يعيش التصوير خلية من فأر الابتدائية حديثي الولادة العضلية بعد الغدانية وLentiviral تنبيغ طريق متحد البؤر المجهري القرص الغزل

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الفئران حديثي الولادة العضلية الأولية هي مفيدة في البحوث الأساسية في القلب والأوعية الدموية المختبر لأنها يمكن أن تكون معزولة بسهولة بأعداد كبيرة في إجراء واحد. بسبب التقدم في التكنولوجيا المجهر فمن السهل نسبيا لالتقاط الصور الخلية الحية لغرض التحقيق الأحداث الخلوية في الوقت الحقيقي مع الحد الأدنى من القلق بشأن الضيائية إلى الخلايا. يصف هذا البروتوكول كيفية التقاط صور timelapse الخلية الحية من الفئران حديثي الولادة العضلية الأولية باستخدام مجهر القرص الغزل مبائر التالية تنبيغ lentiviral والغدانية لتعديل خصائص الخلية. تطبيق نوعين مختلفين من الفيروسات يجعل من الاسهل لتحقيق معدل تنبيغ التعبير والمستويات المناسبة لاثنين من الجينات المختلفة. ويمكن الحصول على صور جيدة التركيز الخلية الحية باستخدام نظام ضبط تلقائي للصورة المجهر، والتي تحافظ على التركيز مستقرة لفترات زمنية طويلة. تطبيق هذا الأسلوب، وظائف مهندس خارجياويمكن تحليل البروتينات إد أعرب في الخلايا الأولية مثقف. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يمكن استخدامه لدراسة وظائف الجينات من خلال استخدام الرناوات siRNAs فضلا عن جهري الكيميائية.

Introduction

لطالما استخدمت الفئران حديثي الولادة العضلية الأولية للتحقيق وظيفة cardiomyocyte في المختبر 1. فهي سهلة لعزل من الفئران الوليدة عن طريق العديد من الطرق راسخة 2-4. الأسلوب الأكثر شيوعا يستخدم كولاجيناز أو التربسين لهضم النسيج الضام للقلب قبل العزلة الخلية. وقد طور الباحثون أيضا أساليب لعزل العضلية من القوارض الكبار 5-8 وكذلك الفئران حديثي الولادة 9،10.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل العضلية من الفئران الوليدة حديثي الولادة، وتوظيف إجراء انزيم الهضم من خطوتين. يستخدم التربسين أول O / N عند 4 درجات مئوية، ومن ثم كولاجيناز المنقى في 37 درجة مئوية. الحضانة من أنسجة القلب مع التربسين O / N عند 4 ° C يقلل من الخطوات اللازمة لخلايا الحصاد بالمقارنة مع الطرق باستخدام حضانات متتابعة في محلول أنزيم دافئ 2. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام المشترك المنقىllagenase بدلا من الانزيمات الخام وتقلب الكثير إلى الكثير يمكن القضاء عليها، وبالتالي توفير تعزيز التكاثر.

الدراسات الفنية للبروتين معين غالبا ما تستخدم نظام التعبير البروتين باستخدام اتش 11-13 و / أو الفيروسة البطيئة 14-16. [تحذيري ملاحظة] ينبغي أن يتم إنتاج الفيروسية والتلاعب بها وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.

لا دمج اتش في جينوم المضيف. لديها كفاءة عالية جدا من تنبيغ في معظم أنواع الخلايا، بما في ذلك تقسيم الخلايا والخلايا غير تقسيم، وكذلك الخلايا الأولية وخطوط الخلايا المحددة. هذا يجعل اتش ناقل موثوق بها للتعبير الجينات. مستويات عالية من البروتين المشفرة بواسطة ناقلات اتش تطوير غضون 48 ساعة بعد تنبيغ، وأنها يمكن أن تستمر لعدة أسابيع 17. ومع ذلك، عيب واحد لاستخدام اتش للتعبير البروتين هو أن تطوير ادي المؤتلفnovirus على حد سواء معقدة وتستغرق وقتا طويلا. يشرح هذا العيب في جزء منه لماذا كثير من الباحثين قد تحول إلى lentiviruses عن المؤتلف التعبير الجيني. على عكس يبني الغدانية، وتوليد بناء lentiviral هو سهل وسريع. على الرغم من lentiviruses عموما أقل كفاءة من تنبيغ من الفيروسات الغدية، في كل من الانقسام وعدم تقسيم الخلايا، فإنها لا الاندماج في الجينوم المضيف. بالتالي، التعبير عن الجينات transduced أكثر استقرارا لlentiviruses من الفيروسات الغدية ل.

بسبب التقدم التكنولوجي في مجال المجهر، انه من الاسهل بكثير لالتقاط الصور الخلية الحية من الخلايا معربا عن البروتينات المؤتلف. هذا ينطبق حتى على سرعات معدل الفيديو الشراء. وهذا يسمح للمحقق لتحديد كيفية إجراء تعديلات خاصة في البروتين يؤثر في المصالح وظيفيا الخلية في الوقت الحقيقي. المجهر القرص الغزل مبائر لديها العديد من السمات الرئيسية التي تجعل من أسلوب الأمثل لليفالتصوير الخلية ه 18،19. الغزل يوكوجاوا القرص يسمح لأكثر من ذلك بكثير الحصول على الصور بسرعة، بينما في الوقت نفسه استخدام طاقة أقل بكثير من الليزر المسح الضوئي نقطة المجاهر متحد البؤر. كل من هذه الميزات الخاصة ومن المقرر أن القرص الغزل، والذي يحتوي على العديد من الثقوب متحد البؤر من خلالها الليزر يمر في وقت واحد للعينات. خلال الاستحواذ، القرص نفسه يدور بسرعة وبشكل مستمر 18-20. باستخدام نظام ضبط تلقائي للصورة من المجهر، يتم الاحتفاظ التركيز مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن. هذا يسمح للباحثين لاتخاذ ركز جيدا الصور الخلية الحية. لعبت الصور المكتسبة يعود إلى ملف الفيلم. ويتم تحليل هذه الصور باستخدام برامج تحليل الصور مثل يماغيج 21،22، 23 في فيجي، أو غيرها من البرمجيات المتاحة تجاريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عزل الفئران حديثي الولادة العضلية

  1. استخدام تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) والأساسية الدنيا والمتوسطة (MEM) تستكمل مع مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين / الستربتوميسين (P / S) باعتبارها وسيلة الثقافة. إضافة bromodeoxyuridine (BrdU) إلى وسيلة لمنع نمو الخلايا الليفية في الأيام الأولى 2 بعد العزلة.
متوسطة قاعدة FBS BrdU (ملم) P / S (U / مل)
اختيار DMEM 10٪ 0 20
اليوم الأول DMEM 10٪ 0.1 10
في اليوم التالي DMEM / MEM 0.1 10
مزيد من ثقافة DMEM / MEM 0 10

الجدول 1: متوسط ​​لالفئران حديثي الولادة العضلية استخدام هذه الوسائط لزراعة الفئران حديثي الولادة العضلية. DMEM / MEM هو 1:1 خليط من DMEM وMEM المتوسطة.

  1. Cardiomyocyte العزلة، يوم 1 (ويقدر الوقت اللازم، وحوالي 1 ساعة)
    ملاحظة: للحصول على العمل مع القوارض الولدان، والرجوع إلى المبادئ التوجيهية الجامعات المحلية والقواعد التي وضعتها برامج الرعاية الحيوانية، والتمسك بروتوكولات الحيوان وافق مؤسسيا. وقد تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام مركز الموارد الحيوانية ييل.
    1. إعداد الكواشف والأدوات: محلول ملحي متوازن خالية من المغنيسيوم والكالسيوم وهانك (HBSS CMF)، 30 مل × 2، 10 × 2 مل، على الجليد؛ 1 ملغ التربسين، أعادت مع 2 مل من CMF HBSS، على الجليد؛ أدوات تعقيمها؛ 70٪ من الإيثانول (ETOH) في 250 مل دورق؛ أربعة تعقيمها 10 سم الأطباق البلاستيكية، وثلاثة لعزل قلوب واحد لtrypsinization.
    2. ليت النظام 1إيه من الفئران الوليدة القديمة 1 إلى 2 يوما (حوالي 10 الجراء) مع السد بهم من موزع على حيوانات التجارب.
    3. Day1، نقل الجراء إلى قفص صغير والموت ببطء السد مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين (الكيتامين، 200ml/10g وزيلازين 20ml/10g) جرعة زائدة.
    4. تأخذ الجرو واحد وتعقيم الجسم بأكمله مع 70٪ ETOH. قطع رأس الجرو مع مجموعاتها مقص جراحي حادة على تعقيمها 10 سم طبق من البلاستيك في مكان معزول من الجراء الأخرى.
      ملاحظة: من أجل جمع العينات بأسرع وقت ممكن، فمن الأفضل استخدام الأسلوب الأسرع وفعالة لإنهاء حياة القوارض. قطع الرأس عند استخدامها بشكل صحيح من قبل المهنيين المهرة مع المعدات جيدا المحافظة قد يؤدي في أقل الخوف والقلق للحيوان ويكون أسرع وأكثر عملية من غيرها من أشكال القتل الرحيم. وهو يتفق مع توصيات المبادئ التوجيهية جمعية الطبية البيطرية الأمريكية للالقتل الرحيم للحيوانات.
    5. إزالة الضرب كانالفن مع الأدوات المعقمة، ووضع القلب في 30 مل كريم برود CMF HBSS في أنبوب 50 مل المخروطية. ملاحظة: إزالة قلوب في أسرع وقت ممكن ووضعها على الجليد على الفور. بعد إزالة قلوب من الجسم، ويجب أن تتم جميع الإجراءات على الجليد.
    6. جمع 5 قلوب في 30 مل من الجليد برود CMF HBSS و5 قلوب المتبقية في 30 مل أخرى من الجليد برود CMF HBSS. دوامة أنبوب لشطف القلوب. ملاحظة: بعد هذه الخطوة، تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء تدفق الصفحي.
    7. تجاهل طاف ونقل القلوب إلى تعقيم 10 سم طبق من البلاستيك جديدة على الجليد. ملاحظة: يجب الحرص على عدم نضح القلوب مع الشافطة.
    8. إزالة السفن الكبيرة و / أو أنسجة غير مرغوب فيها. إضافة 10 مل من الجليد برود CMF HBSS إلى الطبق لشطف القلوب.
    9. نقل كل القلوب إلى تعقيم 10 سم طبق من البلاستيك جديدة على الجليد. تخطر على قلوب مع مقص إلى أقل من 1 ملم 3 على الجليد.
    10. إضافة 9 مل من المبرد CMF HBSS. إضافة 1 مل من التربسين المبردة reconstituted مع CMF HBSS (النهائي 50 ميكروغرام / مل).
    11. ختم طبق مع parafilm وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم، ثم وضعه في غرفة باردة (4 ˚ C) بين عشية وضحاها.
  2. العزلة Cardiomyocyte، يوم 2 (ويقدر الوقت اللازم، حوالي 4 ساعات)
    1. إعداد الكواشف والأدوات: 50 مل المخروطية أنبوب × 2؛ 2 ملغ التربسين المانع، أعيد مع 1 مل من CMF HBSS، على الجليد؛ 1500 وحدة كولاجيناز، أعادت مع 5 مل من ليبوفيتز L-15، في درجة حرارة الغرفة (RT)؛ ليبوفيتز L-15، أعيد مع 1 لتر من الماء المعقم وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون و 8 مل في RT؛ 10 ملغ / مل (32.6 ملم) BrdU في الماء؛ P / S؛ DMEM FBS + 10٪؛ MEM؛ اثنين من البلاستيك 10 سم أطباق زراعة الخلايا؛ أطباق أسفل 3.5 سم الزجاج.
    2. Day2، إعداد أطباق الجيلاتين المغلفة. إضافة 1 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين لمعطف طبق أسفل 3.5 سم الزجاج لتجربة التصوير. احتضان الأطباق في 37 ˚ مئوية لعدة ساعات، ثم نضح وتجاهل حل الجيلاتين قبل الاستخدام.
      NOTE: طبق 3.5 سم أسفل الزجاج هو مناسبة لتجربة التصوير باستخدام المجهر الفلورسنت. لاستخراج البروتينات من العضلية الأولية للكشف عن البروتين التعبير عن طريق النشاف الغربية (WB)، ويمكن استخدام الجيلاتين 0.1٪ المغلفة أطباق زراعة الخلايا البلاستيك.
    3. نقل جميع أنسجة القلب هضمها من قبل التربسين بين عشية وضحاها مع العازلة إلى أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد في هود تعقيمها. إضافة 1 مل من التربسين المانع في CMF HBSS (النهائي 182 ميكروغرام / مل). غطاء بالقرب من أنبوب 50 مل المخروطية بإحكام لمنع التلوث.
    4. احتضان الأنبوب لمدة حوالي 30 دقيقة في حاضنة 37 ˚ C لتسخين الأنسجة والعازلة لل30-37 ˚ C. إضافة 5 مل من كولاجيناز في ليبوفيتز L-15 (النهائي 94 وحدة / مل). احتضان عند 37 ˚ مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز لطيف (170-200 دورة في الدقيقة شاكر في 37 ˚ مئوية الحاضنة).
      ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك خطوة خارج غطاء تدفق الصفحي. يجب أن تتم جميع الخطوات اللاحقة في RT.
    5. تطهير السطح الخارجي للأنبوب 50 مل المخروطية مع 70٪ ETOH ووضعفي غطاء محرك السيارة تعقيمها.
    6. يسحن الأنسجة باستخدام ماصة السيارات مع pipetting لفي 3 مل / ثانية السرعة لمدة 20 مرة. تسمح بقايا الأنسجة لتسوية لمدة 3 دقائق وتحديد طاف مع 70 خلية أم مصفاة.
      ملاحظة: العادية حجم 10 مل ماصة يمكن استخدامها لسحن.
    7. إضافة 5 مل من ليبوفيتز L-15 إلى ما تبقى من كتل الأنسجة ويسحن وتحديد طاف مرة أخرى. غسل مصفاة الخلية مع 2 مل من ليبوفيتز L-15.
    8. وضع حل الخلية التي تمت تصفيتها في غطاء عن 20 - 60 دقيقة للسماح كولاجيناز لهضم الكولاجين المتدهورة جزئيا.
    9. خلايا الرواسب في 100 × ز لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في 20 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS وتركيز عال P / S (20 U / مل).
    10. الخلايا ما قبل لوحة على اثنين من البلاستيك 10 سم أطباق زراعة الخلايا لمدة 1 ساعة في حاضنة CO 2 عند 37 ˚ C لاختيار cardiomyocyte. ملاحظة: الخلايا الليفية إرفاق بسهولة أكبر إلى أسفل الطبق من العضلية.
    11. ملحقإيل الانتظار، وإعداد DMEM تحتوي على 10٪ FBS، P / S (10 U / مل) و 0.1 ملي BrdU. إضافة 1 مل من 10 ملغ / مل إلى 325 مل BrdU من DMEM تحتوي على 10٪ FBS وP / س.
    12. دوامة الأطباق بلطف وجمع cardiomyocyte تحتوي على اثنين من طاف 10 سم الأطباق.
      ملاحظة: لا تزال معظم العضلية يسبح في طاف بعد 1 ساعة من الحضانة. لتجنب تلويث مع الخلايا الليفية التي تعلق بخفة إلى الطبق، لا تجمع طاف من قبل pipetting.
    13. اختياري> عدد الخلايا في طاف مع وبدون 0.2٪ أزرق التريبان للتحقق بقاء الخلية.
    14. خلايا الرواسب في 100 × ز لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في DMEM تحتوي على 10٪ FBS، P / S (10 U / مل) و 0.1 ملي BrdU. خلايا لوحة في 2 × 10 5 خلية / طبق في 3.5 سم أسفل الزجاج أطباق الجيلاتين المغلفة للمراقبة باستخدام المجهر. ملاحظة: لا تخل الخلايا بعد الطلاء لمدة 24 ساعة على الأقل في CO 2 حاضنة عند 37 ˚ C.
    15. اليوم 3، تشانجى المتوسطة 24 ساعة بعد الطلاء لDMEM / MEM تحتوي على 5٪ FBS، P / S و 0.1 ملي BrdU.
    16. اليوم 4، وتغيير المتوسطة 48 ساعة بعد الطلاء لDMEM / MEM تحتوي على 5٪ FBS وP / س.
      ملاحظة: تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام مع DMEM / MEM تحتوي على 5٪ FBS وP / س.

2. تنبيغ Lentiviral

  1. التعبئة والتغليف من البلازميدات lentiviral
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى مصادر أخرى للحصول على مزيد من المعلومات التفصيلية حول هذا الموضوع 24-26. سوف يستغرق حوالي 3 أيام لإعداد حل lentiviral. فمن الأفضل لاستخدام الحل lentiviral جديدة لتحقيق أعلى كفاءة تنبيغ. بدء التعبئة والتغليف من البلازميدات lentiviral وعزلة العضلية الولدان الفئران بشكل متواز. بدلا من استخدام polyethyleneimine (PEI) 27 لتعبئة البلازميدات lentiviral، ويمكن استخدام كاشف ترنسفكأيشن متاحة تجاريا. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
    1. إعداد الكواشف والأدوات؛ HEKالخلايا 293T، 10 سم من البلاستيك أطباق زراعة الخلايا، حلول البلازميد lentiviral (pMDLg / pRRE، pRSV-القس، pMD2.G، ونقل ناقلات lentiviral، 1.0 ملغ / مل لكل منهما)، 1 غرام / لتر جزيرة الأمير إدوارد، وخالية من مصل المتوسطة، و 20 ملي الكلوروكين في الماء، والتبييض 10٪، 1٪ SDS في 70٪ ETOH
    2. 0 يوم، لوحة 2-2.5 الخلايا × 10 6 كلوة الجنين البشري 293T في 10 سم طبق اليوم قبل ترنسفكأيشن.
      ملاحظة: 30-60٪ التقاء في ترنسفكأيشن هو الأمثل.
    3. اليوم 1، إعداد PEI الحل ترنسفكأيشن. إضافة 30 ماي من 1 غرام / لتر إلى 960 PEI المجاهدين المصل خالية المتوسطة في أنبوب 1.5 مل. إضافة 4 البلازميدات في حل ترنسفكأيشن جزيرة الأمير إدوارد في أنبوب 1.5 مل، وتخلط مع التنصت.
    اسم البلازميد مذكرة حجم (KBP) حجم المضافة (مل) المبلغ النهائي في طبق 10 سم (ملغ) تركيز النهائي في طبق 10 سم (بعد الظهر)
    نقل ناقلات lentiviral يشفر الجين المراد تعبئتها 9-13 3،6-5،2 3،6-5،2 60
    pMDLg / pRRE عن HIV-1 GAG / POL 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-القس عن HIV-1 REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G تعرب VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    الجدول 2: كمية البلازميدات للتغليف lentiviral استخدام هذه المبالغ البلازميد ل transfect الخلايا HEK293 في 10 سم الأطباق. قد تختلف المبلغ النهائي لنقل ناقلات lentiviral في طبق وفقا لحجمها، والحفاظ على تركيز النهائي لكل طبق في 60 مساء. متوسط ​​الوزن الجزيئي للزوج قاعدة واحدة من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل هو 660 دالتون.

    1. تجاهل المتوسطة القديمةمن 10 سم طبق من الخلايا 293T كلوة الجنين البشري، وبلطف إضافة 9 مل من المتوسط ​​الجديد (DMEM + 10٪ FBS، دون P / S).
    2. إضافة خليط PEI الحمض النووي إسقاط الحكيم بلطف على طبق وبلطف دوامة لخلط مع المتوسط. إضافة 10 ماي من 20 ملي الكلوروكين (النهائي 20 أم) إلى 10 مل المتوسطة. ويعتقد الكلوروكين للحد من تدهور المجمعات ترنسفكأيشن التي تحتوي على البلازميد من خلال تحييد جزئي لدرجة الحموضة داخل مقصورات الليزوزومية 28: ملاحظة.
    3. احتضان في حاضنة CO 2 عند 37 ˚ مئوية لمدة 6 ساعات. ثم، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على خليط PEI الحمض النووي وإضافة 10 مل من المتوسط ​​الجديد (DMEM + 10٪ FBS + 20 ملي 4 - حمض (2 هيدروكسي)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، pH7.4 + P / S) . ملاحظة: بعد مرور فترة الحضانة، وسيتم إنتاج الفيروس في المتوسط. يجب تطهير ماصات باستور الشفط و / أو نصائح بنسبة 10٪ التبييض. تطهير دائما البيولوجية سطح خزانة السلامة والمعدات يحتمل أن تكون ملوثة مع 70٪ ETOH بغض النظر عما إذا اريق طافأو لا. إذا حدث سفك، التطهير شامل مع 1٪ SDS في 70٪ ETOH ضروري.
    4. يوم 2-3، في احتضان حاضنة CO 2 عند 37 ˚ مئوية لمدة 48-72 ساعة. يوم 4، وجمع حل lentiviral (الاستمرار في القسم 2.2).
      ملاحظة: يمكن تغيير متوسطة في 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. جمع طاف الفيروس 48 ساعة و 72 ساعة مرتين قد تحقق للحصول على أعلى عيار حلول الفيروس.
  2. مجموعة من الحل lentiviral وتنبيغ
    1. تحضير كاشف وأدوات: 15 مل أنابيب مخروطية، 1 M HEPES، pH7.4 (0.22 أم تصفيتها)
    2. اليوم 4، جمع طاف تحتوي على جزيئات الفيروسة البطيئة (حل lentiviral) مع 10 مل تعقيمها يور لوك حقنة، ثم تحديد طاف من خلال 0.45 ميكرون تصفية في أنبوب 15 مل المخروطية. إضافة 1/100 حجم 1 M HEPES pH7.4 لتصفية حل lentiviral (النهائي 10 ملم).
      ملاحظة: للحصول على الترشيح، فقط استخدام الآس السليلوزتيت أو polyethersulfone (PES) (منخفض البروتين ملزمة) مرشحات. لا تستخدم مرشحات النيتروسليلوز. النيتروسليلوز تربط البروتينات السطحية على المغلف lentiviral ويدمر الفيروس.
    3. إزالة المتوسطة من 3.5 سم أطباق من الفئران حديثي الولادة العضلية، تم الحصول عليها في الخطوة الأخيرة من القسم 1.2، إضافة 1 مل من محلول تصفيتها lentiviral إلى 3.5 سم الطبق.
    4. <Optional> إضافة بروميد hexadimethrine (تركيز النهائي 4-6 ميكروغرام / مل).
      ملاحظة: بروميد Hexadimethrine قد يؤدي إلى تعزيز كفاءة تنبيغ lentiviral. ينبغي أن يكون الأمثل تركيز بروميد hexadimethrine.
    5. احتضان الطبق لمدة 6 ساعات في حاضنة CO 2 عند 37 ˚ مئوية لمدة lentiviral تنبيغ، ثم تغيير المتوسطة لجديدة DMEM / MEM تحتوي على 5٪ FBS وP / س. احتضان الطبق في حاضنة CO 2 عند 37 ˚ مئوية لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: يعتبر دمج الجين الخارجية في جينوم المضيف عن طريق الفيروسة البطيئة أن يتم الانتهاء من 72 ساعة.
    6. يوم 7، استخدام الخلايا من الخطوة 2.2.5 للخطوة التالية. ويمكن التأكد من البروتين التعبير البلازميد lentiviral من قبل البنك الدولي أو مناعية (ICH) بعد 48-72 ساعة من تنبيغ من أجل تحديد مستوى التعبير النسبية (الشكل 1A و 1b): ملاحظة.
  3. تركيز محلول lentiviral
    ملاحظة: فمن الأفضل لاستخدام الحل lentiviral جديدة من أجل تحقيق أعلى كفاءة تنبيغ، في حالة الحل عيار lentiviral ليست عالية بما فيه الكفاية، والحل lentiviral يمكن أن تتركز من قبل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) هطول الأمطار 29.
    1. إعداد 4X PEG حل (32٪ PEG6000، 400 ملي كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، و 40 ملي HEPES pH7.4)
      1. ل125 مل 4x وPEG الحل، تزن 40 غرام من PEG6000، ثم حله في 60 مل من الماء.
        ملاحظة: ملاحظة: (أي متوسط ​​الوزن الجزيئي للPEG6000 هو 6،000) عدد بعد PEG هو متوسط ​​الوزن الجزيئي
        ملاحظة: 2.3.1.2) إضافة ببطء 10 ملمن 5 M كلوريد الصوديوم. إضافة ببطء 5 مل من 1 M HEPES pH7.4. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 2 M هيدروكسيد الصوديوم.
        ملاحظة: 2.3.1.3) إضافة الماء إلى 125 مل. تعقيم الحل عن طريق الترشيح PEG 4x والغشاء مع 0.22 أم تصفية وتخزينها في 4 ˚ مئوية.
    2. تركيز الفيروسة البطيئة
      1. مرشح lentiviral transduced طاف في أنبوب جديد 50 مل باستخدام 0.45 ميكرون التصفية.
        ملاحظة: 2.3.2.2) إضافة 4X حل PEG 01:03 نسبة (PEG الحل: طاف = 1:3). تخزين عند 4 ˚ مئوية لمدة 16-48 ساعة.
        ملاحظة: 2.3.2.3) الطرد المركزي في 2600 ز س في 4 ˚ مئوية لمدة 30 دقيقة. تجاهل طاف والطرد المركزي في 2600 ز س في 4 ˚ مئوية لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: 2.3.2.4) تجاهل طاف بعناية لتجنب تعكير صفو بيليه. إعادة تعليق بيليه في المصل خالية المتوسطة باستخدام 1/2 الى 1/25 حجم حجم طاف الأصلي.
        ملاحظة: 2.3.2.5) استخدم مباشرة أو تجميد باستخدام النيتروجين السائل ثم تخزينها في -80 ˚ C

3. تنبيغ الفيروسة الغدانية

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى مصادر أخرى عن طرق لبناء ونشر بنيات الغدانية 13. يجب تطهير ماصات باستور الشفط و / أو نصائح بنسبة 10٪ التبييض. تطهير دائما البيولوجية سطح خزانة السلامة ويحتمل أن تكون ملوثة المعدات مع 70٪ ETOH بغض النظر عما إذا اريق طاف. إذا حدث سفك، التطهير شامل مع 1٪ SDS في 70٪ ETOH ضروري.

  1. المعايرة الغدانية بنسبة 50٪ زراعة الأنسجة الجرعة المعدية (TCID 50)
    ملاحظة: قبل تنبيغ، فمن الضروري أن يعاير محلول المخزون الغدانية. TCID 50 هي واحدة من أفضل الطرق لعاير الحل الفيروسية. لأن أسلوب بتقييم عيار بواسطة قدرة المعدية إلى خلايا كلوة الجنين البشري 293T، وتحسب TCID 50 يعكس infectability الفعلية للسهم اتش. وPFU (أحادي تشكيل اللويحاتنهاية الخبر) يتناسب مع TCID 50 مع عامل من حوالي 0.56 30.
    1. إعداد الخلايا والأدوات: خلايا كلوة الجنين البشري 293T، 10 سم أطباق زراعة الخلايا، 96 جيدا مسطحة القاع لوحة خلية ثقافة، 8 قنوات متعددة ماصة
    2. إعداد 70-90٪ متموجة كلوة الجنين البشري خلايا 293T في واحد 10 سم الطبق.
    3. إجراء قبل التخفيف من 10/1 4 من الأسهم الفيروس. إضافة 50 ماي من DMEM + 10٪ FBS إلى كل بئر من 96 جيدا مسطحة القاع لوحة خلية ثقافة. إضافة 25 ماي من الأسهم الفيروس قبل المخفف في الصف الأول، من الألف إلى H.
    4. تخلط جيدا ونقل 25 شباط من الصف الأول من الآبار إلى الصف الثاني مع متعددة ماصة 8 قنوات. تكرار التخفيف 1/3 من محلول الفيروسية إلى كل صف من الآبار، وذلك حتى الصف 11th و تجاهل المجاهدين ال 25 الماضية.
    5. الخلايا 293T كلوة الجنين البشري يسحن في 10 مل من DMEM + 10٪ FBS. إضافة 50 ماي من حل خلية في كل بئر من الصفوف من 1 إلى 12.
    6. احتضان الخلايا عند 37 ˚ مئوية في حاضنة CO2 ل11-13 يوما. إضافة 50 ماي من DMEM + 10٪ FBS بعد 4-5 أيام و7-8 أيام من الطلاء.
    7. قياس آثار الاعتلال الخلوي في كل بئر في 11-13 يوما بعد الإصابة.
    ممر 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    الصف A د د د د د د د د د
    الصف B د د د د د د د د د
    الصف C د د د د د د د د د
    الصف D د د د د د د د
    الصف E د د د د د د د د د د د
    الصف F د د د د د د د
    الصف G د د د د د د د د
    الصف H د د د د د د د د د د د
    عدد الآبار إيجابية لكل صف 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    نسبة الآبار إيجابية لكل صف 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    د عرض أكثر من 50٪ آثار الاعتلال الخلوي
    عرض أقل من 50٪ أو أي آثار الاعتلال الخلوي

    حارة 1، التخفيف 3 1 4 X10؛ 2 لين، التخفيف 3 2 4 X10؛ ...؛ لين 11، التخفيف 3 2 11 X10؛ لين 12، السيطرة.
    S = مجموع نسب الآبار إيجابية لكل صف
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0.75 +0.63 +0.25 +0.25 +0 = 8.875
    TCID 50 = 3 × 10 4 × 3 × (8،875-0،5) = 2.97 × 10 8
    TCID 50 / مل = 5.94 × 10 9

    الجدول 3: مثال على المصابين 96 لوحة جيدا بعد 10 أيام الحضانة قياس آثار الاعتلال الخلوي في كل بئر وخلاصة القول نسب آبار إيجابية لكل صف.

    1. حساب عيار وفقا لصيغة Kaerber ل
    2. TCID 50 = (التخفيف من المسار الأول) × (التخفيف) (S-0.5)
    3. S = مجموع نسب الآبار إيجابية لكل صف
      ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، TCID 50 = (30000) × (3) (S-0.5). لأنه يتم استخدام 50 ماي من حل الفيروسية في هذا البروتوكول، وتقسيم TCID 50 بنسبة 0.05 لحساب TCID 50 / مل.
  2. تنبيغ الفيروسة الغدانية
    1. حساب الكمية المطلوبة من حل الغدانية من عيار لها (PFU / مل، الجسيمات الفيروسية / مل أو TCID 50 / مل). استخدام صيغة لحساب وزارة الداخلية (تعدد العدوى).
    2. م> [مكان الجدول 4 هنا]
    3. إضافة كمية محسوبة من حل لفيروس المصل خالية المتوسطة (انظر الجدول 5). تخلط جيدا واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
    4. م> [مكان الجدول 5 هنا]
    5. Day7، خذ طبق تم الحصول عليها في الخطوة الأخيرة من القسم 2.2، واستبدال المتوسطة مع 750 من المجاهدين جديدة DMEM / MEM تحتوي على 5٪ FBS وP / س.
      ملاحظة: تخفيض حجم المتوسطةفي تنبيغ إلى حوالي 50٪ من حجم الأصلي هو أمر حاسم لعالية الكفاءة تنبيغ.
    6. إضافة حل الفيروس المخفف إلى الطبق. احتضان طبق لمدة 4-8 ساعات في حاضنة CO 2 عند 37 ˚ C. ثم، مع استبدال المتوسطة الطازجة.
    7. احتضان الطبق لمدة 24-48 ساعة في حاضنة CO 2 عند 37 ˚ C. في يوم 8-9، استخدام الخلايا للتجربة التصوير الخلية الحية. ويمكن التأكد من البروتين التعبير البلازميد الفيروسة الغدانية من قبل البنك الدولي أو ICH بعد 24-48 ساعة من تنبيغ من أجل تحديد البروتين النسبية التعبير مستوى (1C الشكل و1D): ملاحظة.

4. التصوير الخلية الحية

  1. الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر القرص الغزل مع غرفة التحكم بدرجة حرارته ونظام CO 2 البيئية (اختياري)
    1. تحويل نظام التحكم في درجة الحرارة على ما لا يقل عن 1 ساعة قبل الاستحواذ، حتى يتسنى لجميع الأجهزة تتوازن إلى 37 ˚ مئوية قبل بداية الاستحواذ. بدوره على confocآل الغزل نظام القرص المجهر (PC للتشغيل، المجهر، والغزل وحدة القرص، وكاميرا CCD، وأشعة الليزر، ومصدر ضوء الفلورسنت، مصدر ضوء طبيعي، ومرحلة الآلية، ومصاريع التلقائي).
      ملاحظة: أكثر من 1 ساعة هو ضروري لتحقيق موازنة درجة حرارة الكامل لجميع الأجهزة.
    2. تغيير المتوسطة في 3.5 سم أسفل الزجاج الأطباق والمتوسطة المطلوبة لعملية الاستحواذ، إذا لزم الأمر. وضع الطبق على مرحلة متحد البؤر المجهر القرص الغزل في غرفة درجة الحرارة التي تسيطر عليها.
      ملاحظة: نظرا لانحراف كروية للمراقبة الأمثل عن طريق استخدام المجهر من صحن أسفل 3.5 سم الزجاج مع غطاء زجاجي رقم 1.5 (حوالي 0،16-0،19 مم سمك) هو المثل الاعلى. إذا كان الهدف المستخدمة لديها طوق التصحيح، والصور التي تم الحصول عليها مع غطاء النظارات أكثر سمكا من 0.17 ملم ويمكن تصحيحها. أيضا، الفينول الأحمر لديه مضان طفيفة. أحيانا يكون من الأفضل استخدام الفينول الحمراء المتوسطة الحرة، مثل الفينول DMEM دون الحمراء. إذا لم يكن هناك جهاز للتحكم CO 2 متوسطة أو متوسطة مخزنة من قبل HEPES على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير مستقلة.
    3. حدد مسار الضوء إلى العدسات.
    4. تحويل مصراع من مصدر الضوء مشرق الميدان جرا. ضبط التركيز إلى الخلايا تحت المجهر من خلال العدسات. تحويل مصراع للمشرق الميدان مصدر ضوء قبالة.
    5. تحويل مصراع لمصدر ضوء الفلورسنت جرا. البحث عن الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية تحت المجهر من خلال العدسات. تحويل مصراع لضوء الفلورسنت مصدر قبالة.
    6. اختياري> اضغط على زر تفعيل لنظام التركيز مثالية أمام المجهر لتحويل نظام التركيز على الكمال من اجل الحفاظ على التركيز المستمر خلال اقتناء مرور الزمن.
    7. تغيير مسار الضوء إلى المجهر متحد البؤر القرص الغزل. ضبط إعدادات لاقتناء بشكل مناسب باستخدام برنامج التشغيل، والتحقق من الصور displaYED على الشاشة. (مثل التركيز، قوة الليزر، وقت التعرض، واتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا ومكاسب خارج مجموعة)
    8. مجموعة الإعدادات الخاصة الحصول على الصور الفلورسنت باستخدام برنامج التشغيل. مثال: اختر "تغيير القنوات باستخدام مسارات الضوء" و "قناة 1: EGFP" للحصول على إشارة الفلورسنت من EGFP للقناة واحدة.
    9. تعيين التردد بين نقاط الوقت عن طريق تكوين إعدادات الوقت الفاصل من أجل اتخاذ الوقت الفاصل بين الصور باستخدام برنامج التشغيل. مثال: لاكتساب مرة واحدة نقطة كل 5 دقائق، حدد "دقيقة في وقت نقطة" من القائمة المنسدلة، وأدخل 5 في حقل النص.
      ملاحظة: حدد "السرعة القصوى" لتقديم الفيلم في السرعة الفعلية. إذا التعبير عن بروتين فلوري منخفضة، ومضان قد تبييض بسرعة خلال الاستحواذ الوقت الفاصل. في هذه الحالة، فمن الأفضل للحد من عدد من اكتساب نقاط الوقت.
    10. بدء اقتناء مرور الزمن من خلال النقر على "ستاغ الزر "للحصول على صورة تسلسل.
      ملاحظة: من الأفضل عدم استخدام نقاط متعددة الوظائف الاستحواذ. فإنه قد يسبب فقدان التركيز أو حركة ميدان التصوير خلال الوقت الفاصل بين التصوير.
  2. تحليل الصور المكتسبة
    ملاحظة: تم شراؤها الصور يمكن تشغيلها كملف الفيلم وتحليلها باستخدام برنامج التحليل.
    1. حدد الصور المكتسبة ليتم تضمينها في الفيلم. إذا لزم الأمر، مناطق المحاصيل من الاهتمام من الصور وحدد نقاط مثيرة للاهتمام الوقت لتقليل حجم ملف الفيلم باستخدام برنامج التشغيل.
    2. تصدير الصور كملف الفيلم في شكل AVI أو MOV. حدد تنسيق الفيلم من "تنسيق" القائمة المنسدلة وتوقيت المطلوبة للفيلم النهائي، ثم انقر فوق "تصدير". ملاحظة: الصور في الوقت الفاصل بين الحصول عليها في وقت واحد نقطة كل 5 دقائق يمكن أن تقوم مرة أخرى كفيلم في 10 لقطة في الثانية، وهو 3،000 مرات أسرع من سرعته الفعلية.
  3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح هذه التقنية، والفيروسة البطيئة EGFP الترميز (تعزيز البروتين الفلوري الأخضر) الموسومة Cx43 (Connexin43) أو Cx43 تحور 32 كانت تستخدم للتعبير عن البروتينات الموسومة EGFP في الخلايا، وترميز اتش FGFR1DN (عامل نمو الخلايا الليفية مستقبلات 1 السلبية السائدة تم استخدام) لاغلاق جمعية جيل المستقبل الإشارات في الخلية 33-35. ثلاثة أيام في أعقاب عزل العضلية، و transduced والعضلية معزولة مع الفيروسة البطيئة من أجل التعبير عن البروتينات الموسومة EGFP في الخلايا. ثم بعد 3 أيام من تنبيغ lentiviral، و transduced والعضلية معزولة كذلك مع الترميز اتش FGFR1DN للقضاء على جمعية جيل المستقبل الإشارات في الخلايا. بعد السماح الوقت الكافي للخلايا للتعبير عن الجينات الخارجية transduced، تم استخدام المجهر القرص الغزل مبائر لالتقاط الصور الخلية الحية. لعبت الصور المكتسبة مرة أخرى كملف الفيلم وتحليلها باستخدام برامج تحليل الصور. للالتمثيل أكثر تفصيلاالنتائج TIVE يرجى الاطلاع ساكوراي وآخرون 32.

التعبير عن EGFP الموسومة البروتينات التالية وأكد تنبيغ lentiviral التي كتبها متحد البؤر المجهري القرص الغزل 72 ساعة التالية lentiviral أرقام تنبيغ 1A-B. وأكد التعبير عن FGFR1DN بواسطة تنبيغ الفيروسة الغدانية من قبل البنك الدولي والمحكمة الجنائية الدولية بعد 24 ساعة من الغدانية أرقام تنبيغ 1C-D. تم تعريف وقت الغدانية بالإضافة إلى 3.5 سم أطباق من الوقت 0 والوقت الفاصل بين الصور تم الحصول عليها مع 40X الهواء NA 0.9 عدسة الهدف كل 5 دقائق لمدة 6 ساعة باستخدام سخان الغرفة للحفاظ على درجة الحرارة عند 37 ˚ C. وتظهر الصور الوقت الفاصل بين البروتينات الموسومة EGFP في العضلية الأولية التي اتخذتها متحد البؤر المجهري القرص الغزل في أفلام التكميلي 1-2.

في الحالات التي تكون فيها درجة الحرارة موازنة يست كافية، أو تم وضع متعددة اقتناء لا يعمل بشكل صحيح،الصور الملتقطة يمكن أن تتحرك في الطائرة س ص التكميلي فيلم 1. ولكن عندما تعمل بشكل صحيح على نظام ضبط تلقائي للصورة الحفاظ على ثابت التركيز وهذا لم يحدث. كما هو مبين في خلفية فيلم 2، عندما كانت درجة الحرارة موازنة كافية وتم الحصول منطقة واحدة فقط من الفائدة، والصور التي تم التقاطها هي ذات جودة عالية جدا.

تم تقييم ضرب العضلية بعد فترة طويلة الأجل الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية من أجل تأكيد بقاء الخلية. حتى بعد 16 ساعة من الوقت الفاصل بين التصوير EGFP العضلية معربا عن الحفاظ على الخصائص الوظيفية وفاز فيلم التكميلي إيقاعي 3.

الشكل 1
الشكل 1. تأكيد من البروتين التعبير التالي تنبيغ lentiviral أو الغدانية. (A) الفئران المعزولة العضلية حديثي الولادة التعبير عن Cx43-WT-EGFP transduced مع الإعلان، وFGFR1DN بعد 3 أيام تنبيغ. انظر أيضا فيلم التكميلي 1 (B) المعزولة الفئران حديثي الولادة العضلية معربا عن Cx43-S325/328/330E (3SE) EGFP transduced مع الإعلان، وFGFR1DN بعد 3 أيام تنبيغ. انظر أيضا فيلم التكميلي 2. (C) التعبير البروتين التالية تنبيغ الفيروسة الغدانية الكشف عنها من قبل المحكمة الجنائية الدولية 24 ساعة بعد تنبيغ. راصة دموية (HA) تم الكشف عن الألغام المضادة للFGFR1DN HA الأجسام المضادة باستخدام أساليب المحكمة الجنائية الدولية التقليدية الموسومة البروتين، وكان يستخدم ألفا actinin كعلامة للالعضلية. (D) التعبير عن البروتين FGFR1DN التالية تنبيغ الفيروسة الغدانية الكشف عنها بواسطة WB 24 ساعة بعد تنبيغ. تم الكشف HA الموسومة FGFR1DN من قبل مكافحة HA الأجسام المضادة من قبل البنك الدولي، وكان يستخدم بيتا تويولين كما تحكم التحميل.

فيلم تكميلية 1. الوقت الفاصل بين التصوير من الفئران المعزولة سيارة حديثي الولادة تم الحصول عليها diomyocytes التعبير عن Cx43-WT-EGFP transduced مع الإعلان، وFGFR1DN. الصور الوقت الفاصل بين مع 40X عدسة الهدف كل 5 دقائق لمدة 6 ساعة مع المجهر القرص الغزل متحد البؤر. وقد لعبت الصور المكتسبة يعود إلى فيلم في 10 لقطة في الثانية. تم تعديل هذا الفيلم من ساكوراي وآخرون 32. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.

فيلم التكميلي 2. الوقت الفاصل بين التصوير من الفئران المعزولة العضلية حديثي الولادة معربا عن Cx43-S325/328/330E-EGFP transduced مع الإعلان، وFGFR1DN، بينما حصل الصور الوقت الفاصل بين مع 40X عدسة الهدف كل 5 دقائق لمدة 6 ساعة مع متحد البؤر الغزل المجهر القرص. وقد لعبت الصور المكتسبة يعود إلى فيلم في 10 لقطة في الثانية. تم تعديل هذا الفيلم من ساكوراي وآخرون 32."الهدف =" _blank "> الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.

فيلم التكميلي 3. الوقت الفاصل بين التصوير من الفئران المعزولة العضلية حديثي الولادة لعبت مرة أخرى في السرعة الفعلية. الصور الوقت الفاصل بين الفئران المعزولة من الأطفال حديثي الولادة العضلية التعبير عن Cx43-EGFP transduced مع تم الحصول عليها الإعلان، وFGFR1DN مع 40X عدسة الهدف كل 200 ميللي ثانية لمدة 10 ثانية مع المجهر القرص الغزل مبائر التالية 16 ساعة من اكتساب الوقت الفاصل. وقد لعبت الصور المكتسبة يعود إلى فيلم في 5 إطارات في الثانية في سرعة الفعلية. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لطالما استخدمت العضلية الأولية المعزولة من الفئران حديثي الولادة لدراسة وظائف cardiomyocyte في المختبر. يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل العضلية حديثي الولادة من الجراء الفئران باستخدام خطوتين طريقة انزيم الهضم، هضم الأول مع التربسين O / N عند 4 درجة مئوية ثم كولاجيناز المنقى. واحد الاستفادة من توظيف الخطوة كولاجيناز المنقى هو أن نفس الصف من انزيم يستخدم لجميع العزلة. وبالتالي، فإن نوعية وكمية الخلايا المعزولة يتسق من تجربة إلى تجربة.

نظرا للكفاءات أعلى تنبيغ المرتبطة اتش، إذا كان كفاءة عالية من تنبيغ من ثقافة الخلية ضروري لتجربة معينة، فمن الأفضل لاستخدام اتش. ومع ذلك، إذا كانت مستويات عالية من تنبيغ ليست ضرورية، يمكن استخدام ناقلات lentiviral. وجود خيار استخدام ناقلات إما الغدانية أو lentiviral يجعل من الاسهل لتحقيق transd المناسبةuction والتعبير مستويات لأنواع مختلفة من الجينات. إذا كانت كثافة الفلورسنت الكشف عنها بواسطة التصوير الخلية الحية باستخدام متحد البؤر المجهر القرص الغزل أو المحكمة الجنائية الدولية منخفضة جدا بعد تنبيغ lentiviral، وذلك باستخدام ناقلات نقل lentiviral آخر يستخدم مروج مختلفة للتعبير عن الجينات في المصالح قد حل هذه المشكلة. مع ناقلات الفيروسة الغدانية، إذا كانت الفرقة الكشف عنها من قبل البنك الدولي ضعيفة بعد تنبيغ الفيروسة الغدانية، وهذا قد يشير إلى وجود انخفاض الأسهم الفيروسية عيار. في هذه الحالة، فمن الأفضل أن تعد عيار حل الغدانية بنسبة انتشار في الخلايا قبل المتابعة.

واحد الحد من هذه التقنية هو أن محصول العضلية قابلة للحياة منعزلة لا تتفق إلى حد كبير من تجربة إلى تجربة، حتى عند استخدام كولاجيناز المنقى. من أجل إجراء تجارب التصوير استنساخه فمن الأفضل أن نعتمد خلايا قابلة للحياة بعد اختيار العضلية المعزولة في طاف في خطوة 1.2.13. في قسم البروتوكول. ثم، حد ذاتهإد العضلية على أطباق الزجاج السفلي في التخفيفات متفاوتة. مرة واحدة وقد أرفقت الخلايا، حدد المخطط الأطباق مع تركيز الخلية المناسبة للتجربة.

هناك العديد من المزايا من استخدام العضلية حديثي الولادة، ولكن هناك أيضا بعض العيوب. العيب الرئيسي هو الفرق بينهما واضحة من الكبار العضلية. الكبار العضلية متباينة تماما هي قضيب شكل والعضلية الأولية الكبار معزولة الحفاظ على التشكل على شكل قضيب، وحين العضلية الأولية حديثي الولادة معزولة تنتشر في جميع الاتجاهات 36. وتنعكس الاختلافات المظهرية بين الكبار معزولة وحديثي الولادة العضلية أيضا في أنماطها في التعبير الجيني 37. لذلك، للتجارب التي يلزم فيها العضلية المتباينة، وسوف تكون هناك حاجة إلى بروتوكول لعزل العضلية الكبار 4.

توظيف تنبيغ الفيروسة الغدانية وlentiviral المؤتلفالبروتينات في الفئران حديثي الولادة العضلية الأولية في تركيبة مع متحد البؤر المجهري القرص الغزل يسمح لنا لتحليل وظائف البروتينات في الخلايا الأولية الحية المستزرعة. بالنسبة لطرق القائمة، التي تستخدم ترنسفكأيشن لإدخال الجينات في المصالح في الخلايا، وهي ميزة كبيرة من هذا البروتوكول هو أن الفيروسات الغدية وlentiviruses تؤخذ بكفاءة عالية من قبل الخلايا الناتجة في التعبير عن الجينات في المصالح في جميع الخلايا تقريبا في ثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نوعين مختلفين من الفيروسات للتعبير الجين يجعل من الاسهل لتحقيق معدلات تنبيغ المناسبة ومستويات التعبير عن جينات متعددة. ويمكن أيضا الرناوات siRNAs ومنبهات الكيميائية ومضادات استخدامها في هذا النظام لمزيد من التشويش وتحليل وظائف الجينات والبروتينات التي ترميز.

إعداد قلوب خطوة هامة للغاية في البروتوكول. إزالة قلوب من الجسم في أسرع وقت ممكن. تأكد منوضعها على الجليد على الفور للحفاظ على الخلايا عالية الجدوى. خطوة هامة أخرى هي إعداد جودة عالية، وعيار والأسهم lentiviral / الغدانية. إذا تم استخدام المخزونات الفيروسية ذات نوعية رديئة، وسوف تنبيغ التعبير ومستويات الجين من الفائدة تكون منخفضة. وبالتالي، فإنها قد لا تكون مناسبة لدراسات التصوير.

سوف تطبيق هام من هذه التقنية في المستقبل تكون "استخدامه في العضلية الماوس. اختبار الدراسات التجريبية ما إذا كان هذا الأسلوب يمكن أن تستخدم لعزل الماوس العضلية حديثي الولادة قد أسفرت عن نتائج واعدة. نظرا لحجم صغير نسبيا من قلوب الماوس مقارنة مع تلك الفئران، يتم الحصول على الأنسجة أقل في البداية. وبالتالي، يتم عزل الخلايا أقل في إجراء واحد باستخدام نفس العدد من الحيوانات ولكن ينبغي أن مجرد استخدام مزيد من الفئران لعزل القضاء على هذه العقبة. القدرة على عزل العضلية الماوس يسمح للباحثين لتحقيق وظائف الخلايا المعزولة من المعدلة وراثيا مالجليد (المعدلة وراثيا، خروج المغلوب، الضربة القاضية في) الذي تم إنتاجه من أجل دراسة شكل معين من الجينات في المصالح.

كان واحدا من العقبات الرئيسية في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية صعوبة المرتبطة بالتحقيق في التعبير وظيفة الجين نظرا أعرب في أنسجة القلب في الجسم الحي في الوقت الحقيقي. ولكن القدرة على عزل العضلية الضرب وظيفية، تعدل وظائف الخلية باستخدام تنبيغ الفيروسية، ومن ثم دراستها في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر القرص الغزل مبائر يساعد على تسليط الضوء على دور العضلية في الجسم الحي وردم هذه الفجوة. يوفر هذا الأسلوب نظام مبسط لفهم وظيفة cardiomyocyte على المستوى الخلوي. فإنه يسمح للتحليل في الوقت الحقيقي لكيفية الاضطرابات في التعبير الجيني تغيير وظيفة cardiomyocyte. سوف التصوير الخلية الحية من العضلية تقديم مزيد من نظرة ثاقبة وظيفة cardiomyocyte. ومثل هذه الأفكار يؤدي إلى التقدم في cardiovascula الأساسيةالبحث ص، مما أدى إلى علاجات جديدة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31, (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28, (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79, (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32, (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63, (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62, (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. 264-573 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics