تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وهناك طريقة لتقييم قدرة معزولة الضامة السنخية الماوس للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة من قبل الرشاشيات المجهري متحد البؤر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الرئة هو واجهة حيث تتعرض الخلايا المضيفة بشكل روتيني للميكروبات والمنتجات الميكروبية. الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الفطريات والميكروبات الأخرى المستنشق. الضامة والخلايا المناعية الأخرى تعترف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض والشروع في الاستجابات الالتهابية المصب. أوكسيديز NADPH بلعمية يولد سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس) وهذا أمر مهم للدفاع المضيف. على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف 1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وكان الهدف من هذه الدراسة لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم 4. هنا، نحن تصف طريقة لتقييم قدرة الفأرالضامة lveolar (AMS) للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة الرشاشيات (غبيرات). هي ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي وعزل بعد عشرة أيام من الفئران عن طريق غسل القصبات (BAL). ومطلي الضامة على coverslips الزجاج، ثم المصنف مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، معربا عن A. جراثيم فوميجاتوس. في أوقات محددة، يتم إصلاح الخلايا ويتم تقييم عدد الضامة سليمة مع الجراثيم المبتلعة بواسطة المجهر متحد البؤر.

Introduction

الضامة السنخية هي الخلايا البلعمية الخط الأول التي تواجه الميكروبات المستنشق. الضامة الاعتراف الزخارف الرشاشيات بواسطة مستقبلات الاعتراف الممرض، واستيعاب الحد من نمو الجراثيم استنشاقه (غبيرات)، والشروع في الاستجابات الالتهابية. أوكسيديز NADPH بلعمية يحول الأكسجين الجزيئي لأنيون الفائق والمصب سيطة الاكسجين التفاعلية (رويس). الداء الحبيبي المزمن (CGD) هو اضطراب وراثي من أوكسيديز NADPH تتميز الالتهابات البكتيرية والفطرية الشديدة والاستجابات الالتهابية المفرطة.

على الرغم من NADPH أوكسيديز هو أمر حاسم لبوساطة العدلات دفاع المضيف 1-3، ليست محددة جيدا أهمية NADPH أوكسيديز في الضامة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الضامة السنخية استيعاب وقتل الجراثيم الرشاشيات، في حين تستهدف أساسا العدلات المرحلة خوطي 5. ومع ذلك، فقد كان هناك تضارب بالنتيجهنهاية الخبر لدور أوكسيديز NADPH في البلاعم في السيطرة على نمو A. فوميجاتوس جراثيم 6، 7.

وكان الهدف من هذا الأسلوب لتحديد دور محدد من NADPH أوكسيديز في الضامة في التوسط الدفاع المضيف ضد A. جراثيم فوميجاتوس. وجدنا أن أوكسيديز NADPH في الضامة السنخية تسيطر على نمو المبتلعة A. فوميجاتوس جراثيم 4. لنمذجة الأكثر تطابقا استجابة المضيف لاستنشاق الفطريات، استخدمنا الضامة السنخية المقطوع من قبل غسل الشعبى من الفئران unstimulated التالية التضحية فورا. استخدام الضامة السنخية معزولة مكنتنا من التركيز على نشاطهم مضاد للفطريات في غياب الخلايا المناعية الأخرى (على سبيل المثال، العدلات المعينين) التي تدافع ضد الرشاشيات في الجسم الحي. في هذه الطريقة، كانت ملطخة الضامة السنخية في الجسم الحي قبل الحصاد وذلك لتقليل كمية من التلاعب في مرحلة ما بعد الحصاد. </ ع>

ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام، معربا عن GFP A. فوميجاتوس السلالة. هذه الفطريات عن GFP من مرحلة غبيري خلال المرحلة خوطي وليس لديها الحاجة إلى مزيد من تلطيخ. للحصول على صور مع بمزيد من التفصيل، اخترنا المجهري متحد البؤر والتي تمكن إعادة بناء هياكل ثلاثية الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها. إعادة البناء ثلاثي الأبعاد يعطي القدرة على التفريق بين خيوط متنامية في جميع أنحاء بدلا من أو من خلال البلاعم. غبيرات يمكن أيضا أن تكون متميزة تماما كما داخل الخلايا مقابل خارج الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام في معهد روزويل بارك للسرطان وامتثلت لجميع الدولة الاتحادية، والمعاهد الوطنية للصحة اللوائح.

1. في الجسم الحي بلعم صفها

ملاحظة: PHK26 هو صبغ محبة للدهون التي سيتم تناولها من قبل الخلايا البلعمية في كل من الدورة الدموية والأنسجة في عندما تدار عن طريق الوريد (رابعا). وقد استخدم PKH26 لوضع العلامات في الجسم الحي لتقليل كمية من التلاعب ما بعد الحصاد من البلاعم. PKH-26 في الاستفادة من تراكم ثابت في الضامة السنخية على مدى فترات طويلة. الانتظار بعد 10 أيام الإدارة يسمح لتطهير جميع الخلايا المسمى من التداول البلاعم السنخية ولم يتبق سوى المسمى ثابت مع PKH26 8، 9. PKH26 هو تألقي الحمراء التي لديها الإثارة (551 نانومتر) والانبعاثات (567 نانومتر) الخصائص المتوافقةمع أنظمة رودامين أو الكشف فيكوإيريترين. يمكن لأي إجراءات وضع العلامات إدخال قطعة أثرية، بما في ذلك فقدان قدرتها على البقاء. ومع ذلك، وبما أننا نستخدم نفس النهج لوضع العلامات الضامة في المورثات الماوس مختلفة (على سبيل المثال، WT-أوكسيديز NADPH مقابل ناقص)، وآثار هذه الأعمال الفنية أن تكون موحدة.

  1. تمييع الحل الأسهم من PKH26 (1 × 10 -3 M في الإيثانول) في 01:05 مخفف C المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
  2. تحميل 100 ميكرولتر من المخفف PKH26 إلى الأنسولين حقنة 1/2 مل (29 G × 1/2 ") لكل الماوس.
  3. إدارة على الفئران عن طريق الحقن الرابع (إما الذيل الوريد أو الرجعية المدارية) 10 يوما على الأقل قبل الحصاد.

2. حصاد الضامة السنخية بواسطة القصبات الغسل (BAL)

يمكن أن تختلف في عدد من الفئران لاستخدامها في تجربة. A العائد نموذجية من الماوس unstimulated هو في حدود 3-5 × 10 5 الضامة السنخية، ولكن هذا العدد يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا النحتإد على عوامل مثل حجم الفأر، خبرة الشخص أداء غسيل، وعدد instillations من السائل غسل وحجم سحبها من الرئتين. في هذا البروتوكول يتم تنفيذ غسيل الرئة مع تجويف الصدري المغلقة التي جنبا إلى جنب مع تكرار 1 مل lavages يساعد على زيادة الغلة الخلية.

  1. الموت ببطء الماوس عن طريق إدارة جرعة قاتلة من مخدر AVERTIN (12.5 ملغ) الغشاء البريتونى (IP) باستخدام ظروف معقمة للحفاظ على محلول معقم.
  2. رذاذ الماوس تماما مع الايثانول 70٪.
  3. إزالة الجلد من نهاية الجمجمة من الحيوان تعريض الصدر (الشكل 1A).
    1. جعل قطع صغير في الجلد فقط تحت الحجاب الحاجز.
    2. إدراج إصبع في خفض وسحب الجلد بعيدا عن نهاية الجمجمة من (1A الشكل) الحيوان.
    3. دفع ما يصل قليلا على الرأس، وتمتد الجانب البطني من الرقبة (الشكل 1A).
  4. قطع ثقب صغير من خلال القفص الصدريفي الجانب الأيمن من الصدر لامتصاص التضخم الرئتين وأيضا يسمح التصور من الرئتين خلال الخطوات التالية.
  5. تحديد موقع القصبة الهوائية، وبعناية تشريح الأنسجة المحيطة بها بعيدا.
    1. إزالة الغدد اللعابية والعضلات العضلة القصية والحنجرة، وما إلى ذلك مع ملقط المنحني.
    2. رفع بعناية مع ملقط المنحني وقطع مع مقص النسيج الرقيق الذي يغطي القصبة الهوائية (البرانية) الكشف عن بنية الغضروف الحلقية الأساسية.
  6. إدراج قسطرة في القصبة الهوائية.
    1. باستخدام ملقط المنحني، ووضع خياطة وراء (الظهرية ل) القصبة الهوائية وسحب بطول 10 سم من خلال فتح.
    2. بدءا فوق الحلقي (حلقة سميكة من غضروف) توجيه بعناية 22 G قسطرة أسفل القصبة الهوائية وقف حيث يختفي القصبة الهوائية وراء القص.
    3. بحزم التعادل خياطة حول القصبة الهوائية والقسطرة لنوبة دافئ. إزالة الإبرة من القسطرة.
  7. تجميع 4 في اتجاه محبس.
    1. شغلواحد 6 مل المحاقن مع DPBS، 1٪ FBS ونعلق على 4 في اتجاه محبس كما هو مبين في الشكل 1B.
    2. إرفاق فارغة 6 مل حقنة في موقف مبين على 4 في اتجاه محبس (الشكل 1B).
    3. إرفاق منفذ مفتوح على 4 في اتجاه محبس لقسطرة (الشكل 1B). نكون حذرين حتى لا طرد القسطرة من القصبة الهوائية.
  8. جمع السائل غسل من الرئتين.
    ملاحظة: المحققون قد تختار لاستخدام وحدات التخزين أقل من السوائل غسيل لتقليل احتمال حدوث تلف في الأنسجة. من المهم أن نفس النهج يتم تطبيقها باستمرار في جميع الفئات الماوس.
    1. تحويل مقبض على محبس حتى يتم إغلاق حقنة فارغة وحقن ببطء ~ 1 مل DPBS، 1٪ FBS لتضخيم الرئتين. مراقبة التضخم الرئة من خلال قطع حفرة في الخطوة 2.4.
    2. يجب الحرص على عدم overinflate الرئتين.
    3. تحويل مقبض على محبس بحيث يتم إغلاق حقنة كاملة، وسحب بعناية الانفلونزا معرف من الرئتين.
    4. مراقبة الرئتين فرغ من خلال قطع حفرة في الخطوة 1.4. قد تحتاج القسطرة أن تحرك حركة طفيفة في الظهر أو إيابا للحصول على قرعة جيدة. اتخاذ الاحتياطات الخاصة للحفاظ على القسطرة داخل القصبة الهوائية.
    5. كرر الخطوات من 2.8.1-2.8.4 5-6X حتى كل DPBS، 1٪ تم حقن FBS وسحبها من الرئتين. ملاحظة: سوف استرداد السوائل الرئة لا تكون 100٪ من سائل المحقون.
  9. حقنة فارغة بسائل غسيل في أنبوب مخروطي 50 مل. إبقاء الخلايا في درجة حرارة الغرفة.
  10. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتصب قبالة طاف. يمكن حفظ هذا لتحليل خلوى اذا شئت.
  11. الخلايا resuspend في 1-5 مل 1640 RPMI مع FBS 10٪ والاعتماد على عدادة الكريات. في الماوس unstimulated، ومن المتوقع أن تكون الضامة، والتي يمكن التأكد من الخلايا> 95٪ من الخلايا تحصد BAL.

3. التثقيف وحصاد الفطر

"> وفوميجاتوس الرشاشيات المستخدمة في هذا البروتوكول عن GFP في جميع مراحل دورة حياتها: جراثيم، germlings وخيوط وقدمت هذه السلالة الفطرية الدكتور مارجو مور، جامعة سايمون فريزر، برنابي، BC، كندا.

  1. لوحة غبيرات من سلالة الرشاشيات الدخناء معربا عن GFP في سابورو القلب ضخ الدماغ (بهي) أجار الميول مع كلورامفينيكول (0.05 ز / L) وجنتاميسين (0.5 جم / لتر).
  2. احتضان في الظلام توج فضفاضة لمدة 7 إلى 10 أيام في درجة حرارة الغرفة.
  3. الحصاد غبيرات عن طريق الغسيل الميل مع 10 مل من 0.01٪ توين 20 في DPBS. بخفة كشط الفطر مع stripette لتخفيف. شطف مائل عدة مرات لزيادة الغلة.
  4. تمرير تعليق غبيري من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر إلى 50 مل المخروطية.
  5. بيليه غبيرات بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. غبيرات resuspend في 50 مل DPBS والعد باستخدام عدادة الكريات.
  7. يغسل مرتين مع DPBS وتمييع لتركيزات المطلوبالفلترة.

4. التحدي الفطرية ومتحد البؤر المجهري

للتحقيق في دور بلعم NADPH أوكسيديز في الدفاع المضيف، تم تقييم قدرة الضامة السنخية الفئران المعزولة من ثلاثة أنماط جينية للسيطرة على نمو الجراثيم المبتلعة الرشاشيات. وتشمل الطرز الوراثية المستخدمة في هذه الدراسة؛ 1) من النوع البري الفئران، 2) Ncf1 * / * المنغنيز والفئران مع طفرة Ncf1 طبيعيا (Ncf1 بترميز لphox P47، مكون مطلوب من أوكسيديز NADPH بلعمية) تركهم NADPH أوكسيديز ناقصة، و3) Ncf1 * / * المنغنيز + الفئران المعدلة وراثيا (MN يدل على التحوير ايواء wildtype Ncf1 تحت سيطرة المروج CD68 الإنسان) حيث تم إعادة تشكيل NADPH أوكسيديز النشاط في عدد السكان الوحيدات / بلعم 10، 11.

هو الانسب المجهري متحد البؤر لهذا الفحص نظرا لوجودونمو غبيرات غير المبتلعة على الشرائح. سوف المجهر متحد البؤر تسمح لرؤية الطائرات الفردية ضمن Z-المحور، وتمكين التفريق بين الفطريات المتنامية في جميع أنحاء بدلا من داخل البلاعم. يتم الحصول على جميع الصور متحد البؤر باستخدام عدسة 63X الغمر النفط. يتم الحصول على Z-مداخن مع عامل التكبير الإلكترونية من 2.5. يتم تحديد سمك Z-مكدس باستخدام دابي والصور مجال مشرق لتحديد أعلى وأسفل الحقل. تراوحت Z-مداخن 14-24 ميكرومتر مع شرائح الفردية ~ 1 ميكرون سميكة. لتقدير حجم الضامة، وأجريت عمليات الفحص واحدة من التكبير الإلكترونية 1X على 10 حقول في التركيب الوراثي. وحددت الضامة سليمة على أساس PKH26 وتلطيخ دابي من الغشاء والنواة على التوالي. وقد تم تحديد غبيرات على أساس التعبير FITC وصورة حقل مشرق.

  1. إعداد coverslips العقيمة وألواح
    1. تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ونقع 22 × 22 مم coverslips الزجاج في 70٪ ethanoلتر لمدة 5-10 دقيقة.
    2. شطف coverslips في برنامج تلفزيوني العقيمة.
    3. باستخدام ملقط معقم، ووضع بلطف ساترة واحد في الجزء السفلي من كل بئر من العقيمة معبأة منفردة وحة 6 جيدا.
  2. البذور ~ 1 × 10 6 تحصد المسمى PKH26 الضامة السنخية علقت في 300 ميكرولتر RPMI 1640، 10٪ FBS على كل ساترة. قد تختلف العدد الدقيق اعتمادا على محصول الحصاد.
  3. تسمح بلعم على الالتزام التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
  4. في صباح اليوم التالي، إضافة ~ 1 × 10 معربا عن GFP A. فوميجاتوس غبيرات علقت في 100 ميكرولتر قبل حرارة (37 درجة مئوية) RPMI 1640، 10٪ FBS.
  5. العودة إلى لوحة الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
  6. ينبغي أن تكون ثابتة الخلايا مدة لا تقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في 3 و 7 و 14 ساعة خلايا الإصلاح عن طريق إضافة حجم مساو من 2٪ الفورمالديهايد إلى كل بئر (تركيز النهائي 1٪ الفورمالديهايد). مكان لوحات لنقاط زمنية مبكرة في 4 درجات مئوية خلال الليل. لنقطة مرة الأخيرة (14 ساعة)، وإصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  7. بعد التثبيت، وإزالة بلطف coverslips باستخدام ملقط وشطف في DPBS.
  8. إزالة السوائل الزائدة عن طريق وضع حافة ساترة على Kimwipe مطوية.
  9. 6 تطبيق ميكرولتر مضان المتوسطة المتزايدة مع دابي إلى شريحة المجهر والزجاج.
  10. وضع حافة واحدة من ساترة على الشريحة وإسقاط بلطف مع الجانب الخلية أسفل إلى المتوسطة المتزايدة. وتصاعد المتوسطة تنتشر وتشكل حتى طبقة تحت ساترة. ليست هناك حاجة للضغط على ساترة.
  11. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة وتسمح للهواء الجاف.
  12. مخزن أعد الشرائح في مربع الشريحة (محمية من الضوء) في درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة للتحليل بواسطة المجهر متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وجمع البلاعم السنخية بواسطة BAL من الفئران unstimulated يؤدي إلى السكان نقية> 95٪ على أساس علم الخلايا. 3 و 7 ساعة (الشكل 2) نقاط زمنية تسبق مرحلة خوطي من نمو الفطريات والسماح للمقارنة بين كفاءة أكلة من غبيرات بين الأنماط الجينية. نقطة الساعة 14 ساعة حيث يمكن مقارنة الأنماط الجينية فيما يتعلق القدرة على منع انتقال غبيرات المبتلعة إلى مرحلة خوطي الأنسجة الغازية (الشكل 3). يمكن التعرف على البلاعم سليمة بواسطة المجهر متحد البؤر استنادا PKH26 وتلطيخ دابي من الغشاء والنواة، على التوالي (الشكلين 2 و 3). ويتم تحديد غبيرات وخيوط على أساس التعبير GFP (الشكلين 2 و 3).

iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
يتم عرض الرقم 1. المراجع تشريحية الاتجاه و4 في اتجاه ومحبس. أ) مراجع الاتجاه التشريحية للماوس. الجمجمة هي في اتجاه الرأس، بينما هو الذيلية في اتجاه الذيل. الجانب البطني من ذوات الأربع هو نحو البطن أو السطح السفلي من الحيوان، في حين أن الجانب الظهري هو نحو الخلف أو السطح العلوي للحيوان. ب) محبس 4 في اتجاه لديه ثلاثة اتصالات بالتركيبة ومقبض التي تدور 360 درجة لتوجيه تدفق السوائل من خلال محبس. يشار إلى موضع حقنة فارغة، الحقنة كاملة والقسطرة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2 الشكل 2. البلعمة من A. جراثيم فوميجاتوس مشابه بين التراكيب الوراثية في 7 ساعة. تقييم قدرة الضامة السنخية معزولة مع NADPH أوكسيديز النشاط للحد من نمو غبيرات المبتلعة، (A) من النوع البري، (B) Ncf1 * / * المنغنيز و (C كانت تدار الفئران الرابع PKH26 -) Ncf1 * / * المنغنيز. وكان حصاد الضامة السنخية بواسطة BAL بعد 10 أيام والمصنف مع غبيرات، معربا عن GFP من A. فوميجاتوس. تم إصلاح الخلايا في 3 و 7 و 14 ساعة بعد إضافة غبيرات. في 3 (لا تظهر البيانات) و 7 ساعة كل من عدد إجمالي الضامة والبلاعم مع ≥ 1 المبتلعة غبيرات (السهام) كانت مشابهة بين التراكيب الوراثية الثلاثة، مما يعكس كفاءة البلعمة مماثلة. ويتم تحديد الضامة سليمة على أساس PKH26 (الحمراء) ودابي (الأزرق) تلطيخ غشاءنوى الثانية على التوالي. ومضافين الصور مضان من نفس واحدة Z-الطائرة مع صورة حقل مشرق. تتكون صورة حقل من الضوء الساطع تنتقل عن طريق العينة بأكمله وذلك عندما تعلوها على الفلورسنت Z-عادي يسمح التصور من الخلايا وغبيرات داخل بأكمله Z-المكدس. شريط النطاق، 19 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
مطلوب الرقم 3. بلعم NADPH أوكسيديز للسيطرة على نمو A. . جراثيم فوميجاتوس المجهري متحد البؤر من (A، D) من النوع البري، (B، E) Ncf1 * / * المنغنيز و (C، F) Ncf1 * / * المنغنيز - < / سوب> بلعم السنخية في 14 ساعة بعد البذر مع GFP + A. فوميجاتوس غبيرات. ويتم تحديد الضامة سليمة على أساس PKH26 (الحمراء) ودابي (الأزرق) تلطيخ الأغشية والنوى، على التوالي. تظهر السهام صلبة الضامة سليمة مع واحد على الأقل غبيرات المبتلعة وتشير السهام جوفاء لخيوط. AMS عديدة مع ما لا يقل عن 1 المبتلعة لوحظت غبيرات مع من النوع البري وNcf1 * / * المنغنيز + الخلايا، ولكن ليس مع خلايا أوكسيديز NADPH ناقصة. إشارة GFP في خيوط ومتغير يعتمد على الطائرة من الصورة مكدسة ض مبين. AC) الصور الإسفار من نفس واحدة Z-الطائرة مع صورة حقل مشرق تمكين التصور من الخلايا وخيوط داخل بأكمله Z-المكدس. DF) وصور الإسفار من نفس واحدة Z-طائرة من دون خلفية حقل مشرق تمكين تحديد خلايا، ولكن ليس العلاقة المكانية من الخلايا والفطريات في مختلف Z-الطائرات. شريط النطاق، 19 ميكرومتر..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استخدام هذا النهج لالسابقين فيفو تحليل نشاط مضاد الضامة في الجسم الحي جنبا إلى جنب مع الفطرية التحدي، أثبتنا سابقا أن أوكسيديز NADPH في الضامة تلعب دورا هاما في الدفاع ضد A. فوميجاتوس 4. استخدام الضامة السنخية معزولة يتيح لنا التركيز على نشاطهم مضاد للفطريات في غياب الخلايا المناعية الأخرى (مثل تجنيد العدلات) التي تدافع ضد الرشاشيات في الجسم الحي.

وقد استخدمت استراتيجيات مختلفة التصور لتقييم نشاط مضاد البلاعم في الجسم الحي وخارج الحي. لوثر وآخرون، استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لدراسة البلعمة من الرشاشيات غبيرات من قبل الإنسان (تحصد من متلقي زرع الرئة) وAMS الماوس 12. Geunes-بوير وآخرون. يتميز التفاعل بين المبيضات krusei والفئران الضامة التالية البلعمة. هماستخدام خط خلية بلعم، RAW264.7 وبلعم الابتدائية من الصفاق 13. غارسيا روداس وآخرون. أظهرت أن بروتين بالسطح-D بربط ويسهل البلعمة وبقاء الأدعومية المستخفية 14. وكان التحقيق SP-D ملزمة أيضا في الجسم الحي باستخدام SP-D - / - الفئران الملقحة الأنف مع اليكسا فلور 488 المسمى C. الأدعومية. بعد غسل الرئة، وقد وصفت هيئة علماء المسلمين immunofluorescently وكان يستخدم متحد البؤر المجهري لتحليل البلعمة.

الضامة من مواقع مختلفة التشريحية (مثل السنخية، الطحال، البريتوني)، ولدت مع محفزات مختلفة (على سبيل المثال، thioglycollate الاستنباط أو في تمايز المختبر)، أو من خطوط الخلايا (على سبيل المثال، RAW264.7) يمكن أن يكون مختلفا بشكل كبير الاستجابات المضادة للميكروبات والتهابات 15 - 18. لذلك، لنموذج الأكثر تطابقا استجابة المضيف لمتعة استنشاقغي، استخدمنا الضامة السنخية المقطوع من قبل غسل الشعبى من الفئران unstimulated التالية التضحية فورا.

في البداية كنا التصوير الخلية الحية لتقييم نشاط مضاد بلعم 4. كانت مطلية البلاعم السنخية في الشرائح الزجاجية تشامبيريد ثم المصنف مع GFP التعبير عن الرشاشيات. بعد 3 ساعة، أزيلت غبيرات غير المبتلعة من قبل الغسيل لطيف للسماح التصور دون عائق من غبيرات المبتلعة. ثم تم رصدها من قبل الإنبات غبيري الوقت الفاصل بين التصوير في 30 دقيقة فترات باستخدام صور الضوء الساطع لتصور بلعم وGFP مضان لتصور الفطريات. هذا الأسلوب له ميزة الحصول على صور متسلسلة من نفس الثقافة الخلية الأولية. ومع ذلك، فإن الاتجاه لبلعم إلى الهجرة عبر مجال الرؤية أثناء اقتناء يسمح لالنوعية بدلا من تقييم كمي للنشاط conidiocidal. وثمة عيب آخر من التصوير الخلية الحية هو رانه عدم الوضوح والتفصيل على النحو نقل الخلايا داخل وخارج الطائرة من التركيز.

للحصول على صور مع بمزيد من التفصيل اخترنا المجهري متحد البؤر والتي تمكن إعادة بناء هياكل ثلاثية الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها. إعادة البناء ثلاثي الأبعاد يعطي القدرة على التفريق بين خيوط متنامية في جميع أنحاء بدلا من أو من خلال البلاعم. مع هذه القدرة لعرض الخلايا والفطريات في ثلاثة أبعاد، وإزالة غبيرات غير المبتلعة في 3 ساعة لم يعد خطوة ضرورية. غبيرات يمكن أيضا أن تكون متميزة تماما كما داخل الخلايا مقابل خارج الخلية.

لتعزيز التصور، وصفت البلاعم السنخية في الجسم الحي مع PKH26. هذا صبغة الفلورسنت لديه ذيل طويل الأليفاتية التي تضم مستقر في المناطق الدهنية من أغشية الخلايا. عند حقنه وريديا، يتم أخذ هذه الصبغة محبة للدهون بنسبة الخلايا البلعمية سواء في مجرى الدم والأنسجة في. بعد 10 يوما، ابييتم مسح البالعات أدى من التداول الفئران وتبقى فقط في أنسجة مما يسمح لجمع وصفت بالفعل البلاعم السنخية بواسطة BAL. مع والتقليل من استخدام الوسم في الجسم الحي، والتلاعب ما بعد الحصاد الضامة السنخية.

ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام، معربا عن GFP A. فوميجاتوس السلالة. هذه الفطريات عن GFP من مرحلة غبيري خلال المرحلة خوطي وليس لديها الحاجة إلى مزيد من تلطيخ. مع تلطيخ مزدوجة الضامة والرشاشيات، ونحن قادرون على تحديد غبيرات المبتلعة.

وهناك عامل يحد من هذا البروتوكول هو العائد بلعم من BAL. A العائد نموذجية من الماوس unstimulated هو في حدود 3-5 × 10 5 الضامة السنخية، ولكن هذا العدد يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا يعتمد على عوامل مثل حجم الفأر، خبرة الشخص أداء الغسل، وعدد instillations انفلونزا غسيلمعرف وحجم سحبها من الرئتين. في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ غسيل الرئة مع تجويف الصدري المغلقة التي جنبا إلى جنب مع تكرار 1 مل instillations يساعد على زيادة العائد خلية بالمقارنة مع تجويف الصدر مفتوحة وأقل instillations. ويمكن أيضا زيادة أعداد الماوس لزيادة الغلة الحصاد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية منحة R01AI079253 (لBHS)، والمعهد الوطني للسرطان مركز سرطان دعم المنح CA016056 لمعهد روزويل بارك للسرطان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
  2. Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
  3. Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
  4. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
  5. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
  6. Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
  7. Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
  8. Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
  9. Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
  10. Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
  11. Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
  12. Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
  13. Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
  14. García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
  15. Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
  16. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
  17. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
  18. Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics