מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Heme משמש כקבוצה התותבת למגוון רחב של חלבונים המכונים hemoproteins, כגון המוגלובין, מיוגלובין וcytochromes. הוא מעורב בתהליכים מולקולריים ותאיים שונים כגון שעתוק הגנים, תרגום, התמיינות תאים וחלוקה של תאים. רמות ביוסינתזה של heme להשתנות על פני רקמות שונות וסוגי תאים ומשתנות בתנאים חולים כגון אנמיה, נוירופתיה וסרטן. טכניקה זו משתמשת [4 14 C] חומצת 5-aminolevulinic ([14 C] 5-ALA), אחד מהמבשרים המוקדמים במסלול ביוסינתזה heme כדי למדוד את הרמות של סינתזת heme בתאי יונקים. assay זה כרוך דגירה של תאים עם [14 C] 5-עלא ואחרי חילוץ של heme ומדידה של הרדיואקטיביות שולבה heme. הליך זה הוא מדויק ומהיר. שיטה זו מודדת את הרמות היחסית של ביוסינתזה heme ולא מוחלט תוכן heme. כדי להדגים את השימוש בtechn זהique הרמות של ביוסינתזה heme נמדדו בכמה שורות תאי יונקים.

Introduction

Heme, קומפלקס של ברזל ברזלי ותשיעי protoporphyrin הוא מולקולה מרכזית להובלה וניצול חמצן באורגניזמים כמעט כל חיים 1-3. המבנה הייחודי של heme מאפשר לו לתפקד כנשא של גזים ואלקטרונים דו אטומיים, כמו גם לבצע פעולות שונות אחרות 1-5. לדוגמא, heme נקשר לחמצן בהמוגלובין ומיוגלובין להעברה והאחסון של 6,7 חמצן. זה עובד גם כמוביל אלקטרון בcytochromes במהלך נשימה ומשמש כתורם אלקטרונים לתגובות חמצון-חיזור מזורזות על ידי אנזימי ציטוכרום P450 8,9. אחת התכונות החשובות ביותר של heme הוא ש, הוא יכול לשחק תפקידי פיקוח בתהליכים תאיים ומולקולריים כגון שעתוק הגנים, סינתזת חלבון ומייקרו-רנ"א biogenesis 4. לדוגמא, זה משפיע על השעתוק של גנים רבים על ידי שליטה על הפעילות של מדכאי תעתיק יונקים Bach1 וrec הגרעיני היונקיםeptor Rev-erbα 10-15. Heme מסדיר את הפעלת חלבון activator heme (האפ) 1 אשר ממלא תפקיד חשוב בהפעלה של גני המעורבים בנשימה ושליטה נזק חמצוני, בתגובה לheme או חמצן 16. Heme גם מסדיר שעתוק הגנים בתאים עצביים באמצעות גורם גדילה עצבית (NGF) איתות 3,17-20. זה גם מסדיר את סינתזת חלבון בתאי יונקים erythroid על ידי ויסות הפעילות של קינאז מוסדר heme eIF2α (HRI) 21-24. יתר על כן, heme משפיע על פעילותם של חלבוני איתות מפתח כגון טירוזין קינאז Jak2 וSrc, שהם חיוניים לתפקוד תאים תקין ו4,20,25 צמיחת תאים. נמצא כי בהלה עיכוב heme תאים גורם לעצירת מחזור התא והפעלה של סמנים הקשורים להזדקנות ומות תאים מתוכן 26. שני חסר הרן או הרמות הגבוהות של heme המשויכות השפעות בריאותיות חמורות בבני אדם 27. מולקולרי האחרוןND מחקרים אפידמיולוגיים הראו קשר חיובי של צריכת heme גבוהה וסיכון מוגבר למחלות, כגון סוכרת מסוג 2, מחלת לב כלילית וכמה סוגי סרטן, כולל סרטן הריאות, סרטן מעי גס וסרטן לבלב 27,28. בעזרת זוג תואם של המעבדה של המחברים תאי ריאה נורמלים והסרטן מצאו כי תאים סרטניים רמות גבוהות של צריכת חמצן, סינתזת heme וחלבונים המעורבים בספיגת heme וחמצן ניצול 28. מעניין לציין, עיכוב של סינתזת heme ירידה בצריכת חמצן, התפשטות, היווצרות הגירה ומושבה של תאים סרטניים 28. לפיכך, התנודות ברמות של heme אנדוגני ממלא תפקיד חשוב בויסות תהליכים מולקולריים ותאיים 3,4,28,29.

ביונקים, ביוסינתזה של heme מתרחשת בשמונה שלבים, הכולל אנזימים הממוקמים במיטוכונדריה וcytosol 4 (איור 1). biosyn hemeתזה מתחילה במטריצה ​​של המיטוכונדריה עם העיבוי של גליצין וsuccinyl-CoA ליצירת חומצת 5-aminolevulinic (5-ALA), מזורז על ידי synthase ALA (אבוי) 4,31. זהו שיעור הגבלת צעד בביוסינתזה heme בתאי nonerythroid. 5-ALA לאחר מכן ייצא לcytosol בי ארבעה הצעדים הבאים להתרחש כדי ליצור coproporphyrinogen III (CPgenIII), אשר לאחר מכן מיובא חזרה למיטוכונדריה, שבו הוא הופך לIX protoporphyrin (PPIX). לבסוף, מולקולה אחת של ברזל משולב לIX protoporphyrin (PPIX) לייצר heme, תגובה מזורזת על ידי ferrochelatase (FECH) 2,4.

רמת ביוסינתזה heme תלויה בעיקר ברמה של אנזים אבוי שנתונה לפיקוח הדוקה על ידי ברזל וheme 4 תאיים. ביוסינתזה של heme יכולה להיות מושפעת מפגמים גנטיים, זמינות של מינרלים מסוימים וויטמינים (למשל, ריבופלאבין, אבץ), חשיפה לרעלים (למשל, אלומיניום, עופרת), אנוקסיה, חום, ורמות של סטרואידים מסוימים (לדוגמא, אסטרוגן) 32-35. רמת סינתזת heme משתנה בתנאים חולים שונים. ביוסינתזה heme ירד יכולה לגרום לאנמיה, כמו גם מחלות נוירולוגיות 3,36. לחלופין, ביוסינתזה heme המוגברת ממלאת תפקיד חשוב בהתקדמות של סרטן מסוים 28,37. Heme הוכח להיות קריטי לצמיחה, הבידול וההישרדות של שומן יונקים, erythroid ותאים עצביים 4,38-41. לדוגמא, מחסור heme מוביל לנזק neurite בנוירונים בקליפת המוח עכבר העיקרי באמצעות העיכוב של גלוטמט NMDA (N -methyl-D-aspartate) קולטן 17. בנוסף, עיכוב של סינתזת heme גורם למות תאים מתוכנת בקרצינומה של צוואר רחם אפיתל אדם תאי הלה 26,41. לכן, מדידת רמות ביוסינתזה heme בתאים שונים בתנאים שונים חשובה ללימוד אטיולוגיה וprogressiבמחלות רבות.

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ורגישה למדידת הרמה של סינתזת heme תאית באמצעות חומצת 5-aminolevulic [4 14 C]. זוהי שיטה חלופית לשיטות אחרות באמצעות 55 או 59 Fe Fe. אנחנו מעדיפים להשתמש 14 C כי הקרינה שלה היא חלשה מאוד. לעומת זאת, הגנה חזקה נדרשת לעבודה עם איזוטופים פה. יתר על כן, בשיטה זו נועדה למדוד ולהשוות סינתזת heme בתאים שונים במקביל באופן מהיר. על מנת למדוד את רמות heme מוחלטות, ניתן להשתמש בשיטה שהוקמה בעבר בתחום השימוש בHPLC 42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

זהירות: בעת שעבדה עם רדיואקטיביות, לנקוט באמצעי זהירות מתאימה כדי למנוע זיהום של הנסיין והסביבה. השלך את כל הפסולת הבאה הנחיות בטיחות קרינה מקומיות.

1. הכנת תאים

  1. תאי זרע בצלחות 3.5 סנטימטר כך שconfluency מגיע 80% -90% ביום assay.
    1. שים לב שזריעת confluency לתאים תלויה בסוג התא וקצב הצמיחה שלהם. כאשר טיפול בתאים עם מגיב למספר מסוים של ימים, תאי זרע, כך שconfluency הוא 80% -90% ביום מדידת heme. אם מספר התאים המתקבלים מצלחות 3.5 סנטימטר אינו מספיק, השתמש 6 צלחות סנטימטר עם אותה הכמות של ALA רדיואקטיבי כמו בשלב הבא.
      הערה: שימוש בצלחות אישיות מומלצת כי זה קל יותר לטפל צלחות בודדות.
  2. יום לפני מדידת heme, להוסיף .1-0.3 μCi [14 C] 5-עלא וALA הקר להגיע ג סופיoncentration של 20 מיקרומטר של ALA המוחלט לכל מנה תרבות באזור העבודה מתאימה לעבודה עם חומרים רדיואקטיביים ולשים את הצלחות בחזרה לתוך החממה. באופן אידיאלי, דגירה עם ALA רדיואקטיבי במשך 16 שעות.
    הערה: radiolabeled 5-ALA הנדרש עשויים להשתנות בין שורות תאים. ספירה רדיואקטיביים לדקה (CPM) של לפחות 100 נדרש כדי למזער את השגיאה הקשורות לספירה. מומלץ לקבוע סכום מינימאלי של [14 C] 5-ALA נדרש לשורות תאים תחת מחקר. עבור רוב הניסויים .1-0.3 μCi מספיק כדי לקבל מדידה טובה. תוספת של ALA הקר היא אופציונלית.

2. הרן הפקה

  1. מניחים את הכלים תרבית תאים על קרח ולקחת אותם לאזור כשיר לעבודת רדיואקטיביות.
    1. לבצע את כל ההפקה ותהליך אידוי במכסת מנוע חסין פיצוץ. בגלל האתר מאוחסן יכול להתפוצץ, להשתמש באתר בבקבוקים קטנים ולהתאדות כל נוזלים שנותרו, לא שומר את אתר בבקבוק פתוח יותר מאחד בחודש. אין להשתמש באצטון ליד להבות ומחממים פתוחים כפי שהוא דליק מאוד. אצטון חנות המכיל חומרים כימיים בבקבוקי זכוכית כפי שהוא מתמוסס פלסטיק בתרבית רקמה.
  2. לשאוב את המדיום באמצעות פיפטה. לשטוף את תאים פעם אחת עם 1 מיליליטר של PBS הקר 1x. לשאוב את PBS.
  3. הוסף 1 מיליליטר של PBS הקר 1x לצלחות ולאסוף את התאים בחלק התחתון של הצלחת באמצעות שוטר גומי. להעביר את התאים שנאספו מכל צלחת לצינור מיליליטר 2 טרום צוננים שכותרת. לאסוף את כל התאים במ"ל 2 צינורות.
    הערה: השתמש שוטר גומי טרי לכל צלחת לגירוד תאים מכל צלחת. לכל צלחת היית דורש ארבעה 2 מיליליטר צינורות, צינור 1.5 מיליליטר ובקבוקון נצנץ.
  4. ספין ב15,000 XG דקות 1 ב 4 ° C.
  5. קח את PBS באמצעות פיפטה, לתת ספין קצר ולהסיר את PBS השייר. תאים גלולים בשל 1x PBS 100 μl. מערבולת כדי resuspend תאים ולשמור על קרח.
  6. קח 10 ו956 #; l מהשלב 5 ולהעביר צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולאחסן על קרח למדוד ריכוז חלבון.
    הערה: מאגר תמוגה תא יש להוסיף לתאים ושמר על קרח כדי למדוד ריכוז חלבון מאוחר יותר.
  7. ספין 90 μl שנותר מהשלב 5 בXG 5000 למשך 30 שניות ב 4 ° C; להסיר PBS באמצעות קצה פיפטה 200 μl לחלוטין.
  8. להוסיף 300 μl של חיץ חילוץ heme (ראה חומרי רשימה) על צינור אחד. אז מערבולת במשך 15 שניות כדי לערבב ולשים על קרח דק 1, לחזור על זה 3 פעמים.
    1. הוסף חוצץ מיצוי heme (HEB) ומערבולת הצינור במהירות לresuspend גלולה, לעשות רק אחד או שני צינורות בזמן, כי גלולה צריכה להיות resuspended במהירות מבלי שהשאיר בHEB במשך זמן רב מדי. ברגע שHEB מתווסף לכל הצינורות וגלולים הוא resuspended לאחר מכן בצע את מערבולת 15 שניות ודקות 1 במחזור הקרח כמו בשלב הערה 8. שגלולה לא יכולה ללכת לגמרי לHEB אם גלולה נותרת במאגר HEB ל עודזמן ולא resuspended במהירות.
  9. להוסיף 1.2 מיליליטר של אתר diethyl על צינור אחד ומערבולת למשך 30 שניות. ספין ב15,000 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: דיאתיל אתר נגמר טיפים פיפטה במהירות. כדי לשלוט בזה, אתר את diethyl פיפטה ולמטה פעם או פעמיים, בכך אעזור להחזיק את אתר diethyl בפיפטה. חזור על כל פעם שזה קצה פיפטה טרי משמש.
  10. העבר עליון שלב (אתר) עם פיפטה 1 מיליליטר לצינור microcentrifuge חדש. הוסף 0.5 מיליליטר של 2 N HCl, מערבולת לערבב וספין כמו בשלב 9.
    הערה: קשה לראות את ההפרדה בין שלבים ואתר HCl. לכן, להוסיף כמויות קטנות של Trypan כחול בפתרון 2 N HCl לשימוש במהלך הניסוי, מספיק כדי לתת לו צבע כחול חיוור. זה יעזור לי להבחין בין שני השלבים. השלב נמוך יותר יהיה כחול והשלב העליון האתר יהיה חסר צבע. מעבירים את שלב האתר חסר צבע העליון לצינור חדש וזורקים את השלב הנמוך HCl (הכחול).
  11. חזור על שלב 10 שנייותר פעמים כדי לשטוף את שלב האתר עם 2 N HCl. מעבירים את השלב העליון האתר רק לצינור חדש במהלך כל חזרה וזורקים את שלב HCl נמוך יותר.
  12. לאחר לשטוף השלישי עם HCl, להעביר את השלב העליון עם פיפטה 1 מיליליטר לבקבוקון נצנץ. ייבש את הדגימות על ידי מתאדה אתר diethyl על ידי שמירה על הדגימות בO מכסה המנוע הכימי / N.

3. מדידה של רדיואקטיביות

  1. למחרת, להוסיף 5 מיליליטר של נוזל נצנץ לדגימות מיובשות מצעד 2.12.
  2. לנער היטב כדי לערבב. מדוד את הרדיואקטיביות באמצעות מונה נצנץ.

4. חישובים

  1. Lyse תאים מצעד 2.6 באמצעות כמויות שווה של חיץ CelLytic M (ראו חומרי רשימה) וספין על 14,000 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. קח aliquot של supernatant ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת assay חלבון BCA.
    הסכום כולל של חלבון במ"ג (TP) = (90 μl קונצרט כלשהו *. של חלבון ב81; ז / μl) / 1000
    רמת heme סינתזה (רדיואקטיביות / TP) = pmol / מ"ג של חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו משמשת להשוואת הרמות של סינתזת heme בנורמלי (HBEC30KT) לעומת סרטן תאים (HCC4017) ריאות. איור 2 מראה על רמה גבוהה יותר של סינתזת heme בתאי סרטן (HCC4017) מאשר בתאים רגילים ריאות (HBEC30KT). רמת סינתזת heme נמדדה גם בתאים נורמלים וסרטניים בנוכחות ציאניד קרבוניל uncoupler 3-chlorophenylhydrazone המיטוכונדריה (CCCP). תאים שטופלו עם CCCP 10 מיקרומטר למשך 24 שעות לפני המדידה של רמות סינתזת heme. כצפוי, הרמות של סינתזת heme (איור 2) ירד בנוכחות CCCP בשני תאים נורמלים וסרטניים. זה כבר הראה בעבר כי סינתזת heme יכולה להיות מעוכבת על ידי אצטון succinyl (SA), מעכב חזק וספציפי של dehydratase החומצה 5-aminolevulinic (ALAD) שהוא האנזים השני במסלול biosynthetic heme 41. באמצעות שיטה זו, רמות סינתזת heme נמדדו בתאים הלה בנוכחות ושרירי הבטןence של 0.5 מ"מ SA. איור 3 מראה כי הרמות של סינתזת heme ירד ביותר מ 10-קפלים בנוכחות SA. כדי להדגים את השימוש בטכניקה זו נוספת, הרמות של סינתזת heme נמדדו והושוו בסרטן 4 ובשורות תאי HEK293T כפי שמוצגות באיור 4.

איור 1
איור 1. מסלול heme ביוסינתזה בבני אדם אבוי, 5-aminolevulinic synthase חומצה.; 5-ALA, חומצת 5-aminolevulinic; ALAD, ALA dehydratase; PBG, porphobilinogen; HMBS, synthase hydroxymethylbilane; HMB, hydroxymethylbilane; Uros, uroporphyrinogen III synthase; UPgenIII, uroporphyrinogen III; UROD, uroporphyrinogen decarboxylase; CPgenIII, coproporphyrinogen III; CPOX, coproporphyrinogen III מונואמין; PPgenIX, protoporphyrinogen התשיעי; PPOX, מונואמין התשיעי protoporphyrinogen; PPIX, protoporphyrin התשיעי; FECH, Ferrochelatase. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
קווי איור 2. הרמות של ביוסינתזה heme בנורמלי (HBEC30KT) וסרטן תאים (HCC4017), בהעדר ונוכחות של 10 מיקרומטר CCCP uncoupler המיטוכונדריה. רמת הרקע הייתה דומה לרמה של מדגם ריק (נוזל נצנץ לבד) וזה היה פחות מ -2% מהשליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. רמות של ביוסינתזה heme בתאי הלה שברירי בטןence ונוכחות של 0.5 מ"מ של אצטון succinyl מעכב סינתזת heme (SA). תאים שטופלו עם SA במשך 3 ימים לפני מדידת heme. רמת הרקע הייתה דומה לרמה של מדגם ריק (נוזל נצנץ לבד) וזה היה פחות מ -2% מהשליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
השוואת איור 4. הרמות של ביוסינתזה heme ב 4 שורות תאי סרטן וHEK293T. Assay בוצע בהתאם לפרוטוקול. HCC4017 גדל בACL4 תקשורת, A549 וH1395 בRPMI1640 בתוספת 5% FBS, HEK293T והלה DMEM בתוספת 10% FBS. לניתוח סטטיסטי, רמות סינתזת heme בתאי סרטן ותאי HEK293T הושוו לרמת סינתזת heme בHCC4017 תאים, באמצעות וולש 2-מדגם T-מבחן. **, עמ 'ערך <0.005. רמת הרקע הייתה דומה לרמה של מדגם ריק (נוזל נצנץ לבד) וזה היה פחות מ -2% מהשליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heme ממלא תפקיד מרכזי בדור של אנרגיה תאית באמצעות נשימה 26. חילוף החומרים heme שינה ידוע להיות קשורים למחלות שונות, כוללים סרטן 28,41. עיכוב של סינתזת heme ידוע כגורם לעצירת מחזור התא ואפופטוזיס בתאי הלה 26,41. הוכח שרמת סינתזה הגבוהה heme קשור ההתקדמות של תאי סרטן הריאות 28. לכן, זה יהיה בעל חשיבות רבה למדידת הרמות של ביוסינתזה heme בתאים בתנאים שונים. השיטה שנדונה כאן לא לכמת את הסכום הכולל של heme לכן, זה לא מספק את הערך המוחלט של heme הנמצא בתאים. יש מגוון של שיטות colorimetric וערכות זמינות כדי למדוד את הכמויות הכוללת של heme בתאים. לדוגמא, heme ניתן לחלץ מהתאים ומיטוכונדריה בתערובת של אצטון וHCl ומעורבב עם 50% (V / V) אצטוניטריל. לאחר מכן את התערובת ניתן ליישםלטור C18 Bondclone 3.9 x 300 מ"מ ואחריו elution של heme בשיפוע של אצטוניטריל מכיל 0.05% (V / V) חומצת trifluoroacetic וזיהוי תרכובות heme ב 400 44,45 ננומטר.

בעבר, כדי למדוד את הרמות של ביוסינתזה heme ברקמות של יונקים ותמציות תא [14 C] -glycine ו[ 14 C] 5 ALA שימש 46,47. למרות גליצין שכותרתו נכנס למסלול ביוסינתזה heme בצעד הראשון אך הוא רוקן את ידי מסלולי מטבוליים אחרים וכתוצאה מכך התאגדותה המוגבלת לheme. גליצין הוא לא המטבוליט ספציפי למסלול ביוסינתזה heme 48. מצד השני, שכותרתו 5-ALA הוא ספציפי למסלול ביוסינתזה heme. תכונה זו מקנה יתרון הכמותי של שימוש 5-עלא על גליצין 46,48,49. לכן, שימוש ב5-ALA רדיואקטיבי הוא שיטה יותר ספציפית ומדויקת למדוד ולהשוות את הרמות של ביוסינתזה heme.

רוב גצעדי ritical כדי לקבל תוצאות עקביות הם: 1) לוודא confluency התא לא הולך גבוהה יותר מ -100% ולא מתחת ל -70% על פני תנאים שונים; 2) הסכום של רדיואקטיביות הוסיף לכל צלחת צריך להיות זהה כי שיטה זו היא מאוד רגישה; 3) חיץ חילוץ heme לא צריך להיות ישן, מומלץ לעשות טרי בכל פעם. הנפח של הרדיואקטיביות הנדרשת לכל צלחת הוא קטן מאוד וקשה לשמור על הסכומים הזהים על פני הדגימות. לכן, מומלץ לעשות פתרון מניות עובד במדיום התרבות, אם משתמש באותו מדיום לכל הדגימות, ניתן להשתמש PBS אחר (שנאגרו מלוח פוספט). פתרון מניות עבודה יכול להיות מוכן בצורה כזאת, כי ההיקף לוותר לכל צלחת הוא מתחת לגיל 10 μl. כמו כן, כדי להיות מדויק יותר, הבינוני מהדגימות לשכפל לתנאי אחד יכול להילקח בצינור מיליליטר 50 וניתן להוסיף הכמויות המתאימות של רדיואקטיביות ממניות הפתרון עובד, אז לוותר בחזרה דואר כמויות qual של מדיום לצלחות. אם מספר התאים מוגבלים, כגון בתרבויות עיקריות, יכולה לשמש 12 גם צלחות או 24 גם לתרבות התאים ולהפחית את כמות הרדיואקטיביות הוסיפה לכל גם באופן יחסי.

פרוטוקול זה הוא פשוט, פשוט, ומספק אמצעים מדויקים של הרמות של סינתזת heme. לפעמים, זה עלול להיות קשה לresuspend תא גלולה במאגר חילוץ heme (שלב 2.8) לחלוטין. כדי להימנע מכך להיות מהירים בשלב 2.8, להוסיף למאגר חילוץ heme 1-2 דגימות בכל פעם, מערבולת ולשים אותם על קרח. ודא חיץ חילוץ heme הוא לא זקן מדי. אם סטיית התקן בין הדגימות לשכפל היא גבוהה מדי, לשים לב לשלבים הבאים: 1) PBS הוסר בשלב 2.7 לחלוטין; 2) להימנע משפיכת המדגם כאשר בשלב diethyl אתר, בצע את הקצה בשלב 2.9; 3) לוודא הרדיואקטיביות הוסיפה לכל צלחת וconfluency של הדגימות לשכפל היו זהה.

ss = "jove_content"> שימוש בשיטת 5-ALA רדיואקטיבי, הרמות של סינתזת heme הושוו כפי שמוצגים בעבר 28 בנורמלי nonmalignant (HBEC) לעומת סרטן תאים (HCC), שפותחו מאותו החולה. הטכניקה המתוארת כאן דורשת שימוש ב[ 14 C] 5-עלא, מבשר במסלול ביוסינתזה heme (איור 1), ומודדת את הרדיואקטיביות שולבה heme. בטכניקה זו, פורפירינים, כולל heme, הוצאו מהתאים בתערובת של אצטון, מרוכז HCl ו50,51 מים. Heme הופרד נוסף מפורפירינים ידי חילוץ באתר diethyl ושטיפת שלב האתר עם ​​2 N HCl 50,51. לאחר מכן, הרדיואקטיביות שולבה heme נקבעה באמצעות מונה נצנץ. יכולות להיות מנורמלות תוצאות על ידי הסכום הכולל של חלבון או מספר תאים. סינתזת heme בתאי הלה הייתה מעוכבת על ידי השימוש באצטון succinyl (SA) וירידה ברמה של סינתזת heme נצפה כטרום מוצגלציין 26 (איור 3).

שיטה זו שימושית מאוד להשוואה של הרמות של סינתזת heme בתנאים שונים או בין שורות תאים (איור 4). זה דורש מספר קטן של תאים ומספק מדידה והשוואה של הרמות של סינתזת heme בתאים שונים ספציפיות. זה אינו מיועד למדידה מדויקת של רמות heme מוחלטות בתאים. הוא משמש הטוב ביותר להשוות את הרמות של סינתזת heme בתאים בעלי תכונות שונות, כגון תאי סרטן שונים. בגלל קובלט, במקום ברזל, יכול להיות משולב בתוך heme בשלב האחרון של סינתזת heme ולחלץ 51, שיטה זו לא עשויה להניב השוואה מדויקת של סינתזת heme, אם תקשורת הצמיחה מכילה רמות של קובלט או יונים של מתכות אחרות שונות. יחד עם זאת, המסלול הסינתטי heme מחומצת 5-aminolevulinic לפורפירינים וheme הוא מאוד ספציפי, מדידת רמות השטף של כל pathway עשוי להיות מהורהר יותר של פעילות מטבולית רלוונטית לheme, ללא קשר ליוני המתכת. לעומת זאת, השיטה באמצעות 59 Fe מזהה רק את החלק של מסלול שילוב פה כדי ליצור heme 52. אמנם זה יותר ספציפי, בנוכחות הרמות משמעותיות של יונים של מתכות, רמות סינתזת heme זוהו עלולות שלא לשקף את פוטנציאל חילוף החומרים של תאים מסוימים, כגון תאים סרטניים. יתר על כן, פה יכול להיות מוחרם למקומות סלולריים אחרים ליד מיטוכונדריה לעשות heme. באופן כללי, אנו מאמינים כי השימוש ב[ 4 14 C] 5-ALA הוא שיטה מעשית יותר למדידת רמות heme כאשר משווים תאים שונים עם מאפיינים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgments

שורות תאי HCC4017 וHBEC30KT נמסרו באדיבות על ידי המעבדה של ד"ר ג'ון מינה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות ססיל ה 'ואידה הירוקה לד"ר לי ג'אנג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)
Acetone
Concentrated HCl
Water
25 ml
1.3 ml
5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Comments

1 Comment

  1. Could you please share where did you get the 14C-ALA?
    thanks a lot

    Reply
    Posted by: abel g.
    February 24, 2018 - 5:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics