포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Biology

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Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

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Abstract

헴은 헤모글로빈, 미오글로빈 및 사이토 크롬 등 hemoproteins로 알려진 단백질의 광범위한 보철 기로서 기능한다. 그것은 같은 유전자 전사, 번역, 세포 분화 및 세포 증식 등의 다양한 분자와 세포 과정에 참여하고있다. 헴 생합성 레벨이 다른 조직과 세포 유형에 걸쳐 다양하며, 빈혈, 신경 장애 및 암과 같은 질병 상태로 변경된다. 이 기술을 사용하여 [4- (14) C] 5- 아미노 레 불린 산 ([14 C] 5-ALA), 포유류 세포에서 헴 합성의 수준을 측정하는 헴 생합성 경로에서 초기 전구체 중 하나. 이 분석은 헴에 혼입 된 방사능의 측정 및 헴 추출하여 [14 C] 5-ALA를 가진 세포의 배양을 수반한다. 이 절차는 정확하고 신속하다. 이 방법은 헴 생합성의 상대적인 수준보다는 헴 총 함량을 측정한다. 이 TECHN의 사용을 설명하기 위해헴 생합성 수준 개새끼 것은 여러 포유 동물 세포주에서 측정 하였다.

Introduction

헴은 철 철과 프로토 포르피린 IX의 복잡한 수송 및 거의 모든 살아있는 유기체 1-3에 산소를 이용하기위한 중앙 분자이다. 헴의 독특한 구조는 이원자 가스 및 전자의 캐리어로서 기능 할뿐만 아니라, 다양한 다른 기능 1-5을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 헴 산소 -6,7-의 전송 및 저장을 위해 미오글로빈 헤모글로빈의 산소에 결합한다. 또한, 호흡시에 시토크롬 전자 캐리어로 작동과 시토크롬 P450 효소에 의해 촉매 8,9 산화 환원 반응에서 전자 공여체로서 작용한다. 헴의 가장 중요한 특징 중 하나는 이러한 유전자 전사, 단백질 합성 및 마이크로 RNA의 생합성과 같은 4 세포 및 분자 공정에서 규제 역할을 할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 포유류의 전사 리프레 Bach1의 활성 및 포유류 핵 REC를 제어함으로써 많은 유전자의 전사에 영향을 미치는eptor 목사 erbα 10 ~ 15. 헴 헴 또는 산소 (16)에 응답하여, 호흡 및 산화 적 손상의 제어에 관여하는 유전자의 활성화에 중요한 역할을 헴 활성제 단백질 HAP (1)의 작동을 조절한다. 헴 또한 3,17-20 시그널링 신경 성장 인자 (NGF)를 통한 신경 세포에서의 유전자 전사를 조절한다. 또한 헴 조절 eIF2α 키나아제 (HRI) 21-24의 활성을 조절함으로써 포유류 적혈구 세포에서 단백질 합성을 조절한다. 또한, 헴 적절한 세포 기능 및 세포 증식 4,20,25에 필수적인 티로신 키나제의 Src 릴화 Jak2과 같은 주요 신호 전달 단백질의 활성에 영향을 미친다. 그것은 헬라 세포의 헴 억제 노화 및 세포 사멸 (26)과 관련된 마커의 세포주기 정지 및 활성화가 발생하였습니다. 헴 결핍 또는 헴의 증가 수준은 모두 인간 27 심각한 건강에 미치는 영향과 관련이있다. 최근 분자ND 역학 연구는 높은 헴 섭취 양 협회 및 2 형 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환, 폐암, 대장 암, 췌장암 27,28 등 여러 암과 같은 질병의 위험 증가를 보여 주었다. 정상 및 폐 암 세포 저자 '랩의 짝을 사용하는 것이 암세포 산소 소비, 헴 합성 및 헴 흡수 및 산소 이용률 28에 관여하는 단백질의 수준이 증가 된 것을 발견 하였다. 흥미롭게도, 헴 합성의 억제는 산소 소비, 증식, 암 세포 (28)의 이동과 콜로니 형성을 감소시켰다. 따라서, 내인성 헴의 레벨 변동이 분자 세포 프로세스 3,4,28,29의 조절에 중요한 역할을한다.

포유 동물에서, 헴의 생합성은 미토콘드리아와 세포질 4 (그림 1)에있는 효소를 포함, 여덟 단계에서 발생합니다. 헴 biosyn논문 ALA 신타 (아아) 4,31 의해 촉매 5- 아미노 레 불린 산 (5-ALA)을 형성 글리신 및 숙시 닐 -CoA의 응축과 미토콘드리아의 행렬에서 시작된다. 이것은 nonerythroid 세포에서 헴 생합성에서 속도 제한 단계이다. 5-ALA는 다음 다음 4 단계를 다시는 프로토 포르피린 IX (PPIX)로 변환되어 미토콘드리아로 가져 코프로 포르 피리 노겐 III (CPgenIII)​​를 형성하기 위해 발생하는 세포질에 밖으로 내 보냅니다. 마지막으로, 철의 한 분자는 헴, 페로 (FECH) 1,2,4에 의해 촉매 반응을 생성하기 위해 프로토 포르피린 IX (PPIX)에 통합된다.

헴 생합성의 레벨은 주로 세포 단단히 철 및 헴 (4)에 의해 제어된다 아아 효소의 수준에 따라 달라진다. 헴 생합성 유전자 결함은 특정 미네랄과 비타민 (예를 들어, 리보플라빈, 아연), 독소 (예를 들어, 알루미늄, 납 노출의 가용성에 의해 영향을받을 수있다), 특정 스테로이드 (의 산소 결핍, 발열 및 레벨 예를 들어, 에스트로겐) 32 ~ 35. 헴 합성의 수준은 다양한 질환 상태에 변경된다. 감소 헴 생합성 빈혈뿐만 아니라 신경 질환 3,36의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 증가 된 헴 생합성은 특정 암 28,37의 진행에 중요한 역할을한다. 헴은 포유 동물의 지방, 적혈구와 신경 세포 4,38-41의 성장, 분화 및 생존에 중요한 것으로 나타났다. 예를 들어, 헴의 결핍은 글루타민산 NMDA (N- 메틸 - 디 - 아스파 테이트) 수용체 (17)의 억제를 통해 기본 마우스 대뇌 피질의 신경 세포의 신경 돌기의 손상으로 이어집니다. 또한 헴 합성의 억제는 인간 경부 상피 암종 HeLa 세포 26,41 프로그래밍 세포 사멸을 야기한다. 따라서, 다른 조건에서 다양한 세포에서 헴 생합성 수준을 측정하는 단계와 progressi 병인 연구에 중요많은 질병의에.

여기에서는 [4- (14) C] 5- 레 블루 닉 산을 사용하여 세포 내 헴 합성의 수준을 측정하기 위해 빠르고 민감한 방법을 설명한다. 이것은 55의 Fe 또는 59의 Fe를 사용하는 다른 방법과 다른 방법이다. 그 방사선이 매우 약한 때문에 우리는 14 C를 사용하여 선호합니다. 반면, 강력한 보호는 철 동위 원소와 협력이 필요합니다. 또한,이 방법은 측정하고 빠른 방식으로 병렬로 서로 다른 셀에서 헴 합성을 비교하기위한 것이다. 헴 절대 수준을 측정하기 위하여, 하나는 HPLC 42,43의 사용을 포함하는 이전에 확립 된 방법을 사용할 수있다.

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Protocol

주의 : 방사능과 함께 작업하는 동안, 실험자와 환경 오염을 방지하기 위해 적절한 예방 조치를 취할. 지역의 방사선 안전 지침에 따라 모든 폐기물을 폐기 할 것.

세포의 1. 준비

  1. 포화 상태는 시험 당일의 80 % -90 %에 도달하도록 3.5 cm 플레이트 종자 세포.
    1. 세포 생장을 시드하는 세포의 종류와 성장 속도에 따라 다를 수 있습니다. 특정 일수 시약으로 처리하면 세포 생장이 헴 측정 일에 80 % -90 %가되도록 세포를 시드. 3.5 cm 플레이트로부터 얻은 세포의 수가 부족하면, 다음 단계에서 방사성 ALA의 동량 6cm 판을 사용한다.
      주 : 개별 판을 쉽게 처리 할 수​​ 있기 때문에 개인 접시를 사용하면 좋습니다.
  2. 헴 측정 전 날, 최종 C에 도달하기 위해 0.1 ~ 0.3 μCi를 [14 C] 5-ALA 차가운 ALA를 추가방사성 물질 작업을위한 작업 영역에 맞는 각각의 배양 접시에 총 ALA 20 μM의 oncentration과 것은 다시 인큐베이터에 접시를 넣어. 이상적으로, 16 시간 동안 방사성 ALA에 품어.
    참고 : 방사성 표지 된 5-ALA는 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다 요구했다. 적어도 100 분 (CPM) 당 방사능 카운트가 카운트와 연관​​된 오차를 최소화 할 필요가있다. 이 연구중인 세포주 필요한 [14 C] 5-ALA의 최소한의 양을 결정하는 것이 바람직하다. 대부분의 실험에서 0.1 ~ 0.3 μCi를는 좋은 측정 값을 얻기에 충분하다. 감기 ALA의 추가는 선택 사항입니다.

2. 헴 추출

  1. 얼음에 세포 배양 접시를 놓고 방사능 작업 영역에 맞게 가져 가라.
    1. 방폭 후드 전체 추출 및 증발 과정을 수행한다. 저장 에테르가 폭발 할 수 있기 때문에,에 에테르 저장하지 않는, 작은 병에 에테르를 사용하고 남은 액체를 증발한 달 이상을위한 개방형 병. 이 가연성이기 때문에 화염, 히터 근처에 아세톤을 사용하지 마십시오. 이 조직 배양 플라스틱을 용해시키는 유리 병에 시약을 함유하는 저장소 아세톤.
  2. 피펫을 사용하여 매체 대기음. 1X 차가운 PBS 1 ml의 세포를 한 번 씻으십시오. PBS를 대기음.
  3. 고무 경찰관을 사용하여 판의 하단에있는 세포를 플레이트에 1X 차가운 PBS 1 ㎖를 추가하고 수집합니다. 레이블이 사전 냉장 2 ML 튜브 각 판에서 수집 된 세포를 전송합니다. 2 ml의 튜브에있는 모든 세포를 수집합니다.
    참고 : 각 판에서 세포를 긁어 각 판의 신선한 고무 경찰관을 사용합니다. 각 플레이트를 들어 네 개의 2 ㎖의 튜브, 1.5 ML 튜브 및 섬광 유리 병을 필요로한다.
  4. 4 ° C에서 1 분 15,000 XG에 스핀.
  5. , 피펫을 사용하여 PBS를 꺼내 짧은 스핀을주고 잔여 PBS를 제거합니다. 1X PBS 100 ㎕에 재현 탁 세포. 소용돌이는 세포를 재현 탁과 얼음에 유지합니다.
  6. 받아 10# 956; L 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관 및 저장소에 5 단계 및 전송의 단백질 농도를 측정합니다.
    주 : 세포 용해 완충액은 세포에 첨가하고, 이후 단백질 농도를 측정하기 위해 얼음에 보관해야한다.
  7. 4 ° C에서 30 초 동안 5,000 XG에서 5 단계에서 나머지 90 μl를 스핀; 완전히 200 μL 피펫 팁을 사용하여 PBS를 제거합니다.
  8. 헴 추출 버퍼 300 μl를 추가 각 튜브 (자료 목록 참조). 그런 다음 15 초 동안 와류 믹스 1 분 동안 얼음에 넣어,이 3 번 반복합니다.
    1. 헴 추출 완충액 (HEB)를 첨가하고, 펠렛을 재현 탁 신속 튜브를 와동, 펠릿이 너무 오래 남아 HEB없이 신속 재현 탁되어야하기 때문에 한 번에 하나 또는 두 개의 튜브를 수행. HEB 모든 튜브에 첨가하고, 펠릿 후 재현 탁되면하는 펠릿을위한 HEB 버퍼에 남아 있으면 펠릿 HEB로 완전히 전환되지 않을 수 있음을 8 단계 참고 같이 얼음주기에 15 초간 와동 1 분을 수행 더 길게시간과 신속하게 재현 탁 없습니다.
  9. 30 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 디 에틸 에테르 1.2 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 15,000 XG에 스핀.
    참고 : 디 에틸 에테르 신속하게 피펫 팁의 부족. 아래로 한 번 또는 두 번이, 피펫 디 에틸 에테르 위를 제어하려면, 이렇게하면 피펫에 디 에틸 에테르를 유지하는 데 도움이됩니다. 신선한 피펫 팁을 사용하는이 때마다 반복합니다.
  10. 새로운 microcentrifuge 관 1 ML의 피펫 맨 (에테르) 상을 전송합니다. 9 단계에서와 같이 2 N 염산, 혼합하는 소용돌이와 스핀의 0.5 ML을 추가합니다.
    주 : 에테르 염산 상 사이의 간격을 표시하는 것은 곤란하다. 따라서, 그것을 옅은 청색을주고, 실험 기간 동안 충분히 사용될 2 N HCl 용액에 트리 판 블루 소량 추가. 이 두 단계를 구분하는 데 도움이됩니다. 하부상은 청색되며 상부 에테르 상을 무색이 될 것이다. 새로운 튜브로 상단 무색 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 (파란색) 단계를 폐기합니다.
  11. 10 단계를 반복이번 이상은 2 N HCl로 에테르 상을 씻어. 각 반복하는 동안 새로운 튜브 만 상단 에테르 위상을 전송하고 낮은 염산 단계를 폐기합니다.
  12. HCl로 세 번째 세척 후, 섬광 유리 병에 1 ML의 피펫 상단 위상을 전송합니다. 화학 후드 O / N에서 샘플을 유지하여 디 에틸 에테르를 증발시켜 샘플을 건조시킵니다.

방사능 3. 측정

  1. 다음 날, 단계 2.12에서 건조 된 샘플 섬광 액 5 mL를 추가 할 수 있습니다.
  2. 혼합 잘 흔들어. 섬광 계수기를 이용하여 방사능을 측정한다.

4. 계산

  1. CelLytic M 버퍼의 동일한 양을 사용하여 단계 2.6에서를 Lyse이 세포를 4 ℃에서 5 분 동안 14,000 XG에 스핀 (자료 목록 참조).
  2. 상청액의 분취 량을 취하여 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정한다.
    mg의 (TP) 단백질의 총량 = (90 μL의 *의 농. 단백질에(81); G / μL) / 1000
    헴 합성 레벨 (방사능 / TP) = 단백질의 pmol의 / mg의.

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Representative Results

이 방법은 암 (HCC4017) 폐 세포 대 정상 (HBEC30KT)에서 헴 합성 수준을 비교하기 위해 사용되었다.이 정상 폐 세포 (HBEC30KT)보다 암세포 (HCC4017)에서 헴 합성의 더 높은 수준을 보여준다. 헴 합성의 레벨은 미토콘드리아 uncoupler 보닐 시안화 -3- chlorophenylhydrazone (CCCP)의 존재 하에서 정상 및 암 세포에서 측정 하였다. 세포는 헴 합성 수준을 측정하기 전에 24 시간 동안 10 μM의 CCCP 처리 하였다. 예상대로, 헴 합성의 레벨 (도 2)은 정상 및 암 세포 모두에서 CCCP의 존재 하에서 감소 하였다. 또, 헴 합성 숙시 닐 아세톤 (SA)에 의해 억제 될 수 있음을 이전에 5- 아미노 레 불린 산 탈수 헴 생합성 경로 41 제 효소 (ALAD)의 강력하고 특이 억제제를 보여왔다. 이 방법을 사용하면, 헴 합성 수준은 존재 및 ABS에 HeLa 세포에서 측정 하였다0.5 mM의 SA.도 3을 미치 보여준다 SA의 존재하에 10 개 이상의 주름 감소 헴 합성 수준. 또이 기술의 사용을 설명하기위한, 헴 합성의 수준을 측정하고,도 4에 도시 된 바와 같이 4 및 HEK293T 암 세포주에서 비교 하였다.

그림 1
그림 1. 인간 헴 생합성 경로 아아, 5- 아미노 레 불린 산 신타.; 5-ALA, 5- 아미노 레 불린 산; ALAD, ALA는 탈수; PBG, 포 르포 빌리 노겐; HMBS, hydroxymethylbilane 합성 효소; HMB, hydroxymethylbilane; 우로스, III 합성 효소 uroporphyrinogen; UPgenIII, uroporphyrinogen III; UROD, 디카 르 복실 라 아제 uroporphyrinogen; CPgenIII, 코프로 포르 피리 노겐 III; CPOX, 코프로 포르 피리 노겐 III 옥시다아제; PPgenIX, 프로토 포르 피리 노겐 IX; PPOX, 프로토 포르 피리 노겐 IX 옥시 다제; PPIX는 프로토 포르피린 IX를; FECH, 페로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 일반 (HBEC30KT)에서 헴 생합성의 수준과 암 (HCC4017) 세포가없는 10 μm의 미토콘드리아 uncoupler의 CCCP의 존재 라인. 배경 레벨이 빈 샘플 (혼자 섬광 유체)의 수준과 유사했다과 컨트롤의 2 % 미만이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
ABS에서 HeLa 세포에서 헴 생합성 3. 레벨 도표줬어 세포가 헴 측정하기 전에 3 일간 SA 처리 한 헴 합성 억제제 숙시 닐 아세톤 0.5 mM의 (SA).의 존재. 배경 수준은 빈 샘플 (혼자 섬광 유체)의 수준과 유사했다 그것은. 컨트롤의 2 % 미만이었다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
(4) 암과 HEK293T 세포주 헴 생합성 레벨도 4의 비교. 세이 프로토콜에 따라 수행 하였다. HCC4017 5 % FBS, 10 % FBS가 보충 된 DMEM에서 HEK293T와 헬라가 보충 된 RPMI1640에서 ACL4 매체, A549 및 H1395에서 재배 하였다. 통계적인 분석을 위해, 암 세포 및 HEK293T 세포에서 헴 합성 수준 HCC40에서 헴 합성 수준을 비교했다웰치 2 표본 t 검정을 이용하여 셀 (17). **, P 값 <0.005. 배경 수준은 빈 샘플 (혼자 섬광 유체)의 수준과 유사했다 그것은. 컨트롤의 2 % 미만이었다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

헴은 호흡 (26)를 통해 세포 에너지의 생성에 중요한 역할을한다. 변경된 헴 대사 암 28,41 포함한 다양한 질환과 관련이있는 것으로 알려져있다. 헴 합성의 억제는 HeLa 세포 26,41 세포주기 정지 및 세포 사멸을 일으키는 것으로 알려져있다. 그것은 높은 헴 합성 수준 폐암 세포 (28)의 진행과 연관되어 있음을 보여왔다. 따라서, 다른 조건 하에서 세포에서 헴 생합성의 수준을 측정하기 위해 매우 중요 할 것이다. 따라서 헴의 총량을 정량화하지 여기서 설명하는 방법은, 상기 셀 내에 존재하는 헴의 절대 값을 제공하지 않는다. 세포에서 헴의 총량을 측정하는 것이 가능한 방법 및 키트 색채의 다양하다. 예를 들어, 헴 아세톤과 염산의 혼합물에서 세포와 미토콘드리아로부터 추출 될 수 있고, 50 % (v / v)의 아세토 니트릴과 혼합 하였다. 이어서 혼합물을 적용 할 수있다400 nm의 44,45 0.05 %를 함유하는 아세토 니트릴 (v / v)의 트라이 플루오로 아세트산과 헴 화합물을 식별 구배 용출 헴이어서 3.9 X 300mm Bondclone C18 컬럼.

이전에는 포유 동물 조직과 세포 추출물 [14 C] - 글리신 및 [14 C] 5- ALA가 46, 47을 사용 하였다에서 헴 생합성의 수준을 측정한다. 표지 글리신 첫 단계에서 헴 생합성 경로에 진입하지만, 비록 그것이 헴으로 제한된 통합 결과 다른 대사 경로에 의해 떨어져 배출된다. 글리신은 헴 생합성 경로 (48)에 대해 특정 대사 산물이 아니다. 한편, 5-ALA는 헴 생합성 경로에 고유 라벨. 이 기능은 글리신 46,48,49 위에 -5- ALA를 이용하는 정량 이점을 부여. 따라서, 방사성 -5- ALA의 사용은 측정 헴 생합성의 수준과 비교하는 구체적이고 정확한 방법이다.

대부분의 C일관된 결과를 얻을 수 ritical 단계는 다음과 같습니다 1) 있는지 확인보다 높은 100 % 및 다양한 조건에서하지 이하 70 % 가지 않습니다 셀 컨 플루; 이 방법은 매우 민감하기 때문에 2) 판 당 추가 된 방사능의 양이 동일해야합니다; 3) 헴 추출 버퍼가 오래 안, 그것은 신선한마다 확인하는 것이 좋습니다. 접시 당 필요한 방사능의 양이 매우 적고, 그 샘플에 걸쳐 동일한 양을 유지하는 것이 곤란하다. 따라서, 모든 샘플에 대해 동일한 매체를 사용하는 경우, 배양액의 작업 저장 용액을 만들기 위해 권장 다른 PBS (인산 완충 식염수)가 사용될 수있다. 작업 스톡 용액을 플레이트 당 분배 부피가 10 μL하에있는 방식으로 제조 될 수있다. 또한,보다 정확한 것으로, 하나의 조건에 대한 복제 샘플에서 배지이어서 전자 위로 분배, 50 ㎖ 튜브에 취출 할 수 있으며, 방사능의 적절한 양의 작업 원액으로부터 첨가 할 수있다판에 매체의 QUAL 양. 세포의 수는 일차 배양 물에서와 같이 제한되는 경우, 12 웰 또는 24 웰 플레이트 세포 배양에 사용되는 잘 비례 당 첨가 된 방사능의 양을 줄일 수있다.

이 프로토콜은, 간단 간단하고, 헴 합성 수준의 정확한 측정을 제공한다. 때때로, 그것은 완전히 헴 추출 완충액 (단계 2.8)에서 세포 펠렛을 재현 탁 것이 어려울 수있다. 이 단계 2.8에서 빨리 피하려면, 시간, 소용돌이에 1-2 샘플 헴 추출 버퍼를 추가하고 얼음에 넣어 두 었어요. 헴 추출 버퍼가 너무 오래하지 있는지 확인합니다. 복제 샘플 중에서 표준 편차가 너무 높으면, 다음 단계에주의 : PBS 완전히 단계 2.7에서 제거 1); 2) 디 에틸 에테르 단계에서, 단계 2.9에서 팁을 수행 할 때 샘플을 유출 방지; 3) 방사능 접시 당 추가 복제 샘플의 포화 상태가 동일해야합니다.

28와 같이 방사성 -5- ALA 방법을 사용하여 SS = "jove_content은"> 헴 합성 수준을 비교 하였다. 여기 기재된 기술들은 [14 C] -5- ALA, 헴 생합성 경로의 전구체 (도 1)의 사용을 필요로하고, 헴에 혼입 된 방사능을 측정한다. 이 기술에서, 헴 포함 포르피린은, 아세톤의 혼합물에 세포로부터 추출하고, HCl 및 물을 농축 50,51. 헴은 또한 디 에틸 에테르로 추출하고, 2 N 염산 50, 51와 에테르 상을 세척하여 포르피린으로부터 분리 하였다. 이어서, 헴에 혼입 된 방사능은 섬광 계수기를 사용하여 측정 하였다. 결과는 단백질 또는 세포 수의 총량에 의해 정규화 될 수있다. HeLa 세포에서 헴 합성가 숙시 닐 아세톤 (SA) 및 헴 (heme) 합성의 수준의 감소를 억제하여 나타낸 바와 같이 사전 관찰viously (26) (그림 3).

이 방법은 (그림 4) 다른 조건 또는 셀 라인 사이의 헴 합성의 수준의 비교에 매우 유용하다. 그것은 세포의 작은 숫자가 필요하고 특정 측정 및 다른 셀들에서 헴 합성 수준의 비교를 제공한다. 그것은 세포의 절대 헴 레벨의 정확한 측정을 위해 의도되지 않는다. 그것은 가장 상이한 암 세포와 같은 다른 특성을 가진 세포에서 헴 합성 수준을 비교하기 위해 사용된다. 코발트 때문에, 대신에 철, 성장 배지는 코발트 또는 다른 금속 이온의 상이한 레벨을 포함 할 경우,이 방법은, 헴 합성의 정확한 비교를 산출하지 않을 수 헴 합성의 마지막 단계에서 헴에 혼입 될 수있다 (51)을 추출한다. 그러나, 5- 아미노 레 불린 산의 포르피린 및 헴 헴 합성 경로가 (P)의 전체 플럭스 수준을 측정하는 매우 특이athway 관계없이 금속 이온, 헴 관련된 대사 활동 이상의 반사 될 가능성이있다. 대조적으로, 59 철을 이용하는 방법은 헴 (52)을 형성하는 철을 도입 경로의 일부를 검출한다. 이러한 금속 이온의 상당한 수준의 존재 하에서,보다 구체적이지만 검출 헴 합성 수준은 암 세포와 같은 특정 세포의 대사 전위를 반영하지 않을. 또한, 철은 헴 (heme)을하는 미토콘드리아 옆에 다른 세포 위치로 압수 할 수있다. 전반적으로, 우리는 [4- (14) C] 5-ALA의 사용은 다양한 특성을 갖는 다른 세포를 비교할 때 헴 수준을 측정하기위한보다 실용적인 방법이라고 믿는다.

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Disclosures

우리는 공개 할게 없다.

Acknowledgments

HCC4017 및 HBEC30KT 세포주 친절 닥터 존 민나의 실험실에 의해 제공되었다. 이 작품은 닥터 리 장에 세실 H.와 아이다 녹색 기금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)
Acetone
Concentrated HCl
Water
25 ml
1.3 ml
5 ml

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References

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Comments

1 Comment

  1. Could you please share where did you get the 14C-ALA?
    thanks a lot

    Reply
    Posted by: abel g.
    February 24, 2018 - 5:52 PM

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