प्राथमिक चूहा नवजात cardiomyocytes लाइव सेल इमेजिंग के adenoviral के बाद और Lentiviral पारगमन Confocal डिस्क माइक्रोस्कोपी स्पिनिंग का प्रयोग

Biology

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Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

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Abstract

वे आसानी से एक ही प्रक्रिया में बड़ी संख्या में अलग किया जा सकता है क्योंकि प्राथमिक चूहे नवजात cardiomyocytes विट्रो हृदय अनुसंधान में बुनियादी में उपयोगी होते हैं. कारण माइक्रोस्कोप प्रौद्योगिकी में प्रगति के लिए यह कोशिकाओं को phototoxicity के बारे में कम से कम चिंता के साथ वास्तविक समय में सेलुलर घटनाओं की जांच करने के प्रयोजन के लिए जीना सेल छवियों पर कब्जा करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. इस प्रोटोकॉल सेल के गुण व्यवस्थित करना lentiviral और adenoviral पारगमन के बाद एक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप का उपयोग प्राथमिक चूहे नवजात cardiomyocytes की जीवित कोशिका timelapse चित्र लेने के लिए कैसे करें. वायरस के दो विभिन्न प्रकार के आवेदन के लिए यह आसान दो अलग जीनों के लिए एक उपयुक्त पारगमन दर और अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए बनाता है. खैर केंद्रित रहते सेल छवियों लंबे समय अवधि के लिए स्थिर ध्यान रखता है जो माइक्रोस्कोप के autofocus प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. इस पद्धति लागू, exogenously इंजीनियर के कार्यसुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं में व्यक्त एड प्रोटीन का विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली siRNAs के उपयोग के माध्यम से और साथ ही रासायनिक modulators के जीनों के कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

प्राथमिक चूहे नवजात cardiomyocytes लंबे विट्रो 1 में cardiomyocyte समारोह की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है. वे कई अच्छी तरह से स्थापित तरीकों 2-4 से चूहे पिल्ले से अलग करने के लिए आसान कर रहे हैं. सबसे आम तरीका collagenase या पूर्व सेल अलगाव को दिल की संयोजी ऊतक को पचाने के लिए trypsin कार्यरत हैं. शोधकर्ताओं ने यह भी वयस्क कृन्तकों 5-8 के साथ ही नवजात चूहों 9,10 से cardiomyocytes के लिए अलग तरीके विकसित किया है.

इस प्रोटोकॉल एक दो कदम एंजाइम पाचन प्रक्रिया को रोजगार, नवजात चूहे पिल्ले से cardiomyocytes अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. Trypsin पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन इस्तेमाल किया, और 37 डिग्री सेल्सियस पर तो शुद्ध collagenase है 4 डिग्री सेल्सियस पर trypsin हे / एन के साथ हृदय के ऊतकों की ऊष्मायन एक गर्म एंजाइम समाधान 2 में अनुक्रमिक incubations का उपयोग तरीकों की तुलना में फसल की कोशिकाओं के लिए आवश्यक कदम कम कर देता है. इसके अलावा, शुद्ध सह का उपयोग करकेllagenase बल्कि कच्चे तेल की एंजाइमों से, बहुत से बहुत परिवर्तनशीलता इस प्रकार बढ़ाया reproducibility प्रदान करने, समाप्त किया जा सकता है.

एक विशेष प्रोटीन के कार्यात्मक अध्ययन अक्सर एक adenovirus 11-13 और / या एक lentivirus 14-16 का उपयोग कर एक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली को रोजगार. [सजग नोट] वायरल उत्पादन और हेरफेर एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए.

adenovirus मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं है. यह कोशिकाओं को विभाजित और गैर विभाजित कोशिकाओं सहित अधिकांश प्रकार की कोशिकाओं,, साथ ही प्राथमिक कोशिकाओं और स्थापित सेल लाइनों में पारगमन की एक बहुत ही उच्च क्षमता है. इस adenovirus जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक विश्वसनीय वेक्टर बनाता है. Adenovirus वेक्टर द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन का उच्च स्तर पारगमन निम्नलिखित 48 घंटे के भीतर विकसित करने, और वे कई हफ्तों 17 के लिए पिछले कर सकते हैं. हालांकि, प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक adenovirus का उपयोग करने के लिए एक दोष यह है कि एक पुनः संयोजक एडीई का विकासnovirus जटिल और समय लेने वाली दोनों है. कई शोधकर्ताओं पुनः संयोजक जीन की अभिव्यक्ति के लिए lentiviruses के लिए बदल दिया गया है कि क्यों इस खामी भाग में बताते हैं. Adenoviral निर्माणों के विपरीत, एक lentiviral निर्माण पैदा त्वरित और आसान है. Lentiviruses आम तौर पर दोनों को विभाजित और गैर विभाजित कोशिकाओं में adenoviruses से पारगमन की कम क्षमता है, हालांकि, वे मेजबान जीनोम में एकीकृत है. नतीजतन, transduced जीन की अभिव्यक्ति adenoviruses के लिए की तुलना में lentiviruses के लिए और अधिक स्थिर है.

कारण माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र में तकनीकी विकास के लिए, यह पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं का जीना सेल छवियों पर कब्जा करने के लिए बहुत आसान है. यह भी अधिग्रहण की वीडियो दर गति पर सच है. इस अन्वेषक ब्याज की प्रोटीन में विशेष परिवर्तन कार्यात्मक वास्तविक समय में सेल को प्रभावित कैसे निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप यह लिव लिए एक इष्टतम तकनीक है कि बनाने के लिए कई महत्वपूर्ण विशेषताएं हैंई सेल इमेजिंग 18,19. एक ही समय में बिंदु स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी की तुलना में कहीं कम लेजर शक्ति का उपयोग करते हुए Yokogawa कताई डिस्क, और अधिक तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है. इन विशेष सुविधाओं के दोनों लेजर के नमूने को एक साथ गुजरता है, जिसके माध्यम से कई confocal छेद होता है जो कताई डिस्क, के कारण होते हैं. अधिग्रहण के दौरान, डिस्क ही जल्दी और लगातार 18-20 घूमती है. माइक्रोस्कोप के autofocus प्रणाली का उपयोग करके, स्थिर फोकस समय की लंबी अवधि में बनाए रखा है. इस शोधकर्ताओं अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित रहते हैं कक्ष चित्र लेने के लिए अनुमति देता है. अधिग्रहीत छवियों एक फिल्म फ़ाइल के रूप में वापस खेला जाता है. छवियों ऐसे ImageJ 21,22, फिजी 23, या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं.

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Protocol

चूहे नवजात cardiomyocytes की 1. अलगाव

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) और संस्कृति के माध्यम के रूप में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) का प्रयोग करें. अलगाव के बाद पहले 2 दिनों के लिए fibroblasts की वृद्धि को रोकने के लिए माध्यम के लिए bromodeoxyuridine (BrdU) जोड़ें.
बेस मध्यम FBS BrdU (मिमी) पी / एस (यू / एमएल)
चयन DMEM 10% 0 20
पहला दिन DMEM 10% 0.1 10
अगले दिन DMEM / सदस्य 5% 0.1 10
इसके अलावा संस्कृति DMEM / सदस्य 5% 0 10

तालिका 1:. चूहे नवजात cardiomyocytes के लिए मध्यम चूहे नवजात cardiomyocytes संवर्धन के लिए इस मीडिया का प्रयोग करें. DMEM / सदस्य DMEM और सदस्य माध्यम की 1:1 मिश्रण है.

  1. Cardiomyocyte अलगाव, दिन 1 (अनुमानित समय की आवश्यकता के बारे में 1 घंटा)
    नोट: नवजात कृन्तकों के साथ काम के लिए, जानवरों की देखभाल कार्यक्रमों द्वारा निर्धारित स्थानीय विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों और नियमों का उल्लेख है, और संस्थागत अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल का पालन करें. इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों येल पशु संसाधन केंद्र के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.
    1. अभिकर्मकों और उपकरण तैयार: कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त हांक संतुलित नमक समाधान (सीएमएफ HBSS), 30 मिलीलीटर एक्स 2, 10 मिलीलीटर एक्स 2, बर्फ पर; बर्फ पर सीएमएफ HBSS के 2 मिलीलीटर, साथ पुनर्गठन 1 मिलीग्राम trypsin,; उपकरणों autoclaved; 70% 250 मिलीलीटर बीकर में इथेनॉल (EtOH); चार 10 सेमी प्लास्टिक के बर्तन, दिल के अलगाव के लिए तीन और trypsinization के लिए एक निष्फल.
    2. आदेश 1 लिटएक प्रयोगात्मक पशु distributer से उनकी बांध के साथ 1 से 2 दिन की उम्र में चूहे पिल्ले (लगभग 10 पिल्ले) के एर.
    3. Day1, छोटे पिंजरे में पिल्ले स्थानांतरण और एक ketamine / xylazine कॉकटेल (Ketamine, 200ml/10g और xylazine 20ml/10g) की अधिक मात्रा के साथ बांध euthanize.
    4. एक पिल्ला ले लो और 70% EtOH के साथ अपने पूरे शरीर बाँझ. अन्य पिल्ले से अलग किसी स्थान पर एक निष्फल 10 सेमी प्लास्टिक पकवान पर अच्छी तरह से बनाए रखा तेज शल्य कैंची के साथ पिल्ला सिर काटना.
      नोट: जितनी जल्दी संभव नमूने एकत्र करने के लिए, यह कृंतक का जीवन समाप्त करने के लिए सबसे तेजी से और कुशल पद्धति का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. ठीक से अच्छी तरह से बनाए रखा उपकरणों के साथ कुशल पेशेवरों द्वारा इस्तेमाल किया जब कत्ल जानवर के लिए कम भय और चिंता में परिणाम और इच्छामृत्यु के अन्य रूपों की तुलना में अधिक तेजी से और व्यावहारिक हो सकता है. यह जानवरों की इच्छामृत्यु के लिए पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन के दिशा निर्देशों की सिफारिशों के अनुरूप है.
    5. निकालें वह पिटाईनिष्फल उपकरणों के साथ कला, और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 30 मिलीलीटर बर्फ ठंडा सीएमएफ HBSS में दिल डाल दिया. नोट: जितनी जल्दी संभव दिलों निकालें और तुरंत बर्फ पर डाल दिया. शरीर से दिल को हटाने के बाद, सभी प्रक्रियाओं बर्फ पर किया जाना चाहिए.
    6. बर्फ ठंडा सीएमएफ HBSS के 30 मिलीग्राम और बर्फ ठंडा सीएमएफ HBSS के एक और 30 मिलीलीटर में शेष 5 दिलों में 5 दिलों इकट्ठा. दिल कुल्ला करने के लिए ट्यूब ज़ुल्फ़. नोट: इस कदम के बाद, एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.
    7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बर्फ पर एक नया निष्फल 10 सेमी प्लास्टिक पकवान दिलों हस्तांतरण. नोट: वातशोषक साथ दिलों महाप्राण के प्रति सावधान रहें.
    8. बड़े जहाजों और / या अवांछित ऊतकों निकालें. दिल कुल्ला करने के लिए डिश के लिए बर्फ ठंडा सीएमएफ HBSS के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
    9. बर्फ पर एक नया निष्फल 10 सेमी प्लास्टिक पकवान सब के दिल स्थानांतरण. बर्फ पर कम से कम 1 मिमी से 3 कैंची से दिल क़ीमा.
    10. ठंडा सीएमएफ HBSS के 9 मिलीलीटर जोड़ें. ठंडा trypsin reconsti के 1 मिलीलीटर जोड़ेंसीएमएफ HBSS (अंतिम 50 स्नातकीय / एमएल) के साथ tuted.
    11. Parafilm के साथ पकवान सील और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर, फिर ठंडे कमरे में (4 ˚ सी) यह रातोंरात जगह है.
  2. Cardiomyocyte अलगाव, दिन 2 (अनुमानित समय की आवश्यकता के बारे में 4 घंटे)
    1. तैयार करें अभिकर्मकों और उपकरण: 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब एक्स 2; बर्फ पर सीएमएफ HBSS के 1 मिलीलीटर, साथ पुनर्गठन 2 मिलीग्राम trypsin अवरोध करनेवाला,; कमरे के तापमान (आर टी) पर लेबोविट्ज़ एल 15, 5 एमएल के साथ पुनर्गठन 1,500 इकाइयों collagenase,; लेबोविट्ज़ एल 15, निष्फल 1 लीटर पानी के साथ पुनर्गठन और एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर, आरटी पर 8 मिलीलीटर के माध्यम से फिल्टर; पानी में 10 मिलीग्राम / एमएल (32.6 मिमी) BrdU; पी / एस; DMEM + 10% FBS; सदस्य; दो 10 सेमी प्लास्टिक सेल संस्कृति व्यंजन; 3.5 सेमी गिलास नीचे व्यंजन.
    2. Day2, जिलेटिन लेपित व्यंजन तैयार. कोट करने के लिए एक इमेजिंग प्रयोग के लिए एक 3.5 सेमी गिलास नीचे पकवान 0.1% जिलेटिन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. फिर aspirate और उपयोग करने से पहले जिलेटिन समाधान त्यागें, कई घंटे के लिए 37 ˚ सी व्यंजन सेते हैं.
      कोईते: 3.5 सेमी गिलास नीचे पकवान एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक इमेजिंग प्रयोग के लिए उपयुक्त है. पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) से प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्राथमिक cardiomyocytes से प्रोटीन निकालने के लिए, 0.1% जिलेटिन लेपित प्लास्टिक सेल संस्कृति बर्तन का इस्तेमाल किया जा सकता है.
    3. निष्फल हुड में बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बफर के साथ रात भर trypsin से पच सभी दिल ऊतक स्थानांतरण. सीएमएफ HBSS में trypsin अवरोध के 1 मिलीलीटर (अंतिम 182 यूजी / एमएल) जोड़ें. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के बंद ढक्कन कसकर प्रदूषण को रोकने के लिए.
    4. ऊतक गर्म और 30-37 ˚ सी के लिए बफर करने के लिए एक 37 ˚ सी इनक्यूबेटर में लगभग 30 मिनट के लिए ट्यूब सेते लेबोविट्ज़ एल 15 में collagenase के 5 मिलीलीटर (अंतिम 94 यूनिट / एमएल) जोड़ें. कोमल (37 ˚ सी इनक्यूबेटर में 170-200 RPM प्रकार के बरतन) झटकों के साथ 45 मिनट के लिए 37 ˚ सी सेते हैं.
      नोट: यह चरण लामिना का प्रवाह हुड के बाहर किया जा सकता है. सभी बाद के चरणों आरटी पर किया जाना चाहिए.
    5. 70% EtOH के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के बाहर कीटाणुरहित और डालनिष्फल हुड में यह.
    6. 20 बार के लिए गति के 3 मिलीग्राम / सेकंड में pipetting के साथ ऑटो पिपेट का उपयोग महीन चुर्ण बनाना ऊतकों. ऊतक अवशेषों एक 70 उम सेल झरनी के साथ सतह पर तैरनेवाला 3 मिनट के लिए व्यवस्थित और फिल्टर करने की अनुमति दें.
      ध्यान दें: एक नियमित आकार 10 एमएल पिपेट विचूर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    7. शेष ऊतक clumps और महीन चुर्ण बनाना करने लेबोविट्ज़ एल 15 के 5 मिलीलीटर जोड़ें और फिर सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर. लेबोविट्ज़ एल -15 के 2 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी धो लें.
    8. Collagenase आंशिक रूप से अपमानित कोलेजन को पचाने के लिए अनुमति देने के लिए 60 मिनट - 20 के लिए एक हुड में फ़िल्टर्ड सेल समाधान रखें.
    9. 5 मिनट के लिए 100 x जी पर तलछट कोशिकाओं. 10% FBS और उच्च एकाग्रता पी / एस (20 यू / एमएल) युक्त DMEM के 20 मिलीलीटर में कोशिकाओं फिर से निलंबित.
    10. Cardiomyocyte चयन के लिए 37 ˚ सी में सीओ 2 इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए दो 10 सेमी प्लास्टिक सेल संस्कृति व्यंजन पर पूर्व प्लेट कोशिकाओं. नोट: Fibroblasts cardiomyocytes से पकवान के नीचे करने के लिए और अधिक आसानी से देते हैं.
    11. कइले प्रतीक्षा, DMEM 10% FBS, पी / एस (10 यू / एमएल) और 0.1 मिमी BrdU युक्त तैयार करते हैं. 10% FBS और पी / एस युक्त DMEM के 325 मिलीलीटर के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल BrdU के 1 मिलीलीटर जोड़ें
    12. धीरे व्यंजन घुमाना और दो 10 सेमी व्यंजन से cardiomyocyte युक्त सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
      नोट: अधिकांश cardiomyocytes अभी ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद सतह पर तैरनेवाला में चल जाएगा. हल्के से पकवान से जुड़े होते हैं कि fibroblasts के साथ contaminating से बचने के लिए, pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला एकत्र नहीं है.
    13. वैकल्पिक> सेल व्यवहार्यता की जांच करने के लिए trypan नीले रंग के साथ और 0.2% के बिना सतह पर तैरनेवाला में कक्षों की गणना.
    14. 5 मिनट के लिए 100 x जी पर तलछट कोशिकाओं. 10% FBS, पी / एस (10 यू / एमएल) और 0.1 मिमी BrdU युक्त DMEM में कोशिकाओं फिर से निलंबित. माइक्रोस्कोप का उपयोग अवलोकन के लिए जिलेटिन में लिपटे 3.5 सेमी गिलास नीचे बर्तन में 2 x 10 5 कोशिकाओं / पकवान पर प्लेट कोशिकाओं. नोट: 37 ˚ सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में कम से कम 24 घंटे के लिए चढ़ाना के बाद कोशिकाओं को परेशान मत करो
    15. 3 दिन, चाnge मध्यम 24 बजे 5% FBS, पी / एस और 0.1 मिमी BrdU युक्त DMEM / सदस्य को चढ़ाना के बाद.
    16. 4 दिन, 5% FBS और पी / एस युक्त DMEM / सदस्य को चढ़ाना के बाद मध्यम 48 बजे बदलें
      नोट: 5% FBS और पी / एस युक्त DMEM / सदस्य के साथ हर 2-3 दिनों मध्यम बदलें

2. Lentiviral पारगमन

  1. Lentiviral plasmids के पैकेजिंग
    नोट: इस विषय 24-26 पर आगे में गहराई से जानकारी के लिए अन्य स्रोतों को देखें. यह lentiviral समाधान तैयार करने के बारे में 3 दिन का समय लगेगा. यह उच्च पारगमन दक्षता हासिल करने के लिए नए सिरे से lentiviral समाधान का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. Lentiviral plasmids और समानांतर में चूहे नवजात cardiomyocytes के अलगाव की पैकेजिंग शुरू करो. इसके बजाय lentiviral plasmids की पैकेजिंग के लिए polyethyleneimine (पी) 27 का उपयोग कर के, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मक इस्तेमाल किया जा सकता है. निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
    1. अभिकर्मकों और उपकरण तैयार; HEK293T कोशिकाओं, 10 सेमी प्लास्टिक सेल संस्कृति बर्तन, lentiviral प्लाज्मिड समाधान (pMDLg / pRRE, pRSV फिरना, pMD2.G, lentiviral स्थानांतरण वेक्टर, 1.0 मिलीग्राम / एमएल प्रत्येक), 1 जी / एल पी, सीरम मुक्त मध्यम, 20 मिमी 70% EtOH में पानी में क्लोरोक्वीन, 10% ब्लीच, 1% एसडीएस
    2. 0 दिन, 10 सेमी प्रति 2-2.5 x 10 6 HEK 293T कोशिकाओं अभिकर्मक पहले दिन पकवान प्लेट.
      नोट: अभिकर्मक में 30-60% संगम इष्टतम है.
    3. दिन 1, पी अभिकर्मक समाधान की तैयारी. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 960 उल सीरम मुक्त मध्यम करने के लिए 1 जी / एल पी के 30 उल जोड़ें. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पी अभिकर्मक समाधान में 4 plasmids जोड़ें, और दोहन के साथ मिश्रण.
    प्लाज्मिड का नाम नोट आकार (KBP) मात्रा गयी (माले) 10 सेमी पकवान की अंतिम राशि (एमजी) 10 सेमी पकवान (प्रधानमंत्री) में अंतिम एकाग्रता
    Lentiviral स्थानांतरण वेक्टर पैक किया जा करने के लिए जीन encodes 9-13 3.6-5.2 3.6-5.2 60
    pMDLg / pRRE एचआईवी -1 भूमिकाः / पीओएल व्यक्त करता है 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV फिरना एचआईवी -1 REV व्यक्त करता है 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G VSV जी व्यक्त करता है 5.8 1.16 1.16 30

    तालिका 2:. Lentiviral पैकेजिंग के लिए plasmids की राशि 10 सेमी बर्तन में HEK293 कोशिकाओं transfect करने के लिए इन प्लाज्मिड मात्रा में प्रयोग करें. पकवान प्रति lentiviral स्थानांतरण वेक्टर की अंतिम राशि, उसके आकार के अनुसार अलग 60 बजे पकवान प्रति अंतिम एकाग्रता बनाए रखने सकता है. डबल असहाय डीएनए का एक आधार जोड़ी का औसत आणविक वजन 660 डाल्टन है.

    1. पुराने मध्यम त्यागेंधीरे 10 सेमी HEK 293T कोशिकाओं के पकवान, और से नए माध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ने (DMEM + 10% FBS, पी / एस) के बिना.
    2. पी डीएनए मिश्रण जोड़ें धीरे थाली पर वार छोड़ देता है और धीरे मध्यम के साथ मिश्रण करने के लिए ज़ुल्फ़. 10 मिलीलीटर मध्यम करने के लिए 20 मिमी क्लोरोक्वीन (अंतिम 20 उम) के 10 उल जोड़ें. नोट: क्लोरोक्विन lysosomal डिब्बों में 28 के भीतर पीएच का आंशिक निराकरण के माध्यम से प्लाज्मिड युक्त अभिकर्मक परिसरों की गिरावट को कम करने के बारे में सोचा है.
    3. 6 घंटे के लिए 37 ˚ सी में सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं. फिर, पी डीएनए मिश्रण युक्त मध्यम हटाने और नए माध्यम के 10 एमएल जोड़ें (DMEM + 10% FBS + 20 मिमी 4 - (2 hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), pH7.4 + पी / एस) . नोट: ऊष्मायन के बाद, वायरस माध्यम में उत्पादन किया जाएगा. Aspirating पाश्चर pipettes और / या सुझाव 10% ब्लीच द्वारा decontaminated किया जाना चाहिए. हमेशा जैविक सुरक्षा कैबिनेट की सतह शुद्ध करना और परवाह किए बिना सतह पर तैरनेवाला गिरा दिया गया है के 70% EtOH के साथ संभावित दूषित उपकरणया नहीं. Spilling आ गई है, तो 70% EtOH में 1% एसडीएस के साथ पूरी तरह से परिशोधन आवश्यक है.
    4. दिन में 2-3, सीओ में सेते 48-72 बजे. 4 दिन के लिए 37 ˚ सी 2 इनक्यूबेटर, lentiviral समाधान (धारा 2.2 के लिए जारी) इकट्ठा.
      नोट: मध्यम अभिकर्मक के बाद 48 बजे बदला जा सकता है. दो बार वायरस सतह पर तैरनेवाला 48 बजे और 72 बजे एकत्रित उच्च टिटर वायरस समाधान प्राप्त करने के लिए प्राप्त कर सकते हैं.
  2. Lentiviral समाधान और पारगमन का संग्रह
    1. अभिकर्मक और उपकरण तैयार: 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, 1 एम HEPES, pH7.4 (0.22 उम फ़िल्टर)
    2. 4 दिन, Luer लोक सिरिंज निष्फल 10 एमएल के साथ lentivirus कणों (lentiviral समाधान) युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए, फिर 0.45 के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर उम एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में फिल्टर. फ़िल्टर किया lentiviral समाधान (अंतिम 10 मिमी) के लिए 1 एम HEPES pH7.4 के 1/100 मात्रा में जोड़ें.
      नोट: छानने के लिए, केवल सेलूलोज ऐस का उपयोगटेट या polyethersulfone (पी इ एस) (कम प्रोटीन बाध्यकारी) फिल्टर. Nitrocellulose फिल्टर का प्रयोग न करें. Nitrocellulose lentiviral लिफाफे पर सतह प्रोटीन बांध और वायरस नष्ट कर देता है.
    3. धारा 1.2 के अंतिम चरण में प्राप्त चूहे नवजात cardiomyocytes की 3.5 सेमी बर्तन, से मध्यम निकालें, 3.5 सेमी पकवान के लिए फ़िल्टर lentiviral समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    4. Hexadimethrine ब्रोमाइड (अंतिम एकाग्रता 4-6 स्नातकीय / एमएल) जोड़ें <Optional>.
      नोट: Hexadimethrine ब्रोमाइड lentiviral पारगमन क्षमता बढ़ाने सकता है. Hexadimethrine ब्रोमाइड की एकाग्रता अनुकूलित किया जाना चाहिए.
    5. Lentiviral पारगमन के लिए 37 ˚ सी में सीओ 2 इनक्यूबेटर में 6 घंटे के लिए पकवान सेते हैं, तो 5% FBS और पी / एस युक्त नया DMEM / सदस्य के लिए मध्यम बदल 3 दिनों के लिए 37 ˚ सी में सीओ 2 इनक्यूबेटर में पकवान सेते हैं.
      नोट: lentivirus से मेजबान जीनोम में exogenous जीन की एकता 72 बजे तक पूरा किया जाना माना जाता है.
    6. 7 दिन, अगले कदम के लिए कदम 2.2.5 से कोशिकाओं का उपयोग करें. नोट: lentiviral प्लाज्मिड से प्रोटीन अभिव्यक्ति रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर निर्धारित करने के लिए पारगमन के 48-72 बजे के बाद पश्चिम बंगाल या immunocytochemistry (आईसीएच) से इसकी पुष्टि की जा सकती है (चित्रा 1 ए और 1 बी).
  3. Lentiviral समाधान की एकाग्रता
    नोट: यह lentiviral समाधान अनुमापांक पर्याप्त उच्च नहीं है, के मामले में उच्चतम पारगमन क्षमता हासिल करने के लिए नए सिरे से lentiviral समाधान का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है, lentiviral समाधान polyethylene glycol (खूंटी) वर्षा 29 से ध्यान केंद्रित किया जा सकता है.
    1. 4x खूंटी समाधान (32% PEG6000, 400 मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl), 40 मिमी HEPES pH7.4) की तैयारी
      1. 125 मिलीलीटर 4x खूंटी समाधान के लिए, PEG6000 की 40 ग्राम का वजन तो 60 मिलीलीटर पानी में भंग.
        नोट: नोट: (. यानी PEG6000 का औसत आणविक वजन 6000 है) खूंटी के बाद संख्या औसत आणविक भार है
        नोट: 2.3.1.2) धीरे धीरे 10 एमएल जोड़ें5 एम NaCl की. धीरे धीरे 1 एम HEPES pH7.4 के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 2 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित करें.
        नोट: 2.3.1.3) 125 मिलीलीटर पानी जोड़ें. 0.22 उम फिल्टर के साथ झिल्ली निस्पंदन द्वारा 4x खूंटी समाधान जीवाणुरहित और यह 4 ˚ सेल्सियस पर स्टोर
    2. Lentivirus एकाग्रता
      1. फ़िल्टर lentiviral एक 0.45 उम फिल्टर का उपयोग कर नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला transduced.
        नोट: सतह पर तैरनेवाला = 1:3): 2.3.2.2) 4x खूंटी समाधान 01:03 अनुपात (खूंटी समाधान जोड़ें. 16-48 घंटे के लिए 4 ˚ सेल्सियस पर स्टोर.
        नोट: 30 मिनट के लिए 4 ˚ सी 2600 x जी पर 2.3.2.3) अपकेंद्रित्र. 5 मिनट के लिए 4 ˚ सी 2600 x जी पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र त्यागें.
        नोट: 2.3.2.4) गोली परेशान से बचने के लिए सावधानी से सतह पर तैरनेवाला त्यागें. फिर से निलंबित 1/2 मूल सतह पर तैरनेवाला मात्रा का 1/25 मात्रा के लिए उपयोग कर सीरम मुक्त माध्यम में गोली.
        नोट: 2.3.2.5) सीधे प्रयोग करें या फिर -80 ˚ सेल्सियस पर स्टोर तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हुए फ्रीज

3. Adenoviral पारगमन

नोट: adenoviral निर्माणों 13 के निर्माण और प्रचार के लिए तरीकों के लिए अन्य स्रोतों को देखें. Aspirating पाश्चर pipettes और / या सुझाव 10% ब्लीच द्वारा decontaminated किया जाना चाहिए. हमेशा जैविक सुरक्षा कैबिनेट की सतह शुद्ध करना और संभावित परवाह किए बिना सतह पर तैरनेवाला गिरा दिया गया है के 70% EtOH के साथ उपकरण दूषित. Spilling आ गई है, तो 70% EtOH में 1% एसडीएस के साथ पूरी तरह से परिशोधन आवश्यक है.

  1. 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक से adenoviral अनुमापन (TCID 50)
    नोट: पारगमन से पहले, यह adenoviral शेयर समाधान टाइट्रेट करने के लिए आवश्यक है. TCID 50 वायरल समाधान टाइट्रेट सर्वोत्तम तरीकों में से एक है. विधि TCID 50 गणना की HEK 293T कोशिकाओं को एक संक्रामक क्षमता, द्वारा एक टिटर का मूल्यांकन करता है क्योंकि adenovirus शेयर की वास्तविक infectability को दर्शाता है. Pfu (पट्टिका के गठन यूनीटीएस) के बारे में 0.56 30 का एक पहलू के साथ TCID 50 के लिए आनुपातिक है.
    1. HEK 293T कोशिकाओं, 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन, 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे सेल संस्कृति प्लेट, 8 चैनल बहु पिपेट: कोशिकाओं और उपकरण तैयार
    2. एक 10 सेमी पकवान में 70-90% मिला हुआ HEK 293T कोशिकाओं को तैयार है.
    3. वायरस शेयर की 1/10 4 के एक पूर्व कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना. एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे सेल संस्कृति प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए DMEM + 10% FBS की 50 उल जोड़ें. एक से एच. करने के लिए, पहली पंक्ति में पूर्व पतला वायरस शेयर के 25 उल जोड़ें
    4. अच्छी तरह मिक्स और एक 8 चैनल बहु विंदुक के साथ दूसरी पंक्ति के लिए कुओं की पहली पंक्ति से 25 उल हस्तांतरण. 1/3 अप करने के लिए कुओं की प्रत्येक पंक्ति को वायरल समाधान के कमजोर पड़ने और 11 वीं पंक्ति सहित दोहराएँ और पिछले 25 उल त्यागें.
    5. महीन चुर्ण बनाना HEK 293T DMEM + 10% FBS की 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं. 1 से 12 तक पंक्तियों से प्रत्येक कुएं में सेल समाधान के 50 उल जोड़ें.
    6. 11-13 दिनों के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ˚ सी कोशिकाओं को सेते हैं. DMEM + 1 की 50 उल जोड़ें4-5 दिन और चढ़ाना के 7-8 दिनों के बाद 0% FBS.
    7. संक्रमण के बाद 11-13 दिनों में प्रत्येक कुएं में कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव को मापने.
    लेन 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    पंक्ति डी डी डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति बी डी डी डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति सी डी डी डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति डी डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति ई डी डी डी डी डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति एफ डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति जी डी डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति एच डी डी डी डी डी डी डी डी डी डी डी
    पंक्ति प्रति सकारात्मक कुओं की संख्या 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    पंक्ति प्रति सकारात्मक कुओं के अनुपात 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    डी 50% कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव पर प्रदर्शित हो
    50% या कोई कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव के तहत प्रदर्शित

    लेन 1, कमजोर पड़ने 3 1 X10 4; 2 लेन, कमजोर पड़ने 3 2 X10 4; ...; लेन 11, कमजोर पड़ने 3 2 X10 11; लेन 12, नियंत्रण.
    एस पंक्ति प्रति सकारात्मक कुओं के अनुपात की राशि =
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0.75 0.63 0.25 0.25 0 = 8.875
    TCID 50 = 3 एक्स 10 4 एक्स 3 एक्स (8.875-.5) = 2.97 x 10 8
    TCID 50 / मिलीलीटर = 5.94 x 10 9

    तालिका 3:. एक संक्रमित 96 अच्छी तरह से थाली 10 दिनों के ऊष्मायन के बाद अच्छी तरह से प्रत्येक में कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव को मापने और पंक्ति प्रति सकारात्मक कुओं का अनुपात योग का उदाहरण है.

    1. Kaerber के सूत्र के अनुसार अनुमापांक की गणना
    2. TCID 50 = (पहले लेन के कमजोर पड़ने) एक्स (कमजोर पड़ने) (एस 0.5)
    3. एस पंक्ति प्रति सकारात्मक कुओं के अनुपात की राशि =
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, TCID 50 = (30000) एक्स (3) (एस 0.5). वायरल समाधान के 50 उल इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, TCID 50 / एमएल की गणना करने के लिए 0.05 से TCID 50 विभाजित करते हैं.
  2. Adenoviral पारगमन
    1. इसके अनुमापांक (pfu / एमएल, एमएल या TCID 50 / एमएल वायरल कण /) से adenoviral समाधान के लिए आवश्यक राशि की गणना. MOI (संक्रमण की बहुलता) की गणना करने के लिए सूत्र का उपयोग करें.
    2. उन्हें> [यहाँ प्लेस तालिका 4]
    3. सीरम मुक्त मध्यम करने के लिए वायरस समाधान की राशि की गणना जोड़ें (5 तालिका देखें). अच्छी तरह मिक्स और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
    4. उन्हें> [यहाँ प्लेस सारणी 5]
    5. Day7, धारा 2.2 के अंतिम चरण में प्राप्त पकवान ले लो, और 5% FBS और पी / एस युक्त नया DMEM / सदस्य के 750 उल साथ मध्यम जगह
      नोट: मध्यम मात्रा की कमीमूल मात्रा के बारे में 50% करने के लिए पारगमन में उच्च पारगमन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है.
    6. डिश को पतला वायरस समाधान जोड़ें. 37 ˚ सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 4-8 घंटे के लिए पकवान सेते फिर, ताजा माध्यम के साथ बदलें.
    7. 37 ˚ सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24-48 घंटे के लिए पकवान सेते दिन 8-9 में, जीना सेल इमेजिंग प्रयोग के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें. नोट: adenoviral प्लाज्मिड से प्रोटीन अभिव्यक्ति सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर (चित्रा -1 सी और 1 डी) निर्धारित करने के लिए पारगमन के 24-48 बजे के बाद पश्चिम बंगाल या आईसीएच से इसकी पुष्टि की जा सकती है.

4. लाइव सेल इमेजिंग

  1. तापमान नियंत्रित कक्ष के साथ एक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप और सीओ 2 पर्यावरण प्रणाली (वैकल्पिक) का उपयोग कर छवि अधिग्रहण
    1. सभी उपकरणों से पहले अधिग्रहण के शुरू करने के लिए 37 ˚ सी को संतुलित करना है, ताकि पूर्व अधिग्रहण करने के लिए कम से कम 1 घंटा पर तापमान नियंत्रण प्रणाली मुड़ें. Confoc चालू करेंअल डिस्क माइक्रोस्कोप प्रणाली (पीसी आपरेशन के लिए, माइक्रोस्कोप, कताई डिस्क इकाई, सीसीडी कैमरा, लेज़रों, फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, सामान्य प्रकाश स्रोत, motorized मंच, और स्वत: बंद के) कताई.
      नोट: अधिक से अधिक 1 घंटा सभी उपकरणों का पूरा तापमान संतुलन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
    2. यदि आवश्यक हो तो, अधिग्रहण के लिए वांछित मध्यम करने के लिए 3.5 सेमी गिलास नीचे बर्तन में मध्यम बदलें. तापमान नियंत्रित कक्ष में confocal कताई डिस्क खुर्दबीन के मंच पर पकवान.
      नोट: नियत संख्या 1.5 कवर गिलास के साथ एक 3.5 सेमी गिलास नीचे पकवान (लगभग 0.16-0.19 मिमी मोटाई) के माइक्रोस्कोपी उपयोग से इष्टतम अवलोकन के लिए गोलाकार विपथन के लिए आदर्श है. प्रयोग किया जा रहा उद्देश्य के लिए एक सुधार कॉलर किया है, 0.17 मिमी से अधिक गहरा कवर चश्मे के साथ प्राप्त छवियों सुधारा जा सकता है. इसके अलावा, phenol लाल एक मामूली प्रतिदीप्ति है. कभी कभी यह फिनोल लाल के बिना इस तरह के DMEM के रूप में एक फिनोल लाल मुक्त मध्यम, उपयोग करने के लिए बेहतर है. सीओ को नियंत्रित करने के लिए कोई उपकरण नहीं है, तो 2 स्वतंत्र दीर्घकालिक समय चूक इमेजिंग के लिए HEPES द्वारा बफर मध्यम या मध्यम.
    3. Eyepieces के लिए प्रकाश पथ का चयन करें.
    4. पर उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश स्रोत के शटर मुड़ें. Eyepieces के माध्यम से खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को फोकस समायोजित करें. उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश स्रोत बंद के शटर मुड़ें.
    5. पर फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत के लिए शटर मुड़ें. Eyepieces के माध्यम से खुर्दबीन के नीचे फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाएं. फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत बंद के शटर मुड़ें.
    6. वैकल्पिक> प्रेस समय चूक अधिग्रहण के दौरान स्थिर ध्यान केंद्रित रखने के लिए पर सही फोकस प्रणाली चालू करने के लिए खुर्दबीन के सामने सही फोकस प्रणाली के लिए सक्रियण बटन.
    7. कताई डिस्क confocal खुर्दबीन से प्रकाश पथ बदलें. उचित छवियों displa जाँच, ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अधिग्रहण के लिए सेटिंग्स समायोजित करेंस्क्रीन पर Yed. (उदाहरण के लिए फोकस, लेजर बिजली, जोखिम समय, सीसीडी कैमरा लाभ और बंद सेट)
    8. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण के लिए सेट सेटिंग. उदाहरण: एक चैनल के लिए EGFP से फ्लोरोसेंट संकेत प्राप्त करने के लिए: "प्रकाश पथ का उपयोग चैनल बदलने" और "EGFP 1 चैनल" का चयन करें.
    9. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समय व्यतीत चित्र लेने के क्रम में समय चूक सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करके समय अंक के बीच आवृत्ति सेट करें. उदाहरण: एक समय बिंदु हर 5 मिनट हासिल करने के लिए, ड्रॉप डाउन मेनू से "समय बिंदु प्रति मिनट" का चयन करें, और पाठ क्षेत्र में 5 दर्ज करें.
      नोट: वास्तविक गति पर एक फिल्म बनाने के लिए "अधिकतम गति" का चयन करें. फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति कम है, तो प्रतिदीप्ति समय चूक अधिग्रहण के दौरान जल्दी ब्लीच सकता है. उस मामले में, यह अधिग्रहण समय अंक की संख्या को कम करने के लिए बेहतर है.
    10. "स्टेशन पर क्लिक करके समय व्यतीत अधिग्रहण शुरूएक छवि अनुक्रम प्राप्त करने के लिए आर टी "बटन.
      नोट: यह कई अंक अधिग्रहण समारोह का उपयोग करने के लिए बेहतर नहीं है. यह समय चूक इमेजिंग के दौरान इमेजिंग क्षेत्र का फोकस या आंदोलन की हानि हो सकती है.
  2. अधिग्रहीत छवियों का विश्लेषण
    नोट: अधिग्रहीत छवियों एक फिल्म फ़ाइल के रूप में वापस खेला और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग का विश्लेषण किया जा सकता है.
    1. एक फिल्म में शामिल होने के लिए अधिग्रहीत छवियों का चयन करें. यदि आवश्यक हो, फसल छवियों से हित के क्षेत्रों और ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग फिल्म के फ़ाइल आकार को कम करने के लिए दिलचस्प समय अंक का चयन करें.
    2. एक AVI में फिल्म फ़ाइल या MOV प्रारूप के रूप में निर्यात छवियाँ. "स्वरूप" ड्रॉप डाउन मीनू और समाप्त फिल्म के लिए आवश्यक समय से एक फिल्म प्रारूप का चयन करें, तो "निर्यात" पर क्लिक करें. नोट: हर 5 मिनट में अपने वास्तविक गति से 3,000 गुना तेजी से है, जो प्रति सेकंड 10 तख्ते पर एक फिल्म के रूप में वापस खेला जा सकता है एक समय बिंदु पर हासिल समय चूक छवियों.
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Representative Results

तकनीक, एक lentivirus एन्कोडिंग EGFP (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) टैग Cx43 (Connexin43) या कोशिकाओं में EGFP टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था एक उत्परिवर्तित Cx43 32, और एक adenovirus एन्कोडिंग FGFR1DN (fibroblast वृद्धि कारक रिसेप्टर 1 प्रमुख नकारात्मक वर्णन करने के लिए ) सेल 33-35 में FGF संकेतन शट डाउन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Cardiomyocytes के अलगाव के बाद तीन दिन, अलग cardiomyocytes कोशिकाओं में EGFP टैग प्रोटीन व्यक्त करने के क्रम में lentivirus के साथ transduced थे. फिर lentiviral पारगमन के 3 दिन के बाद, अलग cardiomyocytes आगे कोशिकाओं में FGF संकेतन खत्म करने के लिए एक adenovirus एन्कोडिंग FGFR1DN साथ transduced थे. Transduced एक्सोजेनस जीन व्यक्त करने के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय देने के बाद, एक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप जीवित कोशिका छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अधिग्रहीत छवियों एक फिल्म फ़ाइल के रूप में वापस खेला और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. अधिक विस्तृत प्रतिनिधि के लिएेश्य परिणाम Sakurai एट अल 32 देखें.

EGFP की अभिव्यक्ति lentiviral पारगमन lentiviral पारगमन आंकड़े 1 ए बी निम्नलिखित confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी 72 घंटा द्वारा पुष्टि की गई निम्नलिखित टैग प्रोटीन. adenoviral पारगमन द्वारा FGFR1DN की अभिव्यक्ति adenoviral पारगमन आंकड़े -1 सी डी के 24 घंटे के बाद पश्चिम बंगाल और आईसीसी ने पुष्टि की गई. 3.5 सेमी व्यंजन को adenoviral अलावा के समय छवियों 37 ˚ सेल्सियस तापमान बनाए रखने के लिए एक कक्ष हीटर का उपयोग कर एक 40x हवा एनए 0.9 उद्देश्य लेंस के साथ 6 घंटे के लिए हर 5 मिनट हासिल किया गया 0 समय और समय चूक के रूप में परिभाषित किया गया था Confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई प्राथमिक cardiomyocytes में EGFP टैग प्रोटीन का समय चूक छवियों से पूरक सिनेमा 1-2 में दिखाया गया.

मामलों में, तापमान संतुलन पर्याप्त नहीं था, या एकाधिक अधिग्रहण मोड ठीक से काम नहीं कर रहा था, जहांठीक से autofocus प्रणाली stably बनाए रखा ध्यान केंद्रित जब काम पर कब्जा कर लिया छवियों हालांकि. xy विमान से पूरक मूवी 1 में स्थानांतरित कर सकते हैं और यह घटित नहीं था. तापमान संतुलन पर्याप्त था और केवल ब्याज की एक क्षेत्र का अधिग्रहण किया गया था जब से पूरक मूवी 2 में दिखाया गया है, कब्जा कर लिया छवियों बहुत ही उच्च गुणवत्ता के हैं.

cardiomyocytes की पिटाई सेल व्यवहार्यता की पुष्टि करने के क्रम में लंबी अवधि के समय चूक लाइव सेल इमेजिंग के बाद मूल्यांकन किया गया था. समय चूक इमेजिंग EGFP व्यक्त cardiomyocytes की 16 घंटे उनके कार्यात्मक गुण को बनाए रखा और लय से पूरक मूवी 3 हराया बाद भी.

चित्रा 1
Lentiviral या adenoviral पारगमन निम्नलिखित प्रोटीन अभिव्यक्ति की चित्रा 1. पुष्टि. (ए) Cx43-WT-EGFP व्यक्त पृथक चूहे नवजात cardiomyocytes 3 ​​दिनों के पारगमन के बाद विज्ञापन FGFR1DN साथ transduced. यह भी पूरक 1 मूवी देखें. (ख) 3 दिनों के पारगमन के बाद विज्ञापन FGFR1DN साथ transduced Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP व्यक्त पृथक चूहे नवजात cardiomyocytes. पारगमन के बाद आईसीसी 24 घंटा से पता लगाया adenoviral पारगमन निम्नलिखित पूरक मूवी 2 भी देखें. (सी) प्रोटीन अभिव्यक्ति. पारगमन के बाद पश्चिम बंगाल में 24 घंटे से पता लगाया adenoviral पारगमन निम्नलिखित FGFR1DN प्रोटीन की (हेक्टेयर) hemagglutinin प्रोटीन टैग FGFR1DN पारंपरिक आईसीसी तरीकों का उपयोग कर विरोधी हा एंटीबॉडी द्वारा खोजा गया था, अल्फा actinin cardiomyocytes के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था. (डी) अभिव्यक्ति. हा टैग FGFR1DN पश्चिम बंगाल से विरोधी हा एंटीबॉडी द्वारा खोजा गया था, बीटा ट्यूबिलिन लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

पृथक चूहे नवजात कार के पूरक मूवी 1. समय चूक इमेजिंग विज्ञापन FGFR1DN साथ transduced Cx43-WT-EGFP व्यक्त diomyocytes. समय चूक छवियों को एक 40x उद्देश्य लेंस एक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप के साथ 6 घंटे के लिए हर 5 मिनट के साथ हासिल किया गया. अधिग्रहीत छवियों प्रति सेकंड 10 तख्ते पर एक फिल्म के रूप में वापस खेला गया. इस फिल्म Sakurai एट अल 32 से संशोधित किया गया है. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक मूवी 2. विज्ञापन FGFR1DN साथ transduced Cx43-S325/328/330E-EGFP व्यक्त पृथक चूहे नवजात cardiomyocytes के समय चूक इमेजिंग. समय चूक छवियों एक confocal के साथ 6 घंटे के लिए हर 5 मिनट एक 40x उद्देश्य लेंस के साथ हासिल किया गया डिस्क माइक्रोस्कोप कताई. अधिग्रहीत छवियों प्रति सेकंड 10 तख्ते पर एक फिल्म के रूप में वापस खेला गया. इस फिल्म Sakurai एट अल 32 से संशोधित किया गया है."लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पृथक चूहे नवजात cardiomyocytes के पूरक मूवी 3. समय चूक इमेजिंग वापस वास्तविक गति से खेला. विज्ञापन FGFR1DN 10 के लिए एक 40x उद्देश्य लेंस के साथ हर 200 मिसे हासिल किया गया साथ transduced Cx43-EGFP व्यक्त पृथक चूहे नवजात cardiomyocytes के समय चूक छवियों समय चूक अधिग्रहण के 16 घंटे के बाद एक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप के साथ सेकंड. अधिग्रहीत छवियों वास्तविक गति से प्रति सेकंड 5 फ्रेम में एक फिल्म के रूप में वापस खेला गया. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

नवजात चूहों से अलग प्राथमिक cardiomyocytes लंबे विट्रो में cardiomyocyte कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर trypsin हे / एन के साथ पचा और फिर शुद्ध collagenase, एक दो कदम एंजाइम पाचन पद्धति का उपयोग चूहे पिल्ले से नवजात cardiomyocytes के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करता है. शुद्ध collagenase कदम को रोजगार का एक लाभ यह एंजाइम का एक ही ग्रेड सभी isolations के लिए उपयोग की जाने वाली है. इस प्रकार, अलग कक्षों की गुणवत्ता और मात्रा को प्रयोग करने के लिए प्रयोग से संगत है.

सेल संस्कृति के पारगमन की एक उच्च क्षमता एक भी प्रयोग के लिए आवश्यक है, तो adenovirus साथ जुड़े उच्च पारगमन क्षमता को देखते हुए यह एक adenovirus उपयोग करने के लिए बेहतर है. पारगमन के उच्च स्तर पर आवश्यक नहीं कर रहे हैं हालांकि, अगर एक lentiviral वेक्टर इस्तेमाल किया जा सकता है. Adenoviral या lentiviral या तो वैक्टर का उपयोग करने का विकल्प होने के लिए यह आसान उचित transd प्राप्त करने के लिए बनाता हैजीन के विभिन्न प्रकारों के लिए uction और अभिव्यक्ति के स्तर. फ्लोरोसेंट तीव्रता confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप या आईसीसी का उपयोग कर जीना सेल इमेजिंग से पता लगाया तो यह समस्या हल हो सकती है ब्याज की जीन व्यक्त करने के लिए एक अलग प्रमोटर का उपयोग करता है कि एक और lentiviral स्थानांतरण सदिश का उपयोग, lentiviral पारगमन के बाद बहुत कम है. पश्चिम बंगाल से पता लगाया बैंड adenoviral पारगमन के बाद कमजोर है अगर adenoviral वैक्टर के साथ, यह एक कम अनुमापांक वायरल शेयर संकेत हो सकता है. उस मामले में, यह आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं में प्रचार से एक उच्च टिटर adenoviral समाधान तैयार करने के लिए बेहतर है.

इस तकनीक की एक सीमा शुद्ध collagenase का उपयोग भी जब अलग व्यवहार्य cardiomyocytes की उपज, प्रयोग करने के लिए प्रयोग से अत्यधिक संगत नहीं है. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के क्रम में यह कदम 1.2.13 में सतह पर तैरनेवाला में अलग cardiomyocytes के चयन के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सबसे अच्छा है. प्रोटोकॉल अनुभाग में. फिर, एसईअलग dilutions पर गिलास नीचे व्यंजन पर cardiomyocytes एड. कोशिकाओं संलग्न किए जाने के बाद, प्रयोग के लिए उपयुक्त सेल एकाग्रता के साथ चुनिंदा व्यंजन की योजना बनाई है.

नवजात cardiomyocytes उपयोग करने के कई फायदे हैं, लेकिन कुछ नुकसान भी हैं. बड़ी खामी वयस्क cardiomyocytes से उनके स्पष्ट अंतर है. पूरी तरह से विभेदित वयस्क cardiomyocytes छड़ के आकार रहे हैं और अलग नवजात प्राथमिक cardiomyocytes सभी दिशाओं 36 में फैल जबकि पृथक वयस्क प्राथमिक cardiomyocytes, उनके छड़ के आकार आकारिकी बनाए रखें. पृथक वयस्क और नवजात cardiomyocytes के बीच प्ररूपी मतभेद भी जीन अभिव्यक्ति 37 के अपने पैटर्न में परिलक्षित होते हैं. इसलिए, विभेदित cardiomyocytes आवश्यक हैं जिसमें प्रयोगों के लिए, वयस्क cardiomyocytes के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल 4 की जरूरत होगी.

पुनः संयोजक की adenoviral और lentiviral पारगमन रोजगारconfocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में प्राथमिक चूहे नवजात cardiomyocytes में प्रोटीन हमें सुसंस्कृत लाइव प्राथमिक कोशिकाओं में प्रोटीन के कार्यों का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. कोशिकाओं में ब्याज की जीन पेश करने अभिकर्मक का उपयोग जो मौजूदा तरीकों के सापेक्ष, इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण फायदा adenoviruses और lentiviruses बहुत कुशलता में लगभग सभी कोशिकाओं में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है संस्कृति. इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति के लिए वायरस के दो विभिन्न प्रकार के उपयोग के लिए यह आसान कई जीनों के लिए उपयुक्त पारगमन दरों और अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए बनाता है. siRNAs और रासायनिक agonists और विरोधी भी आगे उपद्रव और जीनों के कार्यों और वे सांकेतिक शब्दों में प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए इस प्रणाली में इस्तेमाल किया जा सकता है.

दिलों की तैयारी प्रोटोकॉल में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है. जितना ज्यादा हो सके शरीर से दिल निकालें. के लिए सुनिश्चित करेंसेल व्यवहार्यता उच्च रखने के लिए तुरंत बर्फ पर डाल दिया. एक और महत्वपूर्ण कदम उच्च गुणवत्ता, और अनुमापांक, adenoviral / lentiviral शेयरों की तैयारी है. खराब गुणवत्ता वायरल शेयरों उपयोग किया जाता है, तो ब्याज की जीन के पारगमन और अभिव्यक्ति का स्तर कम हो जाएगा. इसलिए, वे इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता.

इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण भविष्य आवेदन माउस cardiomyocytes में अपने 'का उपयोग किया जाएगा. इस विधि माउस नवजात cardiomyocytes के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या पायलट अध्ययन परीक्षण आशाजनक परिणाम सामने आए. कारण चूहों के उन लोगों की तुलना माउस दिलों की अपेक्षाकृत छोटे आकार, कम ऊतक शुरू में प्राप्त की है. इस प्रकार, कम कोशिकाओं को एक ही जानवरों की संख्या लेकिन बस अलगाव के लिए अधिक चूहों का उपयोग कर इस बाधा को समाप्त करना चाहिए का उपयोग कर एक ही प्रक्रिया में अलग कर रहे हैं. माउस cardiomyocytes को अलग करने की क्षमता के शोधकर्ताओं ने आनुवंशिक रूप से संशोधित मीटर से अलग कोशिकाओं के कार्यों की जांच करने के लिए अनुमति देता हैबर्फ (ट्रांसजेनिक, नाक आउट, तोड़े में) ब्याज की जीन का एक विशेष रूप से अध्ययन करने के क्रम में उत्पादन किया गया है कि.

हृदय अनुसंधान में प्रमुख बाधाओं में से एक वास्तविक समय में vivo में हृदय के ऊतकों में व्यक्त किसी जीन की अभिव्यक्ति और समारोह की जांच के साथ जुड़े कठिनाई किया गया है. हालांकि, कार्यात्मक पिटाई cardiomyocytes अलग वायरल पारगमन का उपयोग सेल कार्यों मिलाना, और फिर confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप का उपयोग कर उन्हें वास्तविक समय में अध्ययन करने की क्षमता विवो में cardiomyocytes की भूमिका पर प्रकाश डाला और इस अंतर को पाटने में मदद करता है. इस विधि सेलुलर स्तर पर cardiomyocyte समारोह को समझने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करता है. यह जीन अभिव्यक्ति में perturbations cardiomyocyte समारोह में परिवर्तन कैसे की वास्तविक समय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. Cardiomyocytes की लाइव सेल इमेजिंग cardiomyocyte समारोह में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. ऐसे अंतर्दृष्टि बुनियादी cardiovascula के क्षेत्र में प्रगति को बढ़ावा मिलेगाहृदय रोग के उपचार के लिए उपन्यास उपचार में जिसके परिणामस्वरूप R अनुसंधान,.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

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References

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