ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שריר לב בילוד חולדה העיקרית הם שימושיים בבסיסי במחקר לב וכלי דם במבחנה כי הם יכולים להיות מבודדים בקלות במספרים גדולים בהליך אחד. בשל התקדמות טכנולוגית מיקרוסקופ זה קל יחסית כדי ללכוד תמונות תא חיות לצורך חקירת אירועים הסלולר בזמן אמת בדאגה מינימאלית בנוגע phototoxicity לתאים. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקחת תמונות timelapse התא חיות של שריר לב בילוד חולדה העיקרית באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal הבא התמרה lentiviral וadenoviral לווסת את המאפיינים של התא. היישום של שני סוגים שונים של וירוסים עושה את זה יותר קל להשיג רמות שיעור התמרה והביטוי הולמות לשני גנים שונים. ניתן לקבל תמונות תא חיות גם התמקדו באמצעות מערכת פוקוס אוטומטי של מיקרוסקופ, אשר שומרת על מיקוד יציב לתקופות זמן ארוכות. יישום שיטה זו, תפקידיו של מהנדס אקסוגניחלבוני ed לידי ביטוי בתאים ראשוניים בתרבית ניתן לנתח. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש כדי לבחון את הפונקציות של גנים באמצעות siRNAs כמו גם של מאפננים כימיים.

Introduction

שריר לב בילוד חולדה עיקרי כבר מזמן משמש לחקירת תפקוד cardiomyocyte במבחנה 1. הם קלים לבודד מגורי חולדה על ידי מספר שיטות מבוססות היטב 2-4. השיטה הנפוצה ביותר מעסיקה collagenase או טריפסין לעיכול רקמת חיבור של הלב לפני בידוד תא. גם חוקרים פיתחו שיטות לבידוד שריר לב ממכרסמים בוגרים 5-8, כמו גם עכברי יילודי 9,10.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד שריר לב מגורי חולדה ילודים, העסקת הליך עיכול אנזים שני שלבים. טריפסין משמש ראשון O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן collagenase מטוהר ב 37 ° C. דגירה של רקמת הלב עם O טריפסין / N ב 4 ° C מפחיתה את הצעדים הדרושים לתאי קציר בהשוואה לשיטות באמצעות incubations הרציף בפתרון אנזים חם 2. בנוסף, באמצעות שיתוף מטוהרllagenase ולא אנזימים גולמיים, ניתן לבטל את שונות הרבה להרבה, ובכך לספק שחזור משופר.

מחקרים תפקודיים של חלבון מסוים לעתים קרובות להעסיק מערכת ביטוי חלבונים באמצעות adenovirus 11-13 ו / או 14-16 lentivirus. [הערה אזהרה] הייצור והמניפולציה הנגיפי צריכים להתבצע על פי הנחיות NIH.

Adenovirus לא להשתלב בגנום המארח. יש לו יעילות גבוהה מאוד של התמרה ברוב סוגי תאים, כוללים תאים להתחלק ותאים שאינם מתחלקים, כמו גם תאים ראשוניים ושורות תאים הוקמו. זה הופך את adenovirus וקטור אמין על ביטוי גנים. רמות גבוהה של החלבון המקודד על ידי וקטור אדנו להתפתח בתוך 48 שעות הבאות התמרה, והם יכולים להימשך מספר שבועות 17. עם זאת, חסרון אחד לשימוש adenovirus לביטוי חלבון הוא כי הפיתוח של ADE רקומביננטיnovirus הוא גם מסובך וגוזל זמן. חסרון זה מסביר באופן חלקי מדוע חוקרים רבים היו פונים לlentiviruses לביטוי גני רקומביננטי. בניגוד למבני adenoviral, יצירת מבנה lentiviral היא מהירה וקל. למרות שיש לי lentiviruses בדרך כלל יעילות נמוכה יותר של התמרה מ adenoviruses, הן בתאים מתחלקים ולא החלוקה, הם להשתלב בגנום המארח. כתוצאה מכך, הביטוי של גן transduced הוא יציב יותר לlentiviruses מאשר לadenoviruses.

בשל התקדמות טכנולוגית בתחום של מיקרוסקופיה, זה הרבה יותר קל ללכוד תמונות תא חיות של תאים לבטא חלבונים רקומביננטיים. זה נכון גם במהירויות שיעור וידאו של רכישה. זה מאפשר לחוקר כדי לקבוע כיצד שינויים מסוימים בחלבון של עניין מבחינה תפקודית להשפיע על התאים בזמן אמת. יש מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב במספר תכונות שהופכים אותו טכניקה אופטימלית לליבתא דואר ההדמיה 18,19. הדיסק מסתובב Yokogawa מאפשר רכישת תמונה מהירה הרבה יותר, ואילו באותו הזמן ניצול הרבה פחות כוח מאשר לייזר המיקרוסקופים confocal סריקת נקודה. שתי תכונות מיוחדות אלה בשל דיסק ספינינג, המכיל חורי confocal רבים שדרכו הלייזר עובר בו זמנית לדגימות. במהלך רכישה, הדיסק עצמו מסתובב במהירות וברציפות 18-20. על ידי שימוש במערכת פוקוס אוטומטי של המיקרוסקופ, פוקוס יציב נשמר על פני תקופות זמן ארוכות. הדבר מאפשר לחוקרים לקחת תמונות תא חיות ממוקדות היטב. תמונות שנרכשו הם שיחקו בחזרה כקובץ סרט. התמונות נותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כגון 21,22 ImageJ, פיג'י 23, או תוכנה זמינה באופן מסחרי אחרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד של שריר לב בילוד חולדה

  1. השתמש במדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) ובינוני מינימום הכרחי (MEM) בתוספת סרום שור העובר (FBS) ופניצילין / סטרפטומיצין (P / S) כמדיום לתרבות. הוספת bromodeoxyuridine (BrdU) למדיום כדי למנוע צמיחה של fibroblasts עבור 2 הימים הראשונים שלאחר הבידוד.
בינוני בסיס FBS BrdU (מ"מ) P / S (U / ml)
בחירה DMEM 10% 0 20
היום הראשון DMEM 10% 0.1 10
למחרת DMEM / MEM 5% 0.1 10
תרבות נוספת DMEM / MEM 5% 0 10

טבלת 1:. בינוני לשריר לב בילוד חולדה השתמש את המדיה הזו לculturing שריר לב בילוד חולדה. DMEM / MEM הוא 1:1 תמהיל של DMEM ובינוני MEM.

  1. בידוד Cardiomyocyte, 1 יום (הערכת זמן הנדרש, על 1 שעות)
    הערה: לעבודה עם מכרסמים בילוד, עיין בהנחיות מקומיות אוניברסיטה וכללים שנקבעו על ידי תוכניות טיפול בבעלי חיים, ולדבוק בפרוטוקולים בבעלי חיים אישרו מוסדי. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי החיים במרכז המשאבים באוניברסיטת ייל.
    1. הכן את חומרים כימיים וכלים: הפתרון של האנק בסידן ומגנזיום ללא מאוזן מלח (CMF HBSS), 30 מיליליטר x 2, 10 מיליליטר X 2, על קרח; טריפסין 1 מ"ג, מחדש עם 2 מיליליטר של CMF HBSS, על קרח; autoclaved כלים; 70% אתנול (EtOH) ב250 כוס מיליליטר; ארבעה מעוקרים 10 צלחות פלסטיק סנטימטר, שלושה לבידוד של לב ואחד לtrypsinization.
    2. ליט 1 סדראה של גורי 1-to-2-בן יומו חולדה (כ -10 גורים) עם הסכר שלהם ממפיצי בעלי חיים ניסיוניים.
    3. Day1, העבר את הגורים לכלוב קטן ולהרדים סכר עם קוקטייל קטמין / xylazine (קטמין, 200ml/10g ו20ml/10g xylazine) ממנת יתר.
    4. קח את הגור אחד ולעקר את כל הגוף שלה עם EtOH 70%. לערוף גור עם מספריים כירורגיות חדים מתוחזק היטב על צלחת פלסטיק 10 סנטימטר מעוקר במיקום מבודד מגורים אחרים.
      הערה: על מנת לאסוף הדגימות מהר ככל האפשר, עדיף להשתמש בשיטה המהירה והיעילה ביותר להפסקת חייו של המכרסם. עריפת ראש, כאשר משתמשים בו כראוי על ידי אנשי מקצוע מיומנים עם ציוד מתוחזק היטב עלולה לגרום פחות פחד וחרדה לבעלי החיים ולהיות מהיר יותר ומעשי יותר מאשר צורות אחרות של המתת חסד. זה עולה בקנה אחד עם ההמלצות של הנחיות האיגוד האמריקנית לרפואת הווטרינרית להמתת החסד של בעלי חיים.
    5. הסר את מכותיואמנות עם כלים מעוקרים, ולשים לב ב30 מיליליטר קרח צונן CMF HBSS ב50 מיליליטר צינור חרוטי. הערה: הסר את הלבבות במהירות אפשרית ולשים אותם על קרח באופן מיידי. לאחר הסרת הלב מהגוף, צריכים להיעשות כל ההליכים על קרח.
    6. לאסוף 5 לבבות ב30 מיליליטר של קרח צונן CMF HBSS ו5 לבבות שנותרו ב30 מיליליטר נוסף של קרח צונן CMF HBSS. לערבל את הצינור כדי לשטוף את הלבבות. הערה: לאחר שלב זה, לבצע את כל ההליכים בזרימה למינרית.
    7. בטל supernatant ולהעביר את לבם לצלחת חדשה מעוקרת 10 סנטימטר פלסטיק על קרח. הערה: היזהר שלא לשאוב לבבות עם aspirator.
    8. הסר את כלי גדול ו / או רקמות לא רצויות. הוסף 10 מיליליטר של קרח צונן CMF HBSS לצלחת לשטוף את הלבבות.
    9. העבר את כל הלב לצלחת חדשה מעוקרת 10 סנטימטר פלסטיק על קרח. לרכך את לבם במספריים כדי פחות מ 1 מ"מ 3 על קרח.
    10. הוסף 9 מיליליטר של מצונן CMF HBSS. הוסף 1 מיליליטר של טריפסין reconsti המצונןtuted עם CMF HBSS (50 מיקרוגרם / מיליליטר סופי).
    11. חותם את הצלחת עם parafilm ולכסות אותו בנייר אלומיניום, ולאחר מכן למקם אותו בחדר קר (4 ˚ C) למשך לילה.
  2. בידוד Cardiomyocyte, יום 2 (הערכת זמן הנדרש, כ -4 שעות)
    1. ריאגנטים וכלים להכין: 50 מיליליטר חרוטי הצינור x 2; 2 מעכבי טריפסין מ"ג, מחדש עם 1 מיליליטר של CMF HBSS, על קרח; collagenase 1500 יחידות, מחדש עם 5 מיליליטר של ליבוביץ L-15, בטמפרטורת חדר (RT); ליבוביץ L-15, מחדש עם 1 ליטר מים מעוקרים ולסנן דרך פילטר 0.22 מיקרון, 8 מיליליטר ב RT; 10 מ"ג / מיליליטר BrdU (32.6 מ"מ) במים; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; שתי מנות תרבית תאי 10 סנטימטר פלסטיק; מנות תחתית כוס 3.5 סנטימטר.
    2. Day2, הכנת מאכלי ג'לטין מצופה. הוסף 1 מיליליטר של .0.1% פתרון ג'לטין למעייל צלחת תחתית זכוכית 3.5 סנטימטר לניסוי הדמיה. דגירה צלחות ב 37 ˚ C למשך מספר שעות, ולאחר מכן לשאוב וזורקים פתרון ג'לטין לפני השימוש.
      איןTE: צלחת זכוכית תחתונה 3.5 סנטימטר מתאים לניסוי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להפקת חלבונים משריר לב ראשוני כדי לזהות ביטוי חלבון על ידי מערבי סופג (WB), ניתן להשתמש בו מנות תרבית תאי 0.1% ג'לטין מצופים פלסטיק.
    3. להעביר את כל רקמת הלב מתעכל על ידי טריפסין הלילה עם חיץ לצינור חרוטי 50 מיליליטר על קרח בשכונה המעוקרת. הוסף 1 מיליליטר של מעכבי טריפסין בCMF HBSS (182 מיקרוגרם / מיליליטר סופי). סגור את המכסה של 50 צינור חרוטי מיליליטר בחוזקה על מנת למנוע זיהום.
    4. דגירה הצינור במשך כ30 דקות בחממה 37 ˚ C כדי לחמם את הרקמות וחיץ ל30-37 ˚ C. הוסף 5 מיליליטר של collagenase בליבוביץ L-15 (יחידה / מיליליטר 94 ​​סופי). לדגור על 37 ˚ C למשך דקות 45 עם עדינים רועד (שייקר סל"ד 170-200 ב37 C חממת ˚).
      הערה: שלב זה יכול להיעשות מחוץ לזרימה למינרית. צריכים לעשות את כל השלבים שלאחר מכן ב RT.
    5. לחטא את החלק החיצוני של צינור חרוטי 50 מיליליטר עם EtOH 70% ולשיםזה בשכונה המעוקרת.
    6. רקמות Triturate באמצעות פיפטה האוטומטית עם pipetting ב3 מיליליטר / השני של מהירות ל20 פעמים. לאפשר שאריות רקמה להתפשר על 3 דקות ולסנן את supernatant עם אממ מסננת תא 70.
      הערה: פיפטה מיליליטר רגילה גודל 10 יכולה לשמש לטחינה הדקה.
    7. הוסף 5 מיליליטר של ליבוביץ L-15 לגושי רקמה שנותרו וtriturate ולסנן את supernatant שוב. שטוף מסננת תא עם 2 מיליליטר של ליבוביץ L-15.
    8. הנח פתרון תא מסונן במכסת מנוע ל20-60 דקות, כדי לאפשר collagenase לעכל קולגן המושפל באופן חלקי.
    9. תאי משקעים בx גרם 100 למשך 5 דקות. Re-להשעות תאים ב20 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS ו-P ריכוז גבוה / S (20 U / ml).
    10. תאים טרום צלחת על שני מנות תרבית תאי פלסטיק 10 סנטימטר לשעה 1 בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C לבחירת cardiomyocyte. הערה: Fibroblasts לצרף בקלות רבה יותר לחלק התחתון של המנה מאשר שריר לב.
    11. מה עלי לעשותאיל ההמתנה, להכין DMEM המכיל 10% FBS, P / S (10 U / ml) ו0.1 מ"מ BrdU. הוסף 1 מיליליטר של 10 מ"ג / מיליליטר BrdU ל325 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS ו-P / S.
    12. מערבולת בעדינות מנות ולאסוף את supernatant cardiomyocyte המכיל משתי 10 מנות סנטימטר.
      הערה: רוב שריר הלב עדיין מרחף בsupernatant לאחר 1 שעות של דגירה. כדי להימנע מזיהום עם fibroblasts הקלילות מצורף למנה, לא אוסף את supernatant ידי pipetting.
    13. אופציונאלי> ספירת תאים בsupernatant עם ובלי 0.2% trypan הכחול כדי לבדוק את כדאיות תא.
    14. תאי משקעים בx גרם 100 למשך 5 דקות. Re-להשעות תאי DMEM המכילים 10% FBS, P / S (10 U / ml) ו0.1 מ"מ BrdU. פלייט תאים ב2 x 10 5 תאים / צלחת במאכלי ג'לטין מצופה זכוכית סנטימטר 3.5 תחתון להסתכלות באמצעות מיקרוסקופ. הערה: נא לא להפריע תאים לאחר ציפוי לפחות 24 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C.
    15. יום 3, צ'הnge 24 שעות בינוניות לאחר ציפוי לDMEM / ממ המכיל 5% FBS, P / S ו0.1 מ"מ BrdU.
    16. יום 4, שינוי 48 שעות בינוניות לאחר ציפוי לDMEM / ממ המכיל 5% FBS ו-P / S.
      הערה: שנה בינונית כל 2-3 ימים עם DMEM / ממ המכיל 5% FBS ו-P / S.

2. התמרה lentiviral

  1. אריזה של פלסמידים lentiviral
    הערה: אנא עיין במקורות אחרים לעוד מידע מעמיק בנושא זה 24-26. זה ייקח בערך 3 ימים כדי להכין את פתרון lentiviral. עדיף להשתמש בפתרון lentiviral טרי כדי להשיג יעילות התמרה גבוהה יותר. התחל האריזה של פלסמידים ובידוד של שריר לב בילוד חולדה במקביל lentiviral. במקום להשתמש polyethyleneimine (PEI) 27 לאריזה של פלסמידים lentiviral, ניתן להשתמש בם מגיב transfection זמין מסחרי. עקוב אחר ההוראות של היצרן.
    1. הכן את חומרים כימיים וכלים; HEKתאי 293T, 10 מנות סנטימטר פלסטיק תרבית תאים, פתרונות פלסמיד lentiviral (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, וקטור העברת lentiviral, 1.0 מ"ג / מיליליטר כל אחד), 1 גרם / ליטר PEI, בינוני סרום ללא, 20 מ"מ chloroquine במים, אקונומיקה 10%, SDS 1% בEtOH 70%
    2. יום 0, צלחת 2-2.5 תאי x 10 6 293T HEK לכל 10 סנטימטר צלחת היום לפני transfection.
      הערה: מפגש 30-60% בtransfection הוא אופטימלי.
    3. יום 1, הכנת פתרון transfection PEI. הוסף 30 ul של 1 גרם / ליטר PEI ל960 בינוני סרום ללא ul בצינור 1.5 מיליליטר. הוסף 4 פלסמידים לפתרון transfection PEI בצינור 1.5 מיליליטר, ולערבב עם הקשה.
    שמו של פלסמיד פתק גודל (KBP) נפח מוסף (מיליליטר) סכום סופי ב10 צלחת סנטימטר (מ"ג) ריכוז סופי בצלחת סנטימטר 10 (PM)
    וקטור העברת lentiviral מקודד גנטי כדי להיות ארוז 9-13 3.6-5.2 3.6-5.2 60
    pMDLg / pRRE מבטא GAG-HIV-1 / POL 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-Rev מבטא REV-HIV-1 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G מבטא VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    טבלה 2:. הסכום של פלסמידים לאריזת lentiviral השתמש כמויות פלסמיד אלה transfect תאי HEK293 ב10 מנות סנטימטר. סכום סופי של וקטור העברת lentiviral לכל צלחת עשוי להיות שונה בהתאם לגודלה, לשמור על ריכוז סופי לכל צלחת ב60 PM. משקל מולקולרי הממוצע של זוג בסיס אחד מגדילי הדנ"א הכפול הוא 660 daltons.

    1. בטל מדיום ישןמ10 צלחת סנטימטר של תאי 293T HEK, ועדינות להוסיף 9 מיליליטר של מדיום חדש (DMEM + 10 FBS%, ללא P / S).
    2. הוסף תערובת PEI-DNA בעדינות טיפה חכם לצלחת ועדינות מערבולת לערבב עם מדיום. הוסף 10 ul של 20 chloroquine מ"מ (20 אום סופי) ל10 בינוני מיליליטר. הוא חשב chloroquine להפחית השפלה של מתחמי transfection המכיל פלסמיד באמצעות נטרול חלקי של ה-pH בתוך תאי lysosomal 28: הערה.
    3. דגירה בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ צלזיוס במשך 6 שעות. לאחר מכן, להסיר בינוני המכיל תערובת PEI-DNA ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום חדש (FBS +10% DMEM + 20 4 מ"מ - חומצה (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), pH7.4 + P / S) . הערה: לאחר דגירה, וירוס יופק במדיום. טפטפות ו / או עצות aspirating פסטר יש לחטא באקונומיקת 10%. תמיד לטהר את שטח ארון בטיחות הביולוגי וציוד שעלול להיות מזוהם בEtOH 70% ללא קשר אם supernatant שנשפךאו לא. אם השפיכה התרחשה, טיהור יסודית עם 1% SDS בEtOH 70% היא הכרחית.
    4. יום 2-3, מדגיר CO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C ל48-72 שעות. יום 4, לאסוף פתרון lentiviral (המשך לסעיף 2.2).
      הערה: בינוני ניתן לשנות ב48 שעות לאחר transfection. איסוף supernatant וירוס 48 שעות ו72 שעות פעמיים יכול להשיג כדי להשיג פתרונות וירוס כייל גבוהים יותר.
  2. אוסף של פתרון lentiviral ותמרה
    1. הכן מגיב וכלים: צינורות מיליליטר חרוטי 15, 1 M HEPES, pH7.4 (0.22 אממ מסונן)
    2. יום 4, איסוף supernatant המכיל חלקיקי lentivirus (פתרון lentiviral) עם 10 מיליליטר מעוקר מזרק Luer-לוק, ואז לסנן את supernatant דרך 0.45 אממ לסנן לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. הוספה של 1 M HEPES pH7.4 1/100 נפח לפתרון מסונן lentiviral (סופי 10 מ"מ).
      הערה: לסינון, השתמש רק באס תאיתטייט או polyethersulfone (PES) (חלבון נמוך מחייב) מסננים. אין להשתמש במסנני ניטרוצלולוזה. ניטרוצלולוזה נקשר משטח חלבונים על מעטפת lentiviral והורסת את הנגיף.
    3. הסר בינוני מ3.5 מנות סנטימטר של שריר לב בילוד חולדה, המתקבלות בשלב האחרון של סעיף 1.2, להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת lentiviral המסוננת למנת 3.5 סנטימטר.
    4. <Optional> הוספת רומיד hexadimethrine (ריכוז סופי 4-6 מיקרוגרם / מיליליטר).
      הערה: ברומיד Hexadimethrine עשוי לשפר את יעילות התמרה lentiviral. הריכוז במתיל hexadimethrine צריך להיות מותאם.
    5. דגירה צלחת למשך 6 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C עבור התמרה lentiviral, ואז לשנות בינוני עד DMEM / MEM החדש המכיל 5% FBS ו-P / S. דגירה הצלחת בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C במשך 3 ימים.
      הערה: שילוב של גן אקסוגני לתוך הגנום המארח ידי lentivirus נחשב להסתיים עד 72 שעות.
    6. יום 7, השתמש בתאים מהצעד 2.2.5 לשלב הבא. הערה: ביטוי חלבון מפלסמיד lentiviral יכול להיות מאושר על ידי WB או immunocytochemistry (ICH) לאחר 48-72 שעות של התמרה על מנת לקבוע את הרמה היחסית הביטוי (איור 1 א ו ב 1).
  3. ריכוז של פתרון lentiviral
    הערה: עדיף להשתמש בפתרון lentiviral טרי על מנת להשיג יעילות התמרה הגבוהה ביותר, במקרה כייל פתרון lentiviral אינו גבוה מספיק, פתרון lentiviral יכול להיות מרוכזת על ידי פוליאתילן גליקול ממטרים (PEG) 29.
    1. הכנת פתרון 4x PEG (32% PEG6000, כלוריד 400 מ"מ נתרן (NaCl), 40 HEPES מ"מ pH7.4)
      1. ל125 פתרון מיליליטר 4x PEG, לשקול 40 גרם של PEG6000, ולאחר מכן לפזר אותו ב60 מיליליטר מים.
        הערה: הערה: (. כלומר משקל מולקולרי הממוצע של PEG6000 הוא 6,000) המספר לאחר PEG הוא המשקל המולקולרי הממוצע
        הערה: 2.3.1.2) לאט לאט להוסיף 10 מיליליטר5 M NaCl. לאט לאט להוסיף 5 מיליליטר של 1 M HEPES pH7.4. התאם ל-pH 7.4 באמצעות נתרן הידרוקסידי 2 M.
        הערה: 2.3.1.3) מוסיף מים עד ל125 מיליליטר. לעקר פתרון PEG 4x על ידי סינון קרום עם מסנן 0.22 אממ ולאחסן אותו בשעה 4 ˚ C.
    2. ריכוז Lentivirus
      1. lentiviral הסינון transduced supernatant לתוך צינור 50 מיליליטר חדש באמצעות מסנן 0.45 אממ.
        הערה: 2.3.2.2) פתרון 4x PEG הוספה 01:03 יחס (פתרון PEG: supernatant = 1:3). חנות ב 4 ˚ C ל16-48 שעות.
        הערה:) צנטריפוגה 2.3.2.3 ב2,600 x גרם ב 4 ˚ C למשך 30 דקות. בטל supernatant ו צנטריפוגות ב 2,600 x גרם ב 4 ˚ צלזיוס למשך 5 דקות.
        הערה: 2.3.2.4) בטל supernatant בזהירות כדי להימנע מלהפריע גלולה. גלולה מחדש להשעות במדיום סרום ללא שימוש 1/2 עד 1/25 נפח של supernatant המקורי הנפח.
        הערה: 2.3.2.5) השתמש במישרין או להקפיא באמצעות חנקן נוזלי לאחר מכן לאחסן ב -80 ˚ C

3. התמרה adenoviral

הערה: אנא עיין במקורות אחרים לשיטות לבנייה וההפצה של מבני adenoviral 13. טפטפות ו / או עצות aspirating פסטר יש לחטא באקונומיקת 10%. תמיד לטהר את שטח ארון בטיחות הביולוגי ושעשויים להיות נגוע ציוד עם EtOH 70% ללא קשר אם supernatant כבר נשפך. אם השפיכה התרחשה, טיהור יסודית עם 1% SDS בEtOH 70% היא הכרחית.

  1. טיטרציה adenoviral ידי 50% מינון זיהומיות תרבית רקמה (TCID 50)
    הערה: לפני התמרה, יש צורך לכיל את פתרון מניות adenoviral. 50 TCID הוא אחת השיטות הטובות ביותר כדי לכיל את הפתרון הנגיפי. בגלל השיטה מעריכה כייל ידי קיבולת זיהומיות לתאי HEK 293T, מחושבת 50 TCID משקף infectability בפועל של מניית adenovirus. PFU (חד יוצרי פלאקts) הוא פרופורציונאלי ל50 TCID עם מקדם של כ 0.56 30.
    1. הכן את התאים וכלים: תאי HEK 293T, צלחות תרבית תאי 10 סנטימטר, 96 היטב צלחת תרבית תאים שטוחה תחתונה, פיפטה רבת 8 ערוצים
    2. הכן את תאי 293T HEK מחוברות 70-90% במנת 10 סנטימטר אחד.
    3. בצע מראש דילול של 1/10 4 של מניית הווירוס. הוסף 50 ul של FBS +10% DMEM היטב בכל 96 היטב צלחת תרבית תאים שטוחה תחתונה. הוסף 25 ul של מניית הווירוס מראש מדוללת לשורה הראשונה, מ-A עד H.
    4. מערבבים היטב ולהעביר 25 ul מהשורה הראשונה של בארות לשורה השנייה עם פיפטה רבת 8 ערוצים. חזור על 1/3 הדילול של פתרון ויראלי לכל שורה של בארות עד וכולל שורת 11th וזורקים 25 ul האחרון.
    5. תאי 293T Triturate HEK ל10 מיליליטר של FBS +10% DMEM. הוסף 50 ul של פתרון תא לתוך באר כל אחד משורות 1 עד 12.
    6. דגירה תאים ב 37 ˚ C בחממת CO2 ל11-13 ימים. הוסף 50 ul של DMEM + 1FBS 0% אחרי 4-5 ימים ו7-8 ימים של ציפוי.
    7. למדוד את השפעות cytopathic בכל הטוב ב11-13 ימים שלאחר זיהום.
    נתיב 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    שורה ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    שורה ב ' ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה C ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה D ד ד ד ד ד ד ד
    שורת E ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה F ד ד ד ד ד ד ד
    השורה G ד ד ד ד ד ד ד ד
    השורה H ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד ד
    מספר הבארות חיוביות בכל שורה 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    היחס של בארות חיוביות בכל שורה 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    ד מציג מעל השפעות cytopathic 50%
    מציג תחת 50% או ללא תופעות cytopathic

    ליין 1, דילול 3 1 x10 4; מסלול 2, דילול 3 2 x10 4; ...; מסלול 11, דילול 3 2 x10 11; נתיב 12, שליטה.
    S = הסכום של היחסים של בארות חיוביות בכל שורה
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0.75 +0.63 +0.25 +0.25 +0 = 8.875
    TCID 50 = 3 x 10 4 x 3 x (8.875-.5) = 2.97 x 10 8
    TCID 50 / מיליליטר = 5.94 x 10 9

    טבלה 3: דוגמא ל96 נגועים היטב צלחת לאחר דגירה 10 ימים למדוד את השפעות cytopathic היטב כל אחד ולסכם את היחסים של בארות חיוביות בכל שורה..

    1. חשב את כייל פי הנוסחה של Kaerber
    2. TCID 50 x = (דילול של הנתיב הראשון) (דילול) (S-0.5)
    3. S = הסכום של היחסים של בארות חיוביות בכל שורה
      הערה: לקבלת פרוטוקול זה, TCID 50 x = (30,000) (3) (S-0.5). בגלל 50 ul של פתרון ויראלי שימוש בפרוטוקול זה, יש לחלק 50 TCID ידי 0.05 לחשב TCID 50 / מיליליטר.
  2. התמרה adenoviral
    1. חישוב כמות הנדרשת של פתרון adenoviral מכייל (PFU / מיליליטר, חלקיקים נגיפיים / מיליליטר או TCID 50 / מיליליטר) שלה. השתמש בנוסחא לחישוב משרד הפנים (ריבוי של זיהום).
    2. em> [טבלת מקום 4 כאן]
    3. הוסף את הכמות מחושבת של פתרון וירוס למדיום סרום ללא (ראה לוח 5). מערבבים היטב דגירה עבור 20 דקות ב RT.
    4. em> [טבלת מקום 5 כאן]
    5. Day7, קח את המנה המתקבלת בשלב האחרון של סעיף 2.2, ולהחליף בינוני עם 750 ul של DMEM / MEM החדש המכיל 5% FBS ו-P / S.
      הערה: הפחתה של נפח בינוניבתמרה לכ -50% מהנפח המקורי הוא קריטי ליעילות התמרה גבוהה.
    6. הוספת פתרון וירוס מדולל לצלחת. דגירה הצלחת ל4-8 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C. לאחר מכן, להחליף עם מדיום חדש.
    7. דגירה צלחת ל24-48 שעות בCO 2 באינקובטור ב 37 ˚ C. ביום 8-9, השתמשו בתאים לניסוי ההדמיה לחיות התאים. הערה: ביטוי חלבון מפלסמיד adenoviral יכול להיות מאושר על ידי WB או ICH לאחר 24-48 שעות של התמרה כדי לקבוע את רמת ביטוי חלבון יחסית (איור 1 ג'ו1D).

4. הדמיה תא חי

  1. רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב עם חדר בטמפרטורה מבוקרת ומערכת CO 2 סביבתית (אופציונלית)
    1. הפעל את מערכת בקרת הטמפרטורה בשעה לפחות 1 לפני הרכישה, כך שכל המכשירים לאזן ל37 ˚ C לפני תחילת רכישה. הפעל confocאל ספינינג מערכת מיקרוסקופ הדיסק (מחשב לתפעול, מיקרוסקופ, יחידת דיסק ספינינג, מצלמת CCD, לייזרים, מקור אור פלורסנט, מקור אור רגיל, שלב ממונע, ותריסים אוטומטיים).
      הערה: שעות יותר מ 1 היא הכרחיות כדי להשיג איזון טמפרטורה המלא של כל ההתקנים.
    2. השנה בינונית ב3.5 מנות תחתית כוס סנטימטר עד בינוני רצויים לרכישה, במידת צורך. מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב בחדר בטמפרטורה מבוקרת.
      הערה: בשל סטייה כדורית לתצפית אופטימלית על ידי שימוש במיקרוסקופ של צלחת זכוכית 3.5 סנטימטר תחתון עם מכסה זכוכית מס 1.5 (כ .16-0.19 מ"מ עובי) הוא אידיאלית. אם יש המטרה בשימוש צווארון תיקון, ניתן לתקן תמונות שהושגו עם משקפיים כיסוי עבים יותר 0.17 מ"מ. כמו כן, יש פנול אדום הקרינה קלה. לפעמים עדיף להשתמש במדיום פנול אדום חופשי, כגון DMEM ללא פנול אדום. אם אין מכשיר לשלוט CO 2 עצמאי בינוני או בינוני שנאגרו על ידי HEPES לזמן לשגות הדמיה לטווח ארוך.
    3. בחר את נתיב האור לעיניות.
    4. הפעל את התריס של מקור האור הבהיר השדה ב. התאם את המיקוד לתאים תחת המיקרוסקופ דרך העיני. הפעל את התריס ממקור האור הבהיר השדה.
    5. הפעל את התריס למקור אור הניאון על. מצא את התאים לבטא חלבוני ניאון מתחת למיקרוסקופ דרך העיני. הפעל את התריס ממקור אור הניאון.
    6. אופציונאלי> לחץ על לחצן הפעלה עבור מערכת הפוקוס המושלמת מול מיקרוסקופ כדי להפוך את מערכת הפוקוס המושלמת על מנת לשמור על מיקוד יציב במהלך רכישת הזמן לשגות.
    7. לשנות את נתיב האור למיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. התאם את הגדרות לרכישה כראוי באמצעות תוכנת ההפעלה, בדיקת displa תמונותyed על המסך. (למשל פוקוס, כוח הלייזר, זמן חשיפה, עלייה במצלמת CCD ומחוץ לסט)
    8. הגדרות שנקבעו לרכישת תמונת הניאון באמצעות תוכנת הפעלה. לדוגמא: בחר באפשרות "שינוי ערוצים באמצעות נתיבי אור" ו "בערוץ 1: EGFP" לרכוש אות ניאון מEGFP לערוץ אחד.
    9. הגדר את התדירות בין נקודות זמן ידי קביעת הגדרות תצורת הזמן לשגות כדי לקחת זמן לשגות תמונות באמצעות תוכנת ההפעלה. לדוגמא: כדי לרכוש זמן נקודה אחת כל 5 דקות, בחר "דקות לכל נקודת זמן" מהתפריט הנפתח והזן 5 בשדה הטקסט.
      הערה: בחר באפשרות "מהירות מקסימלית" לעשות סרט במהירות בפועל. אם הביטוי של החלבון פלואורסצנטי הוא נמוך, הקרינה יכולה להלבין במהירות במהלך רכישת הזמן לשגות. במקרה כזה, עדיף להפחית את מספר נקודות זמן רכישה.
    10. הפעל את רכישת הזמן לשגות ידי לחיצה על "staכפתור RT "לרכוש תמונה ברצף.
      הערה: עדיף לא להשתמש בפונקצית רכישת מספר רב של נקודות. זה עלול לגרום לאובדן מיקוד או תנועה של שדה ההדמיה במהלך הדמיה הזמן לשגות.
  2. ניתוח של תמונות שנרכשו
    ניתן לשחק תמונות שנרכשה בחזרה כקובץ סרט ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח: הערה.
    1. בחר את התמונות שנרכשו להיכלל בסרט. במידת צורך, אזורי יבול של ריבית מתמונות ובחר נקודות זמן מעניינות כדי להקטין את גודל קובץ של הסרט באמצעות תוכנת ההפעלה.
    2. יצוא תמונות כקובץ סרט בפורמט AVI או בפורמט MOV. בחר בפורמט סרט מתפריט הנפתח "פורמט" והעיתוי נדרש לסרט המוגמר, ולאחר מכן לחץ על "יצוא". הערה: זמן לשגות תמונות שנרכשו באחת בזמן נקודה יכולה להיות משחק חזרה כל 5 דקות כסרט ב10 פריימים לשניה, שהוא 3,000 פעמים מהר יותר מאשר מהירותה בפועל.
  3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים את הטכניקה, EGFP lentivirus קידוד (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) מתויג Cx43 (connexin43) או Cx43 מוטציה 32 שימש לבטא חלבונים מתויג EGFP בתאים, וקידוד adenovirus FGFR1DN (קולטן לגורם גדילה פיברובלסטים 1 שלילי דומיננטי ) שימש כדי לכבות את איתות FGF בתא 33-35. שלושה ימים לאחר הבידוד של שריר לב, שריר הלב המבודד היו transduced עם lentivirus כדי לבטא חלבונים מתויג EGFP בתאים. ואז אחרי 3 ימים של התמרה lentiviral, שריר הלב המבודד היו transduced נוסף עם קידוד adenovirus FGFR1DN לחסל איתות FGF בתאים. לאחר שנתן מספיק זמן לתאים לבטא גנים אקסוגניים transduced, מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal שימש כדי ללכוד תמונות תא חיות. תמונות שנרכשו הם שיחקו בחזרה כקובץ סרט ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. לייצוג מפורט יותרתוצאות מופרזות אנא ראו סקוראי ואח' 32.

הביטוי של EGFP מתויג חלבונים הבאים התמרה lentiviral אושרה על ידי מיקרוסקופיה confocal הדיסק מסתובב 72 שעות הבאות 1A-B דמויות התמרה lentiviral. הביטוי של FGFR1DN ידי התמרה adenoviral אושר על ידי WB וICC לאחר 24 שעות של דמויות התמרה 1C-D adenoviral. הזמן של בנוסף adenoviral 3.5 מנות סנטימטר הוגדר כזמן 0 וזמן לשגות תמונות נרכשו עם 0.9 עדשה אובייקטיבית 40x אוויר NA כל 5 דקות למשך 6 שעות באמצעות תנור תא כדי לשמור על הטמפרטורה ב37 ˚ C. זמן לשגות תמונות של חלבונים מתויגים EGFP בשריר הלב העיקרי שננקט על ידי מיקרוסקופיה confocal הדיסק מסתובב מוצגות בסרטי משלימה 1-2.

במקרים בהם לא היה איזון הטמפרטורה נאות, או המצב מרובה הרכישה אינו מתפקד כראוי,תמונות שנתפסו עשויות לנוע במישור xy משלימה סרט 1. עם זאת, כאשר פועלים כראוי במערכת פוקוס אוטומטי נשמרה יציבות פוקוס וזה לא קרה. כפי שניתן לראות בסרט משלימה 2, כאשר איזון הטמפרטורה היה מספיק ורק אחד באזור של העניין נרכש, את התמונות שנתפסו הן באיכות גבוהה מאוד.

הפועם של שריר לב הוערך לאחר הדמיה תא חי לטווח ארוך זמן לשגות על מנת לאשר את כדאיות תא. גם לאחר 16 שעות של שריר לב להביע EGFP הזמן לשגות ההדמיה לשמור על המאפיינים הפונקציונליים שלהם והכו את הסרט בקצב משלימה 3.

איור 1
איור 1. אישור על ביטוי החלבון הבא התמרה lentiviral או adenoviral. () שריר לב בילוד חולדה מבודדת להביע Cx43-WT-EGFP transduced עם Ad-FGFR1DN 3 ימים לאחר התמרה. ראה גם סרט משלימה 1. (ב ') שריר לב בילוד חולדה מבודד להביע Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP transduced עם Ad-FGFR1DN 3 ימים לאחר התמרה. ראה גם סרט משלים 2. (ג) ביטוי חלבון הבא התמרה adenoviral זוהתה על ידי בית הדין הפלילי הבינלאומי 24 שעות לאחר התמרה. ביטוי hemagglutinin (HA) FGFR1DN זוהה על ידי נוגדן אנטי HA תוך שימוש בשיטות קונבנציונליות ICC-מתויג חלבונים, אלפא actinin שימש כסמן לשריר לב. (ד ') של חלבון FGFR1DN הבא התמרה adenoviral זוהתה על ידי WB 24 שעות לאחר התמרה. FGFR1DN מתויג-HA זוהה על ידי נוגדן אנטי HA ידי WB, בטא טובולין שימש כבקרת טעינה.

סרט משלים 1. הזמן לשגות הדמיה של מכונית של ילוד חולדה מבודדת diomyocytes להביע Cx43-WT-EGFP transduced עם Ad-FGFR1DN. הזמן לשגות התמונות נרכשו עם עדשה אובייקטיבית 40x כל 5 דקות במשך שעה 6 עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. תמונות שנרכשו היו משחק חזרה כסרט ב10 מסגרות לשנייה. הסרט הזה שונה מסקוראי ואח' 32. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

סרט משלים 2. זמן לשגות הדמיה של שריר לב בילוד חולדה מבודדת להביע Cx43-S325/328/330E-EGFP transduced עם Ad-FGFR1DN. הזמן לשגות התמונות נרכשו עם עדשה אובייקטיבית 40x כל 5 דקות למשך 6 שעות עם confocal ספינינג מיקרוסקופ דיסק. תמונות שנרכשו היו משחק חזרה כסרט ב10 מסגרות לשנייה. הסרט הזה שונה מסקוראי ואח' 32."= היעד" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

סרט משלים 3. הזמן לשגות הדמיה של שריר לב בילוד חולדה מבודד שיחקה בחזרה במהירות בפועל. התמונות של שריר לב בילוד חולדה מבודדת להביע Cx43-EGFP transduced עם Ad-FGFR1DN נרכשו עם עדשה אובייקטיבית 40x כל 200 msec ל10 הזמן לשגות שניות עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב הבא 16 שעות של רכישת הזמן לשגות. תמונות שנרכשו היו משחק חזרה כסרט ב5 פריימים לשנייה במהירות בפועל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

cardiomyocytes העיקרי מבודדת מחולדות בילוד כבר מזמן משמש ללמוד פונקציות cardiomyocyte במבחנה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד של שריר לב בילוד מגורי חולדה בשיטת עיכול אנזים שני שלבים, לעכל ראשון עם O טריפסין / N ב 4 ° C ולאחר מכן collagenase מטוהר. אחד יתרונות של העסקת צעד collagenase מטוהר הוא שאותה הכיתה של אנזים משמשת עבור כל הבידודים. לכן, את האיכות והכמות של תאים מבודדים היא עקבי מניסוי לניסוי.

בהתחשב ביעילות התמרה גבוהה יותר הקשורים לאדנווירוס, אם יעילות גבוהה של התמרה של תרבית התאים נחוצה לניסוי נתון, עדיף להשתמש adenovirus. עם זאת, אם רמות גבוהות של התמרה אינן נחוצות, יכול לשמש וקטור lentiviral. יש את האפשרות של שימוש בוקטורים או adenoviral או lentiviral עושה את זה יותר קל להשיג transd המתאיםרמות uction והביטוי לסוגים שונים של גנים. אם עוצמת הניאון זוהתה על ידי הדמיה לחיות תאים באמצעות מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב או בית הדין הפלילי הבינלאומי הוא נמוך מאוד לאחר התמרה lentiviral, באמצעות עוד וקטור העברת lentiviral המשתמש במקדם שונה כדי לבטא את הגן של עניין עשוי לפתור בעיה זו. עם וקטורי adenoviral, אם הלהקה זוהתה על ידי WB היא חלשה לאחר התמרה adenoviral, זה עשוי להצביע על מניית ויראלי כייל נמוך. במקרה זה, עדיף להכין פתרון adenoviral כייל גבוה יותר על ידי ריבוי בתאים לפני שתמשיך.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא שהתשואה של שריר לב קיימא המבודד היא לא עקבית מאוד מניסוי לניסוי, גם בעת שימוש collagenase מטוהר. על מנת לבצע ניסויי הדמיה לשחזור עדיף לספור תאי קיימא לאחר בחירתו של שריר לב מבודד בsupernatant בצעד 1.2.13. בסעיף הפרוטוקול. לאחר מכן, seed שריר לב במנות תחתית כוס בדילולים שונים. ברגע שהתאים מחוברים, מנות נבחרות עם ריכוז התא המתאים לניסוי מתוכנן.

ישנם יתרונות רבים של שימוש בשריר לב בילוד, אבל יש גם כמה חסרונות. החסרון העיקרי הוא ההבדל הברור משריר לב מבוגר. שריר לב בוגר באופן מלא המובחן הוא מוט צורה ושריר לב עיקרי למבוגרים מבודדים לשמור על המורפולוגיה בצורת המוט שלהם, ואילו שריר לב ראשוני בילוד מבודד התפשט לכל הכיוונים 36. ההבדלים פנוטיפי בין מבוגרים מבודדים ושריר לב בילוד משתקפים גם בדפוסים של ביטוי גנים 37. לכן, לניסויים שבהם שריר לב מובחן נדרשים, פרוטוקול לבידוד של שריר לב המבוגר יהיה צורך 4.

העסקת התמרה adenoviral וlentiviral של רקומביננטיחלבונים לתוך שריר לב בילוד חולדה עיקרי בשילוב עם מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal מאפשר לנו לנתח את הפונקציות של חלבונים בתאים ראשוניים חיים בתרבית. יחסית לשיטות קיימות, אשר מנצלות transfection להציג את הגן של עניין לתוך תאים, יתרון משמעותי של פרוטוקול זה הוא שadenoviruses וlentiviruses נלקחים ביעילות רבה על ידי התאים וכתוצאה מכך הביטוי של הגן של עניין כמעט בכל התאים ב התרבות. יתר על כן, השימוש בשני סוגים שונים של וירוסים לביטוי גנים שעושה את זה קל יותר להשיג שיעורים מתאימים התמרה ורמות ביטוי למספר רב של גנים. גם siRNAs ואגוניסטים כימיים ויריבים ניתן להשתמש במערכת זו כדי להפריע עוד יותר ולנתח את הפונקציות של גנים והחלבונים שהם מקודדים.

הכנת הלבבות היא צעד חשוב מאוד בפרוטוקול. הסר את הלב מהגוף מהר ככל האפשר. הקפדלשים אותם על קרח באופן מיידי כדי לשמור על כדאיות גבוהה תא. צעד חשוב נוסף הוא הכנת באיכות גבוהה, וכיילתי, מניות lentiviral / adenoviral. אם מניות ויראלי באיכות ירודה המשמשות, רמות התמרה והביטוי של הגן של ריבית תהיה נמוכות. לכן, הם עשויים שלא להיות מתאימים לבדיקות הדמיה.

יישום עתידי חשוב של טכניקה זו יהיה השימוש בו 'בשריר לב עכבר. מחקרי פיילוט בדיקה האם שיטה זו יכולה לשמש לבידוד של שריר לב בילוד עכבר הניבה תוצאות מבטיחות. בשל גודלו הקטן יחסית של לבבות עכבר בהשוואה לאלו של חולדות, פחות רקמה מתקבלת בתחילה. כך, פחות תאים מבודדים בהליך יחיד באמצעות אותו המספר של בעלי חיים, אלא פשוט באמצעות יותר עכברים לבידוד צריך לחסל את המכשול הזה. היכולת לבודד cardiomyocytes עכבר מאפשרת לחוקרים לחקור את הפונקציות של תאים מבודדים ממ 'מהונדס גנטיקרח (מהונדס, עקום החוצה, לדפוק ב) שהופק על מנת ללמוד על צורה מסוימת של הגן של עניין.

אחד המכשולים העיקריים במחקר לב וכלי דם היה הקושי הקשורים בחקירת הביטוי והתפקוד של גן מסוים בא לידי ביטוי ברקמת לב in vivo בזמן אמת. עם זאת היכולת לבודד שריר לב פועם פונקציונלי, לווסת את תפקודי תא באמצעות התמרה ויראלית, ולאחר מכן ללמוד אותם בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal עוזרת לשפוך אור על תפקידו של שריר הלב in vivo ולגשר על הפער הזה. שיטה זו מספקת מערכת פשוטה להבנת תפקוד cardiomyocyte ברמה התאית. היא מאפשרת ניתוח בזמן אמת של כמה הפרעות בביטוי הגנים לשנות את תפקוד cardiomyocyte. הדמיה תא חי של cardiomyocytes תספק תובנות נוספות פונקצית cardiomyocyte. תובנות אלה יובילו להתקדמות בcardiovascula הבסיסיתמחקר r, וכתוצאה מטיפולים חדשניים לטיפול במחלת לב וכלי דם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31, (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28, (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79, (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32, (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63, (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62, (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. 264-573 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics