Måling af hæmoglobinsyntese Niveauer i pattedyrceller

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hæm tjener som den prostetiske gruppe for en bred vifte af proteiner kaldet hæmoproteiner såsom hæmoglobin, myoglobin og cytochromer. Det er involveret i forskellige molekylære og cellulære processer, såsom gen-transkription, translation, celledifferentiering og celleproliferation. Biosyntesen niveauer af hæm varierer på tværs af forskellige væv og celletyper og ændres i syge tilstande, såsom anæmi, neuropati og cancer. Denne teknik anvender [4- 14C] 5-aminolevulinsyre ([14C] 5-ALA), en af de tidlige forstadier i hæm-biosyntesevejen at måle indholdet af hæm syntese i pattedyrceller. Dette assay involverer inkubation af celler med [14C] 5-ALA efterfulgt af ekstraktion af hæm og måling af radioaktiviteten inkorporeret i hæm. Denne procedure er nøjagtig og hurtig. Denne metode måler de relative det samlede hæm indholdet niveauer af hæm biosyntesen stedet. For at demonstrere brugen af ​​denne technique niveauerne af hæm-biosyntese blev målt i flere mammale cellelinjer.

Introduction

Hæm, et kompleks af ferrojern og protoporphyrin IX er et centralt molekyle til transport og udnytte ilt i næsten alle levende organismer 1-3. Den unikke struktur af hæm gør det muligt at fungere som en bærer af diatomiske gasser og elektroner, samt til at udføre forskellige andre funktioner 1-5. For eksempel hæm binder sig til ilt i hæmoglobin og myoglobin til overførsel og opbevaring af ilt 6,7. Det virker også som en elektron luftfartsselskab i cytochromer under respiration og virker som en elektron donor for redoxreaktioner katalyseret af cytochrom P450 enzymer 8,9. En af de mest betydningsfulde træk ved hæm er, at det kan spille regulatoriske roller i cellulære og molekylære processer, såsom gentranskription, proteinsyntese og mikro-RNA biogenese 4. For eksempel den påvirker transkriptionen af ​​mange gener ved at styre aktiviteten af ​​pattedyr transskriptionsrepressor Bach1 og pattedyrs nukleare receptor Rev-erbα 10-15. Hæm regulerer aktiveringen af hæm aktivatorprotein (Hap) 1, som spiller en vigtig rolle i aktiveringen af gener involveret i respiration og styring oxidativ skade, som reaktion på hæm eller oxygen 16. Hæm også regulerer gentranskription i neuronale celler via nervevækstfaktor (NGF) signalering 3,17-20. Det regulerer også proteinsyntese i mammale erythroide celler ved at modulere aktiviteten af hæm-reguleret eIF2α kinase (HRI) 21-24. Desuden hæm påvirker aktiviteten af centrale signalering proteiner såsom tyrosinkinase Jak2 og Src, som er afgørende for korrekt celle funktion og cellevækst 4,20,25. Det konstateredes, at celler hæm inhibering i HeLa forårsager cellecyklusstandsning og aktivering af markører associeret med alderdom og apoptose 26. Både Heme mangel eller øget hæm er forbundet med alvorlige virkninger sundhed hos mennesker 27. Seneste molekylær ennd epidemiologiske undersøgelser har vist en positiv sammenhæng med høj hæm indtag og øget risiko for sygdomme, såsom type-2 diabetes, hjertesygdomme og flere kræftformer, herunder lungekræft, tarmkræft og bugspytkirtelkræft 27,28. Ved hjælp af en matchede par normale og cancer lungeceller forfatternes lab har fundet, at kræftceller har øget indhold af ilt forbrug, hæm syntese og proteiner involveret i hæm optagelse og ilt udnyttelse 28. Interessant inhibering af hæm syntese reduceret oxygenforbrug, proliferation, migration og kolonidannelse af kræftceller 28. Således udsving i niveauet af endogen hæm spiller en vigtig rolle i reguleringen af molekylære og cellulære processer 3,4,28,29.

I pattedyr biosyntesen af hæm forekommer i otte trin, der involverer enzymer placeret i mitokondrierne og cytosolen 4 (figur 1). Hæm Biosynafhandling begynder i matrixen af mitokondrier med kondensationen af glycin og succinyl-CoA til dannelse af 5-aminolevulinsyre (5-ALA), katalyseret af ALA synthase (desværre) 4,31. Dette er det hastighedsbegrænsende trin i hæm biosyntese i nonerythroid celler. 5-ALA derefter eksporteres ud til cytosolen, hvor de næste fire trin forekommer for at danne coproporphyrinogen III (CPgenIII), som derefter importeres tilbage til mitokondrierne, hvor det omdannes til protoporphyrin IX (PPIX). Endelig er et molekyle af jern inkorporeres i protoporphyrin IX (PPIX) til fremstilling af hæm, en reaktion katalyseret af ferrochelatase (FECH) 2,4.

Niveauet af hæm biosyntesen afhænger primært af niveauet af ALAS enzym, der er stramt styret af intracellulær jern og hæm 4. Biosyntesen af hæm kan påvirkes af genetiske defekter, tilgængelighed af visse mineraler og vitaminer (f.eks, riboflavin, zink), udsættelse for toksiner (fx aluminium, bly), Anoksi, feber og koncentrationer af visse steroider (f.eks østrogen) 32-35. Niveauet af hæm syntese ændres i forskellige sygdomstilstande. Nedsat hæm biosyntesen kan forårsage anæmi samt neurologiske sygdomme 3,36. Alternativt øget hæm biosyntesen spiller en vigtig rolle i udviklingen af visse kræftformer 28,37. Hæm har vist sig at være kritisk for vækst, differentiering og overlevelse af pattedyr adipose, erythroide og neuronale celler 4,38-41. For eksempel hæm mangel fører til neurit skader i primære muse corticale neuroner via hæmning af glutamat NMDA (N-methyl-D-aspartat) -receptoren 17. Derudover inhibering af hæm syntese forårsager programmeret celledød i den humane epitel cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Derfor er vigtig for at studere ætiologi og progressi måling af hæm biosyntese niveauer i forskellige celler under forskellige betingelserpå af mange sygdomme.

Her beskriver vi en hurtig og følsom metode til at måle niveauet af intracellulær hæm syntese ved anvendelse af [4- 14C] 5-aminolevulic syre. Dette er en alternativ metode til andre fremgangsmåder, der anvender 55 Fe eller 59 Fe. Vi foretrækker at bruge 14C fordi dens stråling er meget svag. I modsætning hertil er nødvendig for at arbejde med Fe isotoper stærk beskyttelse. Desuden er denne metode bestemt til at måle og sammenligne hæm syntese i forskellige celler i parallel på en hurtig måde. For at måle absolutte hæm niveauer, kan man anvende den tidligere fastsatte fremgangsmåde involverer anvendelsen af HPLC 42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ADVARSEL: Når du arbejder med radioaktivitet, træffe passende forholdsregler for at undgå forurening af forsøgslederen og omgivelserne. Bortskaf off alt affald efter lokale retningslinjer strålingssikkerhed.

1. Fremstilling af celler

  1. Seed celler i 3,5 cm plader, således at sammenflydning når op på 80% -90% på dagen for assayet.
    1. Bemærk, at podning konfluens for celler afhænger af den celletype og deres vækstrate. Ved behandling af cellerne med et reagens til et bestemt antal dage, frø celler, således at sammenflydning er 80% -90% på dagen for hæm måling. Hvis antallet af celler opnået fra 3,5 cm plader er utilstrækkelig, anvende 6 cm plader med samme mængde radioaktivt ALA som i det næste trin.
      Bemærk: Anvendelse af individuelle plader anbefales, da det er lettere at håndtere individuelle plader.
  2. En dag før hæm måling, tilsættes 0,1-0,3 pCi [14 C] 5-ALA og kold ALA at nå en endelig concentration af 20 uM af den samlede ALA til hver kultur skål i et arbejdsområde egnet til at arbejde med radioaktivt materiale og sætte pladerne tilbage i inkubatoren. Ideelt, inkuberes med radioaktivt ALA i 16 timer.
    Bemærk: Radiomærkede 5-ALA kræves, kan variere mellem cellelinier. En radioaktiv tælling per minut (cpm) på mindst 100 er forpligtet til at minimere fejl i forbindelse med optælling. Det er tilrådeligt at bestemme et minimum af [14 C] 5-ALA kræves til cellelinier under studiet. For de fleste eksperimenter 0,1-0,3 uCi er tilstrækkeligt til at få en god måling. Tilsætning af kold ALA er valgfri.

2. Heme Extraction

  1. Placer cellekulturskåle på is og tage dem til pasform område for radioaktivitet arbejde.
    1. Udføre hele ekstraktion og inddampning processen i et eksplosionssikkert hætte. Fordi den lagrede æter kan eksplodere, bruge ether i små flasker og fordampe eventuelle resterende væsker, må ikke opbevares ether ien åben flaske i mere end en måned. Brug ikke acetone nærheden af ​​åben ild og varmeapparater, da det er meget brandfarligt. Store acetone indeholdende reagenser i glasflasker når det opløses vævskultur plast.
  2. Aspirer off mediet ved anvendelse af en pipette. Vask cellerne én gang med 1 ml 1x kold PBS. Aspirer off PBS.
  3. Der tilsættes 1 ml 1x kold PBS til pladerne og indsamle cellerne ved bunden af ​​pladen under anvendelse af en gummiskraber. Overføre de indsamlede celler fra hver plade til en mærket forkølet 2 ml rør. Saml alle celler i 2 ml rør.
    Bemærk: Brug en ny gummispatel for hver plade til at skrabe celler fra hver plade. For hver plade du ville kræve fire 2 ml rør, et 1,5 ml rør og et scintillationsglas.
  4. Centrifugering ved 15.000 xg i 1 min ved 4 ° C.
  5. Tag PBS ved hjælp af en pipette, giver en kort centrifugering og fjern resterende PBS. Resuspender celler i 100 pi 1x PBS. Vortex for at resuspendere celler og holde på is.
  6. Tag 10 &# 956; l fra trin 5 og overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares på is for at måle proteinkoncentration.
    Bemærk: Cell lysisbuffer bør tilsættes til cellerne og holdes på is til måling proteinkoncentration senere.
  7. Spin de resterende 90 pi fra trin 5 ved 5000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C; fjerne PBS fuldstændigt ved anvendelse af en 200 pi pipettespids.
  8. Der tilsættes 300 pi hæm ekstraktionsbuffer (se Materialer List) til hvert rør. Derefter vortex i 15 sekunder for at blande og lagt på is i 1 min, gentages dette 3 gange.
    1. Tilføj hæm ekstraktionsbuffer (HEB) og vortex røret hurtigt at resuspendere pelleten, gør kun en eller to rør ad gangen, fordi pelleten bør resuspenderes hurtigt uden at blive efterladt i HEB for længe. Når HEB sættes til alle rørene og pellet resuspenderes derefter følge 15 sek vortex og 1 min på is cyklus som i trin 8. Bemærk, at pellet ikke kan gå helt ind i HEB hvis pelleten efterlades i HEB buffer i en længeretid og ikke resuspenderet hurtigt.
  9. Tilsæt 1,2 ml diethylether til hvert rør og vortex i 30 sek. Centrifugering ved 15.000 xg i 5 min ved 4 ° C.
    Bemærk: Diethylether løber tør for pipettespidser hurtigt. Til at styre dette, pipette diethylether op og ned et par gange, at gøre det hjælper holde diethylether i pipetten. Gentag dette, hver gang en ny pipettespids anvendes.
  10. Top (ether) fase overføres med 1 ml pipette til et nyt mikrocentrifugerør. Tilføj 0,5 ml 2 N HCI, vortex at blande og centrifugering som i trin 9.
    Bemærk: Det er vanskeligt at se adskillelsen mellem ether og HCl faser. Derfor, tilsættes små mængder af Trypan blå i 2 N HCI-opløsning, der skal anvendes under forsøget, nok til at give det en bleg blå farve. Dette vil hjælpe med at skelne de to faser. Den nedre fase bliver blå og den øvre etherfasen vil være farveløs. Overfør den øvre farveløse ether fase til et nyt rør og den nedre HCI (blå) fase kasseres.
  11. Gentag trin 10 toflere gange for at Etherfasen vaskes med 2 N HCI. Overføre kun det øverste ether fase til et nyt rør i hver gentagelse og den nedre HCI fase kasseres.
  12. Efter den tredje vask med HCI, overføre den øverste fase med 1 ml pipette til et scintillationshætteglas. Tørre prøverne ved afdampning af diethylether ved at holde prøverne i den kemiske hætte O / N.

3. Måling af radioaktivitet

  1. Næste dag, tilsættes 5 ml scintillationsvæske til de tørrede prøver fra trin 2.12.
  2. Ryst godt for at blande. Måle radioaktivitet ved anvendelse af en scintillationstæller.

4. Beregninger

  1. Lysere cellerne fra trin 2.6 under anvendelse af lige mængder af CelLytic M puffer (se Materialer listen) og centrifugering ved 14.000 xg i 5 min ved 4 ° C.
  2. Tag en portion af supernatanten og måle koncentrationen protein under anvendelse af BCA proteinassaykit.
    Totale mængde af protein i mg (TP) = (90 pi * konc. Af protein i81 g / pl) / 1,000
    Hæmoglobinsyntese niveau (radioaktivitet / TP) = pmol / mg protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode blev anvendt til at sammenligne niveauerne af hæm syntese i normal (HBEC30KT) vs. cancer (HCC4017) lungeceller. Figur 2 viser en højere grad af hæm syntese i cancerceller (HCC4017) end normale lungeceller (HBEC30KT). Niveauet af hæm syntese blev også målt i normale celler og cancerceller i nærvær af mitokondrie afkobleren carbonyl cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP). Celler blev behandlet med 10 pM CCCP i 24 timer før målingen af ​​hæm syntese niveauer. Som forventet niveauerne af hæm syntese (Figur 2) faldt i nærvær af CCCP i både normale celler og cancerceller. Det er blevet vist tidligere, at hæm syntese kan hæmmes ved succinyl acetone (SA), en potent og specifik inhibitor af 5-aminolevulinsyre-dehydratase (ALAD) som er det andet enzym i hembiosyntesevejen 41. Under anvendelse af denne fremgangsmåde blev de hæmoglobinsyntese niveauer målt i HeLa-celler i nærvær og absning af 0,5 mM SA. Figur 3 viser, at niveauet af hæm syntese faldt med mere end 10-folds i nærvær af SA. For yderligere at demonstrere brugen af denne teknik, blev niveauerne af hæm syntese målt og sammenlignet i 4 cancer og i HEK293T cellelinier som vist i figur 4.

Figur 1
Figur 1. hæm biosyntese vej hos mennesker ak, 5-aminolevulinsyre-syntase-.; 5-ALA, 5-aminolevulinsyre; ALAD, ALA dehydratasen; PBG, porfobilinogen; HMBS, hydroxymethylbilane syntase; HMB, hydroxymethylbilane; UROS, uroporphyrinogen III syntase; UPgenIII, uroporphyrinogen III; Urod, uroporphyrinogen decarboxylase; CPgenIII, coproporphyrinogen III; CPOX, coproporphyrinogen III oxidase; PPgenIX, protoporphyrinogen IX; PPOX, protoporphyrinogen IX oxidase; PPIX, protoporphyrin IX; FECH, Ferrochelatase. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Niveauerne af hæm biosyntesen i normal (HBEC30KT) og kræft (HCC4017) cellelinjer, i fravær og nærvær af 10 uM mitokondrie afkobler CCCP. Baggrundsniveauet var svarende til niveauet for blindprøve (scintillationsvæske alene) og det var mindre end 2% af kontrollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Niveauer af hæm biosyntesen i HeLa-celler i absning og nærvær af 0,5 mM af hæm syntese inhibitor succinyl acetone (SA). Cellerne blev behandlet med SA i 3 dage før hæm måling. Baggrundsniveauet svarede til niveauet for blindprøve (scintillationsvæske alene), og det var mindre end 2% af kontrollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Sammenligning af indholdet af hæm biosyntesen i 4 kræft og HEK293T cellelinjer. Assay blev udført som pr protokollen. HCC4017 blev dyrket i ACL4 medier, A549 og H1395 i RPMI1640 suppleret med 5% FBS, HEK293T og HeLa i DMEM suppleret med 10% FBS. Til statistisk analyse blev hæm syntese niveauer i cancerceller og HEK293T celler sammenlignet med hæm syntese niveau i HCC4017 celler, ved hjælp af Welch 2-sample t-test. **, P-værdi <0,005. Baggrundsniveauet svarede til niveauet for blindprøve (scintillationsvæske alene), og det var mindre end 2% af kontrollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hæm spiller en central rolle i dannelsen af cellulære energi via respiration 26. Altered hæm stofskifte er kendt for at være forbundet med forskellige sygdomme herunder kræft 28,41. Inhibering af hæm syntese er kendt for at forårsage cellecyklusstop og apoptose i Hela-celler 26,41. Det er blevet vist, at høje hæm syntese niveau er forbundet med progressionen af lungecancerceller 28. Det ville derfor være af stor betydning at måle indholdet af hæm biosyntese i celler under forskellige betingelser. Metoden diskuteret her ikke kvantificere det samlede beløb for hæm derfor betyder det ikke giver den absolutte værdi af hæm stede i cellerne. Der er en række af kolorimetriske fremgangsmåder og kits til rådighed til at måle den samlede mængde af hæm i cellerne. For eksempel kan hæm ekstraheres fra celler og mitokondrier i en blanding af acetone og HCI og blandet med 50% (vol / vol) acetonitril. Så kan anvendes blandingentil en 3,9 x 300 mm C18 Bondclone søjle efterfulgt af eluering af hæm i en gradient af acetonitril indeholdende 0,05% (v / v) trifluoreddikesyre og identificere hæm-forbindelser ved 400 nm 44,45.

Tidligere, at måle indholdet af hæm biosyntesen i mammale væv og celleekstrakter [14C] -glycin og [14C] 5- ALA blev anvendt 46,47. Selvom mærket glycin kommer ind i hæm biosyntese pathway ved det første skridt, men den tappes af andre metaboliske veje resulterer i begrænsede inkorporering i hæm. Glycin er ikke en specifik metabolit for hæm biosyntese pathway 48. På den anden side, mærket 5-ALA er specifik for hæm biosyntesevejen. Denne funktion giver en kvantitativ fordel ved anvendelse af 5-ALA løbet glycin 46,48,49. Derfor anvendelsen af ​​radioaktive 5-ALA er en mere specifik og præcis metode til at måle og sammenligne niveauerne af hæm biosyntesen.

De fleste critical skridt til at få ensartede resultater er: 1) at sikre, at cellekonfluens ikke gå højere end 100% og ikke under 70% på tværs af forskellige forhold; 2) størrelsen af ​​tilsatte radioaktivitet pr plade skal være identiske, fordi denne metode er meget følsom; 3) hæm ekstraktionsbuffer bør ikke være gammel, anbefales det at gøre frisk hver gang. Volumenet af radioaktivitet kræves pr plade er meget små, og det er vanskeligt at opretholde de identiske mængder tværs prøverne. Det anbefales derfor, at foretage en arbejder stamopløsning i dyrkningsmediet, hvis bruger det samme medium for alle prøverne, kan ellers PBS (phosphatbufret saltvand) anvendes. Arbejde stamopløsning kan fremstilles på en sådan måde, at den dispenserede volumen per plade er under 10 pi. Også, at være mere præcis, kan mediet fra udtages med henblik på én betingelse tages ud i et 50 ml rør og passende mængder af radioaktivitet kan tilføjes fra arbejde stamopløsning, så dispensere tilbage ekvali mængder af medium til pladerne. Hvis er begrænset af antallet af celler, såsom i primære kulturer, kan 12-well eller 24-brønds plader anvendes til dyrkning af cellerne og reducere mængden af ​​radioaktivitet tilsat per brønd forholdsmæssigt.

Denne protokol er ligetil, enkel og giver nøjagtige mål for niveauet af hæm syntese. Nogle gange kan det være vanskeligt at resuspendere cellepelleten i hæm ekstraktionsbuffer (trin 2.8) fuldstændigt. For at undgå dette være hurtig i trin 2.8, tilsættes hæm ekstraktionsbuffer til 1-2 prøver ad gangen, vortex og læg dem på is. Sørg for, at hæm ekstraktionsbuffer ikke er for gammel. Hvis standardafvigelsen blandt de udtages er for høj, være opmærksom på følgende trin: 1) PBS blev fjernet helt i trin 2.7; 2) undgå at spilde prøven når i diethylether fase Følg spidsen i trin 2.9; 3) sørg den tilsatte radioaktivitet pr plade og konfluens af de udtages var de samme.

28 i normal ikke-malign (HBEC) vs. cancer (HCC) celler, der er udviklet fra den samme patient. Den her beskrevne teknik kræver anvendelse af [14C] 5-ALA, en precursor i hæm biosyntesevejen (figur 1), og måler radioaktivitet inkorporeret i hæm. Ved denne teknik porphyriner, herunder hæm, blev ekstraheret fra cellerne i en blanding af acetone, koncentreret HCI og vand 50,51. Hæm blev yderligere separeret fra porphyriner ved ekstraktion i diethylether og vaskning af etherfasen med 2 N HCI 50,51. Derefter blev radioaktiviteten inkorporeret i hæm bestemt under anvendelse af en scintillationstæller. Resultaterne kan normaliseres ved den totale mængde af protein eller celleantal. Hæmoglobinsyntese i HeLa-celler blev inhiberet ved anvendelse af succinyl acetone (SA) og et fald i niveauet af hæm syntese blev observeret som vist prægere 26 (figur 3).

Denne metode er meget nyttig til sammenligning af niveauerne af hæm syntese under forskellige betingelser eller mellem cellelinier (figur 4). Det kræver et lille antal celler og tilvejebringer specifik måling og sammenligning af indholdet af hæm-syntese i forskellige celler. Det er ikke beregnet til nøjagtig måling af absolutte hæm niveauer i cellerne. Det er bedst anvendt til at sammenligne niveauerne af hæm syntese i celler med forskellige egenskaber, såsom forskellige cancerceller. Fordi cobalt, i stedet for jern, kan inkorporeres i hæm i det sidste trin af hæm syntese og ekstraheres 51, denne metode kan ikke give nøjagtig sammenligning af hæm syntese, hvis medierne væksten indeholde forskellige niveauer af cobalt eller andre metalioner. Alligevel hæm syntetiske vej fra 5-aminolevulinsyre til porphyriner og hæm er meget specifik, måling af flux niveauer i hele pathway er sandsynligvis være mere reflekterende af metaboliske aktiviteter er relevante for hæm, uanset metalioner. I modsætning hertil fremgangsmåde under anvendelse af 59 Fe detekterer kun den del af omsætningsvejen inkorporerer Fe til dannelse hæm 52. Selv om dette er mere specifik, i nærværelse af signifikante niveauer af metalioner, kan de detekterede hæm syntese niveauer afspejler ikke den metaboliske virkning af visse celler, såsom cancerceller. Endvidere kan Fe sekvestreres i andre cellulære steder ved siden mitokondrier at gøre hæm. I det store, mener vi, at anvendelse af [4- 14C] 5-ALA er en mere praktisk fremgangsmåde til måling hæm niveauer, når man sammenligner forskellige celler med varierende egenskaber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

De HCC4017 og HBEC30KT cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. John Minna laboratorium. Dette arbejde blev støttet af Cecil H. og Ida Grøn midler til Dr. Li Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)
Acetone
Concentrated HCl
Water
25 ml
1.3 ml
5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Comments

1 Comment

  1. Could you please share where did you get the 14C-ALA?
    thanks a lot

    Reply
    Posted by: abel g.
    February 24, 2018 - 5:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics