Живых изображений сотовый первичных Rat неонатальных кардиомиоцитов После Аденовирусный и Лентивирусов Трансдукция Использование конфокальной вращающийся диск микроскопия

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Первичный крыс неонатальные кардиомиоциты могут быть использованы в основном в пробирке сердечно-сосудистых исследований, поскольку они могут быть легко изолированы в больших количествах в одной процедуры. Благодаря достижениям в области микроскопа технологии это относительно легко для захвата изображений живых клеток с целью исследования клеточных событий в режиме реального времени с минимальным беспокойством относительно фототоксичности к клеткам. Этот протокол описывает, как взять живые клетки интервальная съемка фотографий первичных крысиных неонатальных кардиомиоцитов с помощью конфокальной вращающийся диск микроскоп следующие лентивирусным и аденовирусной трансдукции модулировать свойства клетки. Применение двух различных типов вирусов облегчает достижение соответствующего уровня ставок трансдукции и экспрессии для двух разных генов. Хорошо сфокусированных изображений живых клеток могут быть получены с использованием автоматической фокусировки системы микроскопа, который поддерживает стабильную фокусировку в течение длительных периодов времени. Применяя этот метод, функции экзогенно инженераред белки, экспрессированные в культивируемых первичных клеток могут быть проанализированы. Кроме того, эта система может быть использована для изучения функции генов с использованием киРНК а также химических модуляторов.

Introduction

Первичные крысы неонатальные кардиомиоциты уже давно используются для исследования функции кардиомиоцитов в пробирке 1. Они легко изолировать от крысят несколькими хорошо известными способами 2-4. Наиболее распространенным методом работают коллагеназы или трипсин, чтобы переварить соединительной ткани сердца до выделения клеток. Исследователи также разработали методы выделения кардиомиоцитов из взрослых грызунов 5-8, а также новорожденных мышей 9,10.

Этот протокол описан способ выделения кардиомиоцитов из неонатальных детенышей крыс, используя процедуру ферментативному перевариванию двухступенчатый. Трипсин первом использовании O / N при 4 ° С, а затем очищенный коллагеназы при 37 ° С Инкубация ткани сердца с помощью трипсина O / N при 4 ° С уменьшает шаги, необходимые для сбора урожая клеток по сравнению с методами, использующими последовательные инкубации в теплом растворе фермента 2. Кроме того, с помощью очищенного COllagenase, а не сырой ферментов, много к партии изменчивость может быть устранена, тем самым обеспечивая повышенную воспроизводимость.

Функциональные исследования конкретного белка часто используют систему экспрессии белка с использованием аденовирус 11-13 и / или 14-16 лентивирусов. [Примечание по] Вирусный производство и манипуляции должны проводиться в соответствии с рекомендациями NIH.

Аденовирус не интегрируется в геном хозяина. Она имеет очень высокую эффективность трансдукции в большинстве типов клеток, в том числе делящиеся клетки и не-делящихся клеток, а также первичных элементов и установленных клеточных линий. Это делает аденовирус надежным вектор для экспрессии генов. Высокие уровни белка, кодируемого вектором аденовируса развивать в течение 48 часов следующего трансдукции, и они могут продолжаться в течение нескольких недель 17. Однако один недостаток использования аденовирус для экспрессии белка в том, что развитие рекомбинантного адекватноnovirus является одновременно сложным и трудоемким. Этот недостаток отчасти объясняет, почему многие исследователи обращаются к лентивирусы для выражения рекомбинантного гена. В отличие от аденовирусных конструкций, создавая лентивирусов конструкцию быстро. Хотя лентивирусы как правило, имеют более низкую эффективность трансдукции, чем аденовирусы, в обоих разделительных и не делящихся клеток, они интегрируются в геном хозяина. Следовательно, выражение гена трансдуцированных является более стабильным, чем для лентивирусов для аденовирусов.

В связи с технологическими достижениями в области микроскопии, это намного проще, чтобы захватить клетки изображения живых клеток, выражающих рекомбинантных белков. Это справедливо даже на скоростях Оценить видео приобретения. Это позволяет исследователю определить, как определенные изменения в интересующего белка функционально воздействовать на клетки в реальном времени. Конфокальной вращающийся диск микроскоп имеет несколько ключевых особенностей, которые делают его оптимальным методом для Ливе ячейки изображения 18,19. Вращающегося диска Yokogawa позволяет гораздо более быстрого получения изображения, в то же время используя гораздо меньше мощности лазера, чем точка сканирующей конфокальной микроскопии. Обе эти особенности обусловлены вращающийся диск, который содержит многочисленные конфокальных отверстия, через которые проходит лазерный одновременно с образцами. Во время приобретения, сам диск вращается быстро и непрерывно 18-20. С помощью автоматической фокусировки систему микроскопа, устойчивый фокус сохраняется в течение длительного периода времени. Это позволяет исследователям принять целенаправленных изображения живых клеток. Приобретенные изображения воспроизводятся как видеофайл. Изображения анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ 21,22, Фиджи 23 или другого имеющегося в продаже программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Выделение крыс неонатальных кардиомиоцитов

  1. Использование модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) и минимальную поддерживающую среду (MEM) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллина / стрептомицина (P / S) в качестве культуральной среды. Добавить бромдезоксиуридин (BrdU) в среду, чтобы предотвратить рост фибробластов в течение первых 2 дней после изоляции.
База среднего FBS BrdU (мМ) P / S (U / мл)
выбор DMEM 10% 0 20
Первый день DMEM 10% 0.1 10
На следующий день DMEM / MEM 5% 0.1 10
Далее культура DMEM / MEM 5% 0 10

Таблица 1:. Среда для крыс неонатальных кардиомиоцитов Используйте это средства массовой информации для культивирования крысы новорожденных кардиомиоцитов. DMEM / MEM 1:1 смесь DMEM и MEM среде.

  1. Изоляция кардиомиоцитов, день 1 (Оценочная требуется время, приблизительно 1 час)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы с новорожденных грызунов, обратитесь к местным требованиям университета и правилами, установленными программами по уходу за животными, и придерживаться институционально одобренных протоколов животных. Все способы, описанные в этом протоколе были утверждены в Институциональная уходу и использованию животных комитета Йельского ресурсного центра животных на.
    1. Подготовка реагентов и инструменты: сбалансированный солевой раствор кальция и магния-Free Хэнка (CMF HBSS), 30 мл х 2, 10 мл х 2, на льду; 1 мг трипсина, восстановленный с 2 ​​мл CMF HBSS, на льду; автоклавного инструментов; 70% этанол (EtOH) в 250 мл химический стакан; четыре стерилизовать 10 см пластиковой посуды, три для изоляции сердца и один для трипсинизации.
    2. Заказать 1 Литтэ из 1-к-2-дневных крысят (около 10 щенков) с их плотины от экспериментального животного дистрибьютора.
    3. День 1, трансфер щенков в маленькой клетке и усыпить плотину с кетамин / ксилазина коктейля (Кетамин, 200ml/10g и ксилазина 20ml/10g) передозировка.
    4. Возьмите одного щенка и стерилизовать все его тело с 70% этанола. Обезглавьте щенка с ухоженными острыми хирургическими ножницами на стерилизованной 10 см пластиковую чашку в месте, изолированном от других щенков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы собрать образцы как можно быстрее, лучше всего использовать самый быстрый и эффективный способ для прекращения жизни грызуна. Обезглавливание при правильном использовании квалифицированными специалистами с благоустроенной оборудования может привести к меньшим страхом и тревогой за животным и быть более быстрым и практичным, чем другие формы эвтаназии. Это согласуется с рекомендациями Американской Ветеринарной Руководства Ассоциации медицинских для эвтаназии животных.
    5. Удалить побоевискусство стерилизованными инструментами, и положил сердце в 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS в 50 мл коническую трубку. ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите сердца как можно быстрее и положить их на лед сразу. После удаления сердца от тела, все процедуры нужно делать на льду.
    6. Сбор 5 сердца в 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS, а остальные 5 сердца в еще 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS. Вихревой трубки для полоскания сердца. ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага, выполнить все процедуры ламинаре.
    7. Удалите супернатант и передать сердца к новому стерилизованного 10 см пластиковую чашку на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не для аспирации сердца с аспиратором.
    8. Удалить крупных сосудов и / или нежелательные ткани. Добавьте 10 мл ледяной охлажденной CMF HBSS к блюду, чтобы ополоснуть сердца.
    9. Перенесите все сердца на новый стерилизованного 10 см пластиковую чашку на льду. Фарш сердца ножницами до менее 1 мм 3 на льду.
    10. Добавить 9 мл охлажденной CMF HBSS. Добавьте 1 мл охлажденной трипсина reconstituted с CMF HBSS (конечная 50 мкг / мл).
    11. Закройте блюдо парафильмом и покрыть ее с алюминиевой фольгой, затем поместить его в холодной комнате (4 ˚ C) в течение ночи.
  2. Изоляция кардиомиоцитов, День 2 (Расчетное требуется время, около 4 часов)
    1. Подготовка реагентов и инструменты: 50 мл коническую трубку х 2; 2 мг ингибитора трипсина, восстанавливают 1 мл CMF HBSS, на льду; 1500 единиц коллагеназы, восстановленный с 5 мл Лейбовиц L-15, при комнатной температуре (RT); Лейбовиц L-15, восстановленный с 1 л стерилизованной воды и фильтруют через 0,22 микронный фильтр, 8 мл при комнатной температуре; 10 мг / мл (32,6 мМ) BrdU в воде; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; два 10 см пластиковые клеточных культур блюда; 3,5 см со стеклянным дном блюда.
    2. День 2, Подготовка желатиновые покрытием блюда. Добавьте 1 мл 0,1% раствора желатина, чтобы покрыть нижнюю тарелку 3,5 см стекло для эксперимента изображений. Выдержите блюда при 37 ˚ С в течение нескольких часов, а затем аспирации и отказаться раствор желатина перед использованием.
      НЕТTE: 3,5 см со стеклянным дном блюдо подходит для эксперимента изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Для извлечения белков из первичных кардиомиоцитов обнаружить экспрессию белка помощи вестерн-блоттинга (ВБ), 0,1% желатина покрытием пластиковые клеточных культур посуду можно использовать.
    3. Перевести все ткани сердца переваривается трипсином в течение ночи с буфером для конической трубе 50 мл на льду в стерилизованной крышкой. Добавить 1 мл ингибитора трипсина в CMF HBSS (конечная 182 мкг / мл). Закрыть крышкой 50 мл коническую трубку плотно, чтобы предотвратить загрязнение.
    4. Выдержите трубки в течение примерно 30 мин в инкубаторе 37 ˚ C, чтобы нагреть ткани и буфер для 30-37 ˚ С. Добавить 5 мл коллагеназы в Лейбовиц L-15 (конечная 94 ед / мл). Инкубировать при 37 ˚ С в течение 45 мин при осторожном встряхивании (170-200 оборотов в минуту в шейкер 37 ˚ С инкубатор).
      Примечание: Этот шаг может быть сделано за пределами ламинарном боксе. Все последующие шаги должны сделать при комнатной температуре.
    5. Лечить снаружи 50 мл коническую трубку с 70% этанола и положитьэто в стерилизованной крышкой.
    6. Растирают тканей с использованием автоматического пипетки с пипетки на 3 мл / сек скорости 20 раз. Разрешить ткани остаток урегулировать в течение 3 мин и процеживают супернатант с 70 мкм ячейки фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: обычный размер 10 мл пипетки может быть использован для растирания.
    7. Добавить 5 мл Лейбовиц L-15 для остальных сгустков ткани и растирают и фильтруют супернатант снова. Промыть фильтр клеток с 2 мл Лейбовиц L-15.
    8. Наведите отфильтрованного раствора клеток в капюшоне в течение 20 - 60 мин, чтобы позволить коллагеназы переварить частично разрушенного коллагена.
    9. Отложений клетки при 100 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в 20 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS и высокой концентрации P / S (20 ед / мл).
    10. Предварительно плиты клетки на двух 10 см пластиковых клеточных культур блюд в течение 1 часа в СО 2 инкубатора при 37 ˚ C для выбора кардиомиоцитов. Примечание: Фибробласты придавать более легко в нижней части блюда, чем кардиомиоцитов.
    11. БелыйIle ожидания, подготовить DMEM, содержащей 10% FBS, P / S (10 ед / мл) и 0,1 мМ BrdU. Добавить 1 мл 10 мг / мл BrdU в 325 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS и P / S.
    12. Вихревой блюда аккуратно и собирать кардиомиоцитов, содержащий супернатант из двух 10 см чашки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство кардиомиоциты все равно завис в супернатанта после 1 часа инкубации. Во избежание загрязнения с фибробластами, которые слегка прикрепленных к блюду, не собирают супернатант с помощью пипетки.
    13. Дополнительно> Граф клеток в супернатант с и без 0,2% трипанового синего и проверить жизнеспособность клеток.
    14. Отложений клетки при 100 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в DMEM, содержащей 10% FBS, P / S (10 ед / мл) и 0,1 мМ BrdU. Пластина клеток в 2 х 10 5 клеток / блюдо в покрытые желатином 3,5 см со стеклянным дном посуды для наблюдения с помощью микроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокоить клетки после покрытия по крайней мере 24 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С.
    15. День 3, ЧаNGe средние 24 часа после нанесения покрытия, чтобы DMEM / MEM, содержащей 5% FBS, P / S и 0,1 мМ BrdU.
    16. День 4, Изменение средних 48 часов после посева в DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.
      Примечание: изменение среднего каждые 2-3 дня с DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.

2. Лентивирусов трансдукции

  1. Упаковка лентивирусных плазмид
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к другим источникам для дальнейшего углубленного информации по этому вопросу 24-26. Это займет около 3 дней, чтобы подготовить лентивирусного решение. Лучше всего использовать свежий раствор лентивирусов для достижения более высокой эффективности трансдукции. Начните упаковку лентивирусных плазмид и изоляции крыс неонатальных кардиомиоцитов в параллельном режиме. Вместо того чтобы использовать полиэтиленимин (PEI) 27 для упаковки лентивирусов плазмид, коммерчески доступный реагент трансфекции может быть использован. Следуйте инструкциям производителя.
    1. Подготовка реагентов и инструментов; НЕККлетки 293Т, 10 см пластиковые клеточных культур блюда, лентивирусные решения плазмиды (pMDLg / pRRE, PRSV-Rev, pMD2.G, лентивирусный векторные передачи, 1,0 мг / мл каждая), 1 г / л PEI, сыворотки среде, 20 мМ хлорохин в воде, 10% отбеливателя, 1% SDS в 70% этанола
    2. День 0, плиты 2-2,5 х 10 6 НЕК 293Т клеток на 10 см блюдо накануне трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 30-60% слияния в трансфекции является оптимальным.
    3. День 1, Подготовка PEI трансфекции решение. Добавить 30 мкл 1 г / л PEI в 960 мкл бессывороточной среды в 1,5 мл трубки. Добавить 4 плазмиды в трансфекции решения PEI в 1,5 мл трубки, и смешать с отводом.
    Название плазмиды Примечание Размер (кб) Объем добавлено (мл) Окончательная сумма в 10 см блюдо (мг) Конечная концентрация в 10 см блюдо (PM)
    Лентивирусов вектор переноса кодирует ген должен быть упакован 9-13 3.6-5.2 3.6-5.2 60
    pMDLg / pRRE выражает ВИЧ-1 GAG / POL 8.8 1.76 1.76 30
    PRSV-Версия выражает ВИЧ-1 REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G выражает VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    Таблица 2:. Количество плазмид для упаковки лентивирусов использовать эти суммы для трансфекции плазмиды клеток НЕК293 в 10 см чашки. Итоговый объем лентивирусным вектора переноса за блюдо может отличаться в зависимости от его размера, поддерживать конечной концентрации за блюдо при 60 мкМ. Средний молекулярный вес от одной базовой пары двухцепочечной ДНК 660 дальтон.

    1. Утилизировать старые средуот 10 см блюдо из HEK 293Т и осторожно добавить 9 мл новой среде (DMEM + 10% FBS, без P / S).
    2. Добавить смесь PEI-ДНК мягко каплям на тарелку и нежно вихревой смешать со средой. Добавить 10 мкл 20 мМ хлорохина (конечная 20 мкМ) в 10 мл среды. Примечание: Хлорохин, как полагают, уменьшают деградацию плазмиды, содержащие трансфекции комплексов через частичной нейтрализации рН в пределах лизосомальных отсеков 28.
    3. Выдержите в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение 6 часов. Затем удалить среду, содержащую смесь PEI-ДНК и добавляют 10 мл новой среде (DMEM + 10% FBS + 20 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислоту (HEPES), рН 7,4 + P / S) . ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации вируса будет производиться в среде. Аспирационные Пипетки Пастера и / или советы должны быть подвергнуты дезактивации на 10% отбеливателя. Всегда обеззараживания биологической безопасности поверхность шкафа и потенциально загрязненное оборудование с 70% этанола независимо от того, была пролита супернатантили нет. Если разлив произошел, тщательное обеззараживание с 1% SDS в 70% этанола необходимо.
    4. 2-3 день, инкубировать в СО 2-инкубатор при 37 ˚ С в течение 48-72 часов. День 4, собирать лентивирусов решение (продолжать разделе 2.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средний могут быть изменены в 48 часов после трансфекции. Сбор Вирус супернатант 48 часов и 72 часа в два раза может достичь для получения более высокого титра вируса решения.
  2. Коллекция решения лентивирусным и трансдукции
    1. Подготовка реагента и инструменты: 15 мл конические пробирки, 1 М HEPES, рН 7,4 (0,22 мкм фильтруется)
    2. День 4, Сбор супернатант, содержащий частицы лентивирусов (лентивирусов раствор) 10 мл стерилизованной Luer-Lok шприц, затем фильтруют супернатанта через 0,45 мкм фильтр в 15 мл коническую пробирку. Добавить 1/100 объема 1 М HEPES рН 7,4 до отфильтрованного раствора лентивирусов (конечная 10 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фильтрации, используйте только целлюлозы тузТейт или полиэфирсульфона (PES) (связывание низким содержанием белка) фильтры. Не используйте нитроцеллюлозных фильтров. Нитроцеллюлозы связывает поверхностные белки на лентивирусным конверт и разрушает вирус.
    3. Удалите среду от 3,5 см чашки крысы неонатальных кардиомиоцитов, полученных на последнем шаге разделе 1.2, добавить 1 мл фильтрованной лентивирусным решения 3.5 см блюдо.
    4. <optional> Добавить гексадиметрин бромид (конечная концентрация 4-6 мкг / мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: гексадиметрин бромид может повысить лентивирусов эффективность трансдукции. Концентрация гексадиметрин бромид должны быть оптимизированы.
    5. Выдержите блюдо для 6 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение лентивирусным трансдукции, а затем изменить среду, чтобы новый DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S. Выдержите блюдо в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интеграция экзогенного гена в геном хозяина по лентивирус считается, будет завершена к 72 часов.
    6. День 7, использовать клетки от шага 2.2.5 для следующего шага. Примечание: Белки выражение из лентивирусов плазмиды может быть подтверждено WB или иммуноцитохимии (ICH) после 48-72 часов трансдукции, чтобы определить относительный уровень экспрессии (фиг.1А и 1В).
  3. Концентрация лентивирусным решения
    Примечание: Лучше всего использовать свежий раствор лентивирусов, чтобы достичь наивысшую эффективность трансдукции, в случае, лентивирусов решение титр не достаточно высока, лентивирусов раствор может быть сконцентрирован полиэтиленгликоль (ПЭГ) осадков 29.
    1. Приготовление раствора 4x ПЭГ (32% ПЭГ6000, 400 мМ хлорида натрия (NaCl), 40 мМ HEPES рН 7,4)
      1. Для 125 мл раствора ПЭГ 4x, взвешивают 40 г ПЭГ6000, затем растворить его в 60 мл воды.
        Примечание: Примечание: (. Т.е. средняя молекулярная масса составляет 6000 ПЭГ6000) после ПЭГ число средняя молекулярная масса
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.1.2) Медленно добавляют 10 мл5 М NaCl. Медленно добавьте 5 мл 1 М HEPES рН 7,4. Регулировка рН до 7,4 с помощью 2 М гидроксида натрия.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.1.3) Добавьте воду до 125 мл. Стерилизация 4x раствора ПЭГ мембранной фильтрацией с 0,22 мкм фильтр и хранить его при температуре 4 ˚ С.
    2. Лентивирус концентрация
      1. Фильтр лентивирусов трансдуцированных супернатант в новую пробирку на 50 мл с помощью 0,45 мкм фильтра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.2) Добавить решение 4x Peg 1:03 соотношение (раствор ПЭГ: супернатант = 1:3). Хранить при температуре 4 ˚ С в течение 16-48 часов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.3) Центрифуга при 2600 х г при 4 ˚ С в течение 30 мин. Удалите супернатант и центрифуги в 2600 х г при 4 ˚ C в течение 5 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.4) Удалите супернатант осторожно, чтобы не нарушая гранул. Повторное приостановить гранул в бессывороточной среде с использованием 1/2 до 1/25 объема от первоначального объема надосадочной жидкости.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.5) Используйте прямо или заморозить с помощью жидкого азота затем сохранить при -80 ˚ C

3. Аденовирусной трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к другим источникам для методов построения и распространения аденовирусных конструкций 13. Аспирационные Пипетки Пастера и / или советы должны быть подвергнуты дезактивации на 10% отбеливателя. Всегда обеззараживания биологической безопасности поверхность шкафа и потенциально загрязненное оборудование с 70% этанола независимо от того, была пролита супернатант. Если разлив произошел, тщательное обеззараживание с 1% SDS в 70% этанола необходимо.

  1. Аденовирусный титрования на 50% тканевой культуры инфекционного дозы (TCID 50)
    Примечание: Перед трансдукции, необходимо, чтобы титровать аденовирусный маточного раствора. ТцД 50 является одним из лучших методов для титрования вируса решение. Поскольку метод оценивает титр инфекционным мощностью до НЕК 293Т, рассчитанной тцД 50 отражает фактическое infectability аденовируса складе. ОРП (бляшкообразующих униTS) пропорциональна TCID 50 с коэффициентом около 0,56 30.
    1. Подготовка клетки и инструменты: НЕК 293Т, 10 см клеточных культур блюда, 96-а плоским дном культуры клеток плиты, 8-канальный мульти пипеток
    2. Подготовьте 70-90% сливной НЕК 293Т в одном 10 см блюдо.
    3. Выполните предварительный разбавление 1/10 4 вируса складе. Добавить 50 мкл DMEM + 10% FBS в каждую лунку 96-луночного плоским дном для культуры клеток пластины. Добавьте 25 мкл предварительно разбавленной вируса складе в первом ряду, от А до Я.
    4. Хорошо перемешать и перенести 25 мкл из первой строки скважин на второй строке с 8-канальной пипетки несколькими. Повторите разведение на 1/3 вирусной решения каждой строке скважин, вплоть до 11-й строки и отбросить последние 25 ул.
    5. Triturate НЕК клетки 293Т в 10 мл DMEM + 10% FBS. Добавить 50 мкл раствора клеток в каждую лунку от строк с 1 по 12.
    6. Инкубируйте клетки при 37 ˚ С в СО2-инкубаторе для 11-13 дней. Добавить 50 мкл DMEM + 10% FBS через 4-5 дней и 7-8 дней обшивки.
    7. Измерьте цитопатические эффекты в каждую лунку по 11-13 дней после заражения.
    переулок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Ряд г г г г г г г г г
    Ряд B г г г г г г г г г
    Ряд C г г г г г г г г г
    Ряд D г г г г г г г
    Ряд E г г г г г г г г г г г
    Ряд F г г г г г г г
    Ряд G г г г г г г г г
    Ряд Н г г г г г г г г г г г
    количество положительных лунок в каждом ряду 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    соотношение положительных лунок в каждом ряду 1 1 1 1 1 1 1 0,75 0.63 0.25 0.25 0
    г Показано более 50% цитопатических эффектов
    Показано под 50% или не цитопатических эффектов

    Дорожка 1, разбавление 3 1 4 x10; дорожка 2, разбавление 3 2 x10 4; ...; полоса 11, разбавление 3 2 x10 11; , д. 12, контроль.
    S = сумме соотношения положительных лунок в каждом ряду
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,75 +0,63 +0,25 +0,25 +0 = 8,875
    ТцД 50 = 3 х 10 4 х 3 х (8.875-0.5) = 2,97 х 10 8
    ТцД 50 / мл = 5,94 х 10 9

    Таблица 3: Пример зараженного 96 хорошо пластины после 10 дней инкубации измерить цитопатические эффекты в каждую лунку и подвести соотношения положительных скважин в ряду..

    1. Рассчитать титр по формуле Kaerber в
    2. ТцД 50 = (разбавление первой полосе) х (разведение) (S-0.5)
    3. S = сумме соотношения положительных лунок в каждом ряду
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола, тцД 50 = (30000) х (3) (S-0.5). Поскольку 50 мкл вирусного раствора используется в данном протоколе, разделить TCID 50 на 0,05 рассчитать TCID 50 / мл.
  2. Аденовирусной трансдукции
    1. Рассчитать необходимое количество аденовирусного раствора от его титра (PFU / мл, вирусной частицы / мл или TCID 50 / мл). Используйте формулу для расчета МВД (множественность заражения).
    2. EM> [Место Таблица 4 здесь]
    3. Добавить расчетное количество раствора вируса в бессывороточной среде (см. таблицу 5). Все хорошо перемешать и выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре.
    4. EM> [Место Таблица 5 здесь]
    5. День7 возьми блюдо, полученное на последнем шаге раздела 2.2, и заменить среду с 750 мкл нового DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение среднего объемав трансдукции до примерно 50% от первоначального объема является критическим для высокой эффективностью трансдукции.
    6. Добавить разбавленный вируса решение блюдо. Выдержите блюдо для 4-8 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С. Затем вместо свежей средой.
    7. Выдержите блюдо для 24-48 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ˚ С. В день 8-9, использовать клетки для эксперимента изображений живых клеток. Примечание: Белки выражение из аденовирусного плазмиды может быть подтверждено WB или ICH после 24-48 часов трансдукции, чтобы определить относительную уровень экспрессии белка (фиг. 1с и 1d).

4. Изображений живых клеток

  1. Получение изображений с помощью конфокальной вращающийся диск микроскоп с контролируемой температурой камеры и экологической системы CO 2 (необязательно)
    1. Включите систему контроля температуры по крайней мере 1 часа до приобретения, так что все устройства в равновесие до 37 ˚ С до начала приобретения. Включите confocаль спиннинг диск микроскопа системы (ПК для работы, микроскоп, вращающийся диск блок, ПЗС-камеры, лазеры, флуоресцентный источник света, нормальный источник света, моторизованный этап и автоматические жалюзи).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более 1 час необходимо добиться полного уравновешивания температуры всех устройств.
    2. Изменение среды в 3,5 см со стеклянным дном блюд до нужной среды для приобретения, если это необходимо. Место блюдо на сцене конфокальной спиннинг диска микроскопа в контролируемой температурой камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с сферической аберрации для оптимального наблюдения с помощью микроскопа использованием 3,5 см со стеклянным дном блюдо с п. 1.5 покровного стекла (около 0.16-0.19 мм толщины) идеально подходит. Если цель используется имеет коррекции воротник, изображения, полученные с покровными стеклами толщиной более 0,17 мм может быть скорректировано. Кроме того, Фенол красный имеет небольшой флуоресценции. Иногда желательно использовать фенол красный свободный среду, такую ​​как DMEM без фенолового красного. Если нет устройство для контроля CO 2 независимых среднего или среднего буферизируются HEPES для долгосрочного покадровой обработки изображений.
    3. Выберите оптический путь окуляров.
    4. Поверните заслонку светлого поля источника света на. Настройте фокус с клетками под микроскопом через окуляры. Поверните затвор для светлого поля источника света офф.
    5. Поверните затвор для флуоресцентного источника света на. Найти клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки под микроскопом через окуляры. Поверните затвор для флуоресцентного источника света офф.
    6. Дополнительно> Нажмите кнопку активации для совершенной системы фокусировки перед микроскопом, чтобы включить совершенную систему фокусировки на, чтобы сохранить фокус устойчивый при приобретении покадровой.
    7. Измените путь света к вращающимся диском конфокальной микроскопии. Изменение настроек для приобретения надлежащим с помощью программного обеспечения, проверка изображения ДИСПЛЕЙYED на экране. (Например, Focus, мощность лазера, время экспозиции, ПЗС усиления камеры и вне набора)
    8. Установить настройки для флуоресцентного получения изображений с помощью операционной программного обеспечения. Пример: Выберите "Изменить каналы с использованием световых путей» и «Канал 1: EGFP" приобрести флуоресцентный сигнал от EGFP для одного канала.
    9. Установите частоту между временных точках по настройке параметров покадровой, чтобы принять покадровой изображения с помощью программного обеспечения. Пример: на приобретение одной временной точке каждые 5 минут, выберите "Минут на временной точке" из выпадающего меню и введите 5 в поле ввода текста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите "максимальной скорости", чтобы сделать фильм по фактической скорости. Если выражение флуоресцентного белка низкий, флуоресценция может быстро отбелить во время сбора покадровой. В этом случае лучше уменьшить количество сбора временных точках.
    10. Запустите приобретение покадровой, нажав кнопку "STAКнопка RT ", чтобы приобрести последовательность изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше не использовать функцию сбора несколько-очков. Это может привести к потере фокуса или движения области изображения во время покадровой обработки изображений.
  2. Анализ полученных изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приобрел изображения могут быть воспроизведены в видеофайл и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа.
    1. Выберите полученные изображения, которые будут включены в кино. При необходимости, на полях области интереса со стороны образов и выберите интересные моменты времени, чтобы уменьшить размер файла фильма с помощью программного обеспечения.
    2. Экспорт изображений в виде файла фильма в AVI или в формате MOV. Выберите формат фильма из "Формат" в раскрывающемся меню и сроках, необходимых для готового фильма, затем нажмите кнопку "Экспорт". ПРИМЕЧАНИЕ: покадровой изображения, полученные на одном временной точке каждые 5 минут можно воспроизводить как фильм частотой 10 кадров в секунду, что в 3000 раз быстрее, чем его фактической скорости.
  3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать технику, лентивирус кодирования EGFP (усиливается зеленый флуоресцентный белок) с метками Сх43 (коннексина 43) или мутировал Сх43 32 был использован, чтобы выразить EGFP с метками белков в клетках и кодировку аденовируса FGFR1DN (фактор роста фибробластов рецептора 1 доминирующим негативное ) был использован, чтобы закрыть FGF сигнализации в клетке 33-35. Через три дня после выделения кардиомиоцитов, выделенные кардиомиоциты были трансдуцированных лентивирусов, чтобы выразить EGFP-меченных белков в клетках. Затем после 3 дней лентивирусов трансдукции, выделенные кардиомиоциты были дополнительно трансдуцированных кодирования аденовируса FGFR1DN устранения FGF сигналов в клетках. После того достаточно времени для клеток, чтобы выразить Трансдуцированные экзогенных генов, конфокальной вращающийся диск микроскоп был использован для захвата изображения живых клеток. Приобретенные изображения воспроизводятся как видеофайл и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Для получения более подробной представленийными результатами см. Sakurai соавт 32.

Выражение EGFP меченных белков следующее лентивирусов трансдукции была подтверждена с помощью конфокальной микроскопии вращающийся диск 72 ч следующее лентивирусов трансдукции фиг.1А-B. Выражение FGFR1DN по аденовирусной трансдукции было подтверждено ВБ и МУС после 24 часов аденовирусной трансдукции рисунках 1С-D. Время аденовирусной дополнение к 3,5 см чашки была определена как момент времени 0 и покадровой изображения были получены с 0,9 объектива 40х воздух НС каждые 5 мин в течение 6 ч с использованием камеры нагреватель, чтобы поддерживать температуру при 37 ˚ С. Покадровой изображения EGFP с метками белков в первичных кардиомиоцитов, принятых с помощью конфокальной микроскопии вращающемся диске представлены в Дополнительных Фильмы 1-2.

В случаях, когда температура равновесия не была адекватной, или режим с несколькими приобретение не функционировал должным образом,Снимки, сделанные, возможно, двигаться в плоскости Справочная Movie 1. Однако, когда работает должным образом на систему автофокусировки стабильно поддерживается фокусировки и этого не произошло. Как показано на Дополнительного Movie 2, когда температура равновесия соответствовал и только один интерес область была приобретена, изображения, отснятые имеют очень высокое качество.

Избиение кардиомиоцитов оценивали после долгосрочного покадровой визуализации живых клеток в целях подтверждения жизнеспособности клеток. Даже после 16 часов из покадровой визуализации EGFP выражающих кардиомиоцитов сохранили свои функциональные свойства и избили ритмично Справочная кино 3.

Рисунок 1
Рисунок 1. Подтверждение экспрессии белка следующее лентивирусов или аденовирусной трансдукции. (), изолированных крыс неонатальные кардиомиоциты, выражающие Cx43-WT-EGFP трансдуцировали Ad-FGFR1DN через 3 дня после трансдукции. См. также Дополнительного Movie 1. (В) Изолированные крысы неонатальные кардиомиоциты, выражающие Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP трансдуцировали Ad-FGFR1DN через 3 дня после трансдукции. См. также Справочная Фильм 2. (С) Белки выражение, следующее аденовирусной трансдукции, обнаруженного МТП 24 ​​часа после трансдукции. Гемагглютинина (HA) белок-меченый FGFR1DN был обнаружен анти-HA антитела с использованием обычных методов ICC, альфа-актинин был использован в качестве маркера кардиомиоцитов. (D) Экспрессия белка FGFR1DN следующее аденовирусной трансдукции, обнаруженного WB 24 часа после трансдукции. HA-меткой FGFR1DN был обнаружен анти-HA антитела ВБ, бета-тубулина использовали в качестве контроля загрузки.

Справочная Фильм 1. Покадровый визуализации изолированных крыс новорожденных автомобиля diomyocytes выражающие Cx43-WT-EGFP трансдуцировали Ad-FGFR1DN. Временные покадровой изображения были получены с 40x объектива каждые 5 мин в течение 6 часов с конфокальной спиннинг диска микроскопом. Приобретенные изображения были воспроизведены в виде фильма на 10 кадров в сек. Этот фильм был изменен от Sakurai и др. 32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

Справочная Фильм 2. Покадровый визуализации изолированных крыс неонатальных кардиомиоцитов, выражающих Cx43-S325/328/330E-EGFP трансдуцировали Ad-FGFR1DN. Временные покадровой изображения были получены с 40x объектива каждые 5 минут в течение 6 часов с конфокальной спиннинг диска микроскопа. Приобретенные изображения были воспроизведены в виде фильма на 10 кадров в сек. Этот фильм был изменен от Sakurai и др. 32."Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

Справочная Фильм 3. Покадровый визуализации изолированных крыс неонатальных кардиомиоцитов воспроизводиться по фактической скорости. Эти покадровой образы изолированных крыс неонатальных кардиомиоцитов, выражающих Cx43-EGFP трансдуцировали Ad-FGFR1DN были приобретены с 40x объектива каждые 200 мс для 10 сек с конфокальной спиннинг диска микроскопом следующем 16 часов приобретения покадровой. Приобретенные изображения были воспроизведены в виде фильма на 5 кадров в сек при фактической скорости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Первичные кардиомиоциты, выделенные из новорожденных крыс уже давно используются для изучения функций кардиомиоцитов в пробирке. Этот протокол описывает способ выделения неонатальных кардиомиоцитов из крысят с использованием двухэтапный метод фермент пищеварение, сначала переваривания с трипсина O / N при 4 ° С, а затем очищенную коллагеназы. Одним из преимуществ использования очищенной коллагеназы шаг в том, что то же самое класс фермента используется для всех выделений. Таким образом, качество и количество изолированных клеток согласуется от эксперимента к эксперименту.

Учитывая более высокие эффективность трансдукции, связанные с аденовирусом, если высокая эффективность трансдукции клеточной культуры необходимо для данного эксперимента, то лучше использовать аденовирус. Однако, если высокие уровни трансдукции не нужны, вектор лентивирусов может быть использован. Имея возможность использовать либо аденовирусные или лентивирусов облегчает добиться подходящей TRANSDед ен ие и выражения уровней для различных типов генов. Если интенсивность флуоресценции детектируется изображений живых клеток с помощью конфокальной микроскопии спиннинг диска или МУС является очень низким после лентивирусным трансдукции, используя другой лентивирусов вектор-переносчик, который использует другую промотор для экспрессии гена интереса может решить эту проблему. С аденовирусных векторов, если группа обнаружена ВБ слаб после аденовирусной трансдукции, это может указывать на низкий титр вирусной акции. В этом случае, лучше готовить более высокий титр раствора аденовируса при распространении в клетках перед переходом.

Одним из ограничений этого метода является то, что выход из изолированных жизнеспособных кардиомиоцитов не очень согласуется от эксперимента к эксперименту, даже при использовании очищенной коллагеназы. Для того чтобы выполнить воспроизводимые эксперименты изображений лучше всего рассчитывать жизнеспособных клеток после выбора отдельных кардиомиоцитов в надосадочной жидкости на этапе 1.2.13. в разделе протокола. Затем себеред кардиомиоцитов на стеклянным дном блюда на различных разведениях. Как только клетки присоединены, выберите блюда с соответствующей концентрации клеток для эксперимента планировалось.

Есть много преимуществ использования неонатальных кардиомиоцитов, но есть и некоторые недостатки. Основным недостатком является их четкое различие от взрослых кардиомиоцитов. Полностью дифференцированных взрослых кардиомиоциты стержень-форма и отдельные первичные взрослых кардиомиоциты поддерживать их стержнеобразную морфологию, в то время как изолированные первичные неонатальные кардиомиоциты распространяться во всех направлениях 36. Фенотипические различия между изолированной новорожденных и взрослых кардиомиоцитов также отражены в их характере экспрессии генов 37. Таким образом, для экспериментов, в которых требуются дифференцированные кардиомиоциты, протокол для выделения взрослых кардиомиоцитов будут необходимы 4.

Используя аденовирусной и лентивирусов трансдукции рекомбинантногобелки в первичных крысиных неонатальных кардиомиоцитов в сочетании с конфокальной спиннинг диска микроскопии позволяет анализировать функции белков в культивируемых живых первичных клеток. По сравнению с существующими методами, которые используют трансфекцию ввести интересующий ген в клетки, существенным преимуществом этого протокола является то, что аденовирусы и лентивирусы очень эффективно поглощается клетками в результате к экспрессии интересующего гена в почти всех клеток в культура. Кроме того, использование двух различных типов вирусов для экспрессии гена облегчает достижение соответствующих ставок трансдукции и уровни экспрессии для нескольких генов. миРНК и химические агонисты и антагонисты могут быть также использованы в данной системе для дальнейшего возмущать и анализировать функции генов и белков они кодируют.

Подготовка сердцах является чрезвычайно важным шагом в протоколе. Удалить сердца из организма как можно быстрее. Обязательноположить их на лед сразу, чтобы держать сотовый высокую жизнеспособность. Еще одним важным шагом является подготовка высококачественных и титра, лентивирусных / аденовирусная запасов. Если низкое качество вирусные штаммы используются, трансдукции и экспрессии уровни интересующего гена будет низким. Таким образом, они не могут быть пригодны для визуальных исследований.

Важным будущее применение этого метода будет его "использование в кардиомиоциты мыши. Тестирование Экспериментальные исследования ли этот метод может быть использован для изоляции мыши неонатальных кардиомиоцитов дали многообещающие результаты. Из-за относительно небольшого размера мыши сердца по сравнению с теми крыс, меньше ткани получают первоначально. Таким образом, меньшее количество клетки выделяют в одной процедуры с использованием той же количество животных, но просто с помощью больше мышей для изоляции должно устранить это препятствие. Возможность изолировать кардиомиоцитов мыши позволяет исследователям исследовать функции клеток, выделенных из генетически модифицированных млед (трансгенных, нокаут, нокаут в), которые были произведены с целью изучения особую форму интересующего гена.

Одним из основных препятствий на сердечно-сосудистых исследований были трудности, связанные с расследованием экспрессию и функцию данного гена, выраженного в ткани сердца в естественных условиях в реальном времени. Однако способность выделить функциональные избиение кардиомиоцитов, модулировать клеточные функции, используя вирусную трансдукцию, а затем изучить их в реальном времени с помощью конфокальной вращающийся диск микроскоп помогает пролить свет на роль кардиомиоцитов в естественных условиях и преодолеть этот разрыв. Этот метод обеспечивает упрощенную систему для понимания функции кардиомиоцитов на клеточном уровне. Это позволяет в режиме реального анализа времени, как возмущения в экспрессии генов изменяют функции кардиомиоцитов. Живая клетка изображений кардиомиоцитов обеспечит более полное представление о функции кардиомиоцитов. Такие идеи приведет к достижениям в основной cardiovasculaг исследования, в результате новых методов лечения для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31, (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28, (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79, (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32, (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63, (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62, (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. 264-573 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics