Live-Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Etter adenovirus og Lentiviral Transduksjon Bruke Confocal Spinning Disk Mikros

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Primær neonatale rotte cardiomyocytes er nyttige i grunn in vitro kardiovaskulær forskning, fordi de lett kan isoleres i store mengder i en enkelt prosedyre. På grunn av fremskritt i teknologien mikroskop er det relativt enkelt å fange levende celle bilder med det formål å undersøke cellulære begivenheter i sann tid med minimal bekymring vedrørende fototoksisitet til cellene. Denne protokollen beskriver hvordan du kan ta levende celle timelapse bilder av primære rotte neonatal cardiomyocytes bruke en confocal spinnende disk mikroskop etter lentiviral og adenovirale transduksjon å modulere egenskaper i cellen. Anvendelsen av to forskjellige typer av virus som gjør det lettere å oppnå en passende transduksjon hastighet og ekspresjonsnivåer for to forskjellige gener. Godt fokusert levende celle bilder kan oppnås ved hjelp av mikroskop autofokussystem, som opprettholder stabile fokus i lange tidsperioder. Bruk av denne metoden, funksjoner av eksogent ingeniøred proteiner uttrykt i dyrkede primære celler kan bli analysert. I tillegg kan dette systemet bli brukt til å undersøke funksjonene av gener ved bruk av siRNAs samt av kjemiske modulatorer.

Introduction

Primære rotte neonatal cardiomyocytes har lenge blitt brukt for å undersøke cardiomyocyte funksjon in vitro en. De er lett å isolere fra rotteunger av flere godt etablerte metoder 2-4. Den vanligste metoden benytter kollagenase eller trypsin å fordøye bindevev av hjertet før celleisolasjon. Forskere har også utviklet metoder for å isolere cardiomyocytes fra voksne gnagere 5-8 samt neonatale mus 9,10.

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for isolering av kardiomyocytter fra neonatal rotteunger, anvendelse av en to-trinns enzymoppslutningsprosedyre. Trypsin blir først brukt O / N ved 4 ° C, og deretter renset kollagenase ved 37 ° C. Inkubasjon av hjertevevet med trypsin O / N ved 4 ° C reduserer de nødvendige skritt for å høste cellene i forhold til fremgangsmåter som benytter sekvens inkubasjoner i en varm enzymløsning 2. I tillegg, ved å bruke renset collagenase snarere enn råolje enzymer, kan mye til lot variasjon bli eliminert, og dermed gi bedre reproduserbarhet.

Funksjonelle studier av et bestemt protein benytter ofte et protein-ekspresjonssystem ved hjelp av en adenovirus 11 til 13 og / eller en lentivirus 14-16. [FORBEHOLD NOTE] Den virusproduksjonen og manipulasjon bør utføres i henhold til NIH retningslinjer.

Denne adenovirus ikke integreres i vertsgenomet. Den har en meget høy virkningsgrad for transduksjon i de fleste celletyper, blant delende celler og ikke-delende celler, så vel som primære celler og etablerte cellelinjer. Dette gjør adenovirus en pålitelig vektor for genekspresjon. Høye nivåer av proteinet kodet for av adenovirus vektor utvikle seg i løpet av 48 timer etter transduksjon, og de ​​kan vare i flere uker, 17. Det er imidlertid en ulempe å bruke en adenovirus for proteinekspresjon at utviklingen av et rekombinant adenovirus er både komplisert og tidkrevende. Denne ulempen forklarer delvis hvorfor mange forskere har vært å snu til lentiviruses for rekombinant genuttrykk. I motsetning adenovirus konstruerer, genererer en lentiviral konstruere er raskt og enkelt. Selv lentiviruses generelt har lavere effektivitet ved transduksjon enn adenovirus, i begge dele og ikke-delende celler, de integreres i vertsgenomet. Følgelig, er ekspresjon av genet transduced mer stabil for lentiviruses enn for adeno-virus.

På grunn av teknologiske fremskritt innen mikroskopi, er det mye lettere å fange levende celle bilder av celler som uttrykker rekombinante proteiner. Dette gjelder selv ved video rente hastigheter på kjøpet. Dette gjør det mulig for undersøkeren for å bestemme hvor særlige endringer i proteinet av interesse funksjonelt påvirke cellen i sanntid. Confocal roterende disk mikroskop har flere viktige funksjoner som gjør det en optimal teknikk for live cell imaging 18,19. Den Yokogawa roterende plate tillater langt hurtigere bildeopptak, mens på samme tid å benytte langt mindre kraft enn laserpunkt skanning confocal mikroskoper. Begge disse spesielle funksjoner er på grunn av den roterende disk, som inneholder tallrike confocal hull gjennom hvilket laser passerer samtidig med prøvene. Under oppkjøpet, spinner selve disken raskt og kontinuerlig 18-20. Ved hjelp av autofokussystemet av mikroskopet er stabil vekt opprettholdes over lengre tid. Dette gjør det mulig for forskerne å ta godt fokusert levende celle bilder. Ervervede bildene spilles av som en filmfil. Bildene er analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare som ImageJ 21,22, FIJI 23, eller andre kommersielt tilgjengelig programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Isolering av rotte neonatal cardiomyocytes

  1. Bruk Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og minimum essensielt medium (MEM) supplert med kalvefosterserum (FBS) og penicillin / streptomycin (P / S) som dyrkingsmedium. Legg bromodeoxyuridine (BrdU) til mediet for å hindre vekst av fibroblaster for de første to dagene etter isolasjon.
Base medium FBS BrdU (MM) P / S (U / ml)
utvalg DMEM 10% 0 20
Den første dagen DMEM 10% 0,1 10
Den neste dagen DMEM / MEM 5% 0,1 10
Videre kultur DMEM / MEM 5% 0 10

Tabell 1:. Medium for rotte neonatal cardiomyocytes Bruk dette mediet for dyrkning rotte neonatal cardiomyocytes. DMEM / MEM er 01:01 blanding av DMEM og MEM medium.

  1. Cardiomyocyte isolasjon, Dag 1 (Estimert nødvendig tid, ca 1 time)
    MERK: For arbeid med neonatal gnagere, henvises det til lokale retningslinjer universitet og regler fastsatt av dyr skolefritidsordning, og holder seg til institusjonelt godkjente dyre protokoller. Alle metoder som er beskrevet i denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Yale Animal Resource Center.
    1. Forbered reagenser og verktøy: kalsium-og magnesium-fri Hanks balanserte saltløsning (CMF-HBSS), 30 ml x 2, 10 ml x 2, på is; 1 mg trypsin, oppløses med 2 ml CMF HBSS, på is; autoklaveres verktøy; 70% etanol (EtOH) i 250 ml begerglass; fire sterilisert 10 cm plastetter, tre for isolering av hjerter og en for trypsinering.
    2. Bestill en Litteh av en-til-to dager gamle rotteunger (ca 10 valper) med sin demning fra et forsøksdyr distributer.
    3. Dag1, Transfer valper til små bur og avlive dam med en ketamin / xylazin cocktail (Ketamin, 200ml/10g og xylazin 20ml/10g) overdose.
    4. Ta en valp og sterilisere hele sin kropp med 70% EtOH. Halshogge valp med godt vedlikeholdte skarpe kirurgiske saks på et sterilisert 10 cm plast tallerken på et sted isolert fra andre valpene.
      MERK: For å samle prøvene så raskt som mulig, er det best å bruke den raskeste og mest effektive metoden for å avslutte livet av gnager. Halshogging når det brukes riktig av dyktige fagfolk med godt vedlikeholdt utstyr kan føre til mindre frykt og angst for dyret og være raskere og mer praktisk enn andre former for aktiv dødshjelp. Det er i tråd med anbefalingene fra American Veterinary Medical Association retningslinjer for Avliving av dyr.
    5. Fjern slo hankunst med steriliserte verktøy, og sette hjertet i 30 ml isen kjølt CMF HBSS i 50 ml konisk tube. MERK: Fjern hjertene så raskt som mulig og sette dem på is umiddelbart. Etter fjerning hjertene fra kroppen, bør alle prosedyrer utføres på is.
    6. Samle fem hjerter i 30 ml av is kjølt CMF HBSS og de resterende fem hjerter i ytterligere 30 ml av is kjølt CMF HBSS. Virvle røret for å skylle hjertene. MERK: Etter dette trinnet, utfører alle prosedyrer i en laminær hette.
    7. Kast supernatanten og overføre hjertene til en ny sterilisert 10 cm plast tallerken på is. MERK: Vær forsiktig med å aspirere hjerter med vifte.
    8. Fjern store fartøy og / eller uønsket vev. Tilsett 10 ml isen kjølt CMF HBSS til parabolen å skylle hjertene.
    9. Overfør alle hjerter til en ny sterilisert 10 cm plast tallerken på is. Hakke hjerter med saks til mindre enn 1 mm 3 på is.
    10. Legg 9 ml avkjølt CMF HBSS. Legg en ml avkjølt trypsin rekondisjoneres med CMF HBSS (avsluttende 50 ug / ml).
    11. Tett tallerken med parafilm og dekke den med aluminiumsfolie, og legg det i kaldt rom (4 ˚ C) over natten.
  2. Cardiomyocyte isolasjon, Dag 2 (Antatt nødvendig tid, ca 4 timer)
    1. Forbered reagenser og verktøy: 50 ml konisk tube x 2; 2 mg trypsin inhibitor, oppløses med 1 ml CMF HBSS, på is; 1500 enheter kollagenase, oppløses med 5 ml Leibovitz L-15, ved romtemperatur (RT); Leibovitz L-15, oppløses med 1 liter sterilisert vann og filtreres gjennom et 0,22 pm filter og 8 ml ved RT; 10 mg / ml (32,6 mM) BrdU i vann; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; to 10 cm plast cellekultur retter; 3,5 cm glassbunn retter.
    2. Dag2, Forbereder gelatin belagt retter. Legg en ml 0,1% gelatin løsning å belegge en 3,5 cm glassbunn parabolen for en avbildning eksperiment. Inkuber ved 37 retter ˚ C i flere timer, og deretter suge og kast gelatinoppløsning før bruk.
      NOTE: En 3,5 cm glassbunn kar er egnet for en avbildning eksperiment ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. For å trekke ut proteiner fra primær cardiomyocytes å påvise protein uttrykk ved western blotting (WB), kan 0,1% gelatin belagt plast cellekultur retter brukes.
    3. Overfør all hjertevevet fordøyd av trypsin over natten med buffer til en 50 ml konisk rør på is i sterilisert panseret. Tilsett 1 ml av trypsin-inhibitor i CMF HBSS (avsluttende 182 ug / ml). Lukk lokket 50 ml konisk rør tett for å hindre forurensning.
    4. Inkuber røret i ca 30 min i en 37 ˚ C inkubator å varme vev og buffer til 30-37 ˚ C. Tilsett 5 ml kollagenase i Leibovitz L-15 (endelig 94 enhet / ml). Inkuber ved 37 ˚ C i 45 min med forsiktig risting (170-200 rpm shaker i 37 ˚ C inkubator).
      MERK: Dette trinnet kan gjøres utenfor laminær hette. Alle etterfølgende trinn bør gjøres ved RT.
    5. Desinfiser utsiden av en 50 ml konisk tube med 70% EtOH og setteden i sterilisert hetten.
    6. Triturer vev ved hjelp av automatisk pipette med pipettering ved 3 ml / sek hastighet på 20 ganger. Tillat vev rester til takke med 3 min og filtrere supernatanten med en 70 um celle sil.
      MERK: En vanlig størrelse 10 ml pipette kan brukes for trituration.
    7. Tilsett 5 ml av Leibovitz L-15 til de gjenværende vev klumper og Trituratet og filtrere den overliggende væske igjen. Vask celle sil med 2 ml av Leibovitz L-15.
    8. Plasser filtrert celle-løsning i en hette i 20 - 60 min for å tillate kollagenase å fordøye den delvis nedbrutt kollagen.
    9. Sediment cellene ved 100 x g i 5 min. Re-suspendere cellene i 20 ml DMEM inneholdende 10% FBS og høy konsentrasjon P / S (20 U / ml).
    10. Pre-plate celler på to 10 cm plast cellekultur retter for en time i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C for cardiomyocyte valg. MERK: Fibroblaster feste lettere til bunnen av fatet enn kardiomyocytter.
    11. While venter, klar DMEM inneholdende 10% FBS, P / S (10 U / ml) og 0,1 mM BrdU. Tilsett 1 ml av 10 mg / ml BrdU i 325 ml DMEM inneholdende 10% FBS og P / S.
    12. Swirl retter forsiktig og samle cardiomyocyte inneholder supernatanten fra to 10 cm retter.
      MERK: De fleste kardiomyocytter vil fortsatt være flytende i supernatanten etter en time med inkubasjon. For å unngå forurensing med fibroblaster som er lett festet til parabolen, ikke samler supernatanten ved pipettering.
    13. Valgfritt> Tell celler i supernatanten med og uten 0,2% trypan blått for å kontrollere cellelevedyktighet.
    14. Sediment cellene ved 100 x g i 5 min. Re-suspendere celler i DMEM inneholdende 10% FBS, P / S (10 U / ml) og 0,1 mM BrdU. Plate celler på 2 x 10 5 celler / fatet i gelatin-belagt 3,5 cm glassbunn retter for observasjon ved hjelp av mikroskop. MERK: Ikke forstyrr celler etter plating i minst 24 timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C.
    15. Dag 3, ChaNGE mellom 24 timer etter plating til DMEM / MEM inneholder 5% FBS, P / S og 0,1 mM BrdU.
    16. Dag 4, Endre mellom 48 timer etter plating til DMEM / MEM inneholder 5% FBS og P / S.
      MERK: Endre medium hver 2-3 dager med DMEM / MEM inneholder 5% FBS og P / S.

2. Lentiviral transduksjon

  1. Pakking av lentiviral plasmider
    MERK: Det henvises til andre kilder for ytterligere detaljert informasjon om dette temaet 24-26. Det vil ta ca tre dager å forberede lentiviral løsning. Det er best å bruke fersk lentiviral løsning for å oppnå høyere transduksjon effektivitet. Start pakking av lentiviral plasmider og isolering av rotte neonatal cardiomyocytes i parallell. I stedet for ved hjelp av polyetylenimin (PEI) 27 for pakking av lentiviral plasmider, kan et kommersielt tilgjengelig transfeksjon reagens benyttes. Følg produsentens anvisninger.
    1. Forbered reagenser og verktøy; HEK293T-celler, 10 cm plastcellekultur-retter, lentiviral plasmid løsninger (pMDLg / pRRE, PRSV-Rev, pMD2.G, lentiviral transfer vektor, 1,0 mg / ml hver gang), 1 g / l PEI, serumfritt medium, 20 mM klorokin i vann, 10% blekemiddel, en% SDS i 70% EtOH
    2. Dag 0, Plate 2-2,5 x 10 6 HEK 293T celler per 10 cm parabolen dagen før transfeksjon.
      MERK: 30-60% samløpet ved transfeksjon er optimal.
    3. Dag 1, Forbereder PEI transfeksjon løsning. Tilsett 30 ul av 1 g / l PEI til 960 ul serumfritt medium i et 1,5 ml rør. Tilsett 4-plasmider inn i PEI transfeksjon løsning i 1,5 ml rør og blandes med tappe.
    Navn på plasmid Note Størrelse (KBP) volum tilsatt (ml) Sluttbeløpet i 10 cm tallerken (mg) Endelig konsentrasjon på 10 cm tallerken (PM)
    Lentiviral overføring vektor koder for genet som skal pakkes 9-13 03.06 til 05.02 03.06 til 05.02 60
    pMDLg / pRRE uttrykker HIV-1 GAG / POL 8.8 1,76 1,76 30
    PRSV-Rev uttrykker HIV-1 REV 4.1 0,82 0,82 30
    pMD2.G uttrykker VSV G 5.8 1,16 1,16 30

    Tabell 2:. Mengden av plasmider for lentiviral emballasje Bruk disse plasmid utgjør transfektere HEK293 celler i 10 cm retter. Endelige beløpet av lentiviral overføring vektor per parabolen kan variere i henhold til sin størrelse, vedlikeholde endelig konsentrasjon per fatet ved 60 pM. Gjennomsnittlig molekylvekt av en base par av dobbelt-trådet DNA er 660 dalton.

    1. Kast gamle mediumfra 10 cm rett av HEK 293T celler, og tilsett 9 ml av nye medium (DMEM + 10% FBS, uten P / S).
    2. Legg PEI-DNA-blandingen forsiktig dråpevis på platen og virvle å blande seg med mediet. Tilsett 10 pl av 20 mM klorokin (endelig 20 uM) til 10 ml medium. MERK: Klorokin er antatt å redusere nedbrytning av plasmid-inneholdende komplekser transfeksjon ved partiell nøytralisering av pH-verdien i løpet av lysosomale rom 28.
    3. Inkuber i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C i 6 timer. Deretter fjerner medium inneholdende PEI-DNA blandingen og tilsett 10 ml nytt medium (DMEM + 10% FBS + 20 mM 4 - (2-hydroksyetyl)-1-piperazin-etansulfonsyre (HEPES), pH 7,4 + P / S) . MERK: Etter inkubasjon, viruset vil bli produsert i mediet. Aspirasjonsdetektoren Pasteur pipetter og / eller tips må dekontamineres med 10% blekemiddel. Alltid dekontaminer biologisk sikkerhetskabinett overflaten og potensielt forurenset utstyr med 70% EtOH uansett om supernatant er sølteller ikke. Dersom søl har oppstått, er nødvendig grundig dekontaminering med 1% SDS i 70% EtOH.
    4. Dag 2-3, Inkuber i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C i 48-72 timer. Dag 4, samle lentiviral løsning (fortsatt avsnitt 2.2).
      MERK: Medium kan endres på 48 timer etter transfeksjon. Samle virus supernatant 48 timer og 72 timer to ganger kan oppnå å få høyere titer virus løsninger.
  2. Innsamling av lentiviral løsning og transduksjon
    1. Forbered reagens og verktøy: 15 ml koniske rør, en M HEPES, pH 7,4 (0,22 um filtrert)
    2. Dag 4, Samle supernatanten inneholder lentivirus partikler (lentiviral løsning) med 10 ml sterilt Luer-Lok sprøyte, deretter filtrere supernatanten gjennom 0,45 um filter inn en 15 ml konisk tube. Til 1/100 volum av 1 M HEPES pH 7,4 til filtrert lentiviral-løsning (10 mM endelig).
      MERK: For filtrering, bruk kun cellulose esstate eller polyetersulfon (PES) (lav proteinbinding) filtre. Ikke bruk nitrocellulose filtre. Nitro binder overflateproteiner på lentiviral konvolutten og ødelegger viruset.
    3. Fjern medium fra 3,5 cm retter av rotte neonatal cardiomyocytes, oppnådd ved det siste trinnet i pkt. 1.2, legg en ml filtrert lentiviral løsning på 3,5 cm parabolen.
    4. <Optional> Til hexadimethrine bromid (sluttkonsentrasjon 4-6 ug / ml).
      MERK: Hexadimethrine bromide kan forsterke lentiviral transduksjon effektivitet. Konsentrasjon av hexadimethrine bromid bør optimaliseres.
    5. Inkuber parabolen for seks timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C for lentiviral transduksjon, deretter endre medium til ny DMEM / MEM inneholder 5% FBS og P / S. Inkuber fatet i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C i 3 dager.
      MERK: Integrasjon av eksogene genet i verten genomet av lentivirus anses å være ferdig innen 72 timer.
    6. Dag 7, bruke celler fra trinn 2.2.5 for neste trinn. MERK: Protein uttrykk fra lentiviral plasmid kan bekreftes ved WB eller immunocytochemistry (ICH) etter 48-72 timer av transduksjon for å bestemme den relative uttrykk nivå (Figur 1a og 1b).
  3. Konsentrasjon av lentiviral løsning
    MERK: Det er best å bruke fersk lentiviral løsning for å oppnå høyest transduksjon effektivitet, i tilfelle lentiviral løsning titer er ikke høy nok, lentiviral løsningen kan bli konsentrert ved polyetylenglykol (PEG) nedbør 29.
    1. Utarbeidelse av 4x PEG-løsning (32% PEG6000, 400 mM natriumklorid (NaCl), 40 mMHEPES pH 7,4)
      1. For 125 ml 4x PEG løsning, veier 40 g PEG6000, løs dem opp i 60 ml vann.
        MERK: MERK: (. Dvs. Gjennomsnittlig molekylvekt PEG6000 er 6000) Tallet etter PEG er gjennomsnittlig molekylvekt
        MERK: 2.3.1.2) Sakte legger 10 mlav 5 M NaCl. Sakte legger 5 ml av en M HEPES pH 7,4. Juster pH til 7,4 under anvendelse av 2 M natriumhydroksyd.
        MERK: 2.3.1.3) Tilsett vann til 125 ml. Steril 4x PEG løsning ved membranfiltrering med en 0,22 um filter og lagre den på 4 ˚ C.
    2. Lentivirus konsentrasjon
      1. Filter lentiviral transduseres supernatant inn nye 50 ml tube å bruke en 0,45 um filter.
        MERK: 2.3.2.2) Legg 4x PEG løsning 01:03 ratio (PEG løsning: supernatant = 1:03). Oppbevar ved 4 ˚ C i 16-48 timer.
        MERK: 2.3.2.3) Sentrifuger ved 2600 x g ved 4 ˚ C i 30 min. Kast supernatanten og sentrifuger ved 2600 x g ved 4 ˚ C i 5 min.
        MERK: 2.3.2.4) Kast supernatanten forsiktig for å unngå å forstyrre pelleten. Re-suspendere pelleten i serumfritt medium ved anvendelse av 1/2 til 1/25 volum av det opprinnelige volum supernatant.
        MERK: 2.3.2.5) Bruk direkte eller fryse hjelp av flytende nitrogen og deretter lagre ved -80 ˚ C

Tre. Adenovirus transduksjon

MERK: Det henvises til andre kilder for metoder for konstruksjon og forplantning av adenovirus konstruerer 13. Aspirasjonsdetektoren Pasteur pipetter og / eller tips må dekontamineres med 10% blekemiddel. Alltid dekontaminer biologisk sikkerhetskabinett overflaten og potensielt forurenset utstyr med 70% EtOH uansett om supernatant er sølt. Dersom søl har oppstått, er nødvendig grundig dekontaminering med 1% SDS i 70% EtOH.

  1. Adenoviral titrering med 50% vevkultur infeksiøs dose (TCID 50)
    MERK: Før transduksjon, er det nødvendig å titrere adenovirale stamløsning. TCID 50 er en av de beste fremgangsmåter for å titrere den virale løsning. Fordi metoden evaluerer en titer av en smittsom kapasitet til HEK 293T celler, beregnet TCID 50 gjenspeiler faktiske infectability av adenovirus lager. Den PFU (plakk-forming units) er proporsjonal med TCID 50 med en faktor på omtrent 0,56 30.
    1. Forbered celler og verktøy: HEK 293T celler, 10 cm cellekultur retter, 96-vel flat-bottom cellekultur plate, 8-kanals pipette
    2. Forbered 70-90% konfluent HEK 293T celler i en 10 cm tallerken.
    3. Utføre en pre-fortynning på 1/10 4 av viruset lager. Tilsett 50 pl av DMEM + 10% FBS til hver brønn av en 96-brønns flatbunnet cellekulturplate. Tilsett 25 ul av de forhåndsfortynnede viruslager inn i den første rad, fra A til H.
    4. Bland godt og overfør 25 pl fra den første rekke av brønner til den andre rekke med en 8-kanals pipette. Gjenta 1/3 fortynning av virus-løsning til hver rekke av brønner til og med den 11. raden og kast siste 25 ul.
    5. Trituratet HEK 293T-celler i 10 ml DMEM + 10% FBS. Tilsett 50 pl av celle-løsning til hver brønn av radene 1 til og med 12..
    6. Inkuber cellene ved 37 ˚ C i CO2 inkubator for 11-13 dager. Tilsett 50 ul DMEM + 10% FBS etter 4-5 dager og 7-8 dager med platekledning.
    7. Mål de cytopatiske effekter i hver brønn ved 11 til 13 dager etter infeksjon.
    lane 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Rad A d d d d d d d d d
    Rad B d d d d d d d d d
    Row C d d d d d d d d d
    Row D d d d d d d d
    Row E d d d d d d d d d d d
    Rad F d d d d d d d
    Row G d d d d d d d d
    Rad H d d d d d d d d d d d
    Antall positive brønner per rad 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    forholdet av positive brønner per rad 1 1 1 1 1 1 1 0,75 0,63 0,25 0,25 0
    d Viser over 50% cytopathic effekter
    Viser under 50% eller ingen cytopathic effekter

    Lane 1, fortynning 3 1 x10 4; felt 2, fortynning 3 2 x10 4; ...; lane 11, fortynning 3 2 x10 11; lane 12, kontroll.
    S = summen av forholdene mellom positive brønner per rad
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8.875
    TCID 50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875 til 0,5) = 2,97 x 10 8
    TCID 50 / ml = 5,94 x 10 9

    Tabell 3: Eksempel på en infisert 96 vel-plate etter 10 dager inkubasjonstid Mål cytopathic effekter i hver brønn og oppsummere prosenter av positive brønner per rad..

    1. Beregn titer ifølge Kaerber formel
    2. TCID 50 = (fortynning av første kjørefelt) x (fortynning) (S-0.5)
    3. S = summen av forholdene mellom positive brønner per rad
      MERK: For denne protokollen, TCID 50 = (30 000) x (3) (S-0.5). Fordi 50 ul av viral oppløsning er brukt i denne protokollen, deler TCID 50 av 0,05 til å beregne 50 TCID / ml.
  2. Adenovirale transduksjon
    1. Beregn nødvendig mengde adenoviral løsning fra dens titer (PFU / ml, viral partikkel / ml eller 50 TCID / ml). Bruk formelen for å beregne MOI (mangfold av infeksjon).
    2. em> [Place Tabell 4 her]
    3. Til beregnet mengde av virusløsningen til serumfritt medium (se tabell 5). Bland godt og inkuber 20 min ved RT.
    4. em> [Place Tabell 5 her]
    5. Day7, Ta fatet innhentet i siste trinn i avsnitt 2.2, og erstatte medium med 750 ul av ny DMEM / MEM inneholder 5% FBS og P / S.
      MERK: Reduksjon av middels volumved transduksjon til omtrent 50% av det opprinnelige volumet er kritisk for transduksjon høy effektivitet.
    6. Legg fortynnet virus løsning til parabolen. Inkuber tallerken for 4-8 timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C. Deretter kan du erstatte med friskt medium.
    7. Inkuber parabolen for 24-48 timer i CO 2 inkubator ved 37 ˚ C. På dag 8-9, Bruk celler for live-cell imaging eksperiment. MERK: Protein uttrykk fra adenovirale plasmid kan bekreftes ved WB eller ICH etter 24-48 timer av transduksjon for å bestemme den relative protein uttrykk nivå (Figur 1c og 1d).

4. Live-cell imaging

  1. Bilde innsamlingen med en confocal spinnende disk mikroskop med en temperaturstyrt kammer og et CO 2 miljøsystem (valgfritt)
    1. Drei temperaturkontroll system på minst 1 time før kjøpet, slik at alle enheter likevekt til 37 ˚ C før starten av oppkjøpet. Slå på confocal spinne disk mikroskop system (PC for drift, mikroskop, spinning disk enhet, CCD-kamera, lasere, fluorescerende lyskilde, normal lyskilde, motorisert scenen, og automatiske persienner).
      MERK: Mer enn en time er nødvendig for å oppnå den fullstendige temperaturstabilisering av alle enheter.
    2. Endre medium i 3,5 cm glassbunn retter til ønsket medium for oppkjøpet, hvis det er nødvendig. Sett fatet på scenen av confocal roterende disk mikroskop i et temperaturkontrollert kammer.
      MERK: På grunn av sfærisk aberrasjon for optimal observasjon ved mikros bruk av en 3,5 cm glassbunn tallerken med nr 1,5 cover glass (ca 0,16 til 0,19 mm tykkelse) er ideelt. Hvis målet som brukes har en korreksjon krage, kan bildene innhentet med dekkglass tykkere enn 0,17 mm korrigeres. Dessuten har fenolrødt en svak fluorescens. Noen ganger er det foretrukket å anvende en fenol rød fri medium, slik som DMEM uten fenolrødt. Hvis det ikke er noen som skal kontrolleres CO 2 uavhengig medium eller medium bufret av HEPES for langsiktig time-lapse bildebehandling.
    3. Velg lysbanen til okularene.
    4. Slå lukkeren av den lyse-feltet lyskilden. Juster fokus på celler i mikroskop gjennom okularene. Slå lukkeren for den lyse-feltet lyskilde off.
    5. Slå lukkeren for den fluorescerende lyskilde på. Finn celler som uttrykker fluorescerende proteiner under mikroskopet gjennom okularene. Slå lukkeren for den fluorescerende lyskilde off.
    6. Valgfritt> Trykk aktiveringsknappen for den perfekte fokussystem foran mikroskopet for å slå den perfekte fokussystem på for å holde fokus stødig under time-lapse oppkjøpet.
    7. Endre lysbanen til roterende disk confocal mikroskop. Juster innstillinger for erverv hensiktsmessig med programvaren, sjekke bilder displaYed på skjermen. (F.eks Focus, laser makt, eksponeringstid, CCD-kamera gevinst og off-set)
    8. Angi innstillinger for fluorescerende bilde innsamlingen med drifts programvare. Eksempel: Velg "Endre kanaler ved hjelp av lys stier" og "Kanal 1: EGFP" å skaffe fluorescerende signal fra EGFP for kanal en.
    9. Angi frekvensen mellom tidspunkter ved å konfigurere time-lapse-innstillingene for å ta time-lapse bilder med programvaren. Eksempel: Hvis du vil kjøpe en gang-point hvert 5. minutt, velg "Minutter per Time-point" fra rullegardinmenyen, og skriv 5 i tekstfeltet.
      MERK: Velg "Maximum Speed" for å lage en film på faktiske hastigheten. Hvis uttrykk for fluorescerende protein er lav, kan fluorescens bleke raskt under time-lapse oppkjøpet. I så fall, er det bedre å redusere antall time-poeng oppkjøp.
    10. Start time-lapse oppkjøpet ved å klikke på "start "-knappen for å skaffe seg en bildesekvens.
      MERK: Det er bedre å ikke bruke den flere-poeng oppkjøpet funksjon. Det kan føre til tap av fokus eller bevegelse av bildefeltet under time-lapse bildebehandling.
  2. Analyse av oppkjøpte bilder
    MERK: Kjøpte bilder kan spilles av som en filmfil og analysert ved hjelp av analyseprogrammet.
    1. Velg de oppkjøpte bilder som skal inkluderes i en film. Hvis det er nødvendig, beskjære regioner av interesse fra bilder og velge interessante tidspunkter for å redusere filstørrelsen på filmen med programvaren.
    2. Eksport av bilder som en filmfil i AVI eller MOV format. Velg et filmformat fra "Format" drop-down menyen og timing er nødvendig for den ferdige filmen, og klikk deretter på "Export". MERK: Time-lapse bilder ervervet på en gang-point hvert 5. minutt kan spilles av som en film på 10 bilder per sekund, noe som er 3000 ganger raskere enn den faktiske hastigheten.
  3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere teknikken, et lentivirus koding EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein)-merket Cx43 (Connexin43) eller en mutert Cx43 32 ble brukt til å uttrykke EGFP-merket proteiner i celler, og en adenovirus koding FGFR1DN (fibroblast growth factor receptor en dominerende negative ) ble brukt til å stenge FGF signale i cellen 33-35. Tre dager etter isolering av cardiomyocytes, ble de isolerte cardiomyocytes transduced med lentivirus for å uttrykke EGFP-kodede proteiner i cellene. Deretter etter 3 dager av lentiviral transduksjon, ble de isolerte cardiomyocytes videre omformet til en adenovirus som koder FGFR1DN å eliminere FGF signalisering i celler. Etter å ha gitt nok tid for cellene å uttrykke transduserte eksogene gener, ble en confocal spinnende disk mikroskop brukes til å fange levende celle bilder. Ervervede bildene spilles av som en filmfil og analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare. For mer detaljert representantertive resultater kan du se Sakurai et al 32.

Uttrykket av EGFP tagget proteiner etter lentiviral transduksjon ble bekreftet av confocal roterende disk mikros 72 timer etter lentiviral transduksjon Tall 1A-B. Uttrykket av FGFR1DN av adenovirus transduksjon ble bekreftet av WB og ICC etter 24 timer av adenovirus transduksjon Tall 1C-D. Tidspunktet for adenoviral tillegg til 3,5 cm retter ble definert som tiden 0 og time-lapse bilder ble ervervet med en 40x luft NA 0,9 objektivlinse hver 5 min i 6 timer ved hjelp av et kammer ovn for å holde temperaturen ved 37 ˚ C. Time-lapse bilder av EGFP-merket proteiner i primær cardiomyocytes tatt av confocal roterende disk mikroskopi er vist i Supplemental Movies 1-2.

I tilfeller hvor stabilisering av temperaturen var ikke tilstrekkelig, eller multiple-oppkjøpet modus var ikke fungerer som den skal,bilder tatt kan bevege seg i xy planet Supplemental Movie en. Men når man jobber riktig autofokussystemet opprettholdes stabilt fokus og dette skjedde ikke. Som vist i Supplemental Movie 2, når temperaturstabilisering var tilstrekkelig og bare én region av interesse ble kjøpt, bilder tatt er av meget høy kvalitet.

Den juling av cardiomyocytes ble vurdert etter langsiktige time-lapse levende celle bildebehandling for å bekrefte celle levedyktighet. Selv etter 16 timer av time-lapse bildebehandling EGFP uttrykker cardiomyocytes opprettholdt sine funksjonelle egenskaper, og slo rytmisk Supplemental Movie 3.

Figur 1
Figur 1. Bekreftelse av protein uttrykket etter lentiviral eller adenovirale transduksjon. (A) Isolert rotte neonatal cardiomyocytes uttrykker Cx43-WT-EGFP omformet med Ad-FGFR1DN tre dager etter transduksjon. Se også Supplemental Movie en. (B) Isolerte rotte neonatal cardiomyocytes uttrykker Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP omformet med Ad-FGFR1DN tre dager etter transduksjon. Se også Supplemental Movie 2. (C) Protein uttrykket etter adenovirale transduksjon oppdaget av ICC 24 timer etter transduksjon. Hemagglutinin (HA) protein-merket FGFR1DN ble påvist ved anti-HA-antistoff ved hjelp av konvensjonelle metoder ICC, ble alfa-actinin anvendes som en markør for kardiomyocytter. (D) Expression of FGFR1DN protein følgende adenoviral transduksjon detektert av WB 24 timer etter transduksjon. HA-merket FGFR1DN ble oppdaget av anti-HA antistoff etter WB, ble beta-tubulin brukt som lasting kontroll.

Supplerende Movie en Time-lapse avbildning av isolert rotte neonatal bil. diomyocytes uttrykker Cx43-WT-EGFP omformet med Ad-FGFR1DN. time-lapse bilder ble kjøpt med et 40x objektiv hvert 5 min for 6 timer med en confocal spinnende disk mikroskop. Ervervede bildene ble spilt tilbake som en film på 10 bilder per sekund. Denne filmen har blitt forandret fra Sakurai et al 32. Vennligst klikk her for å se denne videoen.

Supplerende Movie 2. Time-lapse avbildning av isolerte rotte neonatal cardiomyocytes uttrykker Cx43-S325/328/330E-EGFP transduced med Ad-FGFR1DN. Time-lapse bilder ble kjøpt med et 40x objektiv hvert 5 min for 6 timers med en confocal spinne disk mikroskop. Ervervede bildene ble spilt tilbake som en film på 10 bilder per sekund. Denne filmen har blitt forandret fra Sakurai et al 32."Target =" _blank "> Klikk her for å se denne videoen.

Time-lapse avbildning av isolerte rotte neonatal cardiomyocytes supplerende Movie 3. Avspilt i faktiske hastigheten. Time-lapse bilder av isolert rotte neonatal cardiomyocytes uttrykker Cx43-EGFP omformet med Ad-FGFR1DN ble kjøpt med et 40x objektiv hver 200 msek for 10 sek med en confocal spinnende disk mikroskop etter 16 timer av time-lapse oppkjøpet. Ervervede bildene ble spilt tilbake som en film på 5 bilder per sekund ved faktiske hastigheten. Vennligst klikk her for å se denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Primære cardiomyocytes isolert fra nyfødte rotter har lenge blitt brukt til å studere cardiomyocyte funksjoner in vitro. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for isolering av neonatale kardiomyocytter fra rotteunger ved hjelp av en to-trinns enzymfordøyelsesmetode, først fordøyd med trypsin O / N ved 4 ° C og deretter renset collagenase. En fordel ved anvendelse av det rensede kollagenase trinn er at den samme grad av enzym blir brukt for alle isoleringer. Således, kvaliteten og mengden av isolerte celler konsekvent fra eksperiment til eksperiment.

Gitt de høyere transduksjon effektiviteten forbundet med adenovirus, hvis en høy effektivitet for transduksjon av cellekultur som er nødvendig for et gitt eksperiment, er det bedre å bruke en adenovirus. Imidlertid, dersom høye nivåer av transduksjon ikke er nødvendig, et lentiviral vektor kan benyttes. Å ha muligheten til å bruke enten adenovirus eller lentiviral vektorer gjør det lettere å oppnå en hensiktsmessig transduction og uttrykk nivåer for ulike typer gener. Hvis den fluorescerende intensitet detektert av levende celler avbildning ved hjelp av konfokal roterende disk mikroskop eller ICC er meget lav etter lentiviral transduksjon, ved hjelp av en annen lentiviral overføringsvektor som bruker en annen promoter for å uttrykke genet av interesse kan løse dette problem. Med adenovirus vektorer, dersom den oppdages av WB bandet er svak etter adenovirale transduksjon, kan dette tyde på et lavt titer viral lager. I dette tilfelle er det bedre å fremstille en høyere titer adenoviral løsning ved forplantning i cellene før fortsetter.

En begrensning ved denne teknikken er at utbyttet av isolerte levedyktige cardiomyocytes er ikke meget ensartet fra eksperiment til eksperiment, selv ved bruk av renset collagenase. For å utføre reproduserbare avbildnings eksperimenter er det best å telle levedyktige celler etter valg av isolerte cardiomyocytes i supernatanten fra trinn 1.2.13. i protokollinformasjonen. Så, seed cardiomyocytes på glassbunn retter på varierende fortynninger. Når cellene har festet, velger retter med passende cellekonsentrasjonen for forsøket planlagt.

Det er mange fordeler med å bruke neonatal cardiomyocytes, men det er også noen ulemper. Den store ulempen er deres klar forskjell fra voksne cardiomyocytes. Fullt differensierte voksne cardiomyocytes er stang-form og isolerte voksne primære cardiomyocytes opprettholde sin stavformet morfologi, mens isolerte neonatale primære cardiomyocytes spredt i alle retninger 36. De fenotypiske forskjeller mellom isolerte voksne og neonatale cardiomyocytes er også reflektert i sine mønstre av genuttrykk 37. Derfor, for eksperimenter hvor differensierte cardiomyocytes er nødvendige, en protokoll for isolering av voksen cardiomyocytes vil være nødvendig 4..

Ansette adenovirus og lentiviral transduksjon av rekombinantproteiner til primære rotte neonatal cardiomyocytes i kombinasjon med confocal roterende disk mikroskopi tillater oss å analysere funksjoner av proteiner i dyrkede levende primære celler. I forhold til eksisterende fremgangsmåter, som utnytter transfeksjon for å innføre genet av interesse inn i cellene, er en betydelig fordel med denne protokoll som adenovirus og lentiviruses er meget effektivt tatt opp av celler som resulterer i ekspresjon av genet av interesse i nesten alle celler i kulturen. Videre gjør bruk av to forskjellige typer av virus for genekspresjon det lettere å oppnå riktig transduksjon rater og ekspresjonsnivåer for flere gener. siRNAs og kjemiske agonister og antagonister kan også brukes i dette systemet for ytterligere å forstyrre og analysere funksjoner av gener og proteiner som de koder for.

Utarbeidelse av hjertene er et svært viktig skritt i protokollen. Fjern hjertene fra kroppen så raskt som mulig. Pass på åsette dem på isen umiddelbart for å holde celle levedyktighet høy. Et annet viktig skritt er utarbeidelsen av høy kvalitet, og titer, lentiviral / adenovirus aksjer. Hvis dårlig kvalitet viral aksjer blir brukt, vil transduksjon og uttrykk nivåer av genet av interesse være lav. Derfor kan de ikke være egnet for bildediagnostikk.

En viktig fremtidig anvendelse av denne teknikken vil være dens 'bruk i muse kardiomyocytter. Pilotstudier testing om denne metoden kan anvendes for isolering av neonatale mus cardiomyocytes har gitt lovende resultater. På grunn av den relativt lille størrelsen på mus hjerter sammenlignet med de av rotter, er mindre vev erholdt i utgangspunktet. Således er færre celler isolert i en enkelt prosedyre ved bruk av det samme antall dyr, men ganske enkelt ved å bruke mer mus for isolering skal eliminere denne hindring. Evnen til å isolere mus cardiomyocytes tillater forskere å undersøke funksjonene til celler isolert fra genetisk modifiserte mice (transgene, knock-out, knock-in) som er produsert for å studere en bestemt form av genet av interesse.

En av de viktigste hindringer i hjerte-forskning har vært vanskeligheten forbundet med å undersøke ekspresjon og funksjon av et gitt gen uttrykt i hjertevevet in vivo i sanntid. Men evnen til å isolere funksjonelle juling cardiomyocytes, modulere cellefunksjoner ved hjelp av viral transduksjon, og deretter studere dem i sanntid ved hjelp av confocal roterende disk mikroskop bidrar til å kaste lys over rollen som cardiomyocytes in vivo og bygge bro over dette gapet. Denne metoden gir et forenklet system for å forstå cardiomyocyte funksjon på cellenivå. Det gir mulighet for sanntids analyse av hvordan forstyrrelser i genuttrykk endre cardiomyocyte funksjon. Live-cell imaging av cardiomyocytes vil gi ytterligere innsikt i cardiomyocyte funksjon. Slike innsikter vil føre til fremskritt innen grunnleggende cardiovascular undersøkelser, noe som resulterer i nye behandlingsformer for behandling av kardiovaskulær sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31, (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28, (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79, (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32, (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63, (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62, (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. 264-573 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics