Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Biology

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Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

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Abstract

Heme serve como o grupo prostético de uma grande variedade de proteínas conhecidas como hemoproteinas, tais como a hemoglobina, mioglobina e citocromos. Ele está envolvido em vários processos moleculares e celulares, tais como a transcrição do gene, tradução, diferenciação celular e a proliferação celular. Os níveis de biossíntese do heme variar entre diferentes tecidos e tipos de células e é alterada em condições de doença, tais como a anemia, neuropatia e cancro. Esta técnica utiliza [4- 14 C] ácido 5-aminolevulínico ([14 C] 5-ALA), um dos primeiros precursores na via de biossíntese do heme para medir os níveis de síntese do heme em células de mamíferos. Este ensaio envolve a incubação de células com [14 C] 5-ALA, seguido por extracção do heme e medição da radioactividade incorporada no heme. Este procedimento é preciso e rápido. Este método mede os níveis relativos de heme, em vez de o teor total do heme. Para demonstrar o uso da presente technique os níveis de biossíntese do heme foram medidos em várias linhas de células de mamíferos.

Introduction

O heme, um complexo de ferro ferroso e protoporfirina IX é uma molécula central para o transporte e a utilização de oxigénio em organismos vivos praticamente todos 1-3. A estrutura única do heme lhe permite funcionar como um transportador de gases diatómicos e electrões, assim como para executar diversas outras funções 1-5. Por exemplo, liga-se ao heme oxigénio na hemoglobina e mioglobina de transferência e armazenagem de 6,7 oxigénio. Ele também funciona como um transportador de electrões nos citocromos durante a respiração e atua como um doador de elétrons para reações redox catalisada por enzimas do citocromo P450 8,9. Uma das características mais significativas do heme é que, pode desempenhar papéis regulatórios em processos celulares e moleculares, como a transcrição de genes, síntese de proteínas e micro-RNA biogênese 4. Por exemplo, afecta a transcrição de muitos genes, controlando a actividade do repressor de transcrição de mamífero Bach1 e o rec nucleares de mamíferoseptor Rev-erbα 10-15. Heme regula a activação do activador de proteína heme (Hap) 1, o qual desempenha um papel importante na activação de genes envolvidos na respiração e controlar os danos oxidativos, em resposta a heme ou oxigénio 16. Heme também regula a transcrição de genes em células neuronais através do factor de crescimento do nervo (NGF) de sinalização 3,17-20. É também regula a síntese de proteínas em células eritróides de mamíferos através da modulação da actividade da heme-reguladas eIF2α quinase (HRI) 21-24. Além disso, o heme afecta a actividade das proteínas principais de sinalização, tais como tirosina-quinase Src e Jak2, que são essenciais para o funcionamento adequado das células e o crescimento de células 4,20,25. Verificou-se que, em células HeLa inibição heme provoca paragem do ciclo celular e a activação de marcadores associados à senescência e a apoptose 26. Tanto a deficiência heme ou aumento dos níveis de heme estão associados com efeitos graves para a saúde em seres humanos 27. Um molecular recentend estudos epidemiológicos têm mostrado uma associação positiva do consumo elevado de heme e aumento do risco de doenças, tais como diabetes tipo 2, doenças coronárias e vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, cancro colo-rectal e cancro do pâncreas 27,28. Usando um par combinado de laboratório células pulmonares normais e cancerosas autores descobriram que as células cancerosas se aumentaram os níveis de consumo de oxigênio, a síntese do heme e proteínas envolvidas na absorção de oxigênio heme e utilização 28. Curiosamente, a inibição da síntese do heme diminuição do consumo de oxigénio, proliferação, migração e formação de colónias de células de cancro 28. Deste modo, a flutuação nos níveis de heme endógena desempenha um papel importante na regulação de processos celulares e moleculares 3,4,28,29.

Nos mamíferos, a biossíntese do heme ocorre em oito passos, envolvendo enzimas localizadas nas mitocôndrias e o citosol 4 (Figura 1). Heme biostese começa na matriz de mitocôndria com a condensação de glicina e succinil-CoA para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalisada por sintase de ALA (Alas) 4,31. Este é o passo limitante da velocidade na biossíntese do heme em células nonerythroid. 5-ALA é então exportado para o citosol onde as quatro etapas seguintes ocorrem para formar coproporfirinogênio III (CPgenIII), o qual é então novamente importados para as mitocôndrias, onde é convertido em protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, uma molécula de ferro é incorporado à protoporfirina IX (PPIX) para produzir o heme, numa reacção catalisada por ferroquelatase (FEQ) 2,4.

O nível da biossíntese do heme depende principalmente do nível de enzima ALA que é rigorosamente controlada por ferro intracelular e heme 4. A biossíntese do heme podem ser afectadas por defeitos genéticos, disponibilidade de certos minerais e vitaminas (por exemplo, riboflavina, zinco), exposição a toxinas (por exemplo, alumínio, chumbo), Anoxia, febre, e os níveis de certos esteróides (por exemplo, estrogénio) 32-35. O nível de síntese do heme é alterada em várias condições de doença. Diminuição da biossíntese do heme pode causar anemia, bem como doenças neurológicas 3,36. Alternativamente, o aumento da biossíntese do heme desempenha um papel importante na progressão de certos cancros 28,37. O heme tem sido demonstrado que é crítica para o crescimento, diferenciação e sobrevivência de tecido adiposo de mamífero, eritróide e de células neuronais 4,38-41. Por exemplo, a deficiência de heme leva a danos de neurites em neurónios corticais de rato primária através da inibição de glutamato de NMDA (N-metil-D-aspartato) do receptor 17. Além disso, a inibição da síntese do heme provoca a morte celular programada no humano Carcinoma epitelial do colo células HeLa 26,41. Portanto, a medição dos níveis de biossíntese do heme em várias células sob diferentes condições é importante para o estudo de etiologia e progressino de muitas doenças.

Aqui, descrevemos um método rápido e sensível para medir o nível de síntese do heme intracelular utilizando [4- 14 C] ácido 5-aminolevulic. Este é um método alternativo para os métodos que utilizam outros 55 Fe ou 59Fe. Nós preferimos usar 14 C, porque a sua radiação é muito fraco. Em contraste, a protecção forte é necessário para trabalhar com isótopos Fe. Além disso, este método se destina a medir e comparar a síntese do heme em células diferentes em paralelo de uma maneira rápida. A fim de medir os níveis absolutos de heme, pode-se utilizar o método previamente estabelecido, envolvendo o uso de HPLC de 42,43.

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Protocol

CUIDADO: Ao trabalhar com radioatividade, tomar as precauções adequadas para evitar a contaminação do experimentador e os arredores. Elimine todos os resíduos fora de seguir as diretrizes de segurança de radiação local.

1. Preparação de células

  1. Semear as células em placas de 3,5 centímetros de tal modo que a confluência atinge 80% -90% em relação ao dia do ensaio.
    1. Note-se que sementeira confluência de células depende do tipo de célula e a sua taxa de crescimento. Quando o tratamento de células com um reagente para um certo número de dias, as células semente de modo que a confluência é de 80% -90% no dia da medição do heme. Se o número de células obtido a partir de 3,5 centímetros placas é insuficiente, usar 6 centímetros placas com a mesma quantidade de ALA radioactivos como no passo seguinte.
      Nota: A utilização de placas individuais é recomendado porque é mais fácil de lidar com placas individuais.
  2. Um dia antes da medição do heme, adicionar 0,1-0,3 uCi [14 C] 5-ALA ALA e frio para chegar a um final concentration de 20? M de ALA total a cada placa de cultura em um ajuste da área de trabalho para trabalhar com materiais radioativos e colocar as placas de volta para a incubadora. Idealmente, incubar com radioativo ALA durante 16 horas.
    Nota: radiomarcado 5-ALA necessário pode variar entre linhas celulares. Uma contagem radioactiva por minuto (cpm) de, pelo menos, 100 é necessário para minimizar o erro associado a contagem. É aconselhável determinar uma quantidade mínima de [14 C] 5-ALA necessário para as linhas celulares em estudo. Para a maioria dos experimentos 0,1-0,3 �i é suficiente para obter uma boa medição. A adição de frio ALA é opcional.

2. Heme Extração

  1. Coloque as placas de cultura de células em gelo e levá-los para a área apto para o trabalho radioatividade.
    1. Executar toda a extração e processo de evaporação em um capuz prova de explosão. Porque o éter armazenadas podem explodir, utilize o éter em pequenas garrafas e evaporar quaisquer líquidos restantes, não armazene em éterum frasco aberto há mais de um mês. Não use acetona perto de chamas e aquecedores, pois é altamente inflamável. Loja acetona contendo reagentes em garrafas de vidro, uma vez que se dissolve plásticos de cultura de tecidos.
  2. Aspirar fora do meio utilizando uma pipeta. Lave as células uma vez com 1 ml de PBS frio 1x. Aspirar off PBS.
  3. Adicionar 1 ml de 1x PBS frio para as placas e recolher as células na parte inferior da placa utilizando um polícia de borracha. Transferir as células recolhidas a partir de cada placa para um pré-refrigerada 2 ml tubo rotulado. Recolha todas as células em 2 ml tubos.
    Nota: Use um policial de borracha nova para cada placa para raspar as células de cada placa. Para cada placa, precisaria de quatro tubos de 2 ml, um tubo de 1,5 mL e num frasco de cintilação.
  4. Rotação a 15000 xg durante 1 min a 4 ° C.
  5. Retire PBS com uma pipeta, dar uma breve centrifugação e remover o PBS residual. Ressuspender as células em 100 ul de 1x PBS. Vortex para voltar a suspender as células e manter em gelo.
  6. Pegue 10 &# 956; l a partir do passo 5 e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar em gelo para medir a concentração de proteína.
    Nota: tampão de lise celular deve ser adicionado às células e mantidas em gelo para medir a concentração de proteína mais tarde.
  7. Girar os restantes 90 mL do passo 5 a 5000 xg durante 30 seg a 4 ° C; remover completamente PBS com uma pipeta de ponta de 200 mL.
  8. Adicionar 300 ul de tampão de extracção de heme (ver Lista de Materiais) para cada tubo. Então vortex durante 15 segundos para misturar e colocar em gelo durante 1 min, repetir 3 vezes.
    1. Adicionar tampão de extracção do heme (Hb) e o tubo rapidamente vortex para ressuspender o sedimento, fazer apenas um ou dois tubos de cada vez, pois o sedimento deverá ser ressuspenso rapidamente sem serem deixados na HEB por muito tempo. Uma vez HEB é adicionado a todos os tubos e sedimento é ressuspenso em seguida, a seguir vórtice e 15 seg 1 min em gelo ciclo como no passo 8. Note que pelete pode não entrar completamente em HEB se o sedimento é deixado no buffer HEB para uma maistempo e não ressuspensas rapidamente.
  9. Adicionar 1,2 ml de éter dietílico e a cada tubo de vórtice durante 30 seg. Rotação a 15000 xg durante 5 min a 4 ° C.
    Nota: O éter etílico é executado fora de pontas de pipeta rapidamente. Para controlar isso, pipeta éter etílico cima e para baixo uma ou duas vezes, fazer isso ajuda a manter o éter etílico na pipeta. Repita esta cada vez que uma nova ponta de pipeta é usado.
  10. Transferir fase superior (éter) com 1 ml de pipeta num novo tubo de microcentrifugação. Adicionar 0,5 mL de HCl 2 N, vortex para misturar e centrifugação como no passo 9.
    Nota: É difícil ver a separação entre as fases de éter e HCl. Por isso, adicionar pequenas quantidades de azul de Tripano em solução de HCl 2 N para ser utilizado durante a experiência, o suficiente para dar uma cor azul pálido. Isso vai ajudar a distinguir as duas fases. A fase mais baixa será azul e a fase de éter superior será incolor. Transferir a fase etérea incolor superior para um novo tubo e descartar a fase HCl (azul) inferior.
  11. Repita o passo 10 doismais vezes para lavar a fase etérea com 2 N de HCl. Transferir apenas a fase superior com éter para um novo tubo durante cada repetição e eliminar a fase inferior de HCl.
  12. Após a terceira lavagem com HCl, transferir a fase superior com 1 ml de pipeta para um frasco de cintilação. Secam-se as amostras por evaporação do éter dietílico, mantendo as amostras no capuz química O / N.

3. Medição da radioactividade

  1. No dia seguinte, adicionam-se 5 ml de fluido de cintilação para as amostras secas a partir do passo 2.12.
  2. Agite bem para misturar. Medir a radioactividade utilizando um contador de cintilação.

4. Cálculos

  1. Lisar as células do passo 2.6, utilizando quantidades iguais de tampão CelLytic M (ver Materiais List) e centrifugação a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
  2. Tomar uma aliquota do sobrenadante e medir a concentração de proteína utilizando o kit de ensaio de proteína BCA.
    A quantidade total de proteína em mg (TP) = (90 ul * conc. De proteína em81; g / mL) / 1000
    Nível de síntese do heme (radioatividade / TP) = pmol / mg de proteína.

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Representative Results

Este método foi utilizado para comparar os níveis de síntese do heme em condições normais (HBEC30KT) vs cancerosas (células de pulmão HCC4017). A Figura 2 mostra um nível mais elevado da síntese de heme em células de cancro (HCC4017) do que as células normais de pulmão (HBEC30KT). O nível de síntese do heme foi medido também em células normais e cancerosas, na presença de cianeto de carbonilo mitocondrial desacoplador 3-clorofenilhidrazona (CCCP). As células foram tratadas com 10 mM de CCCP, durante 24 h antes da medição dos níveis de síntese do heme. Como esperado, os níveis de síntese do heme (Figura 2) diminuiu na presença de CCCP em ambas as células normais e cancerosas. Foi demonstrado anteriormente que a síntese de heme pode ser inibida por succinil acetona (SA), um inibidor potente e específico da desidratase do ácido 5-aminolevulínico (ALAD), que é a segunda enzima em 41 via biossintética do heme. Usando este método, os níveis de síntese do heme foram medidos em células HeLa na presença e abscia de 0,5 mM SA. A Figura 3 mostra que os níveis de síntese do heme diminuiu em mais de 10 dobras na presença de SA. Para demonstrar ainda mais o uso desta técnica, os níveis de síntese do heme foram medidos e comparados nos quatro cancro e em linhas de células HEK293T, conforme mostrado na Figura 4.

Figura 1
Figura 1. A via de biossíntese do heme ALA em seres humanos, 5-aminolevulínico sintase ácido.; 5-ALA, o ácido 5-aminolevulínico; ALAD, ALA desidratase; PBG, porfobilinogénio; HMBS, hidroximetilbilano sintase; HMB, hidroximetilbilano; UROS, uroporfirinogênio III sintase; UPgenIII, uroporfirinogênio III; UROD, uroporfirinogênio descarboxilase; CPgenIII, coproporfirinogênio III; CPOX, coproporfirinogênio III oxidase; PPgenIX, protoporf irinogénio IX; PPOx, protoporphyrinogen IX oxidase; PPIX, protoporfirina IX; FECH, Ferroquelatase. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Os níveis de biossíntese do heme em condições normais (HBEC30KT) e cancro (HCC4017) linhas de células, na ausência e presença de 10 uM de CCCP desacoplador mitocondrial. O nível de fundo era similar ao nível da amostra em branco (por si só) e fluido de cintilação ele era inferior a 2% do controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Os níveis de biossíntese do heme em células HeLa em ABScia e na presença de 0,5 mM de inibidor da síntese do heme succinil acetona (SA). As células foram tratadas com SA durante 3 dias antes da medição do heme. O nível de fundo foi semelhante ao nível de amostra em branco (isolado líquido de cintilação) e foi inferior a 2% do controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Comparação dos níveis de biossíntese do heme em quatro linhas celulares de cancro e HEK293T. O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo. HCC4017 foram cultivadas em meios ACL4, A549 e H1395 em RPMI 1640 suplementado com 5% de FBS, e HEK293T HeLa em DMEM suplementado com FBS a 10%. Para análise estatística, os níveis de síntese do heme em células cancerosas e células HEK293T foram comparadas com o nível de síntese do heme em HCC4017 células, utilizando o teste t de Welch 2-amostra. **, P valor <0,005. O nível de fundo foi semelhante ao nível de amostra em branco (isolado líquido de cintilação) e foi inferior a 2% do controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O heme desempenha um papel fundamental na geração de energia celular através da respiração 26. Metabolismo do heme Altered é conhecida por estar associada com várias doenças, incluindo cancro 28,41. A inibição da síntese do heme é conhecido por causar a paragem do ciclo celular e apoptose em células Hela 26,41. Demonstrou-se que o nível de síntese de heme está associada com a progressão de células de cancro de pulmão 28. Portanto, seria de grande importância para medir os níveis de biossíntese do heme em células em condições diferentes. O método discutido aqui não se quantificar a quantidade total de heme, por conseguinte, não fornece o valor absoluto do heme presentes nas células. Há uma variedade de métodos colorimétricos e kits disponíveis para medir as quantidades totais de heme nas células. Por exemplo, o heme pode ser extraído a partir de células e mitocôndrias em uma mistura de acetona e HCl e misturado com 50% (v / v) de acetonitrilo. Em seguida, a mistura pode ser aplicadaa um 3,9 x 300 milímetros coluna C18 Bondclone seguido por eluição do heme em um gradiente de acetonitrilo contendo 0,05% (v / v) de ácido trifluoroacético e a identificação de compostos hemo a 400 nm 44,45.

Anteriormente, para medir os níveis de biossíntese do heme em tecidos de mamíferos e extractos celulares [14 C] -glicina e [14 C] 5- ALA foram utilizados 46,47. Apesar de glicina marcada entra na biossíntese via heme no primeiro passo, mas é drenado por outras vias metabólicas que resultam na sua incorporação limitada em heme. A glicina é um metabolito não específica para 48 via de biossíntese do heme. Por outro lado, rotulados 5-ALA é específica para a via de biossíntese do heme. Esta característica confere uma vantagem quantitativa do uso de 5-ALA mais de glicina 46,48,49. Portanto, o uso de substâncias radioativas 5-ALA é um método mais específico e preciso para medir e comparar os níveis de biossíntese do heme.

Maioria critical passos para obter resultados consistentes são: 1) certifique-se a confluência celular não ir superior a 100% e não inferior a 70% em várias condições; 2) a quantidade de radioactividade adicionada por placa deve ser idêntico porque este método é muito sensível; 3) tampão de extracção heme não deve ser velho, recomenda-se fazer fresco o tempo todo. O volume de radioactividade requerida por placa é muito pequena e é difícil de manter as quantidades idênticas através das amostras. Portanto, recomenda-se para produzir uma solução stock de trabalho em meio de cultura, se utilizando o mesmo meio para todas as amostras, o resto de PBS (solução salina tamponada com fosfato) pode ser usado. Trabalhando solução estoque podem ser preparados de tal maneira que o volume distribuído em cada placa sob 10 ul. Além disso, para ser mais preciso, a forma das amostras replicadas para uma condição pode ser retirada para um tubo de 50 ml e as quantidades apropriadas de radioactividade podem ser adicionados a partir da solução de estoque de trabalho, em seguida, de volta e dispensarquantidades de forma a qua as placas. Se o número de células são limitados, tais como em culturas primárias, de 12 poços ou de 24 poços, as placas podem ser usadas para a cultura das células e reduzir a quantidade de radioactividade adicionada por poço proporcionalmente.

Este protocolo é simples, simples, e fornece medidas precisas dos níveis de síntese do heme. Por vezes, pode ser difícil para ressuspender o sedimento de células em tampão de extracção de heme (passo 2.8) completamente. Para evitar este seja rápido na etapa 2.8, adicionar tampão de extracção do heme para 1-2 amostras de cada vez, de vórtice e colocá-los em gelo. Verifique se o tampão de extracção heme não é muito antiga. Se o desvio-padrão entre as amostras idênticas é muito alto, preste atenção aos seguintes passos: 1) PBS foi removido completamente no passo 2,7; 2) evitar o derramamento da amostra quando em fase de éter etílico, siga a dica no passo 2,9; 3) Verifique se a radioactividade adicionada por placa ea confluência das amostras idênticas foram os mesmos.

28 normais não maligna (HBEC) contra células cancerosas (HCC), desenvolvido a partir do mesmo paciente. A técnica aqui descrita requer a utilização de [14 C] 5-ALA, um precursor na via de biossíntese do heme (Figura 1), e mede a radioactividade incorporada em heme. Nesta técnica, as porfirinas, incluindo heme, foram extraídos a partir das células em uma mistura de acetona, de ácido clorídrico concentrado e água 50,51. O heme foi ainda separado do porfirinas por extracção em éter dietílico e lavando a fase de éter com HCl 2 N 50,51. Em seguida, a radioactividade incorporada heme foi determinada utilizando um contador de cintilação. Os resultados podem ser normalizadas por a quantidade total de proteína ou número de células. A síntese de heme em células de HeLa foi inibida usando acetona succinilo (SA) e uma diminuição no nível de síntese do heme foi observado como mostrado prériormente 26 (Figura 3).

Este método é muito útil para a comparação dos níveis de síntese do heme, em condições diferentes, ou entre as linhas celulares (Figura 4). Ele requer um pequeno número de células e proporciona uma medição e comparação dos níveis de síntese do heme em células específicas diferentes. Não se pretende para a medição exacta de níveis absolutos heme nas células. É melhor usado para comparar os níveis de síntese do heme em células com propriedades diferentes, tais como células de cancro diferentes. Uma vez o cobalto, em vez de ferro, pode ser incorporado em heme na última etapa da síntese de heme e ser extraído 51, este método não pode produzir uma comparação precisa de síntese do heme, se os meios de cultura contêm diferentes níveis de cobalto ou de outros iões metálicos. No entanto, a via sintética do heme a partir de ácido 5-aminolevulínico a porfirinas e heme é muito específica, medindo os níveis de fluxo de toda a pathway é provável que seja mais reflexiva de actividades metabólicas relevantes para o heme, independentemente de os iões metálicos. Em contraste, o método utilizando 59Fe detecta apenas a parte da via de incorporação de Fe para formar heme 52. Embora isto seja mais específico, na presença de níveis significativos de iões metálicos, os níveis de síntese do heme detectados podem não reflectir o potencial metabólica de certas células, tais como células cancerosas. Além disso, Fe pode ser seqüestrado em outros locais ao lado de mitocôndrias celulares para fazer heme. De um modo geral, nós acreditamos que a utilização de [4- 14 C] 5-ALA é um método mais prático para a medição dos níveis de heme ao comparar as células com diferentes propriedades variadas.

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Disclosures

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgments

As linhas celulares HCC4017 e HBEC30KT foram gentilmente cedidas pelo laboratório do Dr. John Minna. Este trabalho foi apoiado pelos Cecil H. e Ida verdes fundos para Dr. Li Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)
Acetone
Concentrated HCl
Water
25 ml
1.3 ml
5 ml

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References

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Comments

1 Comment

  1. Could you please share where did you get the 14C-ALA?
    thanks a lot

    Reply
    Posted by: abel g.
    February 24, 2018 - 5:52 PM

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