Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Heme örneğin hemoglobin, miyoglobin ve sitokromlar olarak Hemoproteinler olarak bilinen bir protein çok çeşitli protez grup olarak hizmet etmektedir. Bu gibi gen transkripsiyon, translasyon, hücre farklılaşması, hücre çoğalması gibi farklı moleküler ve hücresel süreçlerde rol oynamaktadır. Heme biyosentez düzeyleri, farklı dokular ve hücre türleri arasında değişiklik gösterir ve anemi, nöropati ve kanser gibi, hastalıklı koşullarda değiştirilir. Bu tekniği kullanan [4- 14C] 5-aminolevulinik asit ([14C] 5-ala), memeli hücrelerinde hema sentez seviyesini ölçmek için hema biyosentez yolunun erken öncüler biri. Bu deney, heme dahil radyoaktivite heme ve ölçüm ekstre [14C] 5-ALA ile hücrelerin inkübasyonu içerir. Bu prosedür doğru ve hızlı. Bu yöntem, heme biyosentezi göreli seviyeleri ziyade toplam heme içeriğini ölçer. Bu techn kullanımını göstermek içinhema biyosentez düzeyleri IQue birçok memeli hücre çizgileri ölçüldü.

Introduction

Heme, ferros demir ve protoporfirin IX kompleks taşınması ve hemen hemen bütün canlı organizmalarda 1-3 oksijen kullanan için merkezi bir moleküldür. heme eşsiz yapısı atomlu gaz ve bir elektron taşıyıcı madde olarak işlev gibi çeşitli fonksiyonları yerine 1-5 sağlar. Örneğin, heme oksijen 6,7 transferi ve depolama için hemoglobin ve miyoglobin oksijen bağlanır. Ayrıca, solunum sırasında sitokromlar halinde bir elektron taşıyıcı madde olarak işler ve sitokrom P450 enzimleri ile katalize edilmiş 8,9-kimyasal redoks reaksiyonları için, elektron verici olarak hareket eder. Heme en önemli özelliklerinden biri de, gen transkripsiyonu, protein sentezi ve mikro-RNA biyogenez 4 gibi hücresel ve moleküler olayların düzenlenmesinde rol oynayabilir olmasıdır. Örneğin, bir memeli transkripsiyonel represör Bach1 aktivitesini ve memeli nükleer rec kontrol edilmesiyle çok sayıda genin transkripsiyonunu etkiliyorsaeptor Rev-erbα 10-15. Heme heme ya da oksijen 16. yanıt olarak, solunum ve oksidatif hasarını kontrol katılan genlerin aktivasyonunda önemli bir rol oynar heme aktivatör protein (Hap) 1 aktivasyonunu düzenler. Heme da 3,17-20 sinyal, sinir büyüme faktörü (NGF) ile nöronal hücrelerde gen transkripsiyonunu düzenler. Ayrıca, hema-regüle eIF2α kinaz (HRI) 21-24 aktivitesini modüle edilmesiyle, memeli eritroid hücrelerde protein sentezini düzenler. Bundan başka, heme uygun hücre fonksiyonu ve hücre büyümesi 4,20,25 için gerekli olan gibi tirosin kinaz Jak2 ve Src gibi anahtar sinyal proteinlerinin aktivitesini etkiler. Bu HeLa hücreleri hema inhibisyonu yaşlanma ve apoptoz 26 ile ilişkili markörler hücre siklüs hapsine ve aktivasyonunu neden olduğu tespit edilmiştir. Heme eksikliği ya da heme artmış düzeyleri her iki insanlarda 27 ciddi sağlık etkileri ile ilişkilidir. Son moleküler and epidemiyolojik çalışmalar yüksek heme alımının pozitif bir ilişki ve bu tip-2 diyabet, koroner kalp hastalığı ve akciğer kanseri, kolorektal kanser ve pankreas kanseri gibi birçok kanser 27,28 olarak hastalıkların riski göstermiştir. Normal ve kanser, akciğer hücreleri yazarların laboratuar eşleşen bir çift kullanarak kanser hücreleri, oksijen tüketimi, hema sentezi ve hem alımı ve oksijen kullanımı 28 yer alan protein düzeylerinde artış olduğunu bulmuşlardır. İlginç bir şekilde, heme sentezinin engellenmesi, oksijen tüketimi, proliferasyonu, kanser hücrelerinin 28 göç ve koloni oluşumu azalmıştır. Böylece endojen Heme seviyelerinde dalgalanmaları, moleküler ve hücresel süreçlerin 3,4,28,29 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar.

Memelilerde, hema grubuna ait biyosentezi mitokondri ve sitosol 4 (Şekil 1) yer alan enzimler içeren, sekiz adımda meydana gelir. Heme biosyntezi ALA sentaz (yazık) 4,31 ile katalize edilmiş 5-aminolevulinik asit (5-ALA) oluşturmak için glisin ve süksinil-CoA kondensasyonu ile mitokondri matris içinde başlar. Bu nonerythroid hücrelerde hem biyosentezi, oranın sınırlandığı aşama olan. 5-ALA ardından sonraki dört adım geri o protoporfirin IX (PPIX) dönüştürülür mitokondri, ithal edilir coproporphyrinogen III (CPgenIII) ​​oluşturmak üzere meydana sitoplazmada dışarı ihraç edilmektedir. Son olarak, demir bir molekülü heme, ferrokelataz (FECH) 2,4 ile katalize edilen bir reaksiyonun üretilmesi için protoporfirin IX (PPIX) için dahil edilmiştir.

hema biyosentezinin seviyesi esas olarak sıkı bir şekilde hücre içi demir ve heme 4 tarafından kontrol ne yazık ki enzim seviyesine bağlıdır. Heme biyosentez genetik bozukluklar, belirli bir mineral ve vitamin (örneğin, riboflavin, çinko), toksinler (örneğin, alüminyum, kurşun maruz kalma durumu etkilenebilir), Bazı steroidler (bir anoksi, ateş, ve düzeyler, örneğin östrojen) 32-35. hema sentezi düzeyi çeşitli hastalıklı koşullarda değiştirilir. Azalmış heme biyosentezi aneminin yanı sıra nörolojik hastalıklar 3,36 neden olabilir. Seçenek olarak ise, artan hem biyosentezi bazı kanser 28,37 ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Heme memeli yağ, eritroid ve nöronal hücrelerin 4,38-41 büyümesi, farklılaşması ve hayatta kalması için kritik olduğu gösterilmiştir. Örneğin, hema eksikliği glutamat NMDA (N-metil-D-aspartat) reseptörü 17 inhibisyonu yoluyla birincil fare kortikal nöronlarda nörit hasarına yol açar. Buna ek olarak, heme sentezinin engellenmesi, insan epitel serviks karsinomu, HeLa hücreleri, 26,41 programlanmış hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, farklı koşullar altında çeşitli hücrelerde hem biyosentezi seviyelerini ölçmek etyoloji ve progressi çalışmaları için önemlidirbirçok hastalığın üzerinde.

Burada [4- 14 C] 5-aminolevulic asit kullanılarak hücre içi heme sentez düzeyini ölçmek için hızlı ve hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Bu 55 Fe veya 59 Fe kullanan diğer yöntemlere alternatif bir yöntemdir. Onun radyasyon çok zayıf olduğu için biz 14 C kullanmayı tercih. Buna karşılık, güçlü bir koruma Fe izotopları ile çalışmak için gereklidir. Bundan başka, bu yöntem, ölçülmesi ve hızlı bir şekilde paralel olarak, farklı hücrelerde hema sentezi Karşılaştırma amaçlanmıştır. Mutlak heme düzeylerini ölçmek amacıyla, bir HPLC 42,43 kullanımını içeren daha önce kurulmuş yöntemi kullanabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

DİKKAT: radyoaktivite ile çalışırken, deneyci ve çevresi kirlenmesini önlemek için gerekli önlemleri alın. Yerel radyasyon güvenliği yönergeleri izleyerek tüm atık atınız.

Hücrelerin hazırlanması 1.

  1. Birleşme sağlandığı tahlil gününde% 80 -90% ulaşır, öyle ki 3,5 cm plakalar içinde tohum hücreleri.
    1. Hücrelerin konfluense ekim hücre tipine ve büyüme hızına bağlı olduğunu unutmayın. Belirli bir gün sayısı için bir reaktif ile hücrelerin tedavi ederken birbirine karışmaya hema ölçüm günü% 80-% 90 olacak şekilde, hücreler tohum. 3.5 cm plakalar elde edilen hücre sayısı yetersiz olduğu takdirde, bir sonraki aşamada olduğu gibi radyoaktif ALA aynı miktarı ile 6 cm tabak kullanın.
      Not: Bireysel plakalar ele almak daha kolay, çünkü tek tek tabak kullanılması tavsiye edilir.
  2. Heme ölçümü bir gün önce, bir nihai c ulaşmak için 0.1-0.3 uCI [14 C] 5-ALA ve soğuk ALA ekleyinRadyoaktif maddeler ile çalışmak için bir çalışma alanı uyum içinde her kültür çanak toplam ALA 20 mcM bağlı yoğunlaşma ve geri kuvöz içine plakaları koydu. İdeal olarak, 16 saat süre ile, radyoaktif ALA ile inkübe edin.
    Not: Radyo-5-ALA hücre hatları arasında değişebilir gerekli. En az 100 dakika (cpm) başına bir radyoaktif sayım sayma ile ilgili hatayı en aza indirmek için gereklidir. Bu çalışılan hücre hatları için gerekli olan [14C] 5-ALA'nın asgari miktarını belirlemek için tavsiye edilir. En deneyler için 0.1-0.3 uCi iyi bir ölçüm elde etmek için yeterlidir. Soğuk ALA'nın eklenmesi isteğe bağlıdır.

2. Heme Ekstraksiyon

  1. Buz üzerinde hücre kültürü yemekleri yerleştirin ve radyoaktivite çalışmaları için alan uyum götürün.
    1. Bir patlamaya dayanıklı kaput tüm çıkarma ve buharlaşma işlemini gerçekleştirmek. Saklanan eter patlayabilir çünkü, eter tutmayın, küçük şişelerde eter kullanımı ve kalan sıvı buharlaşırbir aydan fazla bir açık şişe. Son derece yanıcı olduğundan açık alev ve ısıtıcıların yakınında aseton kullanmayın. Bu doku kültürü plastik erirken cam şişeler içinde reaktifleri içeren mağazası aseton.
  2. Bir pipet kullanarak ortamı kapalı aspire. 1x soğuk PBS içinde 1 ml hücre, bir kez yıkayın. PBS kapalı aspire.
  3. Bir lastik polis kullanılarak plakanın altındaki hücreleri plakalara 1x soğuk PBS 1 ml ekleyin ve toplamak. Etiketlenmiş bir önceden soğutulmuş 2 ml tüp her plaka toplanan hücreler aktarın. 2 ml tüpler tüm hücreleri toplayın.
    Not: her plaka kazıyıcı hücreler her bir tabak için yeni bir kauçuk policeman kullanın. Her plaka için dört 2 ml tüpler, 1.5 ml tüp ve bir parıldama ampulünün gerektirecektir.
  4. 4 ° C'de 1 dakika süre ile 15,000 x g'de dönerler.
  5. Bir pipet kullanarak PBS çıkarıp kısa bir spin vermek ve artık PBS kaldırmak. 1x PBS 100 ul süspanse hücreleri. Vortex hücreleri tekrar süspansiyon ve buz üzerinde tutmak.
  6. Al 10-# 956; l buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüp ve saklamak için adım 5 ve transfer protein konsantrasyonu ölçmek için.
    Not: Hücre lisis tamponu hücrelere ilave edildi ve daha sonra proteini konsantrasyonunu ölçmek için buz üzerinde tutulmalıdır.
  7. 4 ° C sıcaklıkta 30 saniye boyunca 5000 x g'de 5 aşamasından gelen geri kalan 90 ul Spin; tamamen 200 ul pipet kullanarak PBS kaldırmak.
  8. Heme ekstraksiyon tamponu 300 ul ekleyin her tüpe (Malzeme Listesi'ne bakın). Sonra 15 saniye vorteks karıştırın ve 1 dakika süreyle buz koymak, bu 3 kez tekrarlayın.
    1. Heme ekstraksiyon tamponu (HEB) ekleyin ve pelletini hızla tüp vorteks, pelet çok uzun süre HEB sol olmadan hızlı bir şekilde yeniden süspanse edilmelidir çünkü bir anda yalnızca bir ya da iki tüpleri yok. HEB tüplere ilave edildi ve pelet, bundan sonra yeniden süspansiyona sonra pellet için HEB tampon maddesi içinde bırakılırsa pelet HEB içine tamamen devam olmayabilir Kademe 8. Not edildiği haliyle, buz döngüsünde 15 saniye girdap ve 1 dakika izleyin uzunZaman ve hızlı bir şekilde yeniden süspanse değil.
  9. 30 sn için her tüp ve vorteks dietil eter içinde 1.2 ml ilave edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15,000 x g'de dönerler.
    Not: dietil eter hızla pipet uçları biterse. Aşağı bir veya iki kez bu pipet dietil eter yukarı ve kontrol etmek, bunu yaparken pipet dietil eter tutulmasına yardımcı olur. Taze pipet ucu kullanılan bu her zaman tekrarlayın.
  10. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mi pipet ile üst (eter) faz transferi. Aşama 9'daki gibi 2 N HCI, karıştırmak için girdap ve spin 0.5 ml ilave edilir.
    Not: eter ve HCl fazları arasındaki mesafeyi görmek zordur. Bu nedenle, bunu bir soluk mavi renk vermek için, deney sırasında yeterince kullanılmak üzere 2 N HCI çözeltisi içinde Trypan mavi küçük miktarlarda ekleyin. Bu iki aşamadan ayırt yardımcı olacaktır. alt faz mavi olacak ve üst eter fazı renksiz olacaktır. Yeni bir tüp üst renksiz eter fazı aktarın ve alt HCI (mavi) fazı atın.
  11. 10. adımı yineleyin ikidaha çok kez 2 N HCI ile eter fazı yıkayın. Her tekrarı sırasında yeni bir tüpe sadece üst eter fazı aktarın ve alt HCI fazı atın.
  12. HCI ile Üçüncü yıkamadan sonra, bir sintilasyon şişesine 1 ml pipet üst faz transfer. Kimyasal kaput O / N örnekleri tutarak dietil eter buharlaştırılması ile örnekleri kurulayın.

Radyoaktivite ölçümü 3.

  1. Bir sonraki gün, adım 2.12 kurutuldu örneklere sintilasyon sıvısı 5 ml ekleyin.
  2. Karıştırmak için iyice çalkalayın. Bir sintilasyon sayacı kullanılarak radyoaktivite ölçülür.

4. Hesaplamalar

  1. CelLytic M tamponu eşit miktarda kullanarak adım 2.6 Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 14,000 x g'de ve spin (Malzeme listesi bakınız).
  2. Yüzer kısımdan bir şişe almak ve BCA protein tahlil kiti kullanılarak protein konsantrasyonu ölçülür.
    Mg (TP) protein toplam miktarı = (90 ul * kons. Proteininin in81 g / ul) / 1000
    Heme sentez düzeyi (radyoaktivite / TP) = protein pmol / mg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntem, kanser (HCC4017) akciğer hücrelerine karşı normal (HBEC30KT) 'de hema sentez seviyesini karşılaştırmak için kullanıldı. 2, normal akciğer hücrelerinin (HBEC30KT) kıyasla kanser hücreleri (HCC4017)' de hema sentez yüksek seviyede göstermektedir. hema sentezi seviyesi, aynı zamanda mitokondriyal uncoupler karbonil siyanit 3-klorofenilhidrazon (CCCP) varlığında, normal ve kanserli hücrelerde ölçülmüştür. Hücreler, heme sentez seviyelerinin ölçümü için 24 saat boyunca 10 uM CCCP ile tedavi edildi. Beklendiği gibi, hema sentezi seviyeleri (Şekil 2), normal ve kanser hücrelerinin her ikisinde de CCCP mevcudiyetinde azalmıştır. Bu, heme sentezi süksinil aseton (SA) ile inhibe edilebilir, daha önce, 5-aminolevulinik asit dehidrataz hema biyosentetik yolunda 41 ikinci bir enzimdir (ALAD) içindeki bir güçlü ve spesifik inhibitörü olduğu gösterilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, hema sentezi seviyeleri varlığında ve abs HeLa hücrelerinde ölçüldü0.5 mM SA. Şekil 3 ence gösterir SA varlığında fazla 10 kat azalmıştır hema sentezi seviyeleri. Bundan başka, bu tekniğin kullanımını göstermek için, heme sentez seviyesi ölçüldü ve Şekil 4'te gösterildiği gibi 4 kanserde ve HEK293T hücre çizgileri karşılaştırıldı.

Şekil 1
Şekil 1. İnsanlarda heme biyosentez yolu ALAS, 5-aminolevulinik asit sentaz.; 5-ALA, 5-aminolevulinik asit; ALAD, ALA dehidrataz; PBG, porphobilinogen; HMBS, hydroxymethylbilane sentez; HMB, hydroxymethylbilane; UROS III sentaz üroprofirinojen; UPgenIII, üroprofirinojen III; UROD, dekarboksilaz üroprofirinojen; CPgenIII, coproporphyrinogen III; CPOX, coproporphyrinogen III oksidaz; PPgenIX, protoporfirinojen IX; PPOX, protoporfirinojen IX oksidaz; PPIX, protoporfirin IX; FECH, Ferrokelataz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Normal (HBEC30KT) 'de hema biyosentezinin seviyeleri ve kanser (HCC4017) hücre ve yokluğunda 10 uM mitokondriyal uncoupler CCCP mevcudiyetinde yollar. Plan seviyesi boş numuneye (tek başına sintilasyon sıvısı) seviyesinde benzer olduğunu ve kontrol% 2'den az oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Abs HeLa hücrelerinde hema biyosentezinin 3. seviyesi şekildeence ve Hücreler heme ölçümden önce 3 gün SA ile tedavi edildi heme sentez inhibitörü succinyl aseton 0.5 mM (SA). varlığı. arka plan seviyesi boş numune (yalnız parıldama sıvısı) seviyesine benzer ve. kontrolü% 2'den az olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
4 kanseri ve HEK293T hücre çizgilerinde hema biyosentez düzeyleri Şekil 4. karşılaştırması. Deney protokolü gibi gerçekleştirilmiştir. HCC4017% 5 FBS,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK293T ve HeLa ile desteklenmiş RPMI1640 içinde ACL4 ortam, A549 ve H1395 içinde büyütülmüştür. İstatistiksel analiz için, kanser hücreleri ve HEK293T hücrelerinde hema sentezi seviyesi HCC40 heme sentezi seviyesi ile karşılaştırıldıWelch 2-örnek t-testi ile 17 hücreleri. ** P <0.005. arka plan seviyesi boş numune (yalnız parıldama sıvısı) seviyesine benzer ve. kontrolü% 2'den az olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heme solunum yoluyla 26 hücresel enerji üretiminde önemli bir rol oynar. Altered heme metabolizması kanseri 28,41 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu bilinmektedir. Hema sentezinin önlenmesi Hela hücreleri 26,41 hücre döngüsü tutuklama ve apoptoza yol açtığı bilinmektedir. Yüksek heme sentez düzeyi akciğer kanseri hücrelerinin 28 ilerlemesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, farklı koşullar altında hücrelerde hema biyosentezi seviyelerini ölçmek için çok önemli olacaktır. Bu nedenle heme toplam miktarını ölçmek etmez Burada ele alınan yöntem olup, bu hücreler içinde bulunan hema grubuna ait mutlak değeri sağlamaz. Hücrelerde heme toplam miktarlarını ölçmek için kullanılabilir kolorimetrik yöntemler ve kitler bir çeşitlilik vardır. Örneğin, hema aseton ve HCI karışımı içinde hücreler ve mitokondri elde edilebilir ve% 50 (h / h) asetonitril ile karıştırılır. Daha sonra karışım uygulanabilir400 nm 44,45 0.05% ihtiva eden asetonitril (h / h) trifloroasetik asit ve hem bileşiklerin belirlenmesi için bir gradyanı içinde heme elüsyonu ardından 3.9 x 300 mm C18 Bondclone kolonuna.

Daha önce, memeli doku ve hücre özütlerinde [14C] -glisin ve [14C] 5- ALA 46,47 kullanılmıştır heme biyosentezi seviyelerini ölçmek. Etiketli glisin ilk adımda hema biyosentez yoluna giren, ancak rağmen heme içine sınırlı dahil sonuçlanan diğer metabolik yollar ile boşaltılır. Glisin heme biyosentez yolunun 48 için spesifik bir metabolit değildir. Öte yandan, 5-ALA hema biyosentez yolunun özgü etiketlenmiş. Bu özellik, glisin 46,48,49 üzerinden 5-ALA kullanılarak nicel bir avantaj sağlar. Bu nedenle, radyoaktif 5-ALA kullanımı ölçmek ve heme biyosentezi düzeylerini karşılaştırmak için daha spesifik ve doğru bir yöntemdir.

En ctutarlı sonuçlar elde etmek için ritical adımlar şunlardır: 1) emin olun daha yüksek% 100 ve çeşitli koşullar karşısında değil, aşağıda% 70 gitmez hücre confluency; Bu yöntem çok hassas olduğu için 2) plaka başına eklenen radyoaktivite miktarı aynı olmalıdır; 3) heme ekstraksiyon tamponu eski olmamalı, taze her zaman yapmak tavsiye edilir. plaka başına gerekli olan radyoaktivite miktarı çok küçüktür ve bunun örnekleri arasında aynı miktarda muhafaza etmek zordur. Bu nedenle, tüm numuneler için aynı ortam kullanılarak durumunda, kültür ortamı içinde, bir işlem stok çözelti yapmak için tavsiye edilir, başka bir PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) kullanılabilir. Çalışma stok çözeltisi plaka başına tevzi hacmi 10 ul altında şekilde hazırlanabilir. Ayrıca, daha doğru olduğu üzere, tek bir durum için, kopya numuneler arasında ortamı, daha sonra e tekrar tevzi, 50 ml'lik bir tüp içinde alınabilir ve radyoaktivite uygun miktarları işlem stok çözeltisi eklenebilirplakalara orta qual miktarda. Hücrelerin sayısı, birincil kültürleri olarak, bunlarla sınırlı ise, 12 oyuklu veya 24 oyuklu plakalar, kültür hücreleri kullanılır ve de orantılı başına eklenen radyoaktivite miktarını azaltmak edilebilir.

Bu protokol, basit basit ve hem sentezi seviyeleri doğru önlemleri içerir. Bazı durumlarda, tamamen heme ekstraksiyon tamponu (aşama 2.8) hücre pelletini zor olabilir. Bu adımda 2.8 hızlı olmak önlemek için, bir zaman, girdap 1-2 örnekleri heme ekstraksiyon tamponu ekleyin ve buz üzerine koydu. Heme ekstraksiyon tamponu çok eski olmadığından emin olun. Çoğaltmak örnekleri arasında standart sapma çok yüksek ise, aşağıdaki adımlara dikkat: PBS tamamen adımda 2.7 çıkarıldı 1); 2) dietil eter aşamasında, adım 2.9 ucu izlediğinizde örnek dökülmesini önlemek; 3) radyoaktivite plaka başına eklenen ve çoğaltmak örneklerin confluency aynıydı emin olun.

28 gösterildiği gibi radyoaktif 5-ALA yöntem kullanılarak P = "jove_content">, hema sentezi seviyeleri karşılaştırılmıştır. Burada anlatılan teknik, [14C] 5-Ala, heme biyosentez yolunda bir ön-madde (Şekil 1) kullanımını gerektirir ve heme dahil radyoaktivite ölçülür. Bu teknikte, heme içeren porfirinler, aseton karışımında hücrelerinden ekstre edildi, HCI ve su 50,51 konsantre edildi. Heme da dietil eter içinde ekstre edilmesi ve 2 N HCI 50,51 ile, eter fazı yıkanarak porfirinler ayrıldı. Daha sonra, heme dahil radyoaktivite, bir sintilasyon sayacı kullanılarak belirlendi. Sonuçlar protein veya hücre sayısı toplam miktarına göre normalize edilebilmektedir. HeLa hücrelerinde Heme sentezi süksinil aseton (SA) ve hem sentezi seviyesinde bir düşüş ile inhibe edilmiştir gösterilen ön gözlemlenmiştirbir önce 26 (Şekil 3).

Bu yöntem, (Şekil 4), farklı koşullar altında ya da hücre hatları arasında hema sentez seviyelerinin karşılaştırılması için çok yararlıdır. Bu hücrelerin küçük bir sayıda gerektirir ve spesifik ölçüm ve farklı hücrelerde hema sentez seviyelerinin karşılaştırmasını sağlar. Bu hücrelerde mutlak heme seviyelerinin doğru ölçümü için uygun değildir. Bu en iyi biçimde, farklı kanser hücreleri gibi farklı özelliklere sahip hücrelerde hema sentez seviyesini karşılaştırmak için kullanılır. Kobalt için, bunun yerine demir, büyüme ortamı kobalt ya da diğer metal iyonları farklı seviyelerde içeren, bu yöntem, hema sentezi doğru bir karşılaştırma vermeyebilir, hema sentezin son aşamasında heme dahil edilebilir ve 51 elde edilebilir. Bununla birlikte, 5-aminolevulinik asit porfirinler ve heme için hema sentetik bir yol, tüm p akı seviyelerinin ölçülmesi, çok özel birathway bağımsız olarak metal iyonlarının, heme ilgili metabolik faaliyetleri daha yansıtıcı olması muhtemeldir. Bunun aksine, 59 Fe kullanan metot heme 52 oluşturmak üzere Fe içeren yolunun sadece bir bölümünü tespit eder. Bu metal iyonlarının önemli seviyelerde mevcudiyetinde, daha özel olmakla birlikte, tespit edilen heme sentezi seviyeleri, kanser hücreleri gibi belirli hücrelerin metabolik potansiyelini yansıtmayabilir. Ayrıca, Fe heme yapmak için mitokondri yanında diğer hücresel konumlara saklamış olabilir. Ve büyük, biz [4- 14 C] 5-ALA kullanımı değişen özellikleri ile farklı hücreler karşılaştırırken heme seviyelerini ölçmek için daha pratik bir yöntem olduğuna inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

HCC4017 ve HBEC30KT hücre hatları nazik Dr John Minna laboratuvarında tarafından sağlandı. Bu çalışma Dr Li Zhang Cecil H. ve Ida Yeşil fonları tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)
Acetone
Concentrated HCl
Water
25 ml
1.3 ml
5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Comments

1 Comment

  1. Could you please share where did you get the 14C-ALA?
    thanks a lot

    Reply
    Posted by: abel g.
    February 24, 2018 - 5:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics