet blev deponeret. før. R: højre, L: venstre.

    Figur 3
    Fig. 3. a) Lung biopsi fra en kalv inokuleret med Chl amydia psittaci 4 dage efter podning (dpi), b) cellulær sedimentet i BALF fra en kalv podet med C. psittaci 9 dpi. Immunhistokemisk mærkning chlamydier. Chlamydia inklusioner (pile) er til stede i lungen (a) og i alveolære makrofager (B). Hæmatoxylin kontrastfarve.

    Figur 4
    Figur 4.. Cellulær sedimentet i BALF fra en kalv podet med C. psittaci 9 dpi. makrofager (#) er den fremherskende celletype i BALF. Mængden af ​​neutrofile granulocytter (*) stiger, når inflammatoriske processer er til stede. Modificeret Pappenheim farvning.

    es.jpg "width =" 600 "/>
    Figur 5.. Mulige metoder til prøveforberedelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    En bronkoskopiske fremgangsmåde til podning blev udviklet og forskellige bronkoskopiske prøveudtagnings blev indrettet til at anvendes i store dyr under forsøgsbetingelser. De beskrevne teknikker er nemme at lære, selv for eksaminatorer med lidt erfaring i endoskopi. Processen bronkoskopi er minimalt invasiv, og ingen bivirkninger forbundet med de metoder inokuleringen, samt de beskrevne prøveudtagnings (BAL, transbronkial lunge biopsi, bronchial børstning), blev set i nogen af ​​dyrene. De komplikationer forbundet med transbronkial lunge biopsier i mennesker er blødning og pneumothorax 48, ingen af disse blev set i de kalve, der undergik denne procedure. Den transbronkial lunge biopsi er mere tidskrævende og kræver mere udstyr, end det transkutan metode, men det er mindre invasiv og ikke bærer risikoen for sårinfektion.

    Visuelt kontrolleret endoskopisk metode inoculation tillader aflejring af en defineret mængde patogen på specifikke steder i lungerne. Således resulterer det i meget konsistente kliniske og patologiske fund i alle inokulerede dyr 32-34. Imidlertid betyder det ikke ligne alle funktioner i naturlig infektion hos kalve. I en model af en respiratorisk C. psittaci infektion, den beskrevne teknik til podning førte til lungelæsioner forbundet med de steder patogen placering 34, mens der i naturligt infektioner kalve normalt udvikle lungebetændelse af de apikale lapper. Dette faktum skal der tages i betragtning ved fortolkningen relevansen af ​​eksperimentelle resultater i forbindelse med naturlige erhvervede lungeinfektioner hos kvæg.

    Videoendoscopic BAL tillader prøveudtagning et defineret område af lungen. Til eksperimentelle formål, er dette en fordel i forhold til brugen af ​​en nasal kateter under blinde forhold. På grund af anatomien af ​​bovin lunge ville blindt indsat kateter blive skubed til højre diafragmatiske lap i de fleste tilfælde 53,54 og undersøgeren ikke har nogen indflydelse på det område af lungen, der er udskyllet. En anden fordel ved den endoskopiske BAL i bedøvede kalve i sideleje er den høje gennemsnitlige recovery rate på indpodet væske på mere end 80%. En sammenligning med andre undersøgelser afslører, at i stående, sederet kalve, en genopretning af 133,3 ± 1,6 ml 46 og 127,13 ± 3,53 ml 45 efter instillation af 240 ml væske i de caudale lap rapporteres. I sederet kalve 51% af indpodet væske i brystleje kunne udvindes fra kranie lap og 62% fra den caudale lap 43. Det betyder, at cirka halvdelen af ​​indpodet væske kunne nyttiggøres i opretstående stilling kalven. Afhængigt af mængden af ​​BALF behov for yderligere prøveforberedelse, kan det ikke efterlade nok materiale til at udføre alle ønskede eksperimenter. BAL hos kvæg er blevet brugt af mange forskningsgrupper og mangeforskellige parametre er blevet undersøgt under forskellige forhold. De fleste forfattere udførte udskylning af de basale lapper 43,45,46, men mængden af væske, der anvendes til udskylning forskellig mellem forskergrupper. Dette fører til manglende konsekvens i en udvanding af de genvundne celler, proteiner og andre stoffer, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne resultaterne fra forskellige publikationer. Derfor til anvendelse i kvæg anbefales det at udskylning med fem fraktioner af 20 ml (dvs. 100 ml i alt) kroppen varm, isotonisk saltvand, som er inddrevet umiddelbart efter inddrypning. Ved anvendelse af en udskylning kateter med en stor diameter (dvs.> 2 mm) skal steg lidt, afhængigt af mængden af væske, der vil forblive i katetret volumenet af hver fraktion.

    Den meget segmenteret anatomi kvæglunger fører til en metodisk begrænsning; resultater fra en del af lungen, kan ikke være tilfældet for resten af ​​lungen. Da der ikke er nogensynet kontrol over hele lungen området aftestede af transbronkial biopsi og udskylning, kan sagsbehandleren ikke, om de områder, der indgik i stikprøven var sunde eller syge. Derfor er det meget vigtigt at prøve steder, hvor patogenet blev inokuleret før for at have en højere recovery rate af patogenet, og til at have en højere mulighed for prøveudtagning syge lunge områder. En anden begrænsning er den øgede bedøvelsesmiddel risiko hos dyr af dårlig klinisk tilstand. De beskrevne metoder bør kun anvendes i modeller af mild til moderat sygdom at holde byrden for dyrene så lave som muligt. Generel anæstesi hos drøvtyggere skal altid holdes så kort som muligt, da udviklingen gas i vommen øger bedøvelsesmiddel risiko i disse arter. Dyrene skal anbringes i liggende stilling umiddelbart efter bronkoskopi at tillade udstrømning af den udviklede gas og skal overvåges nøje, indtil de er fuldstændigt inddrevet fra anæstesi. Også de beskrevne teknikker er ikke SuitaBle for prøvetagning med mindre end 24 timer.

    Den beskrevne protokol kan tilpasses til andre smitstoffer. Endoskopisk podning af forskellige patogener er blevet beskrevet, såsom C. psittaci 32-34, Pasteurella haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55 og bovin virus diarré virus 44.. Desuden kan de steder patogen deponering i lungerne tilpasses til den ønskede model. Når du vælger de prøveudtagningssteder, skal der tages hensyn til nogle vigtige fakta: bør vælges (i) Stikprøve sites baseret på placeringen af ​​podning og om de forventede patologiske fund. (Ii) Hvis obduktion skal udføres pleje skal tages for at efterlade nok unsampled lungeområder til ex vivo prøveudtagning. (Iii) skal vælges prøveudtagningssted steder, så de kan nås med udstyret. Især for transbronkial lunge biopsi, der er begrænsninger på grund af længden af ​​biopsitang. (Iv) Than ordre af stikprøver er vigtigt, bronchial børstning og transbronkial lunge biopsi kan føre til mindre blødning, som kan forurene BALF. Derfor BALF skal altid indhentes først. Ved brug af protokollen i andre arter, skal artsspecifikke lunge anatomi tages i betragtning.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at afsløre.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Veterinary Video Endoscope Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany PV-SG 22–140 diameter: 9 mm, working channel: 2.2 mm, working length 140 cm
    Lavage catheter Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany diameter: 2 mm; length: 180 cm, Luer-lock-adapter
    Actuator WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Germany 32660 length: 60 mm
    Biopsy forceps Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany REF 60180LT 1.8 mm, serrated, oval
    Omnifix 20 ml, Luer-Lock B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4617207V
    Cytology brush mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany 110240-10 working length 180 cm, brush length: 15 mm, diameter 1.8 mm
    iv acess Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 370-211 diameter: 1.2 mm; length: 43 mm
    Rompun 2% (xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 0.2 mg/kg bodyweight
    Ketamin 10% (ketamine) bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany 2.0 mg/kg bodyweight
    Isotonic saline solution B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
    SUB 6 waterbath CLF analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker, Germany n/a
    Metal tube speculum n/a n/a diameter: 3.5 cm; length: 35 cm
    Flashlight n/a n/a
    Siliconized glass bottles n/a n/a siliconize with Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
    Omnifix Luer 3 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616025V
    Omnifix Luer 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 4616057V
    Sealing plugs Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany 900-3057
    Inoculum n/a dilute pathogen in 8 ml buffer

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ireland, J. J., Roberts, R. M., Palmer, G. H., Bauman, D. E., Bazer, F. W. A commentary on domestic animals as dual-purpose models that benefit agricultural and biomedical research. Journal of animal science. 86, 2797-2805 (2008).
    2. Persson, C. G. Con: mice are not a good model of human airway disease. American journal of respiratory and critical care medicine. 166, 6-7 (2002).
    3. Haley, P. J. Species differences in the structure and function of the immune system. Toxicology. 188, 49-71 (2003).
    4. Hein, W. R., Griebel, P. J. A road less travelled: large animal models in immunological research. Nature reviews. Immunology. 3, 79-84 (2003).
    5. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
    6. Elferink, R. O., Beuers, U. Are pigs more human than mice. Journal of hepatology. 50, 838-841 (2009).
    7. Jawien, J., Korbut, R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. 61, 647-650 (2010).
    8. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3507-3512 (2013).
    9. Pabst, R. Allergy and Allergic Diseases. 1, (2009).
    10. Bovine Genome, S., et al. The genome sequence of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science. 324, 522-528 (2009).
    11. Tellam, R. L., et al. Unlocking the bovine genome. BMC genomics. 10, 193 (2009).
    12. Graphodatsky, A. S., Trifonov, V. A., Stanyon, R. The genome diversity and karyotype evolution of mammals. Molecular cytogenetics. 4, 22 (2011).
    13. Kirschvink, N., Reinhold, P. Use of alternative animals as asthma models. Current drug targets. 9, 470-484 (2008).
    14. Coleman, R. A. Of mouse and man--what is the value of the mouse in predicting gene expression in humans. Drug discovery today. 8, 233-235 (2003).
    15. Kips, J. C., et al. Murine models of asthma. The European respiratory journal. 22, 374-382 (2003).
    16. Coraux, C., Hajj, R., Lesimple, P., Puchelle, E. In vivo models of human airway epithelium repair and regeneration. European Respiratory Review. 14, 131-136 (2005).
    17. McLaughlin, R. F., Tyler, W. S., Canada, R. O. A Study of the Subgross Pulmonary Anatomy in Various Mammals. American Journal of Anatomy. 149-165 (1961).
    18. Robinson, N. E. Some functional consequences of species differences in lung anatomy. Adv Vet Sci Comp Med. 26, 1-33 (1982).
    19. Lekeux, P., Hajer, R., Breukink, H. J. Effect of Somatic Growth on Pulmonary-Function Values in Healthy Friesian Cattle. Am J Vet Res. 45, 2003-2007 (1984).
    20. Veit, H. P., Farrell, R. L. The anatomy and physiology of the bovine respiratory system relating to pulmonary disease. Cornell Vet. 68, 555-581 (1978).
    21. Gallivan, G. J., McDonell, W. N., Forrest, J. B. Comparative pulmonary mechanics in the horse and the cow. Res Vet Sci. 46, 322-330 (1989).
    22. Hunter, K. S., et al. In vivo measurement of proximal pulmonary artery elastic modulus in the neonatal calf model of pulmonary hypertension: development and ex vivo validation. Journal of applied physiology. 108, 968-975 (2010).
    23. Stenmark, K. R., et al. Severe pulmonary hypertension and arterial adventitial changes in newborn calves at 4,300 m. Journal of applied physiology. 62, 821-830 (1987).
    24. Tian, L., et al. Impact of residual stretch and remodeling on collagen engagement in healthy and pulmonary hypertensive calf pulmonary arteries at physiological pressures. Annals of biomedical engineering. 40, 1419-1433 (2012).
    25. Van Rhijn, I., Godfroid, J., Michel, A., Rutten, V. Bovine tuberculosis as a model for human tuberculosis: advantages over small animal models. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 711-715 (2008).
    26. Otto, P., et al. A model for respiratory syncytial virus (RSV) infection based on experimental aerosol exposure with bovine RSV in calves. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 19, 85-97 (1996).
    27. Gershwin, L. J., et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 16, 1225-1236 (1998).
    28. Gershwin, L. J. Immunology of bovine respiratory syncytial virus infection of cattle. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 35, 253-257 (2012).
    29. Jaeger, J., Liebler-Tenorio, E., Kirschvink, N., Sachse, K., Reinhold, P. A clinically silent respiratory infection with Chlamydophila spp. in calves is associated with airway obstruction and pulmonary inflammation. Veterinary research. 38, 711-728 (2007).
    30. Martinez-Olondris, P., Rigol, M., Torres, A. What lessons have been learnt from animal models of MRSA in the lung. The European respiratory journal. 35, 198-201 (2010).
    31. Sadowitz, B., Roy, S., Gatto, L. A., Habashi, N., Nieman, G. Lung injury induced by sepsis: lessons learned from large animal models and future directions for treatment. Expert review of anti-infective therapy. 9, 1169-1178 (2011).
    32. Ostermann, C., et al. Infection, Disease, and Transmission Dynamics in Calves after Experimental and Natural Challenge with a Bovine Chlamydia psittaci Isolate. PloS one. 8, (2013).
    33. Ostermann, C., Schroedl, W., Schubert, E., Sachse, K., Reinhold, P. Dose-dependent effects of Chlamydia psittaci infection on pulmonary gas exchange, innate immunity and acute-phase reaction in a bovine respiratory model. Vet J. 196, (2012).
    34. Reinhold, P., et al. A bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection: challenge dose titration. PloS one. 7, (2012).
    35. Reinhold, P., Sachse, K., Kaltenboeck, B. Chlamydiaceae in cattle: commensals, trigger organisms, or pathogens. Vet J. 189, 257-267 (2011).
    36. Dionisio, J. Diagnostic flexible bronchoscopy and accessory techniques. Revista portuguesa de pneumologia. 18, 99-106 (2012).
    37. Hilding, A. C. Experimental bronchoscopy: resultant trauma to tracheobronchial epithelium in calves from routine inspection. Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol. 72, 604-612 (1968).
    38. Potgieter, M. M., Hopkins, F. M., Walker, R. D., Guy, J. S. Use of fiberoptic bronchoscopy in experimental production of bovine respiratory tract disease. Am J Vet Res. 45, 1015-1019 (1984).
    39. Ackermann, M. R., Kehrli Jr, M. E., Brogden, K. A. Passage of CD18- and CD18+ bovine neutrophils into pulmonary alveoli during acute Pasteurella haemolytica pneumonia. Veterinary pathology. 33, 639-646 (1996).
    40. Malazdrewich, C., Ames, T. R., Abrahamsen, M. S., Maheswaran, S. K. Pulmonary expression of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 in the acute phase of bovine pneumonic pasteurellosis. Veterinary pathology. 38, 297-310 (2001).
    41. Wells, A. U. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in diffuse parenchymal lung disease. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society. 19, 237-241 (2010).
    42. Wilkie, M. R. Sequential titration of bovine lung and serum antibodies after parenteral or pulmonary inoculation with Pasteurella haemolytica. Am J Vet Res. 40, 1690-1693 (1979).
    43. Pringle, J. K., et al. Bronchoalveolar lavage of cranial and caudal lung regions in selected normal calves: cellular, microbiological, immunoglobulin, serological and histological variables. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 52, 239-248 (1988).
    44. Silflow, R. M., Degel, P. M., Harmsen, A. G. Bronchoalveolar immune defense in cattle exposed to primary and secondary challenge with bovine viral diarrhea virus. Veterinary immunology and immunopathology. 103, 129-139 (2005).
    45. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Caswell, J. L. Alterations in the bovine bronchoalveolar lavage proteome induced by dexamethasone. Veterinary immunology and immunopathology. 118, 283-293 (2007).
    46. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Siwicky, M., Caswell, J. L. Stress alters the cellular and proteomic compartments of bovine bronchoalveolar lavage fluid. Veterinary immunology and immunopathology. 125, 111-125 (2008).
    47. Lordan, J. L., et al. Cooperative effects of Th2 cytokines and allergen on normal and asthmatic bronchial epithelial cells. J Immunol. 169, 407-414 (2002).
    48. Tukey, M. H., Wiener, R. S. Population-based estimates of transbronchial lung biopsy utilization and complications. Respiratory medicine. 106, 1559-1565 (2012).
    49. Braun, U., Estermann, U., Feige, K., Sydler, T., Pospischil, A. Percutaneous lung biopsy in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association. 215, 679-681 (1999).
    50. Burgess, B. A., et al. The development of a novel percutaneous lung biopsy procedure for use on feedlot steers. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 75, 254-260 (2011).
    51. Sydler, T., Braun, U., Estermann, U., Pospischil, A. A comparison of biopsy and post-mortem findings in the lungs of healthy cows. Journal of veterinary medicine. A, Physiology, pathology clinical medicine. 51, 184-187 (2004).
    52. Voigt, K., et al. PCR examination of bronchoalveolar lavage samples is a useful tool in pre-clinical diagnosis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte). Research in Veterinary Science. 83, 419-427 (2007).
    53. Caldow, G. Bronchoalveolar lavage in the investigation of bovine respiratory disease. In Practice. 1, 41-43 (2001).
    54. Heilmann, P., Müller, G., Reinhold, P. Bronchoscopy and Segmental Bronchoalveolar Lung Lavage of Anesthetised Calf. Monatsh. Veterinärmed. 43, 79-84 (1988).
    55. Gogolewski, R. P., et al. Protective ability and specificity of convalescent serum from calves with Haemophilus somnus pneumonia. Infection and immunity. 55, 1403-1411 (1987).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics