Live-Cell Imaging Primary Rat Neonatal cardiomyocytes Efter Adenoviral og Lentiviral Transduktion Brug Confocal Spinning Disk Microscopy

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Primær rotte neonatal cardiomyocytter er nyttige i grundlæggende in vitro kardiovaskulær forskning, fordi de let kan isoleres i stort antal i en enkelt procedure. På grund af fremskridt i mikroskop-teknologi er det relativt nemt at fange levende celle billeder med henblik på at undersøge cellulære begivenheder i realtid med minimal bekymring vedrørende fototoxicitet til cellerne. Denne protokol beskriver hvordan man tager levende celle timelapse billeder af primær rotte neonatale cardiomyocytter ved anvendelse af et konfokalt roterende skive mikroskop efter lentiviral og adenoviral transduktion at modulere egenskaberne af cellen. Anvendelsen af ​​to forskellige typer af virus gør det lettere at opnå en passende transduktion rente og udtryk niveauer i to forskellige gener. Godt fokuseret levende celle billeder kan opnås under anvendelse af mikroskopets autofokus-system, som opretholder stabile fokus i lange perioder. Anvendelsen af ​​denne metode, funktioner eksogent ingeniøred proteiner udtrykt i dyrkede primære celler kan analyseres. Derudover kan dette system anvendes til at undersøge funktionen af ​​gener ved anvendelse af siRNAs samt kemiske modulatorer.

Introduction

Primære rotte neonatale cardiomyocytter har længe været anvendt til at undersøge cardiomyocyte funktion in vitro 1. De er nemme at isolere fra rotteunger af flere veletablerede metoder 2-4. Den mest almindelige fremgangsmåde anvender kollagenase eller trypsin til at fordøje bindevæv af hjertet før celleisolering. Forskere har også udviklet fremgangsmåder til isolering cardiomyocytter fra voksne gnavere 5-8 samt neonatale mus 9,10.

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til isolering af cardiomyocytter fra neonatale rotteunger, der anvender en totrins-enzymfordøjelsen procedure. Trypsin bruges først O / N ved 4 ° C og derefter renset collagenase ved 37 ° C. Inkubation af hjertevævet med trypsin O / N ved 4 ° C reducerer de nødvendige høst celler skridt i forhold til fremgangsmåder, der anvender sekventielle inkubationer i en varm enzymopløsning 2. Desuden, ved anvendelse af oprenset collagenase snarere end rå enzymer, kan parti-til-parti variation elimineres, hvilket giver forbedret reproducerbarhed.

Funktionelle undersøgelser af et bestemt protein ofte anvender et protein ekspressionssystem ved hjælp af en adenovirus 11-13 og / eller et lentivirus 14-16. [Advarende note] Den virale produktion og manipulation bør udføres i henhold til NIH retningslinjer.

Adenovirus er ikke integreret i værtsgenomet. Det har en meget høj effektivitet af transduktion i de fleste celletyper, herunder delende celler og ikke-delende celler, såvel som primære celler og etablerede cellelinjer. Dette gør adenovirus en pålidelig vektor til genekspression. Høje niveauer af proteinet kodet af adenovirusvektoren udvikle sig inden for 48 timer efter transduktion, og de ​​kan vare i flere uger 17. Men en ulempe ved et adenovirus til proteinekspression er, at udviklingen af ​​en rekombinant adenovirus er både kompliceret og tidskrævende. Denne ulempe forklarer til dels, hvorfor mange forskere har været at dreje til lentivira for rekombinant genekspression. I modsætning adenovirale konstruktioner, er hurtig og let at generere en lentiviral konstruktion. Selv lentivira generelt har lavere effektivitetsgevinster af transduktion end adenovirus, både delende og ikke-delende celler, de integreres i værtens genom. Følgelig ekspression af det transducerede gen er mere stabilt for lentivirus end for adenovira.

Grund af teknologiske fremskridt inden for mikroskopi, er det meget nemmere at fange levende celle billeder af celler, der udtrykker rekombinante proteiner. Dette gælder også på video rate hastigheder på erhvervelsen. Dette gør det muligt for undersøgeren at bestemme, hvordan bestemte ændringer i proteinet af interesse funktionelt påvirke cellen i realtid. Den konfokal spinning disk mikroskop har flere vigtige funktioner, der gør det til en optimal teknik til live cell imaging 18,19. Yokogawa spinning disk giver mulighed for langt mere erhvervelse hurtig billedet, mens på samme tid udnytte langt mindre laserenergi end punkt konfokal mikroskoper. Begge disse særlige funktioner er på grund af den roterende skive, som indeholder talrige konfokale huller, gennem hvilke laseren passerer samtidigt til prøverne. Under købet selve harddisken spinder hurtigt og kontinuerligt 18-20. Ved at bruge autofokus-system af mikroskopet, er stabil fokus fastholdes over lange perioder. Dette gør det muligt for forskerne at tage velfokuserede levende celle billeder. Erhvervede billeder afspilles som en film fil. Billederne er analyseret ved hjælp af billedanalyse software som ImageJ 21,22, Fiji 23 eller anden kommercielt tilgængelig software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering af rotte neonatale cardiomyocytter

  1. Brug Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og minimalt essentielt medium (MEM) suppleret med føtalt bovint serum (FBS) og penicillin / streptomycin (P / S) som dyrkningsmediet. Tilføj bromdeoxyuridin (BrdU) til mediet for at forhindre vækst af fibroblaster i de første 2 dage efter isolation.
Basemedium FBS BrdU (mM) P / S (U / ml)
udvælgelse DMEM 10% 0 20
Den første dag DMEM 10% 0.1 10
Den næste dag DMEM / MEM 5% 0.1 10
Yderligere kultur DMEM / MEM 5% 0 10

Tabel 1:. Medium til rotte neonatal cardiomyocytter Brug dette medie til dyrkning af rotte neonatal cardiomyocytter. DMEM / MEM er 1:1 blanding af DMEM og MEM-medium.

  1. Cardiomyocyte isolation, Dag 1 (Forventet krævede tid, omkring 1 hr)
    BEMÆRK: Ved arbejde med neonatale gnavere, henvises til lokale retningslinjer universitetsstuderende og regler fastsat af dyr pleje programmer, og holde sig til institutionelt godkendte dyr protokoller. Alle metoder, der er beskrevet i denne protokol er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Yale Animal Resource Center.
    1. Forbered reagenser og værktøjer: calcium-og magnesium-fri Hanks balancerede saltopløsning (CMF HBSS), 30 ml x 2, 10 ml x 2, på is; 1 mg trypsin, rekonstitueres med 2 ml af CMF HBSS, på is; autoklaveres værktøj; 70% ethanol (EtOH) i 250 ml bægerglas; fire steriliseret 10 cm plastskåle, tre til isolering af hjerter og én for trypsinbehandling.
    2. Kendelse 1 littis af 1-til-2-dage gamle rotteunger (ca. 10 unger) med deres dæmning fra et forsøgsdyr distributer.
    3. Day1, Transfer unger til lille bur og aflive dæmning med en ketamin / xylazin cocktail (ketamin, 200ml/10g og xylazin 20ml/10g) overdosis.
    4. Tag en hvalp og sterilisere hele sin krop med 70% EtOH. Halshugge hvalp med velholdte skarpe kirurgiske saks på en steriliseret 10 cm plastik skål på et sted isoleret fra andre hvalpe.
      BEMÆRK: For at indsamle prøverne så hurtigt som muligt, er det bedst at bruge den hurtigste og mest effektive metode til at afslutte livet af gnaver. Halshugning når de anvendes korrekt af dygtige fagfolk med velholdt udstyr kan resultere i mindre frygt og angst for dyret og være hurtigere og mere praktisk end andre former for dødshjælp. Det er i overensstemmelse med anbefalingerne fra de amerikanske Veterinary Medical Association Retningslinjer for aflivning af dyr.
    5. Fjern slå hankunst med steriliseret værktøjer og sætte hjerte i 30 ml is afkølet CMF HBSS i 50 ml konisk rør. BEMÆRK: Tag hjerter så hurtigt som muligt og lægge dem på is med det samme. Efter fjernelse af hjerter fra kroppen, skal alle procedurer gøres på is.
    6. Saml 5 hjerter i 30 ml is afkølet CMF HBSS, og de resterende 5 hjerter i yderligere 30 ml is kølet CMF HBSS. Swirl røret for at skylle hjerter. BEMÆRK: Efter dette trin, skal du udføre alle procedurer i en laminar flow hætte.
    7. Supernatanten fjernes, og overføre hjerter til en ny steriliseret 10 cm plastik skål på is. BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at aspirere hjerter med aspiratoren.
    8. Fjern store fartøjer og / eller uønskede væv. Der tilsættes 10 ml is afkølet CMF HBSS til fadet at skylle hjerter.
    9. Overfør alle hjerter til en ny steriliseret 10 cm plastik skål på is. Hakke hjerter med en saks til mindre end 1 mm3 på is.
    10. Tilføj 9 ml afkølet CMF HBSS. Der tilsættes 1 ml afkølet trypsin reconstituted med CMF HBSS (endelig 50 ug / ml).
    11. Seal fadet med parafilm og dække det med alufolie, og derefter placere den i kølerum (4 ˚ C) natten over.
  2. Cardiomyocyte isolation, Dag 2 (Forventet krævede tid, omkring 4 timer)
    1. Forbered reagenser og værktøjer: 50 ml konisk rør x 2; 2 mg trypsininhibitor rekonstitueres med 1 ml CMF HBSS, på is; 1500 enheder collagenase, rekonstitueres med 5 ml Leibovitz L-15, ved stuetemperatur (RT); Leibovitz L-15, blandes med 1 liter steriliseret vand og filtreres gennem et 0,22 mikron filter, 8 ml ved RT; 10 mg / ml (32,6 mM) BrdU i vand; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; to 10 cm plast celledyrkningsskåle; 3,5 cm glasbund retter.
    2. Day2, Forberedelse gelatineovertrukne retter. Der tilsættes 1 ml 0,1% gelatine løsning til at belægge en 3,5 cm glasbund fad til en billeddiagnostisk eksperiment. Inkuber retter ved 37 ˚ C i adskillige timer, derefter aspireres og gelatineopløsning kasseres før brug.
      NOTE: En 3,5 cm glasbund fad er velegnet til en billeddannende eksperiment ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. Til ekstraktion af proteiner fra primære cardiomyocytter at detektere proteinekspression ved western-blotting (WB), kan 0,1% gelatine belagt plastik celledyrkningsskåle anvendes.
    3. Overfør alle hjertevæv fordøjet af trypsin natten over med buffer til en 50 ml konisk rør på is i steriliseret hætte. Der tilsættes 1 ml trypsin inhibitor i CMF HBSS (endelig 182 ug / ml). Luk låget på 50 ml konisk rør stramt for at undgå forurening.
    4. Inkubér glasset i ca 30 min i en 37 ˚ C inkubator at varme væv og buffer til 30-37 ˚ C. Der tilsættes 5 ml collagenase i Leibovitz L-15 (endelig 94 enhed / ml). Inkuberes ved 37 ˚ C i 45 min med forsigtig omrystning (170-200 rpm shaker i 37 ˚ C inkubator).
      BEMÆRK: Dette trin kan udføres uden for laminar flow hætte. Alle efterfølgende trin skal udføres ved stuetemperatur.
    5. Desinficere ydersiden af ​​en 50 ml konisk rør med 70% EtOH og sættedet i steriliseret hætte.
    6. Triturat væv ved hjælp af automatisk pipette med pipettering på 3 ml / sek hastighed til 20 gange. Tillad væv rest at nøjes med 3 min og foretage supernatanten med en 70 um celle si.
      BEMÆRK: En almindelig størrelse 10 ml pipette kan bruges til findeling.
    7. Tilsæt 5 ml Leibovitz L-15 til de resterende væv klumper og triturat og filtrere supernatanten igen. Vask cellefilter med 2 ml af Leibovitz L-15.
    8. Placer filtreret celle løsning i en hætte for 20-60 minutter for at tillade collagenase at fordøje delvist nedbrudt kollagen.
    9. Sediment cellerne ved 100 x g i 5 minutter. Resuspender cellerne i 20 ml DMEM indeholdende 10% FBS og høj koncentration P / S (20 U / ml).
    10. Pre-plade celler på to 10 cm plast cellekultur retter til 1 time i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C for cardiomyocyte udvælgelse. BEMÆRK: Fibroblaster vedhæfte lettere til bunden af ​​fadet end kardiomyocytter.
    11. While venter, forberede DMEM indeholdende 10% FBS, P / S (10 U / ml) og 0,1 mM BrdU. Der tilsættes 1 ml 10 mg / ml BrdU til 325 ml DMEM indeholdende 10% FBS og P / S.
    12. Swirl retter forsigtigt og indsamle cardiomyocyte supernatant fra to 10 cm skåle.
      BEMÆRK: De fleste cardiomyocytes vil stadig være flydende i supernatanten efter 1 times inkubation. For at undgå forurening med fibroblaster, som er let knyttet til skålen, ikke indsamler supernatanten ved pipettering.
    13. Valgfri> Tæl celler i supernatanten med og uden 0,2% trypanblåt til at kontrollere cellernes levedygtighed.
    14. Sediment cellerne ved 100 x g i 5 minutter. Resuspender cellerne i DMEM indeholdende 10% FBS, P / S (10 U / ml) og 0,1 mM BrdU. Plate celler ved 2 x 10 5 celler / fad i gelatineovertrukne 3,5 cm glasbund retter til observation ved hjælp af mikroskop. BEMÆRK: Du må ikke forstyrre celler efter udpladning i mindst 24 timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C.
    15. Dag 3, ChaNGE medium 24 timer efter plating til DMEM / MEM indeholdende 5% FBS, P / S og 0,1 mM BrdU.
    16. Dag 4, Skift medium 48 timer efter plating til DMEM / MEM indeholdende 5% FBS og P / S.
      BEMÆRK: Skift medium hver 2-3 dage med DMEM / MEM indeholdende 5% FBS og P / S.

2.. Lentiviral transduktion

  1. Pakning af lentivirale plasmider
    BEMÆRK: Der henvises til andre kilder til yderligere dybdegående information om emnet 24-26. Det vil tage omkring 3 dage til at forberede lentiviral løsning. Det er bedst at bruge frisk lentiviral løsning til at opnå højere transduktionseffektivitet. Start emballering af lentivirale plasmider og isolering af rotte neonatale cardiomyocytter parallelt. I stedet for at anvende polyethylenimin (PEI) 27 til emballering af lentivirale plasmider kan et kommercielt tilgængeligt transfektionsreagens anvendes. Følg producentens anvisninger.
    1. Forbered reagenser og værktøjer; HEK293T-celler, 10 cm plast cellekultur retter, lentivirale plasmid løsninger (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentivirusvektor overførsel, 1,0 mg / ml hver), 1 g / l PEI, serum-frit medium, 20 mM chloroquin i vand, 10% blegemiddel, 1% SDS i 70% EtOH
    2. Dag 0, tallerken 2-2,5 x 10 6 HEK 293T celler pr 10 cm parabol dagen før transfektion.
      BEMÆRK: 30-60% konfluens ved transfektion er optimal.
    3. Dag 1, Forberedelse PEI transfektion løsning. Der tilsættes 30 ul af 1 g / l PEI til 960 ul serum-frit medium i et 1,5 ml rør. Tilføj 4 plasmider i PEI transfektion løsning i 1,5 ml rør, og blandes med aflytning.
    Navn plasmid Bemærk Størrelse (kbp) tilført mængde (ml) Endelige beløb i 10 cm skål (mg) Endelig koncentration i 10 cm skål (PM)
    Lentiviral overføringsvektor koder for genet, der skal emballeres 9-13 3,6-5,2 3,6-5,2 60
    pMDLg / pRRE udtrykker HIV-1 gag / POL 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-Rev udtrykker HIV-1 REV 4.1 0,82 0,82 30
    pMD2.G udtrykker VSV G 5.8 1.16 1.16 30

    Tabel 2:. Mængden af plasmider til lentiviral emballage Brug disse plasmid beløb til transfektion HEK293 celler i 10 cm skåle. Endelige beløb for lentiviral transfervektor pr fad kan variere alt efter dens størrelse, vedligeholde slutkoncentration pr parabol på 60 pM. Gennemsnitlig molekylvægt af et basepar i dobbeltstrenget DNA er 660 dalton.

    1. Kassér gamle mediumfra 10 cm skål af HEK 293T celler og forsigtigt tilsættes 9 ml nyt medium (DMEM + 10% FBS, uden P / S).
    2. Tilføj PEI-DNA blandingen forsigtigt dråbevis på pladen, og hvirvl forsigtigt at blande sig med medium. Der tilsættes 10 ul 20 mM chloroquin (endelig 20 uM) til 10 ml medium. BEMÆRK: Chloroquine menes at reducere nedbrydning af plasmid-indeholdende transfektionskomplekser ved delvis neutralisering af pH-værdien inden for lysosomale rum 28.
    3. Inkuber i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C i 6 timer. Derefter fjernes medium indeholdende PEI-DNA-blandingen og tilsæt 10 ml nyt medium (DMEM + 10% FBS + 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), pH 7,4 + P / S) . BEMÆRK: Efter inkubation virus vil blive produceret i mediet. Sugning Pasteur pipetter og / eller tips skal dekontamineres med 10% blegemiddel. Afgifte altid biologiske sikkerhed fryser overflade og potentielt kontamineret udstyr med 70% EtOH uanset om supernatant er blevet spildteller ej. Hvis der er opstået spild er nødvendig grundig sanering med 1% SDS i 70% EtOH.
    4. Dag 2-3, inkuberes i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C i 48-72 timer. Dag 4, indsamle lentiviral løsning (fortsat afsnit 2.2).
      BEMÆRK: Medium kan ændres på 48 timer efter transfektion. Indsamling virus supernatant 48 timer og 72 timer to gange, kan opnå at opnå højere titer virus løsninger.
  2. Indsamling af lentiviral løsning, og transduktion
    1. Forbered reagens og værktøj: 15 ml koniske rør, 1 M HEPES, pH 7,4 (0,22 um filtreret)
    2. Dag 4, Saml supernatant indeholdende lentivirusinfektioner partikler (lentiviral opløsning) med 10 ml steriliseret Luer-Lok sprøjte, derefter filtrere supernatanten gennem 0,45 um filter ind i en 15 ml konisk rør. Tilføj 1/100 volumen af ​​1 M HEPES pH 7,4 til filtreret lentiviral opløsning (endelig 10 mM).
      BEMÆRK: Til filtrering, kun bruge cellulose acetate eller polyethersulfon (PES) (lav proteinbinding) filtre. Brug ikke nitrocellulosefiltre. Nitrocellulose binder overfladeproteiner på lentiviral kuvert og ødelægger virus.
    3. Fjern mediet fra 3,5 cm retter af rotte neonatal cardiomyocytter, opnået på det sidste trin af afsnit 1.2, der tilsættes 1 ml filtreret lentiviral løsning på 3,5 cm skål.
    4. <Optional> Tilføj hexadimethrinbromid (slutkoncentration 4-6 ug / ml).
      BEMÆRK: hexadimethrinbromid kan øge lentiviral transduktion effektivitet. Koncentration af hexadimethrinbromid bør optimeres.
    5. Inkuber fad i 6 timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C for lentiviral transduktion, derefter ændre medium til ny DMEM / MEM indeholdende 5% FBS og P / S. Inkuber fad i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C i 3 dage.
      BEMÆRK: Integration af eksogene gen i værtsgenomet ved lentivirus anses for at være afsluttet senest 72 timer.
    6. Dag 7 Brug celler fra trin 2.2.5 til næste trin. BEMÆRK: Protein ekspression fra lentiviral plasmid kan bekræftes ved WB eller immunocytokemi (ICH) efter 48-72 timers transduktion for at bestemme det relative ekspressionsniveau (figur 1a og 1b).
  3. Koncentration af lentiviral opløsning
    BEMÆRK: Det er bedst at bruge frisk lentiviral løsning for at opnå højeste transduktion effektivitet, i tilfælde af lentiviral løsning titeren ikke er høj nok, lentiviral løsningen kan koncentreres ved polyethylenglycol (PEG) nedbør 29.
    1. Fremstilling af 4x PEG-opløsning (32% PEG6000, 400 mM natriumchlorid (NaCl), 40 mM HEPES pH 7,4)
      1. For 125 ml 4x PEG-opløsning, vejer 40 g PEG6000, så opløse det i 60 ml vand.
        BEMÆRK: BEMÆRK: (. Dvs. Gennemsnitlig molekylvægt af PEG6000 er 6.000) Tallet efter PEG er den gennemsnitlige molekylvægt
        BEMÆRK: 2.3.1.2) tilsættes langsomt 10 ml5 M NaCl. Langsomt tilsættes 5 ml 1 M HEPES pH 7,4. PH justeres til 7,4 ved anvendelse af 2 M natriumhydroxid.
        BEMÆRK: 2.3.1.3) Tilsæt vand til 125 ml. Sterilisere 4x PEG-opløsning ved membranfiltrering med et 0,22 um filter og opbevar det ved 4 ˚ C.
    2. Lentivirus koncentration
      1. Filter lentiviral transduceret supernatant til nye 50 ml rør ved hjælp af et 0,45 um filter.
        BEMÆRK: 2.3.2.2) Tilføj 4x PEG-opløsning 1:3 (PEG løsning: supernatant = 1:3). Opbevar ved 4 ˚ C i 16-48 timer.
        BEMÆRK: 2.3.2.3) centrifugeres ved 2.600 x g ved 4 ˚ C i 30 min. Supernatanten kasseres, og der centrifugeres ved 2.600 x g ved 4 ˚ C i 5 min.
        BEMÆRK: 2.3.2.4) Kassér supernatanten omhyggeligt for at undgå at forstyrre bundfaldet. Genopslæmmes pellet i serum-frit medium under anvendelse af 1/2 til 1/25 volumen af ​​den oprindelige supernatant volumen.
        BEMÆRK: 2.3.2.5) Brug direkte eller fryse hjælp af flydende kvælstof og derefter opbevares ved -80 ˚ C

3.. Adenoviral transduktion

BEMÆRK: Der henvises til andre kilder for metoder til konstruktion og opformering af adenovirale konstruktioner 13. Sugning Pasteur pipetter og / eller tips skal dekontamineres med 10% blegemiddel. Afgifte altid biologiske sikkerhed fryser overflade og potentielt kontamineret udstyr med 70% EtOH uanset om supernatant er blevet spildt. Hvis der er opstået spild er nødvendig grundig sanering med 1% SDS i 70% EtOH.

  1. Adenoviral titrering med 50% vævskulturinfektiøs dosis (TCID50)
    BEMÆRK: Før transduktion, er det nødvendigt at titrere adenovirale stamopløsning. TCID 50 er en af de bedste metoder til at titrere virale løsning. Fordi metoden evaluerer et titer af en smitsom kapacitet til HEK 293T celler beregnet TCID50 afspejler det faktiske infectability af adenovirus lager. Den PFU (plakdannende units) er proportional med TCID50 med en faktor på omkring 0,56 30.
    1. Forbered celler og værktøjer: HEK 293T celler, 10 cm cellekultur retter, 96 brønde fladbundede celledyrkningsplade, 8-kanals multi pipette
    2. Forbered 70-90% sammenflydende HEK 293T-celler i en 10 cm skål.
    3. Udfør en pre-fortynding på 1/10 4 af virusstamopløsningen. Der tilsættes 50 ul DMEM + 10% FBS til hver brønd i en 96-brønds fladbundet celledyrkningsplade. Tilsæt 25 ul af præ-fortyndet virusstamme i den første række, fra A til H.
    4. Bland godt og overføre 25 ul fra den første række af brønde til den anden række med en 8-kanals multi pipette. Gentag 1/3 fortynding af virusopløsningen til hver række af brønde op til og med 11. række og kassér sidste 25 ul.
    5. Tritureres HEK 293T celler i 10 ml DMEM + 10% FBS. Tilføj 50 ul celle løsning i hver brønd fra rækkerne 1 til 12.
    6. Cellerne inkuberes ved 37 ˚ C i CO2 inkubator for 11-13 dage. Tilføj 50 ul DMEM + 10% FBS efter 4-5 dage og 7-8 dage for plettering.
    7. Mål cytopatiske virkninger i hver brønd ved 11-13 dage efter infektion.
    lane 1 2 3 4. 5. 6 7 8. 9 10 11 12
    Række A d d d d d d d d d
    Række B d d d d d d d d d
    Række C d d d d d d d d d
    Række D d d d d d d d
    Række E d d d d d d d d d d d
    Række F d d d d d d d
    Række G d d d d d d d d
    Række H d d d d d d d d d d d
    antallet af positive brønde pr række 8. 8. 8. 8. 8. 8. 8. 6 5. 2 2 0
    forholdet mellem positive brønde per række 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0,63 0.25 0.25 0
    d Viser over 50% cytopatiske virkninger
    Visning under 50% eller ingen cytopatiske virkninger

    Bane 1, fortynding 3 1 x10 4; bane 2, fortynding 3 2 x10 4; ...; bane 11, fortynding 3 2 x10 11; bane 12, kontrol.
    S = summen af ​​de procentdele positive brønde pr omg
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,75 +0,63 +0,25 +0,25 +0 = 8,875
    TCID50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875 til 0,5) = 2,97 x 10 8
    TCID50 / ml = 5,94 x 10 9

    Tabel 3: Eksempel på en inficeret 96 vel-plade efter 10 dages inkubation Mål cytopatiske effekter i hver brønd og opsummere forholdene mellem positive brønde per række..

    1. Beregn titeren ifølge Kaerber formel
    2. TCID 50 = (fortynding af første bane) x (fortynding) (S-0.5)
    3. S = summen af ​​de procentdele positive brønde pr omg
      BEMÆRK: Vedrørende denne protokol, TCID50 = (30000) x (3) (S-0.5). Fordi 50 ul af viral opløsning anvendes i denne protokol, dividere TCID50 med 0,05 for at beregne TCID 50 / ml.
  2. Adenoviral transduktion
    1. Beregn nødvendige mængde adenoviral løsning fra sin titer (PFU / ml, viruspartikel / ml eller TCID50 / ml). Brug formlen til at beregne MOI (mangfoldighed af infektion).
    2. em> [Place tabel 4 her]
    3. Læg beregnede mængde virus løsning på serum-frit medium (se tabel 5). Bland godt og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
    4. em> [Place Tabel 5 her]
    5. Day7, Tag fad opnået på det sidste trin i afsnit 2.2, og erstatte medium med 750 ul af ny DMEM / MEM indeholdende 5% FBS og P / S.
      BEMÆRK: Reduktion af medium volumenved transduktion til omkring 50% af det oprindelige volumen er kritisk for høj transduktionseffektivitet.
    6. Tilføj fortyndet virusopløsning til skålen. Inkuber fad i 4-8 timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C. Derefter udskiftes med frisk medium.
    7. Inkuber fad i 24-48 timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C. På dag 8-9, Brug celler til live-cell imaging eksperiment. BEMÆRK: Protein ekspression fra det adenovirale plasmid kan bekræftes ved WB eller ICH efter 24-48 timers transduktion for at bestemme den relative protein udtryk niveau (figur 1c og 1d).

4.. Live-cell imaging

  1. Billede erhvervelse ved hjælp af en konfokal spinning disk mikroskop med en temperaturstyret kammer og en CO 2-miljø-system (ekstraudstyr)
    1. Drej temperatur kontrolsystem på mindst 1 time før overtagelsen, således at alle enheder i ligevægt til 37 ˚ C før starten på overtagelsestidspunktet. Tænd confocal spinning disk mikroskop-system (PC til drift, mikroskop, spinning disk enhed, CCD-kamera, lasere, fluorescerende lyskilde, normal lyskilde, motoriseret scene, og automatiske skodder).
      BEMÆRK: Mere end 1 time er nødvendig for at opnå den fuldstændige temperatur ligevægt af alle enheder.
    2. Skift medium i 3,5 cm glasbund retter til ønskede medium for erhvervelse, hvis det er nødvendigt. Sæt fadet på scenen af ​​konfokal spinning disk mikroskop i et temperaturstyret kammer.
      BEMÆRK: På grund sfærisk aberration for optimal observation ved mikroskopi brug af en 3,5 cm glasbund fad med nr. 1.5 dækglas (omkring 0,16-0,19 mm tykkelse) er ideel. Hvis det mål, der anvendes, har en korrektion krave kan billeder opnået med dækglas tykkere end 0,17 mm rettes. Også Phenolrødt har en svag fluorescens. Undertiden foretrækkes det at anvende et phenolrødt frit medium, såsom DMEM uden phenolrødt. Hvis der ikke er en enhed til at kontrollere CO 2-uafhængig medium eller medium buffer af HEPES for langsigtet time-lapse billeddannelse.
    3. Vælg strålegangen til okularerne.
    4. Drej udløseren af ​​den lyse felt lyskilden. Juster fokus til celler under mikroskop gennem okularerne. Drej udløseren til den lyse felt lyskilde slukket.
    5. Drej udløseren for det fluorescerende lys kilde på. Find celler, der udtrykker fluorescerende proteiner under lup gennem okularerne. Drej udløseren for det fluorescerende lyskilde slukket.
    6. Valgfri> Tryk aktivering knappen for den perfekt fokus systemet foran mikroskopet for at tænde perfekt fokus systemet for at holde fokus stabil under tidsforskudt købet.
    7. Skift let sti til spinning disk konfokal mikroskop. Juster indstillinger for erhvervelse passende brug af drifts-software, kontrollere billederne forskyyed på skærmen. (Fx Focus, laser magt, eksponeringstid, CCD kamera gain og off-set)
    8. Indstil indstillinger for det fluorescerende billede erhvervelse hjælp drift software. Eksempel: Vælg "Skift kanal ved hjælp af lys stier" og "Kanal 1: EGFP" at erhverve fluorescerende signal fra EGFP for kanal én.
    9. Indstil frekvensen mellem tidspunkter ved at konfigurere time-lapse-indstillinger for at tage time-lapse billeder ved hjælp af operativsystemet software. Eksempel: At erhverve én gang-point hver 5 minutter, skal du vælge "Minutter pr Time-punkt" fra drop-down menuen, og indtast 5 i tekstfeltet.
      BEMÆRK: Vælg "Maximum Speed" for at lave en film i den faktiske hastighed. Hvis udtryk af det fluorescerende protein er lav, kan fluorescens afblege hurtigt under tidsforskudt erhvervelse. I dette tilfælde er det bedre at reducere antallet af erhvervelse tidspunkter.
    10. Start time-lapse købet ved at klikke på "start "knappen for at hente et billede sekvens.
      BEMÆRK: Det er bedre ikke at bruge multiple-point erhvervelse funktion. Det kan forårsage tab af fokus eller bevægelse af Billedfeltet under tidsforskudt billeddannelse.
  2. Analyse af erhvervede billeder
    BEMÆRK: Erhvervet billeder kan afspilles som en film fil og analyseres ved hjælp af analyse software.
    1. Vælg de erhvervede billeder, der skal indgå i en film. Hvis det er nødvendigt, regioner af interesse fra billeder af afgrøder, og vælg interessante tidspunkter at reducere filstørrelsen af ​​filmen ved hjælp af operativsystemet software.
    2. Eksporter billeder som en film fil i AVI eller MOV format. Vælg en film format fra "Format" drop-down menuen og timingen er nødvendig for den færdige film, og klik derefter på "Eksporter". BEMÆRK: Time-lapse billeder erhvervet på én gang-point hvert 5. minut kan afspilles som en film med 10 billeder per sekund, hvilket er 3.000 gange hurtigere end den faktiske hastighed.
  3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere teknikken, et lentivirus, der koder for EGFP (forstærket grønt fluorescerende protein)-mærkede Cx43 (Connexin43) eller en muteret Cx43 32 blev anvendt til at udtrykke EGFP-mærkede proteiner i celler, og et adenovirus der koder FGFR1DN (fibroblastvækstfaktorreceptor 1 dominant negativ ) blev anvendt til at lukke FGF signalering i cellen 33-35. Tre dage efter isolering af cardiomyocytter, blev de isolerede cardiomyocytter transduceret med lentivirus for at udtrykke EGFP-mærkede proteiner i cellerne. Så efter 3 dage af lentiviral transduktion, blev de isolerede cardiomyocytter yderligere transduceret med et adenovirus, der koder FGFR1DN at fjerne FGF signalering i cellerne. Efter at have ladet tilstrækkelig tid til cellerne til at udtrykke de transducerede exogene gener, blev et konfokalt roterende disk mikroskop bruges til at fange levende celle billeder. Erhvervede billeder afspilles som en film fil og analyseret ved hjælp af billedanalyse software. For mere detaljeret repræresultater tive se Sakurai et al 32.

Ekspressionen af EGFP mærkede proteiner efter lentiviral transduktion blev bekræftet ved konfokal mikroskopi roterende skive 72 timer efter lentiviral transduktion figurerne 1A-B. Udtryk for FGFR1DN ved adenoviral transduktion blev bekræftet af WB og ICC efter 24 timer af adenoviral transduktion Tal 1C-D. Tidspunktet for adenoviral over 3,5 cm skåle blev defineret som tiden 0 og time-lapse billeder blev opnået med en 40x luft NA 0,9 objektiv hver 5 min i 6 timer ved hjælp af et kammer varmelegeme til at holde temperaturen ved 37 ˚ C. Time-lapse billeder af EGFP-mærkede proteiner i de primære cardiomyocytes truffet af konfokal spinning disk mikroskopi er vist i Supplerende Film 1-2.

I tilfælde, hvor temperaturækvilibrering ikke var tilstrækkelig, eller flere dataopsamling var ikke fungerer korrekt,billeder taget kunne bevæge sig i xy planet Supplemental Movie 1. Men når fungerer korrekt autofokus systemet stabilt fastholdt fokus og dette ikke ske. Som vist i Supplemental Movie 2, når temperaturen ligevægt var tilstrækkelig og kun én region af interesse blev erhvervet, de billeder er af meget høj kvalitet.

Slå af cardiomyocytes blev vurderet efter langvarig time-lapse af levende celler med henblik på at bekræfte cellernes levedygtighed. Selv efter 16 timer på time-lapse imaging EGFP udtrykker cardiomyocytes fastholdt deres funktionelle egenskaber og slå rytmisk Supplerende Movie 3.

Figur 1
Fig. 1. Bekræftelse af proteinekspression efter lentiviral eller adenoviral transduktion. (A) Isoleret rotte neonatal cardiomyocytter udtrykker Cx43-WT-EGFP transduceret med Ad-FGFR1DN 3 dage efter transduktion. Se også Supplerende Movie 1. (B) Isolerede rotte neonatal cardiomyocytter udtrykker Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP transduced med Ad-FGFR1DN 3 dage efter transduktion. Se også Supplerende Movie 2. (C) Proteinekspression efter adenoviral transduktion opdaget af ICC 24 timer efter transduktion. Hæmagglutinin (HA)-protein-mærket FGFR1DN blev påvist ved anti-HA-antistof under anvendelse af konventionelle metoder ICC blev alpha-actinin anvendes som en markør for cardiomyocytter. (D) Ekspression af FGFR1DN protein efter adenoviral transduktion detekteret ved WB 24 timer efter transduktion. HA-mærket FGFR1DN blev påvist ved anti-HA-antistof ved WB, blev beta-tubulin som loading kontrol.

Supplerende Movie 1. Time-lapse imaging af isolerede rotte neonatal bil diomyocytes udtrykker Cx43-WT-EGFP transduceret med Ad-FGFR1DN. time-lapse billeder blev erhvervet med en 40x objektiv hver 5 min i 6 timer med en konfokal spinning disk mikroskop. Erhvervede billeder blev afspilles som en film på 10 frames per sekund. Denne film er blevet ændret fra Sakurai m.fl. 32. Klik her for at se denne video.

Supplerende Movie 2. Time-lapse imaging af isolerede rotte neonatal cardiomyocytter udtrykker Cx43-S325/328/330E-EGFP transduceret med Ad-FGFR1DN. Time-lapse billeder blev erhvervet med en 40x objektiv hver 5 min i 6 timer med en konfokal spinning disk mikroskop. Erhvervede billeder blev afspilles som en film på 10 frames per sekund. Denne film er blevet ændret fra Sakurai et al 32."Target =" _blank "> Klik her for at se denne video.

Supplerende Movie 3. Time-lapse imaging af isolerede rotte neonatal cardiomyocytter afspilles på den faktiske hastighed. Time-lapse billeder af isolerede rotte neonatal cardiomyocytter udtrykker Cx43-EGFP transduceret med Ad-FGFR1DN blev erhvervet med en 40x objektiv hver 200 msek for 10 sek med en konfokal spinning disk mikroskop efter 16 timer på time-lapse erhvervelsen. Erhvervede billeder blev afspilles som en film på 5 billeder pr sek ved faktiske hastighed. Klik her for at se denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Primære cardiomyocytter isoleret fra neonatale rotter har længe været anvendt til at undersøge cardiomyocyte funktioner in vitro. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til isolering af neonatale cardiomyocytter fra rotteunger under anvendelse af en totrins-enzym fordoejelsesmetoden først fordøjelse med trypsin O / N ved 4 ° C og derefter renset collagenase. En fordel ved at ansætte den rensede collagenase skridt er, at den samme kvalitet af enzym bruges til alle isoleringer. Således er kvaliteten og mængden af ​​isolerede celler er ensartet fra eksperiment til eksperiment.

På grund af de højere transduktion effektivitet er forbundet med adenovirus, hvis det er nødvendigt for en given eksperiment en høj virkningsgrad af transduktion af cellekultur, er det bedre at anvende et adenovirus. Men hvis høje transduktion ikke er nødvendige, en lentiviral vektor kan anvendes. At have mulighed for at bruge enten adenovirale eller lentivirusvektorer gør det lettere at opnå en passende transduction og udtryk niveauer for forskellige typer af gener. Hvis den fluorescerende intensitet opdaget af live-cell imaging ved hjælp af konfokal spinning disk mikroskop eller ICC er meget lav efter lentiviral transduktion, bruge en anden lentiviral transfer vektor, der benytter en anden promotor til at udtrykke genet af interesse kan løse dette problem. Med adenovirusvektorer, hvis bandet opdaget af WB er svag efter adenoviral transduktion, kan dette indikere en lav titer viral lager. I dette tilfælde er det bedre at forberede en højere titer adenoviral løsning ved formering i celler, før du fortsætter.

En begrænsning ved denne teknik er, at udbyttet af isolerede levedygtige cardiomyocytter ikke er meget ensartet fra eksperiment til eksperiment, selv ved anvendelse af renset collagenase. For at udføre reproducerbare billeddannelse eksperimenter er det bedst at tælle levedygtige celler efter udvælgelsen af ​​isolerede cardiomyocytes i supernatanten ved trin 1.2.13. i protokollen afsnit. Derefter, seed kardiomyocytter på glasbund retter på varierende fortyndinger. Når cellerne har vedhæftet, skal du vælge retter med den passende koncentration celle til eksperimentet planlagt.

Der er mange fordele ved at bruge neonatale cardiomyocytter, men der er også nogle ulemper. Den største ulempe er deres klare forskel fra voksne cardiomyocytter. Fuldt differentierede voksne cardiomyocytes er stang-form og isolerede voksne primære cardiomyocytes opretholde deres stavformet morfologi, mens isolerede neonatale primære cardiomyocytes spredes i alle retninger 36. De fænotypiske forskelle mellem isolerede voksne og neonatale cardiomyocytes afspejles også i deres mønstre af genekspression 37.. Derfor, for eksperimenter, hvor differentierede cardiomyocytes er nødvendige, en protokol til isolering af voksne cardiomyocytes vil være behov 4.

Anvender adenovirale og lentiviral transduktion af rekombinanteproteiner til primære rotte neonatal cardiomyocytter i kombination med konfokal spinning disk mikroskopi giver os mulighed for at analysere de funktioner af proteiner i dyrkede levende primære celler. I forhold til eksisterende metoder, der anvender transfektion at indføre genet af interesse ind i celler, er en væsentlig fordel i denne protokol er at adenovira og lentivirus er meget effektivt optages af celler, hvilket resulterer i ekspression af genet af interesse i næsten alle celler i kulturen. Endvidere er anvendelsen af ​​to forskellige typer af virus til genekspression gør det lettere at opnå passende transduktion priser og ekspressionsniveauer for flere gener. siRNAs og kemiske agonister og-antagonister kan også anvendes i dette system for yderligere at forstyrre og analysere funktionerne af gener og proteiner, de koder.

Forberedelse af hjerter er et yderst vigtigt skridt i protokollen. Fjern hjerter fra kroppen så hurtigt som muligt. Vær sikker på atsætte dem på is umiddelbart at holde cellelevedygtighed høj. Et andet vigtigt skridt er udarbejdelse af høj kvalitet, og titer, lentivirale / adenoviral bestande. Hvis der anvendes dårlig kvalitet virusstamopløsninger vil transduktion og ekspressionsniveauer af genet af interesse være lav. Derfor kan de ikke være egnet til billeddiagnostiske undersøgelser.

En vigtig fremtidig anvendelse af denne teknik vil være at bruge det til mus cardiomyocytes. Pilotundersøgelser teste, om denne metode kan anvendes til isolering af muse neonatale cardiomyocytter har givet lovende resultater. På grund af den relativt lille størrelse af muse hjerter i forhold til de rotter, der er mindre væv opnået i første omgang. Således er færre celler isoleres i en enkelt procedure ved hjælp af den samme antal dyr, men blot at bruge flere mus til isolering bør fjerne denne hindring. Evnen til at isolere mus cardiomyocytes giver forskerne at undersøge funktioner af celler isoleret fra genetisk modificeret mis (transgene, knock-out, knock-in), der er fremstillet for at studere en særlig form af genet af interesse.

En af de største hindringer for kardiovaskulær forskning har været vanskeligheder forbundet med at undersøge ekspressionen og funktionen af et givet gen udtrykkes i hjertevæv in vivo i realtid. Evnen til at isolere funktionelle bankende cardiomyocytter, modulere celle funktioner ved hjælp af viral transduktion, og derefter studere dem i realtid ved hjælp af konfokal spinning disk mikroskop hjælper dog at kaste lys over den rolle kardiomyocytter in vivo og bygge bro over denne kløft. Denne metode giver et forenklet system for at forstå cardiomyocyte funktion på celleniveau. Det giver mulighed for tidstro analyse af, hvordan forstyrrelser i genekspression ændre cardiomyocyte funktion. Live-cell imaging af cardiomyocytes vil give yderligere indsigt i cardiomyocyte funktion. Sådanne indsigter vil føre til fremskridt i grundlæggende cardiovascular forskning, hvilket resulterer i nye terapier til behandling af hjertekarsygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31, (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28, (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79, (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32, (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63, (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62, (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. 264-573 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics