ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity. J. Vis. Exp. (88), e51640, doi:10.3791/51640 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניחוחות ליצור דפוסים ייחודיים וחופפים של הפעלה קולטני ריח, המאפשרים למשפחה של כ -1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים להכיר אלפי ניחוחי. ligands odorant פורסמו על פחות מ -6% של קולטנים אנושיים 1-11. זה חוסר הנתונים נובע בחלקו לקשיים תפקודי המבטאים קולטנים אלה במערכות Heterologous. כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי המכריע של משפחת חוש הריח קולטן בתאי Hana3A, ואחריו הערכת תפוקה גבוהה של הפעלה קולטני ריח באמצעות assay כתב בלוציפראז. assay זה יכול לשמש כדי (1) פנלי מסך של ניחוחי נגד פנלים של קולטני ריח; (2) לאשר אינטראקציה odorant / קולט באמצעות עקומות מינון תגובה; ו (3) להשוות את רמות הפעלת קולטן בין גרסאות הקולטן. בנתוני הדוגמא שלנו, 328 קולטני ריח הוקרנו נגד 26 הניחוח. זוגות odorant / קולטן עם ציוני תגובה שונים היו אין תמיכה בבחירהטד ונבדק בתגובה מינון. נתונים אלה מצביעים על כך שמסך הוא שיטה יעילה להעשרה לזוגות odorant / קולט שיעברו ניסוי תגובת מינון, כלומר הקולטנים שיש לי תגובה בתום לב לodorant. לכן, assay לוציפראז תפוקה גבוהה זו הוא שיטה יעילה לאפיון קולטנים צעד חיוני חוש הריח לכיוון מודל של קידוד ריח במערכת ההרחה של היונקים.

Introduction

מערכת חוש הריח של היונקים יש את היכולת להגיב למספר עצום של גירויים ריחניים, המאפשרים זיהוי ואפליה של אלפי ניחוחי. קולטני ריח (אס) הם החיישנים המולקולריים שהביעו עצב סנסורי חוש הריח באפיתל ההרחה 12. הכרת ריח יונקים מתרחשת באמצעות הפעלת ההפרש של חדרי ניתוח על ידי ניחוחי, ו-OR משפחת הגן היא נרחבת, עם בערך 1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים 12-16. הניתוחים תפקודיים קודמים של חדרי ניתוח בתאי עצב של חוש ריח ובתאי Heterologous הראו כי ניחוחי שונה מוכרים על ידי ייחודי, אבל חופף הרכבים של חדרי ניתוח 10,17-20. התאמת ligands לחדרי ניתוח היא קריטית להבנת הקוד וחיוני לבניית מודלים מעשי של חוש ריח חוש הריח. בשל קשיים להביע חדרי ניתוח במערכות Heterologous, כמו גם מספר רב של שניהם ניחוחי וחדרי ניתוח, הנתונים אלה נעדרו במידה רבה מfield; אכן, פחות מ -6% מחדרי ניתוח באדם יש ליגנד פורסם 1-11. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay לוציפראז לאפיין odorant / או אינטראקציות. assay זה מאפשר אפיון התפוקה גבוהה של או.אר. אס, משימה שהיא חיוני להבנת odorant / או אינטראקציות כמו גם בפיתוח מודל של קידוד ריח.

מחקרי תפוקה גבוהה של חדרי ניתוח בפני שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, או.אר. האס באו לידי ביטוי בתאי Heterologous נשמרו בחדר המיון ומושפל לאחר מכן בהפרוטאזום 21,22, מניעת חדרי הניתוח מאינטראקציה עם ניחוחי במערכת assay 23-25. בעיה זו טופלה על ידי הגילוי של חלבוני אבזר המאפשרים ביטוי על פני קרום התא יציב של מגוון רחב של חדרי הניתוח 19,26,27. קולטן חלבוני טרנספורטר-1 ו -2 (RTP1 ו2) לקדם או ביטוי על פני קרום תא והפעלה בתגובה לגירוי odorant 19. המבוסס על עבודה זו, תאי HEK293T היושונה כדי להביע את היציבות RTP1 ארוך (RTP1L) וRTP2, חלבון שיפור ביטוי הקולטן 1, וαolf G, וכתוצאה משורת תאי Hana3A 19,27. בנוסף, קולטן מסוג 3 מוסקריניים אצטילכולין (M3-R) אינטראקציה עם חדרי ניתוח על פני התא ומשפר הפעלה בתגובה לניחוחי 26. Co-transfection של OR עם RTP1S וM3-R לתוצאות תאי Hana3A בביטוי חזק, עקבי ופונקציונלי של מגוון רחב של חדרי ניתוח על פני תא 27. שנית, יונקים או רפרטוארים הם גדולים למדי. בבני אדם, למשל, רפרטואר OR הוא סדר גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט התעורר אצלם, ו -2 סדרי גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט החזותי. למרות שיבוט בודד או הוא פרוטוקול פשוט יחסית, נדרש מאמץ מעלה מול משמעותי כדי ליצור ספרייה מקיפה. שלישית, למרות שאנו יודעים כי בראייה, אורך גל מתורגם לצבע ובתדירות אודישן מיתרגם המגרש, והארגון של ריחות הוא הבין היטב, מה שהקשה על חוקרים ללשרבב ממדגם מייצג של ניחוחי. למרות שחלק מהתקדמות שנעשתה ב10,28 חזית זו, המפה של נוף חוש הריח נשארת שלמה. הקרנת עשרות אלפי מולקולות נגד מאות חדרים הניתוח היא משימה מרתיעה; מסכי תפוקה גבוהה בתחום זה דורשים קמפיינים שהוגדרו בזהירות. האתגרים הנותרים העיקריים הם אלה של לוגיסטיקה ועלות ולא בעיות הטמונות לטכניקה. למרות הקרנת Heterologous לא הייתה בשימוש נרחב כדי לזהות ligands ידי קבוצות אקדמיות, חברה פרטית שהשתמשה באותה הטכניקה כדי לזהות ligands ל100 חדרי ניתוח אנושיים 29. למרבה הצער, הנתונים האלה יישארו קניינית.

יש assay לוציפראז התפוקה גבוהה המתוארים כאן מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות המשמשות להערכה או הפעלה. למרות responses של עצב סנסורי חוש הריח האם נמדד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה סידן, יש טכניקות אלה מתקשים מתגרים מזה בו או גורם לתגובה של נוירון בשל החפיפה במאפייני תגובה לנוירונים חוש הריח. למרות דפיקות-בסוג הקולטן-GFP שכותרת 30,31, אספקת קולטנים ספציפיים באמצעות adenovirus לMurine נוירונים חוש הריח 32,33, או ביצוע RT-PCR אחרי הקלטות 17,24,33 יכולים לקשר הקלטות לסוגים בודדים קולט, שיטות אלו נמוכה תפוקה ואינה מתאים למסכים בקנה מידה גדולה. מערכות הקרנת Heterologous הן מדרגי יותר, ושתי צורות עיקריות נמצאות בספרות: כתבי מסלול cAMP ואדנוזין אינוזיטול כתבי מסלול (IP3). על גירוי ריח, או.אר. אס להפעיל מפל איתות התמרה αolf G כי תוצאות בייצור של AMP המחזורי (cAMP) 12. על ידי שיתוף transfecting גן כתב גחלילית בלוציפראז תחת שליטתו של acאלמנט התגובה AMP (CRE), ייצור לוציפראז ניתן למדוד כפונקציה של תגובת ריח, המאפשר כימות של או הפעלה. או הפעלה יכולה גם להיות קשורה למסלול IP3 על ידי שיתוף להביע G-חלבונים כגון G α15/16 או 24,25,34 הכימרה α15-OLF G. אנו בחרנו בassay המוצג כאן מבוסס על שלושה גורמים: (1) שיתוף הביטוי של RTP1 עם קולטני ריח מתויג-Rho משפר את הביטוי של קולטני ריח בתא השטח 19,27; (2) שימוש בגן ​​כתב cAMP מגיב מאפשר למדידה או ההפעלה דרך מסלול השליח השני הקנונית; ו (3) assay הוא מתאים היטב למסכי תפוקה גבוהה.

assay לוציפראז תפוקה גבוהה זה חל על מגוון רחב של מחקרים חשובים בתחום לחוש ריח. ראשית, מספר גדול של חדרי ניתוח יכול להיות מוקרן נגד odorant בודד על מנת לקבוע את דפוס הפעלת קולטן עבור spodorant ecific. סוג זה של מחקר זיהה OR7D4 כאו אחראי למתן מענה לandrostenone odorant סטרואידי 8. לעומת זאת, אחד או יכול להיות מוקרן נגד פנל של ניחוחי על מנת לקבוע את פרופיל תגובת קולט 10. כאשר odorant מועמד חוש הריח / או זוגות מזוהים באמצעות מסכי אלה, אינטראקציה יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע ניסוי תגובת מינון בוחן את התגובה של או לריכוזים הולך וגדל של odorant. עקומות מינון תגובה יכולות גם להעריך כיצד שונות גנטיות באו משפיעה בתגובה odorant מבחנה 8,9,11,35, וניתן להרחיב את הלימודים האלה לinterspecific או וריאציה, המאפשרים הבדיקה של אבולוציה קולטן על פני מינים ומוטציות סיבתי באבולוציה 36,37, לבסוף, assay זה יכול לשמש מסך ליריבי ריח כי הם מסוגלים להרגיז או תגובה לodorant במיוחד עבור זוג odorant / קולט ידוע 38,39. לסיכום, זה גבוהassay לוציפראז התפוקה הוא ישים למגוון רחב של מחקרים שיעזרו לאפיין או דפוסי הפעלה ולספק הבנה טובה יותר של קידוד ריח במערכת חוש הריח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות של תאי Hana3A

  1. הכן תקשורת M10 ידי להשלים בינוני מינימום הכרחי (MEM) עם 10% (v / v) FBS.
  2. תחזוקת תרבות
    1. שמור על תאים בתקשורת M10. הערה: וקטורי הביטוי לRTP1L, RTP2, REEP1, ו-G αolf להקנות עמידות puromycin לתאי Hana3A, אבל השמירה על התאים עם אנטיביוטיקה זה לא משפיע באופן משמעותי תוצאות assay.
    2. תת ביחס של 1:08 ב10 מנות סנטימטר כל 2-3 ימים.
    3. לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2.

2. תאי ציפוי עבור transfection

  1. תקשורת לשאוב מ100% מחוברות 10 צלחת סנטימטר של תאי Hana3A.
  2. שטוף תאים על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS, מתערבל הצלחת, וaspirating PBS.
  3. הוסף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA ולחכות לתאים לנתק (כ 1 דק ').
  4. להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר M10 ולשבור את גושי תא על ידי triturating בערך 10x &# 160; עם טפטפת 10 מיליליטר. פיפטה בזהירות כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתקשורת.
  5. לכל צלחת 96 היטב, העברת 1 מיליליטר של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות, ולשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה.
  6. Resuspend התאים 6 מיליליטר M10 לכל 1 מיליליטר של תאים שהועברו בשלב 2.5.
  7. פיפטה 50 μl של תאים היטב בכל צלחת 96 היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.

3. Transfection של קולטני ריח

  1. הכנת פלסמיד דנ"א
    1. הכן את ה-DNA פלסמיד באמצעות פרוטוקול ללא רעלן פנימי. הערה: ערכות הכנה השתמש בפלסמיד דנ"א מיועד ", רעלן פנימי ללא תשלום," או להוסיף שלב חילוץ פנול, כלורופורם לפרוטוקול הכנת פלסמיד דנ"א.
    2. לדלל DNA לריכוז של 100 ng / μl בTE חיץ.
  2. שימו לב לתאים מצופים (שלב 2.7) כדי להבטיח confluency נכון של approximately 30-50% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: בעוד confluency זה לא אופטימלי למגיב transfection השומנים בדם, confluency של 30-50% בשלב זה הוא אופטימלי למדידת פעילות לוציפראז 24 שעות לאחר transfection.
  3. הכנת Transfection Mix
    1. פיפטה RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL פלסמידים לתוך מדיום MEM כל הכרכים מפורטים בטבלה המס '1 כדי להפוך את תמהיל פלסמיד (כרכים שצוין הם לכל צלחת 96 היטב). RTP1S-PCI
      תערובת פלסמיד
      בכל טוב לכל צלחת 96 היטב
      MEM - 500 μl
      5 ng 480 ng
      M3-R-PCI 2.5 ng 240 ng
      PCRE לוק 10 ng 960 ng
      pSV40-RL 5 ng 480 ng

      טבלת 1. רכיבי פלסמיד תערובת. היטב ולכל כרכי 96 גם צלחת של RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL, וממ.
    2. לכל צלחת 96 היטב, לדלל 18 מגיב transfection שומנים μl ב450 בינוני MEM μl.
    3. פיפטה פלסמיד תערובת (משלב 3.3.1), קולטני ריח מתויג rhodopsin בפלסמיד PCI (Rho-OR-PCI), ותמהיל שומנים transfection (משלב 3.3.2) כדי להפוך מפורט מורכבים ב טבלה 2 הערה:. התגובה הזו היא זמן רגיש ולא צריך להיות מותר להמשיך ליותר מ 30 דקות. חישוב +10% גם הוא חשוב כדי להבטיח נפח מספיק לשלבים הבאים. תערובת transfection שומנים בדם
      מורכב
      בכל טוב לכל טוב +10%
      תערובת פלסמיד 4.2 μl 4.58 μl
      Rho-OR-PCI 0.05 ng 0.06 ng
      4.2 μl 4.58 μl
      M10 41.7 μl 45.83 μl

      טבלה 2. רכיבים מורכבים. היטב ולכל כרכים + 10% גם של תערובת פלסמיד (טבלת 1), פלסמיד חוש הריח קולט (Rho-OR-PCI), ותערובת transfection שומנים בדם. M10 מתווסף כדי להרוות את התגובה הבאה דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  1. הקש את התקשורת על צלחות התא.
  2. פיפטה 50 μl של מורכב זה לזה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.

4. ריח גירוי

  1. שים לב לתאים transfected כדי להבטיח confluency נכון של 50-80% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: אם תאים הם פחות מ 50קריאות% ומחוברות, גחלילית לוציפראז ולוציפראז Renilla עלולות להיות נמוכות מדי למדידת הפעלת קולט. תשקול לבטל את הצלחת.
  2. הכן 1 פתרונות מניות M של כל ריח בDMSO.
  3. הכן את פתרונות גירוי ריח במדיום CD293.
    1. על ניסויי הקרנה, לדלל פתרון מניות של ריח ל100 מיקרומטר. כמו כן להכין שליטה ללא ריח (CD293 בלבד) על מנת לשלוט לאו הפעלה ברקע. הערה: לניסויי הקרנה, כל זוג או / ריח הוא נבדק רק פעם אחת בכל ניסוי. בגלל כמה דיפוזיה ריח פני בארות אפשרית, מומלץ לעורר עם odorant אחד לכל צלחת.
    2. לניסויי תגובת מינון, להכין שבעה דילולים סדרתי של פי 10 של פתרון מניות ריח בשלושה עותקים החל משעת 1 מ"מ לכל קולטן. כמו כן להכין את אותו ריח דילולים בשלושה עותקים לתאי transfected וקטור ריקים כדי לשלוט על הפעלת רקע ריח. הערה: לניסויי תגובת מינון, כל אחד oטיפול ריכוז dor צריך להתנהל בשלושה עותקים.
  4. הקש את התקשורת על צלחות התא.
  5. 25 μl פיפטה של ​​פתרון גירוי ריח לכל היטב דגירה במשך 4 שעות.

5. מדידה או לפעילות באמצעות בלוציפראז Assay

  1. Resuspend מצע גחלילית לוציפראז להוראות היצרן וחנות ב -80 ° C.
  2. להפשיר 1 מיליליטר של מצע גחלילית בלוציפראז לכל צלחת 96 היטב.
  3. הכן את תגובת גחלילית לוציפראז טרי מרווה ומגיב לוציפראז Renilla מצע (5 לוציפראז μl מרווה / מצע לוציפראז Renilla לכל 1 מיליליטר של חיץ). הערה: כ 1 מיליליטר של מגיב הוא זקוק לכל צלחת 96 היטב.
  4. הכן את קורא microplate זורח. פתח את תוכנת microplate קורא. בתוך סמל המערכת:
    1. תחת "טרום החימום" Tab, סמן את התיבה למצב "ON" ולהגדיר את הטמפרטורה של המכונה ל25 °; ג
    2. תחת הלשונית "Dispenser", ראש כל מתקן עם 1,000 μl של 70% אתנול ואחרי 1,000 μl של מים מזוקקים. הערה: השתמש aliquots נפרדים של אלכוהול ומים לכל מתקן. אתנול משמש לחיטוי מכשירי, ומים מסיר אתנול שיורית.
    3. ראש כל מתקן עם 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: תחול עם אוויר מבטיחה כי מצעי לוציפראז אינם מדוללים במים שיורית.
    4. מתקן ראש 1 עם 1,080 μl של מצע גחלילית לוציפראז (משלב 5.2). מתקן ראש 2 עם מצע Renilla לוציפראז (משלב 5.3). הערה: היזהר שלא לחצות לזהם-מצעי לוציפראז. תחול עם מצעי לוציפראז ממלא את השטח המת במכשירים מגיב.
  5. הגדר את הפרוטוקול הבא לקרוא גחלילית שתי והארת לוציפראז Renilla. בתוך התוכנה הקשורים לקורא microplate, בלתידער תפריט "קובץ", לחץ על "משימה החדשה". סמן "פרוטוקולים" ולחץ על "צור חדש". בחלון הבא, העיגול שליד "תקן פרוטוקול" צריך להיות נבחרים. לחץ על "אישור". לחץ לחיצה כפולה על "נוהל" בצד שמאל של המסך.
    1. לוותר 10 μl של מצע גחלילית בלוציפראז לכל הבארות באמצעות מתקן 1. תחת תפריט "פעולות", לחץ על "לוותר". בחלון "לוותר על שלב", קבע: "Dispenser" 1, "לקרקע" לאף אחד ", כרך לוותר" ל10 μl ו" שיעור "ל225 μl / sec. לחץ על "אישור".
    2. לנער את הצלחת ל30 שניות. תחת תפריט "פעולות", לחץ על "Shake". בחלון "Shake שלב", להגדיר "עוצמה" לבינוני ו" משך "ל00:30 MM: SS. לחץ על "אישור".
    3. קראו את הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. תחת תפריט "פעולות", לחץ על "קראו";. בחלון "קראו שלב", קבע: "איתור שיטה" להארה ", קראו סוג" לנקודתי קצה ", אינטגרציה בזמן" ל00:00:50 MM: SS: ss, "סטי מסנן" 1, "פליטה" לחור, "מיקום אופטיקה" למעלה, "רווח" ל135, ו" קראו גובה "ל1.00 מ"מ. לחץ על "אישור".
    4. לוותר 10 μl של מצע לוציפראז Renilla לכל הבארות באמצעות מתקן 2. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.1, למעט קבוצה "Dispenser" 2.
    5. Shake צלחת ל30 שניות. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.2.
    6. קראו הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.3.
  6. הסר את המכסה מצלחת 96 היטב ומניח את הצלחת בקורא microplate. הפעל את התכנית להקים בשלב 5.5 לקרוא הארה צלחת.
  7. נקה את המשאבות מנפק מגיב. מאייקון המערכת תחת לשונית "Dispenser":
    1. טהר 1,000 μl של fמצע לוציפראז irefly ממתקן גחלילית בלוציפראז לתוך צינור התאוששות. הערה: לוציפראז Firefly ניתן לאחסן ב -80 ° C ושימוש חוזר.
    2. ראש כל מתקן עם 1,000 μl של מים מזוקקים, ואחריו 1,000 μl של 70% אתנול, ולבסוף 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: מים מסיר מצעי לוציפראז מהמשאבות מגיב, מחטא אתנול, ואוויר מתייבש כל אתנול שיורית.

6. ניתוח נתונים

  1. יצוא נתונים
    1. בתוכנת microplate קורא, לחץ לחיצה כפולה על "הבונים דווח / יצוא" בצד השמאל של המסך.
    2. לחץ על הכפתור "חדש היצוא לאקסל" ולחץ על "אישור".
    3. סמן Export1 ולחץ על "ערוך".
      1. על פי "נוהל" "תוכן" לבדוק "תיאור מערכת", "תיאור פלייט", וגם "מטריקס הפריסה פלייט". כולל "נתונים גולמיים"nd "מחושב נתונים".
      2. תחת "עבודה", סמן "Autoexecute על השלמת ההליך". תחת יצוא מצב, לבדוק "כל הצלחות באותה חוברת העבודה" ו "כגיליון עבודה חדש".
      3. תחת "קובץ" בוחר את שם קובץ בפורמט ומיקום קובץ, ולחץ על "אישור".
      4. סגור את החלון "דווח / יצוא הבונים".
  2. כדי להשיג ערכי לוציפראז מנורמלים, לחלק את קריאת גחלילית לוציפראז הארה לכל טוב (שלב 5.6.3) על ידי קריאת Renilla הארה לכל טוב (שלב 5.6.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מסך ראשי נבדק 328 חדרי ניתוח נגד 26 ריחות בריכוז של 100 מיקרומטר. ריכוז ריח זה הוכח כדי להפעיל חלק גדול מחדרי ניתוח עם ligands הידוע 10 ביעילות. ראשית, פעילות לוציפראז המנורמלת הייתה מחושבת על ידי חלוקת קריאת גחלילית בלוציפראז ידי קריאת לוציפראז Renilla. בשלב בא, ערכי baselined היו מחושבים על ידי הפחתת קריאות לוציפראז המנורמלת לשליטה אין ריח מקריאות לוציפראז המנורמלת עבור כל היטב (איור 1). עקומות מינון תגובה בוצעו על 48 odorant / או זוגות מתפזרים באופן אקראי על פני טווח ערכי baselined, כפי שצוין על ידי ברים צבעוניים באיור 1. טופלו חדרי ניתוח עם 7 ריכוזים של odorant פורש ננומטר 1 עד 1 מ"מ, והתגובות שהתקבלו היו בכושר לעקומת sigmoidal באמצעות רגרסיה ליניארית. Odorant / או נחשב אגוניסט אם הוא פגש את שלושה קריטריונים: (1) סטיית התקן של50 logEC היו יחידת יומן פחות מ 1; (2) את מרווחי הביטחון של 95% עבור הפרמטרים העליונים ותחתונים של העקומה לא חופפים; ובדיקת סכומים של ריבועים נוספים (3) אישרה כי odorant הפעיל את התאים או המכילים באופן משמעותי יותר מאשר תאי השליטה, שהיו transfected עם וקטור ריק. תוצאות תגובת מינון מסוכמות בטבלה 3.

נתונים אלה שימשו לאחר מכן לקבוע באיזו מידת מדידות assay במסך ראשי לחזות תוצאות מעקומת תגובת מינון. סורגים כחולים באיור 1 מתאימות לזוגות שסווגו כאגוניסטים בניסוי תגובת מינון מלא, בעוד שברים אדומים לא לעמוד בשלושת הקריטריונים שלנו שתוארו לעיל. ערכים מהמסך הראשי חזו תוצאות מהמינון מלא ניסוי תגובה (השטח מתחת לעקומת מקלט ההפעלה אופיינית (AUC) = 0.68, p <0.01, מבחן מאן ויטני U), מצביעים על כך שהמסך העיקרי שלנו הוא שיטה שימושית כדי להעשיר לodorant / או זוגות שיסווגו כאגוניסטים בניסוי תגובת מינון מלא (איור 2).

איור 1
איור 1. תדר של ערכי לוציפראז baselined למסך עם פנל של קולטנים וניחוחי. היסטוגרמה של התדר (ספירה) של ערכי לוציפראז baselined מחושבים עבור כל odorant / או זוג במסך הראשי של חוש הריח. כמו זוגות הפעלת odorant / קולטן הם דלילים, רוב הערכים הם התרכזו באפס וההפצה המרכזית הגדולה מעריכה את התפלגות הרעש עבור assay זה. ברים צבעוניים מציינים זוגות odorant / קולטן נבחרו לניתוח תגובה במינון; סורגים כחולים הם זוגות שסווגו כאגוניסטים המבוססים על תגובת מינון המלא, וברים אדומים הם זוגות שלא סווגו כאגוניסטים. f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. עקומת ROC עבור מסך odorant / קולט. 48 זוגות odorant / קולטן סווגו כאגוניסטים או כמו לא להיות אגוניסטים. שיעור נכון חיובי (רגישות) היה אז זמם נגד השיעור החיובי הכוזב (1-הסגוליות) באמצעות החבילה הסטטיסטית R 40. השטח מתחת לעקומה (AUC) הוא 0.68, מצביע על כך שזוגות odorant / קולטן עם ערכי מסך לוציפראז גבוהים יותר יש סיכוי גבוהים יותר לעבור תגובת מינון יותר מאשר אלה עם ערכים נמוכים יותר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

= "0" = "width: 277px;" סגנון cellspacing = "0" width = "278"> <גובה TR = "21"> גובה: 21px; "> .164647156 "Style =" 1 גובה: 21px; "> -.109048046
ערך Baselined מינון תגובה
.051793067 להיכשל
.006376956 להיכשל
.331936398 לעבור
.591006519 לעבור
.049093369 לעבור
.396788976 לעבור
-.013655743 לעבור
.011080217 לעבור
.004203349 להיכשל
.003975049 להיכשל
-.077935718 לעבור
-.084488317 לעבור
.030236078 להיכשל
-.042963576 להיכשל
.031466406 להיכשל
.025897747 להיכשל
-.030434651 להיכשל
-.004122795 להיכשל
-.010075533 להיכשל
.028883452 להיכשל
.019402373 להיכשל
.047508749 להיכשל
0.00255344 להיכשל
.017221449 להיכשל
.340216655 לעבור
-.026912181 להיכשל
.037140428 להיכשל
.467763017 לעבור
.097665337 להיכשל
.080657267 לעבור
.172819211 לעבור
0.05568393 לעבור
-.106721064 לעבור
.136614849 לעבור
.457839849 להיכשל
.211751741 להיכשל
0.1581464 לעבור
-.62099155 לעבור
-.066949491 לעבור
-.78712035 לעבור
.752503007 לעבור
1.433407558 לעבור
.475431098 לעבור
1.457936815 לעבור
.048652537 להיכשל
.027196782 להיכשל
.129599842 להיכשל
-.069781272 להיכשל
.016450039 להיכשל
-.025639207 להיכשל
.158152141 להיכשל
-.032570055 להיכשל
.140139926 להיכשל
-.052030276 להיכשל
.657140133 לעבור
1.040410297 לעבור
לעבור
.399588712 לעבור
.188094387 לעבור
.039371424 לעבור
.016784352 לעבור
.229959571 לעבור
.238381997 להיכשל
.074118909 להיכשל
.423901128 לעבור
.152621022 לעבור
לעבור
.075301806 לעבור
.395233972 לעבור
.261892958 לעבור
.156693306 להיכשל
2.163418147 לעבור
3.649862104 לעבור
.025716169 לעבור
-.033258008 לעבור
-.026984127 להיכשל
-.338441868 לעבור
0.37398618 לעבור

זוגות קולטן / ריח לוח 3. חוש הריח נבדקו בתגובה מינון. ערכי לוציפראז Baselined ותוצאות תגובת מינון (לעבור או להיכשל) ל48 או / ריח זוגות שנבחרו מתוך המסך. ל30 זוגות שנבדקו במסך פעמיים, שני ערכי לוציפראז baselined כלולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זהות odorant מקודדת על ידי דפוסי הפעלה קולטני ריח, אבל דפוסי הפעלת קולטן, כולל שהקולטנים מופעלים ובאיזו מידה, ידועים פחות מ -6% מקולטניים ריח האנושי 1-11. מאמצים לאפיין קולטני ריח היו מוגבלים על ידי השיטות עתירות העבודה או תחולתם רק קבוצת משנה של 17,23,24,33,34 משפחה קולטני ריח. מערכת ביטוי Heterologous Hana3A תומכת בביטוי חזק של רוב קולטני ריח שנבדק, והוא יכול לשמש בשילוב עם מערכת כתב בלוציפראז cAMP מגיב כדי לפקח על הפעלה קולטני ריח 19,26,27. ביצועים של assay זה בפורמט 96, גם תומכים במספר העיצובים ניסיוניים תפוקה גבוהה, כולל מסכי לקבוע מועמדים סביר לזוגות odorant / קולטני ריח ומנת תגובה עקום כדי לאשר אינטראקציות ולהעריך כיצד רמות הפעלת קולטן הן affected ידי וריאציות התוך והיתר ספציפיות. זוגות odorant / קולטן עם ערכי פעילות גבוהים יותר במסך נוטים יותר להפגין תגובת מינון משמעותית. נתונים אלה מראים כי שיטת הקרנה זו היא מסוגלת להעשיר לזוגות odorant / קולט שיעברו תגובה במינון, ובכך להקל על זיהוי של ligands odorant ודפוסי הפעלה קולטני ריח.

ההצלחה של assay זה מותאם במיוחד לניתוח קולטני ריח תלויה במספר גורמים. כל פלסמיד דנ"א חייב להיות מוכן באמצעות פרוטוקול ללא רעלן פנימי. ביטוי קולטני ריח עקבי על פני התא הוא קריטי. שורת תאי Hana3A יציבות מבטאת כמה חלבוני אבזר המסייעים באו ביטוי, אבל שיתוף transfection של RTP1S וM3-R משפר ביטוי הקולטן הפעלה, בהתאמה 27. שילוב זה של ביטוי חלבון אבזר תוצאות בביטוי אמין ביותר של קולטני הריח, המאפשר comparison של או הפעלה בין ניסויים ואת הקולטנים. כמו כן, הניטור של confluency התא חשוב להשגת תוצאות עקביות. בהנחת שהתאים ב10 סנטימטר 2 המנה המקורית מחוברות בערך 100%, לאחר הפרוטוקול המתואר במסמך זה יגרום לתא confluency אמין לאורך כל הניסוי. חשוב מכך, תאים מספיק יהיו מצופים כדי להשיג קריאת לוציפראז למדידה, אבל תאים לא גדלו יתר על המידה, מצב אשר עשוי להשפיע הפעלת קולט בעקבות גירוי odorant. נרמול עבור פקדים נוספים ביטוי Renilla מכוננים לא רק לצפיפות תאים, אלא גם ליעילות transfection. לוציפראז Renilla לקרוא יותר מ -2.5 סטיות תקן מתחת לממוצע עשוי להצביע על אובדן תא. תאים צריכים להיות מצופים באופן אחיד, כדי למנוע הפלאק צפוף שלנתק בקלות רבה יותר ממשטח הצלחת מאשר תאים דלילים, ויש להוסיף פתרונות transfection וodorant בעדינות לצד השני של הבאר, כדי למנוע ניתוק cells. גם אובדן תא יכול להיות בגלל המוות של תאים הנגרם על ידי רעילות odorant, בעיה שניתן לעקיפה על ידי הפחתת ריכוז odorant, או DMSO מוגזם, אשר ניתן להימנע על ידי שמירה על ריכוזי DMSO מתחת 0.5%. לבסוף, טיפול בכל אוכלוסיית תא קולטן להביע עם forskolin 1 מיקרומטר, activator cyclase adenylyl שגורם לביטוי עיתונאי לוציפראז מאמרגן cAMP מגיב, יכול לשמש כביקורת חיובית עבור assay.

למרות assay המתואר כאן מהווה שיפור על פני שיטות אלטרנטיביות, כולל בפורמט תפוקה גבוהה ותחולה כללית יותר למשפחה קולטני הריח היונקים, יש לו מגבלות. ראשית, assay שלנו במבחנה חסרת מרכיבים רבים של מערכת חוש הריח in vivo, כוללים חלבונים מחייבים odorant, שכבה רירית, מולקולות תאיים והתנהגויות מרחרחות. שנית, שיטה זו מסתמכת על מערכת כתב בלוציפראז למדוד קולטני ריחהפעלה בניגוד לשיטות אלטרנטיביות נפוצות שעושים שימוש בהדמית סידן. מחקר שנערך לאחרונה מצביע על כך ששתי שיטות אלה יכולים להניב תוצאות סותרות; אכן, כמה קולטני ריח להגיב לodorant בפרט כאשר בדקו באמצעות הדמיה סידן אך לא assay לוציפראז 41. בין אם סוג assay אחד הוא רלוונטי יותר למחקרים של תפיסת חוש הריח אנושית עדיין לא ברור, אבל שני השיטות יכולה להיות שימושיות בהתאם להקשר וסוג הקולטן. שלישית, בזמן שמערכת ביטוי פונקציונלית זו בהצלחה כבר בשימוש כדי לבטא את רוב קולטני ריח של יונקים שנבדקו, כמה חדרי ניתוח לא יכול להיות נוח לביטוי באמצעות מערכת זו. אם הקולטנים uncharacterized בעבר אינם מגיבים לריח, זה יכול להיות בגלל חוסר הביטוי על פני התא ולא חוסר האינטראקציה בין odorant וקולט. ביטוי פני תא קולטן ניתן לבחון באמצעות immunofluorescence לפני הסקת מסקנות מassay השלילי נובע 27,42 38,39, רוב הקולטנים חייבים להיות ראשון מגורה עם ריח כדי לצפות בירידה בפעילות בלוציפראז.

למרות מגבלות אלה, מערכת assay זה יש לו את היכולת להגדיל את רכישת נתונים במידה רבה בתחום לחוש ריח. ראשית, פורמט 96, גם תפוקה גבוהה הופך את מסכי קולטן ו / או ריח בקנה מידה גדולה אפשריים. שנית, מערכת ביטוי Heterologous היא ישימה למגוון רחב של קולטני ריח של יונקים. שלישית, פעילות לוציפראז יכול לשמש למדידת הפעלה קולטני ריח, שהוא בעל ערך הבמתאר את דפוסי הפעלת קולטן לodorant מסוים. הרביעית, תוצאות קודמות במבחנת מערכות assay דומות לחזות תפיסת חוש הריח אנושית 8,11,35. מאפיינים אלה הם particחשוב ularly בהתחשב בגודל הגדול של המשפחה קולטני ריח של היונקים והידע המוגבל שלנו לגבי או דפוסי ההפעלה שהושרו על ידי ריחות ספציפיים. יישום רחב של מערכת assay זה מותאם במיוחד לניתוח קולטני ריח יתרום לתמונה מקיפה יותר של קולטני ריח / אינטראקציה odorant ואת הבסיס המולקולרי של קידוד ריח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי R01 DC013339, R03 DC011373, ורות ל 'Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס T32 DC000014. חלק מהעבודה בוצע באמצעות Monell chemosensory קולטן איתות הליבה, אשר נתמכה בחלקו על ידי מימון מDC011735 P30-NIH NIDCD Core גרנט. המחברים מודים ג Sezille לעזרה באיסוף הנתונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hana3A cells Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-luc Agilent 219076 LUC
pSV40-RL Promega E2231 RL
Minimum Essential Media, Eagle Sigma Aldrich M4655 MEM
FBS Life Technologies 16000-044 FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+) Cellgro 21-040-CV PBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) Life Technologies 25300 Trypsin
CD293 Life Technologies 11913-019 CD293
96-well PDL white/clear plate BD BioCoat 356693 plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay Promega E2980 dual glo
Synergy S2  BioTek SLAD BioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software BioTek Gen5 Gen5
BIOSTACK BioTek BIOSTACK2WR BioStack
Multiflo BioTek MFP MultiFlo
300 μl GripTips Integra 4433 GripTips
12.5 μl GripTips Integra 4414 GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96 Integra 6433 XYZ tips
12.5 μl GripTips 384 XYZ Integra 6403 XYZ tips
384ViaFlo Integra 6030 384ViaFlo
TE buffer Macherey Nagel 740797.1
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML DMSO
Forskolin Enzo Life Sciences BML-CN100-0010 FOR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19, (17), 7426-7433 (1999).
  2. Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299, (5615), 2054-2058 (2003).
  3. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30, (1), 69-80 (2005).
  4. Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30, (3), 195-207 (2005).
  5. Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97, (2), 537-544 (2006).
  6. Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31, (5), 445-452 (2006).
  7. Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280, (12), 11807-11815 (2005).
  8. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449, (7161), 468-472 (2007).
  9. Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5, (11), (2007).
  10. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2, (60), (2009).
  11. Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
  12. DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191, (3), 443-452 (2010).
  13. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5, (2), 124-1233 (2002).
  14. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11, (5), 685-702 (2001).
  15. Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3, (1), 87 (2008).
  16. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5, (4), 263-278 (2004).
  17. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, (5), 713-723 (1999).
  18. Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3, (12), 1248-1255 (2000).
  19. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, (5), 679-691 (2004).
  20. Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25, (7), 1806-1815 (2005).
  21. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4, (6), 416-433 (2003).
  22. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48, (2), 270-278 (1997).
  23. Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279, (5348), 237-242 (1998).
  24. Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21, (16), 6018-6025 (2001).
  25. Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
  26. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4, (155), (2011).
  27. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3, (9), 1402-1413 (2008).
  28. Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5, (5), 425-429 (2008).
  29. Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35, (1), 38-40 (2010).
  30. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22, (8), 3033-3043 (2002).
  31. Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52, (5), 857-869 (2006).
  32. Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, (5348), 237-242 (1998).
  33. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (7), 4040-4045 (1999).
  34. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282, (20), 15284-15293 (2007).
  35. McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37, (7), 585-593 (2012).
  36. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8, (7), (2012).
  37. Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (50), 21247-21251 (2009).
  38. Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29, (9), 815-822 (2004).
  39. Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23, (1), 120-126 (2004).
  40. Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27, (8), 861-874 (2006).
  41. Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
  42. Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics