Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía

Biology

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Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

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Abstract

Primarios de rata cardiomiocitos neonatales son útiles en básica en la investigación cardiovascular in vitro, ya que pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades en un único procedimiento. Debido a los avances en la tecnología de microscopio que es relativamente fácil de capturar imágenes de células vivas con el fin de investigar los eventos celulares en tiempo real con una mínima preocupación con respecto a la fototoxicidad a las células. Este protocolo se describe cómo tomar imágenes timelapse células vivas de rata primaria cardiomiocitos neonatales con un microscopio confocal de disco giratorio tras la transducción lentiviral y adenoviral para modular las propiedades de la célula. La aplicación de dos tipos diferentes de virus hace que sea más fácil de conseguir que la tasa de expresión y la transducción de los niveles adecuados de dos genes diferentes. Imágenes de células vivas bien enfocadas pueden ser obtenidos usando el sistema de enfoque automático del microscopio, que mantiene el enfoque estable durante largos períodos de tiempo. La aplicación de este método, las funciones del ingeniero exógenamenteproteínas ed expresadas en células primarias cultivadas pueden ser analizados. Además, este sistema puede ser usado para examinar las funciones de los genes a través del uso de siRNAs, así como de los moduladores químicos.

Introduction

De rata cardiomiocitos neonatales primarios han sido utilizados para investigar la función de los cardiomiocitos in vitro 1. Son fáciles de aislar de las crías de rata por varios métodos bien establecidos 2-4. El método más común emplea colagenasa o tripsina para digerir tejido conectivo del corazón antes del aislamiento celular. Los investigadores también han desarrollado métodos para aislar los cardiomiocitos de los roedores adultos 5-8, así como los ratones neonatales 9,10.

Este protocolo describe un método para el aislamiento de cardiomiocitos a partir de crías de rata neonatales, el empleo de un procedimiento de digestión de la enzima de dos pasos. La tripsina se utilizó por primera vez O / N a 4 ° C, y luego colagenasa purificada a 37 º C. La incubación del tejido del corazón con tripsina O / N a 4 ° C reduce las medidas necesarias para las células de la cosecha en comparación con los métodos que utilizan las incubaciones secuenciales en una solución de enzima caliente 2. Además, mediante el uso de co purificadallagenase en lugar de las enzimas del crudo, la variabilidad de lote a lote puede ser eliminado, lo que proporciona una mayor reproducibilidad.

Los estudios funcionales de una proteína particular, a menudo emplean un sistema de expresión de proteínas utilizando un adenovirus 11-13 y / o un lentivirus 14-16. [NOTA DE ADVERTENCIA] La producción viral y la manipulación deben llevarse a cabo de acuerdo con las directrices del NIH.

El adenovirus no se integra en el genoma del huésped. Tiene una muy alta eficiencia de transducción en la mayoría de tipos de células, incluyendo células que se dividen y células que no se dividen, así como células primarias y líneas celulares establecidas. Esto hace que el adenovirus de un vector fiable para la expresión génica. Los altos niveles de la proteína codificada por el vector de adenovirus se desarrollan dentro de 48 horas después de la transducción, y pueden durar varias semanas 17. Sin embargo, un inconveniente a la utilización de un adenovirus para la expresión de proteínas es que el desarrollo de un ADE recombinantenovirus es complicado y lleva mucho tiempo. Este inconveniente se explica en parte por qué muchos investigadores han acudido a los lentivirus para la expresión de genes recombinantes. A diferencia de las construcciones adenovirales, generando un constructo lentiviral que es rápida y fácil. Aunque lentivirus generalmente tienen una menor eficiencia de la transducción de adenovirus que, en ambas células que se dividen y que no se dividen, que no integrarse en el genoma del huésped. En consecuencia, la expresión del gen transducido es más estable para los lentivirus que para adenovirus.

Debido a los avances tecnológicos en el campo de la microscopía, es mucho más fácil para capturar imágenes de células vivas de las células que expresan proteínas recombinantes. Esto es cierto incluso a velocidades de tasa de vídeo de adquisición. Esto permite que el investigador para determinar cómo las alteraciones particulares en la proteína de interés funcionalmente impactan la célula en tiempo real. El microscopio confocal de disco giratorio tiene varias características clave que hacen que sea una técnica óptima para livde formación de imágenes e celular 18,19. El disco giratorio Yokogawa permite la adquisición de imágenes mucho más rápido, mientras que al mismo tiempo la utilización de mucha menos energía de láser que los microscopios confocales de barrido punto. Ambas características especiales se deben a la disco giratorio, que contiene numerosos agujeros confocal a través del cual el láser pasa simultáneamente a las muestras. Durante la adquisición, el propio disco gira rápida y continuamente 18-20. Al utilizar el sistema de enfoque automático del microscopio, el enfoque estable se mantiene durante largos períodos de tiempo. Esto permite a los investigadores a tomar imágenes de células vivas bien enfocadas. Las imágenes adquiridas se reproducen como un archivo de película. Las imágenes se analizaron utilizando el software de análisis de imágenes, tales como ImageJ 21,22, FIYI 23, u otro software disponible comercialmente.

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Protocol

1. Aislamiento de cardiomiocitos neonatales de rata

  1. Utilice medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) y penicilina / estreptomicina (P / S) como el medio de cultivo. Añadir bromodesoxiuridina (BrdU) al medio para prevenir el crecimiento de fibroblastos durante los primeros 2 días después del aislamiento.
Medio base FBS BrdU (mM) P / S (U / ml)
selección DMEM 10% 0 20
El primer día DMEM 10% 0.1 10
Al día siguiente DMEM / MEM 5% 0.1 10
Además cultura DMEM / MEM 5% 0 10

Tabla 1:. Medio para ratas cardiomiocitos neonatales Utilizar este medio para el cultivo de cardiomiocitos de ratas neonatales. DMEM / MEM es una mezcla 1:1 de DMEM y medio MEM.

  1. El aislamiento de los cardiomiocitos, Día 1 (tiempo requerido estimado, alrededor de 1 hora)
    NOTA: Para el trabajo con los roedores neonatales, consultar las guías universitarias locales y las normas establecidas por los programas de cuidado de los animales, y se adhieren a los animales protocolos aprobados institucionalmente. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité del Centro de Recursos Animales de Yale Institucional Cuidado de Animales y el uso.
    1. Preparar los reactivos y herramientas: solución salina equilibrada de calcio y magnesio, libre de Hank (HBSS CMF), 30 ml x 2, 10 ml x 2, en hielo; 1 mg de tripsina, se reconstituye con 2 ml de HBSS CMF, en el hielo; herramientas en autoclave; 70% de etanol (EtOH) en 250 ml vaso de precipitados; cuatro esterilizar placas de plástico de 10 cm, tres para el aislamiento de corazones y uno para tripsinización.
    2. Orden 1 litter de crías de rata de 1 a 2 días de edad (unos 10 cachorros) con su presa de un distribuidor de animales de experimentación.
    3. Día 1, Transfer cachorros a pequeña jaula y eutanasia presa con un cóctel de ketamina / xilazina (ketamina, 200ml/10g y 20ml/10g xilazina) sobredosis.
    4. Tome una cría y esterilizar la totalidad de su cuerpo con EtOH al 70%. Decapita a las crías con tijeras quirúrgicas agudas en buen estado en un plato de plástico de 10 cm esterilizada en un lugar aislado de otros cachorros.
      NOTA: Con el fin de recoger las muestras tan pronto como sea posible, lo mejor es utilizar el método más rápido y eficaz para poner fin a la vida de los roedores. Decapitación cuando es utilizado por profesionales cualificados con equipo en buen estado puede resultar en menos temor y ansiedad para el animal y ser más rápido y práctico que otras formas de eutanasia. Es consistente con las recomendaciones de las Guías de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria para la Eutanasia de los Animales.
    5. Retire paliza que learte con herramientas esterilizadas, y poner el corazón en 30 ml de hielo enfriado CMF HBSS en 50 ml tubo cónico. NOTA: Quite el corazón lo más rápido posible y ponerlos en hielo inmediatamente. Después de quitar el corazón desde el cuerpo, todos los procedimientos se deben realizar en hielo.
    6. Recoger 5 corazones en 30 ml de hielo enfriado CMF HBSS y los 5 corazones restantes en otros 30 ml de hielo enfriado CMF HBSS. Agitar el tubo para enjuagar los corazones. NOTA: Después de este paso, realice todos los procedimientos en una campana de flujo laminar.
    7. Descartar el sobrenadante y transferir los corazones a una nueva fuente de plástico esterilizado 10 cm en el hielo. NOTA: Tenga cuidado de no aspirar los corazones con el aspirador.
    8. Retire los grandes vasos y / o tejidos no deseados. Añadir 10 ml de hielo enfriado CMF HBSS al plato para enjuagar los corazones.
    9. Transfiera todos los corazones a una nueva fuente de plástico esterilizado 10 cm en el hielo. Picar los corazones con tijeras a menos de 1 mm 3 en hielo.
    10. Añadir 9 ml de HBSS frío CMF. Añadir 1 ml de tripsina reconstituido refrigeradotuido con CMF HBSS (final de 50 ug / ml).
    11. Sellar la placa con parafilm y se cubre con papel de aluminio, luego se coloca en la cámara fría (4 ˚ C) durante la noche.
  2. El aislamiento de los cardiomiocitos, Día 2 (tiempo requerido estimado, alrededor de 4 horas)
    1. Preparar reactivos y herramientas: 50 ml cónico tubo x 2; 2 mg de inhibidor de tripsina, se reconstituye con 1 ml de HBSS CMF, en el hielo; 1.500 unidades de colagenasa, reconstituido con 5 ml de Leibovitz L-15, a temperatura ambiente (TA); Leibovitz L-15, se reconstituye con 1 litro de agua esterilizada y se filtra a través de un filtro de 0,22 micras, 8 ml a RT; 10 mg / ml (32,6 mM) de BrdU en agua; P / S; DMEM + 10% de FBS; MEM; dos placas de cultivo celular de plástico de 10 cm; Platos inferior 3,5 cm de vidrio.
    2. Día 2, Preparación de platos recubiertos con gelatina. Añadir 1 ml de solución de gelatina al 0,1% para recubrir un plato inferior 3,5 cm de vidrio para un experimento de formación de imágenes. Incubar los platos a 37 ˚ C durante varias horas, y luego aspirar y descartar la solución de gelatina antes de su uso.
      NOTE: Un plato inferior 3,5 cm de vidrio es adecuado para un experimento de formación de imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia. Para la extracción de proteínas a partir de cardiomiocitos primarios para detectar la expresión de proteínas por transferencia de Western (WB), se pueden usar 0,1% de gelatina recubiertas placas de plástico de cultivo de células.
    3. Transferir todo el tejido cardíaco digerido por la tripsina durante la noche con tampón a un tubo cónico de 50 ml en hielo en la campana esterilizada. Añadir 1 ml de inhibidor de tripsina en CMF HBSS (final de 182 ug / ml). Cierre la tapa del tubo cónico de 50 ml herméticamente para evitar la contaminación.
    4. Incubar el tubo durante unos 30 min en una incubadora a 37 ˚ C para calentar el tejido y el tampón de 30 a 37 ˚ C. Añadir 5 ml de colagenasa en Leibovitz L-15 (final de 94 unidades / ml). Se incuba a 37 ˚ C durante 45 minutos con agitación suave (170-200 rpm agitador en el 37 ˚ C incubadora).
      NOTA: Este paso se puede hacer fuera de la campana de flujo laminar. Todas las etapas posteriores se deben realizar a temperatura ambiente.
    5. Desinfectar el exterior de un tubo cónico de 50 ml con 70% de EtOH y poneren la campana esterilizada.
    6. Tejidos tritura utilizando una pipeta automática con pipeta a 3 ml / seg de velocidad de 20 veces. Permita que los residuos de tejido se asiente durante 3 min y filtrar el sobrenadante con un filtro de células de 70 um.
      NOTA: Un ml pipeta de tamaño regular 10 puede ser utilizado para la trituración.
    7. Añadir 5 ml de la Leibovitz L-15 a los grupos de tejidos restantes y el residuo se tritura y se filtra el sobrenadante de nuevo. Lavar filtro de células con 2 ml de la Leibovitz L-15.
    8. Coloque la solución celular filtrado en una campana durante 20 - 60 min para permitir la colagenasa para digerir el colágeno parcialmente degradado.
    9. Células sedimento en 100 x g durante 5 min. Volver a suspender las células en 20 ml de DMEM que contiene 10% de FBS y alta concentración de P / S (20 U / ml).
    10. Células Pre-placas en dos de plástico placas de cultivo celular de 10 cm durante 1 hora en CO 2 incubadora a 37 ˚ C para la selección de los cardiomiocitos. NOTA: Los fibroblastos se adhieren más fácilmente a la parte inferior del plato de cardiomiocitos.
    11. Whde espera Ile, preparar DMEM que contenía 10% de FBS, P / S (10 U / ml) y 0,1 mM de BrdU. Añadir 1 ml de 10 mg / ml de BrdU a 325 ml de DMEM que contenía FBS al 10% y P / S.
    12. Agitar suavemente platos y recoger el sobrenadante que contiene los cardiomiocitos a partir de dos placas de 10 cm.
      NOTA: La mayoría de los cardiomiocitos se seguirán flotando en el sobrenadante después de 1 h de incubación. Para evitar la contaminación con fibroblastos que están ligeramente unidas a la placa, no recoger el sobrenadante por pipeteo.
    13. Opcional> Contar las células en el sobrenadante con y sin 0,2% de azul de tripano para comprobar la viabilidad celular.
    14. Células sedimento en 100 x g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en DMEM que contiene 10% de SFB, P / S (10 U / ml) y 0,1 mM BrdU. Las células de placas a 2 x 10 5 células / placa en placas de fondo 3.5 cm de vidrio recubiertos de gelatina para la observación mediante el microscopio. NOTA: No perturbar las células después de la siembra durante al menos 24 horas en el incubador de CO2 a 37 ˚ C.
    15. Día 3, Change medianas 24 horas después de la siembra a DMEM / MEM que contiene 5% de FBS, P / S y 0,1 mM BrdU.
    16. Día 4, cambio de medio de 48 horas después de la siembra de DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S.
      NOTA: Cambie medio cada 2-3 días con DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S.

2. Transducción lentiviral

  1. Embalaje de plásmidos lentivirales
    NOTA: Por favor consulte otras fuentes para obtener más información en profundidad sobre este tema 24-26. Tomará cerca de 3 días para preparar la solución lentiviral. Lo mejor es utilizar la solución lentiviral fresca para lograr una mayor eficacia de la transducción. Inicie el embalaje de los plásmidos lentiviral y el aislamiento de los cardiomiocitos neonatales de rata en paralelo. En lugar de utilizar polietilenimina (PEI) 27 para el embalaje de los plásmidos lentiviral, un reactivo de transfección comercialmente disponible se puede utilizar. Siga las instrucciones del fabricante.
    1. Preparar reactivos y herramientas; HEK293T, 10 cm de plástico placas de cultivo celular, soluciones de plásmido lentiviral (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, vector lentiviral transferencia, 1,0 mg / ml cada una), 1 g / l de PEI, medio libre de suero, 20 mM cloroquina en el agua, el 10% del blanqueo, 1% SDS en EtOH al 70%
    2. Día 0, mural 2-2,5 x 10 6 células HEK 293T por placa de 10 cm el día antes de la transfección.
      NOTA: 30-60% de confluencia en la transfección es óptima.
    3. Día 1, Preparación de solución de transfección PEI. Añadir 30 ul de 1 g / l de PEI a 960 medio libre de suero ul en un tubo de 1,5 ml. Añadir 4 plásmidos en la solución de transfección PEI en el tubo de 1,5 ml, y mezclar con el tapping.
    Nombre del plásmido Nota Tamaño (kpb) más volumen (ml) Importe final en placa de 10 cm (mg) La concentración final en placa de 10 cm (pM)
    Vector de transferencia de Lentiviral gen codifica a ser empaquetado 9-13 03.06 a 05.02 03.06 a 05.02 60
    pMDLg / pRRE expresa el VIH-1 gag / pol 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-Rev expresa el VIH-1 REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G expresa G VSV 5.8 1.16 1.16 30

    Tabla 2:. La cantidad de plásmidos para embalaje lentiviral Utilice estas cantidades de plásmido a transfectar células HEK293 en placas de 10 cm. Importe final de vector lentiviral transferencia por plato puede ser diferente en función de su tamaño, mantener la concentración final por plato a 60 pM. Peso molecular medio de un par de bases de ADN de doble cadena es 660 daltons.

    1. Deseche medio viejode placa de 10 cm de células HEK 293T, y suavemente añadir 9 ml de nuevo medio (DMEM + 10% de FBS, sin P / S).
    2. Agregue la mezcla de PEI-DNA gota a gota con cuidado sobre el plato y mezcle suavemente para mezclar con el medio. Añadir 10 ul de cloroquina 20 mM (concentración final 20 uM) al medio de 10 ml. NOTA: La cloroquina se cree que reduce la degradación de los complejos de transfección que contienen el plásmido a través de la neutralización parcial del pH dentro de los compartimentos lisosomales 28.
    3. Incubar en CO 2 incubadora a 37 ˚ C durante 6 horas. A continuación, eliminar el medio que contiene la mezcla de PEI-ADN y añadir 10 ml de nuevo medio (DMEM + 10% de FBS + 20 mM de 4 - ácido (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), pH 7,4 + P / S) . NOTA: Después de la incubación, el virus se produce en el medio. Pipetas Pasteur de aspiración y / o consejos deben ser descontaminados en un 10% de lejía. Descontaminar siempre la superficie biológica cabina de seguridad y equipos que puedan estar contaminados con EtOH al 70%, independientemente de si se ha derramado líquido sobrenadanteo no. Si se ha producido el derrame, la descontaminación a fondo con 1% de SDS en 70% de EtOH es necesaria.
    4. Día 2-3, incubar en CO 2 incubadora a 37 ˚ C durante 48-72 horas. Día 4, recoge solución lentiviral (vaya a la Sección 2.2).
      NOTA: Medium se puede cambiar en 48 horas después de la transfección. Recopilación de sobrenadante de virus 48 horas y 72 horas en dos ocasiones puede alcanzar para obtener soluciones de virus título superior.
  2. Colección de solución y la transducción lentiviral
    1. Preparar reactivos y herramientas: 15 ml tubos cónicos, 1 M HEPES, pH 7.4 (0.22 um filtrada)
    2. Día 4, se recoge el sobrenadante que contiene partículas de lentivirus (solución lentiviral) con 10 ml esterilizados Luer-Lok jeringa, luego filtrar el sobrenadante a través de 0,45 um filtrar en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1/100 volumen de 1 M de HEPES pH 7,4 a la solución filtrada lentiviral (final de 10 mM).
      NOTA: Para el filtrado, utilice sólo el as de celulosatate o polietersulfona (PES) (baja unión a proteínas) Filtros. No utilice filtros de nitrocelulosa. La nitrocelulosa se une proteínas de superficie en el sobre lentiviral y destruye el virus.
    3. Retire medio de 3,5 cm de platos de rata cardiomiocitos neonatales, obtenidos en el último paso de la Sección 1.2, añadir 1 ml de solución lentiviral filtrado al plato 3,5 cm.
    4. <Opcional> Añadir bromuro de hexadimetrina (concentración final 4-6 ug / ml).
      NOTA: bromuro de hexadimetrina puede mejorar la eficacia de transducción lentiviral. La concentración de bromuro de hexadimetrina debe ser optimizado.
    5. Incubar plato durante 6 horas en el incubador de CO2 a 37 ˚ C para la transducción lentiviral, a continuación, cambiar a medio y nuevo DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S. Incubar plato de CO 2 incubadora a 37 ˚ C durante 3 días.
      NOTA: La integración del gen exógeno en el genoma del huésped por lentivirus se considera para ser completado por 72 hrs.
    6. Día 7, Usar células de la etapa 2.2.5 para el siguiente paso. NOTA: Expresión de proteínas a partir del plásmido lentiviral se puede confirmar por WB o inmunocitoquímica (ICH) después de 48-72 horas de transducción con el fin de determinar el nivel relativo de expresión (Figura 1a y 1b).
  3. Concentración de la solución lentiviral
    NOTA: Es mejor utilizar la solución lentiviral fresco con el fin de lograr mayores eficiencias de transducción, en caso de que la solución título lentiviral no es lo suficientemente alta, la solución lentiviral se puede concentrar por polietilenglicol (PEG) de precipitación 29.
    1. Preparación de la solución 4x PEG (PEG6000, cloruro de sodio 400 mM, 32% (NaCl), 40 mM de HEPES pH 7,4)
      1. Para 125 ml de solución PEG 4x, pesar 40 g de PEG6000, a continuación, se disuelven en 60 ml de agua.
        NOTA: NOTA: (. Es decir, peso molecular medio de PEG6000 es 6.000) El número después de PEG es el peso molecular medio
        NOTA: 2.3.1.2) Agregue lentamente 10 mlde 5 M de NaCl. Agregue lentamente 5 ml de 1 M HEPES, pH 7,4. Ajustar el pH a 7,4 utilizando hidróxido de sodio 2 M.
        NOTA: 2.3.1.3) Añadir agua hasta 125 ml. Esterilizar la solución PEG 4x por filtración de membrana con un filtro de 0,22 um y almacenarlo a 4 ˚ C.
    2. Concentración Lentivirus
      1. Filtro lentiviral transduced sobrenadante en un nuevo tubo de 50 ml utilizando un filtro de 0,45 um.
        NOTA: 2.3.2.2) Añadir la solución de 4x PEG 1:3 (solución de PEG: sobrenadante = 1:3). Almacenar a 4 ˚ C durante 16-48 horas.
        NOTA: 2.3.2.3) Se centrifuga a 2600 x g a 4 ˚ C durante 30 min. Desechar el sobrenadante y se centrifuga a 2600 x g a 4 ˚ C durante 5 min.
        NOTA: 2.3.2.4) Desechar el sobrenadante con cuidado para evitar perturbar el sedimento. Vuelva a suspender el pellet en medio libre de suero por medio de 1/2 a 1/25 volumen del volumen de sobrenadante inicial.
        NOTA: 2.3.2.5) Utilice directa o congelar con nitrógeno líquido y luego almacenar a -80 ˚ C

3. Transducción adenoviral

NOTA: Por favor consulte otras fuentes para los métodos para la construcción y propagación de construcciones adenovirales 13. Pipetas Pasteur de aspiración y / o consejos deben ser descontaminados en un 10% de lejía. Descontaminar siempre la superficie biológica cabina de seguridad y potencialmente contaminada equipos con EtOH al 70%, independientemente de si se ha derramado líquido sobrenadante. Si se ha producido el derrame, la descontaminación a fondo con 1% de SDS en 70% de EtOH es necesaria.

  1. Titulación Adenoviral en un 50% el cultivo de tejidos dosis infecciosas (TCID 50)
    NOTA: Antes de transducción, es necesario valorar la solución madre adenoviral. TCID 50 es uno de los mejores métodos para valorar la solución viral. Debido a que el método evalúa un título por una capacidad de infección a las células HEK 293T, calculado TCID50 refleja infectabilidad real de la acción adenovirus. La UFP (uni formadoras de placaTS) es proporcional a la TCID 50 con un factor de alrededor de 0,56 30.
    1. Preparar las células y herramientas: células HEK 293T, 10 cm de platos de cultivo celular de 96 pocillos de placas de cultivo celular de fondo plano, de múltiples pipeta de 8 canales
    2. Preparar el 70-90% de las células HEK 293T confluentes en una placa de 10 cm.
    3. Realizar una pre-dilución de 1/10 de 4 de las acciones de virus. Añadir 50 ul de DMEM + 10% de FBS a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano. Añadir 25 ul del stock de virus pre-diluido en la primera fila, de la A a la H.
    4. Mezclar bien y transferir 25 ul de la primera fila de pocillos de la segunda fila con una de múltiples pipeta de 8 canales. Repetir la dilución 1/3 de la solución viral para cada fila de pocillos hasta e incluyendo la fila 11 y descartar última 25 ul.
    5. Células 293T Se tritura HEK en 10 ml de DMEM + 10% de FBS. Añadir 50 ul de solución de células en cada pocillo de las filas 1 a 12.
    6. Se incuban las células a 37 ˚ C en la incubadora de CO2 durante 11-13 días. Añadir 50 ul de DMEM + 10% FBS después de 4-5 días y 7-8 días de chapado.
    7. Medir los efectos citopáticos en cada pocillo a 11 a 13 días después de la infección.
    carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Fila A d d d d d d d d d
    Fila B d d d d d d d d d
    Fila C d d d d d d d d d
    Fila D d d d d d d d
    Fila E d d d d d d d d d d d
    Fila F d d d d d d d
    La fila G d d d d d d d d
    Fila H d d d d d d d d d d d
    el número de pozos positivos por fila 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    la relación de los pocillos positivos por fila 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    d Viendo más del 50% efectos citopáticos
    Viendo menos de 50% o nada de efectos citopáticos

    Carril 1, 3 dilución 1 x10 4; carril 2, dilución 3 2 x10 4; ...; carril 11, dilución 3 2 x10 11; carril 12, de control.
    S = la suma de las proporciones de los pocillos positivos por fila
    = 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0 = 8.875
    TCID 50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875 a 0,5) = 2,97 x 10 8
    DICT 50 / ml = 5,94 x 10 9

    Tabla 3: Ejemplo de un infectado de 96 pocillos de la placa después de 10 días de incubación Medir los efectos citopáticos en cada pocillo y resumir las razones de los pocillos positivos por fila..

    1. Calcular el título de acuerdo con la fórmula de Kaerber
    2. TCID 50 = (dilución de primer carril) x (dilución) (S-0.5)
    3. S = la suma de las proporciones de los pocillos positivos por fila
      NOTA: Para este protocolo DICT 50 = (30 000) x (3) (S-0.5). Debido a que 50 ul de solución viral se utiliza en este protocolo, divida TCID 50 por 0,05 para calcular DICT 50 / ml.
  2. Transducción adenoviral
    1. Calcular la cantidad requerida de solución de adenovirus a partir de su título (PFU / ml, partícula viral / ml o 50 TCID / ml). Utilice la fórmula para calcular MOI (multiplicidad de infección).
    2. em> [Place Tabla 4 aquí]
    3. Agregue la cantidad calculada de solución de virus de medio libre de suero (véase la Tabla 5). Mezclar bien e incubar durante 20 min a TA.
    4. em> [lugar de la tabla 5 aquí]
    5. Día 7: Toma plato obtenido en el último paso de la Sección 2.2, y vuelva a colocar medio con 750 ul de nuevo DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S.
      NOTA: La reducción del volumen medioen la transducción de hasta aproximadamente 50% del volumen original es crítico para alta eficacia de transducción.
    6. Añadir la solución de virus diluido al plato. Incubar plato durante 4-8 horas en el incubador de CO2 a 37 ˚ C. A continuación, reemplace con un nuevo medio.
    7. Incubar plato durante 24-48 horas en CO 2 incubadora a 37 ˚ C. En el día 8-9, Usar células para el experimento de imágenes de células vivas. NOTA: Expresión de proteínas a partir del plásmido adenoviral puede ser confirmado por WB o HIC después de 24-48 horas de transducción con el fin de determinar el nivel de expresión relativa de proteínas (Figura 1c y 1d).

4. Imágenes de células vivas

  1. La adquisición de imágenes utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con una cámara de temperatura controlada y un sistema de medio ambiente de CO 2 (opcional)
    1. Girar el sistema de control de la temperatura en al menos 1 hora antes de la adquisición, de manera que todos los dispositivos equilibren a 37 ˚ C antes del comienzo de la adquisición. Encienda confocal girar sistema de microscopio de disco (PC para la operación, microscopio, girando la unidad de disco, cámara CCD, láser, fuente de luz fluorescente, la fuente de luz normal, la etapa motorizada y persianas automáticas).
      NOTA: Más de 1 hora es necesario para alcanzar el equilibrio de la temperatura completa de todos los dispositivos.
    2. Cambie medio en 3,5 cm de platos con fondo de cristal a medio deseado para la adquisición, si es necesario. Coloque el recipiente en el escenario de un microscopio confocal de disco giratorio en una cámara de temperatura controlada.
      NOTA: Debido a la aberración esférica para la observación óptima mediante el uso de microscopía de un plato inferior 3,5 cm de vidrio con tapa de vidrio No. 1.5 (alrededor de 0,16 hasta 0,19 mm de grosor) es ideal. Si el objetivo se está utilizando tiene un collar de corrección, las imágenes obtenidas con cubiertas de vidrio más grueso que 0,17 mm pueden ser corregidas. También, Rojo fenol tiene una ligera fluorescencia. A veces es preferible utilizar un medio libre de rojo de fenol, tal como DMEM sin rojo de fenol. Si no hay ningún dispositivo para controlar CO CO2 medio o medio amortiguado por HEPES para time-lapse de largo plazo independiente.
    3. Seleccione la trayectoria de la luz a los oculares.
    4. Gire el obturador de la fuente luminosa de campo claro en. Ajuste el enfoque de las células bajo el microscopio a través de los oculares. Gire el obturador para la fuente de luz fuera de campo brillante.
    5. Gire el obturador de la fuente de luz fluorescente. Encuentra las células que expresan proteínas fluorescentes bajo el microscopio a través de los oculares. Gire el obturador para la fuente de la luz fluorescente.
    6. Opcional> Pulse el botón de activación para el sistema de enfoque perfecto delante del microscopio para activar el sistema de enfoque perfecto en el fin de mantener la atención constante durante la adquisición de lapso de tiempo.
    7. Cambie la ruta de la luz para el microscopio confocal de disco giratorio. Ajuste la configuración para la adquisición apropiadamente el uso del software operativo, comprobando imágenes displayEd en la pantalla. (Por ejemplo, Focus, la potencia del láser, tiempo de exposición, CCD ganancia de la cámara y off-set)
    8. Ajustes fijados para la adquisición de imágenes de fluorescencia utilizando el software operativo. Ejemplo: Seleccione "Cambiar canales utilizando trayectorias de la luz" y "Canal 1: EGFP" para adquirir la señal fluorescente de EGFP para el canal uno.
    9. Ajuste la frecuencia entre los puntos de tiempo mediante la configuración de los ajustes de lapso de tiempo con el fin de tomar las imágenes con lapso de tiempo utilizando el software operativo. Ejemplo: Para adquirir un punto de tiempo cada 5 minutos, seleccione "Minutos por Time-punto" en el menú desplegable e introduzca 5 en el campo de texto.
      NOTA: Seleccione "Velocidad máxima" para hacer una película a la velocidad real. Si la expresión de la proteína fluorescente es baja, la fluorescencia puede blanquear rápidamente durante la adquisición de lapso de tiempo. En ese caso, es mejor reducir el número de adquisición de puntos de tiempo.
    10. Iniciar la adquisición de lapso de tiempo haciendo clic en el "stabotón rt "para adquirir una secuencia de imágenes.
      NOTA: Es mejor no utilizar la función de adquisición-de múltiples puntos. Puede causar pérdida de concentración o movimiento del campo de la imagen en time-lapse.
  2. Análisis de las imágenes adquiridas
    NOTA: Adquirido imágenes se pueden reproducir en formato de película y se analizaron utilizando el software de análisis.
    1. Seleccione las imágenes adquiridas que se incluirán en una película. En caso necesario, las regiones de cultivos de interés a partir de imágenes y seleccione interesantes puntos de tiempo para reducir el tamaño del archivo de película utilizando el software operativo.
    2. Exportación de imágenes como un archivo de película en formato AVI o MOV. Selecciona un formato de película en el menú "Formato" lista desplegable y el tiempo requerido para la película terminada, haga clic en "Exportar". NOTA: las imágenes con lapso de tiempo adquiridos en un punto de tiempo cada 5 minutos se pueden reproducir como una película a 10 cuadros por segundo, que es 3.000 veces más rápido que su velocidad real.
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Representative Results

Para ilustrar la técnica, un lentivirus EGFP codificación (proteína fluorescente verde potenciada)-etiquetados Cx43 (connexin43) o un Cx43 mutado 32 se utilizó para expresar proteínas EGFP-etiquetados en las células, y un adenovirus que codifica FGFR1DN (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 negativo dominante ) se utilizó para apagar la señalización de FGF en la celda 33 a 35. Tres días después de la aislamiento de los cardiomiocitos, los cardiomiocitos aislados fueron transducidas con lentivirus para expresar proteínas EGFP-etiquetados en las células. Luego, después de 3 días de transducción lentiviral, los cardiomiocitos aislados se transdujeron adicionalmente con un adenovirus que codifica FGFR1DN para eliminar la señalización de FGF en las células. Después de permitir tiempo suficiente para que las células para expresar los genes exógenos transducidas, se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio para capturar imágenes de células vivas. Las imágenes adquiridas se reproducen en formato de película y analizados utilizando el software de análisis de imágenes. Por representación más detalladaresultados TIVE consulte Sakurai et al 32.

La expresión de EGFP proteínas etiquetadas después de la transducción lentiviral fue confirmada por microscopía confocal de disco giratorio de 72 horas después de transducción lentiviral figuras 1A-B. La expresión de FGFR1DN por transducción adenoviral fue confirmada por el BM y el CPI después de 24 horas de transducción adenoviral figuras 1C-D. El momento de la adición de adenovirus a 3,5 cm de platos se definió como el tiempo 0 y el tiempo de lapso de imágenes fueron adquiridas con una 40x aire NA 0,9 lente objetivo cada 5 minutos durante 6 horas utilizando un calentador de cámara para mantener la temperatura a 37 ˚ C. Imágenes Time-lapse de proteínas EGFP-etiquetados en los cardiomiocitos primarias tomadas por microscopía confocal de disco giratorio se muestran en las películas Suplementarios 1-2.

En los casos en que el equilibrio de la temperatura no era la adecuada, o el modo de adquisición múltiple no estaba funcionando correctamente,imágenes capturadas pueden mover en el plano xy Suplementario Película 1. No obstante, si funciona correctamente el sistema de enfoque automático de forma estable mantenido el enfoque y esto no ocurrió. Como se muestra en el Adicional Movie 2, cuando el equilibrio de la temperatura era adecuada y sólo una región de interés fue adquirida, las imágenes capturadas son de muy alta calidad.

La paliza de los cardiomiocitos se evaluó después de time-lapse de imágenes de células vivas a largo plazo con el fin de confirmar la viabilidad celular. Incluso después de 16 horas de time-lapse de imágenes que expresan EGFP cardiomiocitos mantiene sus propiedades funcionales y venció Película rítmicamente Suplementario 3.

Figura 1
Figura 1. Confirmación de la expresión de la proteína después de la transducción lentiviral o adenoviral. (A) Aislado de rata neonatal cardiomiocitos expresan Cx43-WT-EGFP transducidas con Ad-FGFR1DN 3 días después de la transducción. Ver también películas Suplementario 1. (B) de rata neonatal cardiomiocitos aislados que expresan Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP transducidas con Ad-FGFR1DN 3 días después de la transducción. Ver también películas Suplementario 2. (C) Expresión de proteínas después de la transducción adenoviral detectado por la CCI de 24 horas después de la transducción. La hemaglutinina (HA) de la proteína-tagged FGFR1DN se detectó por el anticuerpo anti-HA usando métodos convencionales ICC, alfa-actinina se utilizó como un marcador para los cardiomiocitos. (D) Expresión de la proteína después de la transducción adenoviral FGFR1DN detectado por WB 24 horas después de la transducción. HA-etiquetados FGFR1DN se detectó por el anticuerpo anti-HA por WB, beta-tubulina se utilizó como control de carga.

Película Complementario 1. Time-lapse de rata aislada coche neonatal diomyocytes que expresan Cx43-WT-EGFP transducidas con Ad-FGFR1DN. Las imágenes con lapso de tiempo fueron adquiridas con una lente objetivo de 40x cada 5 minutos durante 6 horas con un microscopio confocal de disco giratorio. Las imágenes adquiridas se reproducen como una película a 10 cuadros por segundo. Esta película ha sido modificado de Sakurai et al 32. Haga clic aquí para ver el vídeo.

Película Suplementario 2. Time-lapse de rata aislados cardiomiocitos neonatales expresan Cx43-S325/328/330E-EGFP transducidas con Ad-FGFR1DN. Las imágenes con lapso de tiempo fueron adquiridas con una lente objetivo de 40x cada 5 min durante 6 h con un confocal girar microscopio de disco. Las imágenes adquiridas se reproducen como una película a 10 cuadros por segundo. Esta película ha sido modificado de Sakurai et al 32."Target =" _blank "> Haga clic aquí para ver el vídeo.

Película Suplementario 3. Time-lapse de rata neonatal cardiomiocitos aislados reproduce a velocidad real. Las imágenes con lapso de tiempo de rata aislados cardiomiocitos neonatales expresan Cx43-EGFP transducidas con Ad-FGFR1DN fueron adquiridas con un lente objetivo de 40x cada 200 ms para 10 seg con un microscopio confocal de disco giratorio tras 16 horas de adquisición de lapso de tiempo. Las imágenes adquiridas se reproducen como una película en 5 fotogramas por segundo a la velocidad real. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.

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Discussion

Cardiomiocitos primarios aislados de ratas neonatales han sido utilizados para estudiar las funciones de cardiomiocitos in vitro. Este protocolo describe un método para el aislamiento de cardiomiocitos neonatales de crías de rata utilizando un método de digestión de la enzima de dos pasos, primero la digestión con tripsina de O / N a 4 ° C y luego se colagenasa purificada. Una ventaja de emplear el paso de colagenasa purificada es que el mismo grado de enzima se utiliza para todos los aislamientos. Por lo tanto, la calidad y la cantidad de células aisladas es consistente de experimento a experimento.

Teniendo en cuenta las eficiencias de transducción más altos asociados con adenovirus, si una alta eficiencia de transducción del cultivo de células es necesaria para un experimento dado, es mejor utilizar un adenovirus. Sin embargo, si los altos niveles de transducción no son necesarios, un vector lentiviral se puede utilizar. Teniendo la opción de utilizar vectores adenovirales o lentivirales ya sea hace que sea más fácil para lograr TRANSD apropiadaniveles ucción y de expresión para diferentes tipos de genes. Si la intensidad fluorescente detectada por imágenes de células vivas utilizando el microscopio confocal de disco giratorio o de la CPI es muy bajo después de la transducción lentiviral, utilizando otro vector de transferencia lentiviral que utiliza un promotor diferente para expresar el gen de interés puede resolver este problema. Con los vectores adenovirales, si la banda detectada por WB es débil después de la transducción adenoviral, esto puede indicar una acción viral baja titulación. En ese caso, es mejor preparar una solución adenoviral título más alto por propagación en las células antes de proceder.

Una limitación de esta técnica es que el rendimiento de los cardiomiocitos viables aisladas no es muy consistente de experimento a experimento, incluso cuando se utiliza la colagenasa purificada. Para llevar a cabo los experimentos de imagen reproducible lo mejor es contar las células viables después de la selección de cardiomiocitos aislados en el sobrenadante en el paso 1.2.13. en la sección de protocolo. Entonces, SEed cardiomiocitos en los platos con fondo de cristal a diferentes diluciones. Una vez que las células se han unido, selectos platos con la concentración celular apropiada para el experimento planeado.

Hay muchas ventajas del uso de los cardiomiocitos neonatales, pero también hay algunas desventajas. El mayor inconveniente es su clara diferencia con cardiomiocitos adultos. Cardiomiocitos adultos totalmente diferenciadas son de varilla forma y cardiomiocitos aislados primarios adultos mantienen su morfología en forma de barra, mientras que aislados cardiomiocitos neonatales primarios propagan en todas las direcciones 36. Las diferencias fenotípicas entre los aislados de adultos y cardiomiocitos neonatales se reflejan también en sus patrones de expresión génica 37. Por lo tanto, para los experimentos en los que se requieren los cardiomiocitos diferenciados, será necesario un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos adultos 4.

El empleo de la transducción adenoviral y lentiviral de recombinanteproteínas en la rata neonatal cardiomiocitos primarios en combinación con la microscopía confocal de disco giratorio nos permite analizar las funciones de las proteínas en las células primarias vivas cultivadas. En relación con los métodos existentes, que utilizan la transfección para introducir el gen de interés en células, una ventaja significativa de este protocolo es que los adenovirus y los lentivirus son muy eficientemente absorbidos por las células resultantes en la expresión del gen de interés en casi todas las células en la cultura. Además, el uso de dos tipos diferentes de virus para la expresión génica hace que sea más fácil para lograr tasas de transducción apropiados y los niveles de expresión de múltiples genes. siRNAs y agonistas y antagonistas químicos también se pueden utilizar en este sistema para perturbar aún más y analizar las funciones de los genes y las proteínas que codifican.

La preparación de los corazones es un paso muy importante en el protocolo. Retire los corazones del cuerpo lo más rápido posible. Asegúrese deponlas en hielo inmediatamente para mantener la viabilidad celular alta. Otro paso importante es la preparación de alta calidad, y el título, las acciones de lentivirus / adenoviral. Si se utilizan las poblaciones virales mala calidad, transducción y los niveles de expresión del gen de interés será baja. Por lo tanto, pueden no ser adecuados para los estudios de imagen.

Una aplicación futura importante de esta técnica será su "uso en cardiomiocitos de ratón. Pruebas de estudios piloto si este método se puede utilizar para el aislamiento de cardiomiocitos neonatales de ratón han dado resultados prometedores. Debido a la relativamente pequeño tamaño de los corazones de ratón en comparación con los de las ratas, menos tejido se obtiene inicialmente. Por lo tanto, un menor número de células se aíslan en un procedimiento único utilizando el mismo número de animales, sino simplemente utilizando más ratones para el aislamiento debe eliminar este obstáculo. La capacidad de aislar los cardiomiocitos de ratones permite a los investigadores estudiar las funciones de las células aisladas de m modificados genéticamentehielo (transgénicos, knock-out, knock-in) que se han producido con el fin de estudiar una forma particular del gen de interés.

Uno de los principales obstáculos en la investigación cardiovascular ha sido la dificultad asociada con la investigación de la expresión y función de un determinado gen expresado en el tejido del corazón in vivo en tiempo real. Sin embargo, la capacidad de aislar los cardiomiocitos funcionales paliza, modulan las funciones celulares mediante transducción viral, y luego estudiarlas en tiempo real utilizando el microscopio confocal de disco giratorio ayuda a arrojar luz sobre el papel de los cardiomiocitos en vivo y esta brecha. Este método proporciona un sistema simplificado para la comprensión de la función de los cardiomiocitos en el nivel celular. Se permite el análisis en tiempo real de cómo las perturbaciones en la expresión de genes alteran la función de los cardiomiocitos. Imágenes de células vivas de los cardiomiocitos proporcionará más conocimientos sobre la función de los cardiomiocitos. Tales descubrimientos conducirán a avances en cardiovascula básicainvestigación R, que resulta en nuevas terapias para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

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References

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