Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En metod för att utvärdera förmågan hos isolerade mus alveolära makrofager för att kontrollera tillväxten av fagocyterade Aspergillus sporer genom konfokalmikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lungan är ett gränssnitt där värdceller används rutinmässigt exponeras för mikrober och mikrobiella produkter. Alveolära makrofager är första linjens fagocytceller som stöter inhalerade svampar och andra mikrober. Makrofager och andra immunceller känner igen Aspergillus motiv av patogener erkännande receptorer och initiera nedströms inflammatoriska svar. Den fagocytsystemet NADPH-oxidas genererar reaktiva syremellanprodukter (ROI), och är avgörande för värdförsvar. Trots att NADPH-oxidas är avgörande för neutrofilmedierad värdförsvar 1 - 3, vikten av NADPH-oxidas i makrofager är inte väl definierad. Målet med denna studie var att beskriva den särskilda roll som NADPH-oxidas i makrofager i att medla värdförsvar mot A. fumigatus. Vi fann att NADPH-oxidas i alveolära makrofager styr tillväxten av fagocyteras A. fumigatus sporer 4. Här beskriver vi en metod för att bedöma förmågan hos mus-alveolar makrofager (AMS) för att kontrollera tillväxten av fagocyteras Aspergillus sporer (konidier). Alveolära makrofager färgades in vivo och tio dagar senare isolerades från möss genom bronkoalveolär lavage (BAL). Makrofager stryks ut på täckglas av glas, ympades sedan med grönt fluorescerande protein (GFP)-uttryckande S. fumigatus-sporer. Vid bestämda tidpunkter, celler fasta och antalet intakta makrofager med fagocyterade sporer bedöms av konfokalmikroskopi.

Introduction

Alveolära makrofager är första linjens fagocytceller som stöter inhalerade mikrober. Makrofager erkänna Aspergillus motiv genom patogenfria igenkänningsreceptorer ingest och begränsa tillväxten av inhalerade sporer (konidier), och initiera inflammatoriska responser. Den fagocytsystemet NADPH-oxidas omvandlar molekylärt syre till superoxidanjon och nedströms reaktiva syre intermediärer (ROI). Kronisk granulomatös sjukdom (CGD) är en ärftlig sjukdom i NADPH-oxidas med allvarliga bakterie-och svampinfektioner samt genom överdrivna inflammatoriska svar.

Trots att NADPH-oxidas är avgörande för neutrofilmedierad värdförsvar 1 - 3, vikten av NADPH-oxidas i makrofager är inte väl definierad. Tidigare studier har visat att alveolära makrofager äter och döda Aspergillus sporer, medan neutrofiler huvudsakligen rikta hyfal etapp 5. Däremot har det funnits motstridiga Results som till rollen av NADPH-oxidas i makrofager i att kontrollera tillväxten av A. fumigatus sporer 6, 7.

Målet med denna metod var att avgränsa den särskilda roll som NADPH-oxidas i makrofager i att medla värdförsvar mot A. fumigatus-sporer. Vi fann att NADPH-oxidas i alveolära makrofager styr tillväxten av fagocyteras A. fumigatus sporer 4. För närmast modelvärd svar på inhalerade svampar, använde vi alveolära makrofager skördas av lungsköljning från ostimulerade möss omedelbart efter offer. Användningen av isolerade alveolära makrofager möjligt för oss att fokusera på sin svampdödande aktivitet i frånvaro av andra immunceller (t.ex. rekryterade neutrofiler) som försvarar mot Aspergillus in vivo. Vid denna metod var alveolära makrofager färgades in vivo före skörd för att minimera mängden av efter skörd manipulation. </ P>

En annan fördel med detta protokoll är användningen av en GFP-uttryckande S. fumigatus stam. Denna svamp uttrycker GFP från konidiala stadiet genom hyfal ledet och har inget behov av ytterligare färgning. För att erhålla bilder med större detalj, valde vi konfokalmikroskopi som möjliggör rekonstruktion av tredimensionella strukturer från de erhållna bilderna. Tredimensionell rekonstruktion ger förmågan att differentiera mellan hyfer växer runt i stället för i eller genom en makrofag. Konidier kan också vara exakt särskiljas som intracellulär kontra extracellulärt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla ingrepp på djur i denna studie har godkänts av Animal Care och användning kommittén vid Roswell Park Cancer Institute och uppfyllt alla statliga, federala, och National Institutes of Health föreskrifter.

1. In vivo Makrofag Märkning

Anm: PHK26 är en lipofil färg som kommer att tas upp av fagocytiska celler både i omlopp och i vävnaderna när de administreras intravenöst (iv). PKH26 användes för in vivo-märkning för att minimera mängden efter skörd manipulation av makrofagen. PKH-26 har fördelen att stabilt ansamlas i alveolära makrofager under längre perioder. Väntar 10 dagar efter administrering möjliggör avslut av alla märkta celler från cirkulationen lämnar endast alveolär makrofag stabilt märkta med PKH26 8, 9. PKH26 är en röd fluorokrom som har excitation (551 nm) och emission (567 nm) egenskaper kompatiblamed rodamin eller fykoerytrin detektionssystem. Varje förfarande märkning kan införa artefakter, inklusive förlust av livskraft. Men eftersom vi använder samma metod för märkning av makrofager i olika mus genotyper (t.ex. WT vs NADPH-oxidas-brist), effekterna av dessa artefakter skulle vara enhetliga.

  1. Späd stamlösning av PKH26 (1 x 10 -3 M i etanol) 1:05 i spädmedel C tillverkaren lämnat.
  2. Belastning 100 pl av utspädd PKH26 i en spruta 1/2 ml insulin (29 G x 1/2 ") för varje mus.
  3. Administrera till möss genom intravenös injektion (antingen svansvenen eller retro orbital) minst 10 dagar före skörd.

2. Skörd alveolära makrofager från lungsköljning (BAL)

Antalet möss som ska användas för ett experiment kan variera. Ett typiskt utbyte från en ostimulerad musen är i intervallet 3-5 x 10 5 alveolära makrofager, men detta antal kan variera kraftigt BASed på faktorer som storleken på musen, upplevelsen av den som utför sköljning, och antalet instillationer av sköljvätska och volymen tillbaka från lungorna. I detta protokoll lungsköljning genomföres med en sluten brösthålan som tillsammans med upprepad 1 ml sköljningar hjälper till att öka cellutbytet.

  1. Euthanize musen genom att administrera en dödlig dos av avertin bedövningsmedel (12,5 mg) intraperitonealt (ip) med hjälp av aseptiska förhållanden för att hålla lösningen steril.
  2. Spray musen noggrant med 70% etanol.
  3. Ta bort huden från den kraniala änden av animaliskt exponera thorax (Figur 1A).
    1. Gör ett litet snitt i huden precis under membranet.
    2. Sätt fingret i snittet och drar huden bort från den kraniala änden av djuret (Figur 1A).
    3. Skjut upp något på huvudet, utvidga den ventrala sidan av halsen (Figur 1A).
  4. Skär ett litet hål genom bröstkorgenin i höger sida av bröstkorgen för att tömma lungorna och även tillåter visualisering av lungorna under följande steg.
  5. Leta i luftstrupen, och försiktigt dissekera bort omgivande vävnad.
    1. Ta spottkörtlarna, sternohyoid muskler och struphuvudet, etc. med böjda pincett.
    2. Lyft försiktigt med böjda pincett och skär bort med sax den tunna vävnaden som täcker luftstrupen (adventitia) avslöjar den underliggande ringat broskstruktur.
  6. För in katetern i luftstrupen.
    1. Med hjälp av böjda pincett, placera en sutur bakom (dorsalt till) luftstrupen och dra en 10 cm längd genom öppningen.
    2. Starta ovanför cricoid (den tjockare ringen av brosk) försiktigt styra en 22 G kateter ner i luftstrupen stannar där luftstrupen försvinner bakom bröstbenet.
    3. Knyt sutur runt luftstrupen och kateter för bästa passform. Ta bort kanylen från katetern.
  7. Montera 4-vägs kranen.
    1. Fyllen 6 ml spruta med DPBS, 1% FBS och fäst till 4-vägs kran som visas i figur 1B.
    2. Bifoga en tom 6 ml spruta vid den angivna positionen i 4-vägskranen (Figur 1B).
    3. Bifoga öppen port på 4-vägskranen till kateter (Figur 1B). Var noga med att inte få bort katetern från luftstrupen.
  8. Samla upp sköljvätska från lungorna.
    Anm: Investigators kan välja att använda lägre mängder sköljvätska för att minimera risken för skador på vävnaden. Det är viktigt att samma metod tillämpas konsekvent i alla mus grupper.
    1. Vrid handtaget på kranen så att den tomma sprutan är stängd och injicera långsamt ~ 1 ml DPBS, 1% FBS att blåsa upp lungorna. Observera lung inflationen genom hålet skär i steg 2.4.
    2. Var försiktig så att overinflate lungorna.
    3. Vrid handtaget på kranen så att hela sprutan är stängd, och försiktigt dra tillbaka influensan id från lungorna.
    4. Observera lungorna tömma genom hålet skär i steg 1.4. Katetern kan behöva flyttas något framåt eller bakåt för att få en god dragning. Var särskilt försiktighetsåtgärd för att hålla katetern i luftstrupen.
    5. Upprepa steg 2.8.1-2.8.4 5-6x tills all DPBS, 1% FBS har injicerats och dras ut ur lungorna. Anm: återvinning av lungvätska kommer inte att vara 100% av injicerat fluidum.
  9. Tomma spruta med sköljvätska in i en 50 ml koniska rör. Håll cellerna vid rumstemperatur.
  10. Pelletera celler genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten. Detta kan sparas för cytokin analys om så önskas.
  11. Resuspendera celler i 1-5 ml RPMI 1640 med 10% FBS och räkna med en hemocytometer. I ostimulerade musen, är> 95% av cellerna skördas genom BAL förväntas vara makrofager, vilket kan bekräftas av cytologi.

3. Odling och skörd Svamp

"> Det Aspergillus fumigatus som används i detta protokoll uttrycker GFP alla stadier av sin livscykel:. Sporer, groddplantor och hyfer Denna svampstam lämnades av Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada.

  1. Plansch konidier av en Aspergillus fumigatus stam som uttrycker GFP på Sabouraud Brain Heart Infusion (BHI)-agar snedkulturer med kloramfenikol (0,05 g / L) och Gentamicin (0,5 g / L).
  2. Inkubera i mörker löst capped för 7 till 10 dagar vid rumstemperatur.
  3. Harvest konidier av tvätt vinkling med 10 ml 0,01% Tween 20 i DPBS. Lätt skrapa svampen med stripette att lossna. Skölj den lutande flera gånger för att öka avkastningen.
  4. Passera konidial suspension genom en 100 | im cellfilter in i ett 50 ml koniskt.
  5. Pellet konidier genom centrifugering vid 400 x g under 10 min.
  6. Resuspendera konidier i 50 ml DPBS och räkna med en hemocytometer.
  7. Tvätta två gånger med DPBS och späddes till önskade koncentration.

4. Svamp Challenge och konfokalmikroskopi

För att undersöka vilken roll makrofag NADPH-oxidas i värdförsvaret, var möjligheten för isolerade alveolära makrofager från möss av tre genotyper för att kontrollera tillväxten av fagocyteras Aspergillus sporer utvärderas. De genotyper som används i denna studie inkluderar; 1) vildtyp möss, 2) NCF1 * / * Mn-möss med en naturligt förekommande NCF1 mutationen (NCF1 kodar för p47 phox, en erforderlig komponent i fagocyt NADPH-oxidas) lämnar dem NADPH-oxidas bristfällig, och 3) NCF1 * / * Mn + transgena möss (MN betecknar transgen hysande vildtyp NCF1 under kontroll av den humana CD68-promotor) där NADPH-oxidasaktivitet har rekonstitueras i monocyt / makrofag-populationen 10, 11.

Konfokalmikroskopi är bäst lämpad för denna analys på grund av närvaronoch tillväxt av icke-fagocyteras konidier på bilderna. Den konfokalmikroskop kommer att möjliggöra visualisering av individuella flygplan inom Z-axeln, och möjliggör differentiering mellan svampen växer runt snarare än inuti makrofag. Alla konfokala bilder förvärvas med hjälp av en 63x oljeimmersionslins. Z-stackar förvärvas med en elektronisk zoomfaktor på 2,5. Tjockleken på en Z-stapel bestäms med användning av DAPI och ljusa fält bilder för att lokalisera den övre och nedre delen av fältet. Z-stackar varierade från 14 till 24 nm med enskilda skivor ~ 1 mm tjock. För kvantifiering av makrofager, har enstaka skanningar av 1X elektronisk zoomning på 10 fält per genotyp. Intakta makrofager identifierades baserat på PKH26 och DAPI-färgning av membranet och kärnan respektive. Konidier identifierades baserat på FITC uttryck och ljusa fält image.

  1. Förbered sterila täckglas och tallrikar
    1. Under ett biologiskt säkerhetsskåp, blöt 22 x 22 mm täckglas i 70% etanol för 5-10 min.
    2. Skölj täckglas i steril PBS.
    3. Med hjälp av steril pincett, försiktigt placera en enda täckglas i botten av varje brunn i en steril enskilt förpackade 6-brunnar.
  2. Seed ~ 1 x 10 6 skördade PKH26 märkt alveolära makrofager suspenderade i 300 pl RPMI 1640, 10% FBS på varje täckglas. Det exakta antalet kan variera beroende på skördeutbytet.
  3. Tillåt makrofag att vidhäfta genom inkubation vid 37 ° C med 5% CO2 över natten.
  4. Följande morgon, lägga till ~ 1 x 10 7 GFP-uttryck A. fumigatus konidier suspenderades i 100 | il förvärmd (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
  5. Återgå plattan till 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  6. Celler bör fastställas i minst 2 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. Vid 3, 7 och 14 hr fix-celler genom tillsats av en lika stor volym av 2% formaldehyd till varje brunn (slutlig koncentration 1% formaldehyd). Placera plattor förtidiga tidpunkter vid 4 ° C över natten. För den slutliga tidpunkten (14 h), fixera cellerna vid rumstemperatur under 2 timmar.
  7. Efter fixering, försiktigt bort täckglas med hjälp av tång och skölj i DPBS.
  8. Ta bort överflödig vätska genom att placera kanten av täckglas på ett vikt Kimwipe.
  9. Applicera 6 jil fluorescens monteringsmedium med DAPI till en glasmikroskopskiva.
  10. Lägg ena kanten av täckglaset på objektglaset och försiktigt släppa med cellsidan ned i monteringsmedium. Monteringsmedium sprider sig och bildar ett jämnt lager under täckglas. Det finns ingen anledning att trycka på täckglas.
  11. Täta kanterna på täckglas med genomskinligt nagellack och låt lufttorka.
  12. Affär förberett bilder i ett bildspel box (skydd mot ljus) vid rumstemperatur tills den ska analysera med konfokalmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Samla alveolär makrofag från BAL från ostimulerade möss kommer att resultera i en> 95% ren population baserat på cytologi. Den 3 och 7 timmar (figur 2) tidpunkter föregå hyfal skede av svamptillväxt och möjliggöra en jämförelse av fagocytisk effektivitet konidier bland genotyper. Den 14 hr tidpunkt är där genotyper kan jämföras med avseende på förmåga att inhibera omvandling av fagocyteras konidier till vävnaden-invasiv hyfal steg (fig 3). Intakt makrofag kan identifieras genom konfokalmikroskopi baserat på PKH26 och DAPI-färgning av membranet och kärnan, respektive (figur 2 och 3). Konidier och hyfer identifieras utifrån GFP uttryck (figur 2 och 3).

iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg "/>
Figur 1. Anatomiska Riktnings Referenser och den 4-vägskran. A) De anatomiska rikt referenser för en mus visas. Cranial är i riktning mot huvudet, medan svans är i riktning mot svansen. Den ventrala sidan av en quadruped är vänd mot magen eller den undre ytan av djuret, medan ryggsidan är mot baksidan eller den övre ytan av djuret. B) 4-vägskranen har tre luer-anslutningar och ett handtag som roterar 360 ° för att rikta flödet av fluider genom den stoppkranen. Placering av den tomma sprutan, hela sprutan och katetern anges. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2 Figur 2. Fagocytos av A. fumigatus-sporer är likartad mellan genotyper vid 7 tim. För att utvärdera möjligheten av isolerade alveolära makrofager med NADPH-oxidas aktivitet för att begränsa ökningen av fagocyteras konidier, (A) vildtyp, (B) NCF1 * / * Mn +, och (C ) NCF1 * / * Mn - möss administrerades iv PKH26. Alveolära makrofager skördades genom BAL 10 dagar senare och ympades med konidier av GFP-uttryckande S. fumigatus. Celler fixerades vid 3, 7 och 14 h efter tillsats av konidier. Vid 3 (data visas ej) och 7 tim både det totala antalet makrofager och makrofag med ≥ 1 fagocyteras konidier (pilar) var liknande bland de tre genotyper, vilket återspeglar liknande fagocytos effektivitet. Intakta makrofager identifieras utifrån den PKH26 (röd) och DAPI (blå) färgning av membran and kärnor respektive. Den fluorescens bilder från ett enda Z-plan överlagras med det ljusa fältet bilden. Den ljusa fältbild består av ljus som transmitteras genom hela provet och så när överlagras på den fluorescerande Z-plain tillåter visualisering av celler och konidier inom hela Z-stack. Skala bar, 19 um. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Macrophage NADPH-oxidas som krävs för att kontrollera tillväxten av A. . fumigatus-sporer Konfokalmikroskopi av (A, D) vildtyp, (B, E) NCF1 * / * Mn +, och (C, F) NCF1 * / * Mn - < / Sup> alveolär makrofag vid 14 timmar efter sådd med GFP + A. fumigatus-konidier. Intakta makrofager identifieras utifrån den PKH26 (röd) och DAPI (blå) färgning av membran och kärnor, respektive. Fasta pilar visar intakta makrofager med åtminstone en fagocyterade konidier och ihåliga pilarna pekar till hyfer. Talrika äf med minst en fagocyteras konidier observerades med vildtyps-och NCF1 * / * Mn +-celler, men inte med NADPH-oxidas-bristfälliga celler. GFP signal i hyfer har rörlig baserad på planet för z-staplade bilden visas. AC) fluorescens bilder från en enda Z-planet med den ljusa fältbild möjliggör visualisering av celler och hyfer inom hela Z-stack. DF) fluorescens bilder från en enda z-planet utan ljusa fältet bakgrund möjliggöra identifiering av celler, men inte det rumsliga förhållandet av celler och svampar i olika Z-plan. Skala bar, 19 um..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med användning av denna metod för ex vivo-analys av den antifungala aktiviteten hos makrofager tillsammans med in vivo-fungal utmaning, som tidigare visade vi att NADPH-oxidas i makrofager spelar en viktig roll i försvaret mot A. fumigatus 4. Användningen av isolerade alveolära makrofager gör att vi kan fokusera på sin svampdödande aktivitet i frånvaro av andra immunceller (t.ex. rekryterade neutrofiler) som försvarar mot Aspergillus in vivo.

Olika strategier visualiserings har använts för att utvärdera makrofag antimykotisk aktivitet in vivo och ex vivo. Luther et al., Använt konfokalmikroskopi att studera fagocytos av Aspergillus konidier av mänsklig (skördas från lungtransplanterade) och mus äf 12. Geunes-Boyer et al. tecknas samspelet mellan Candida krusei och murina makrofager efter fagocytos. Deanvände en makrofagcellinje, RAW264.7 och primära makrofager från peritoneum 13. Garcia-Rodas et al. visade att tensidprotein-D binder till och underlättar fagocytos och överlevnad av Cryptococcus neoformans 14. SP-D bindning undersöktes också in vivo med hjälp av SP-D - / - möss intranasalt inokulerade med Alexa Fluor 488-märkt C. neoformans. Efter lungsköljning, äf var immunofluorescently märkta och konfokalmikroskopi användes för att analysera fagocytos.

Makrofager från olika anatomiska platser (t.ex. alveolär, mjälten, peritoneal), som genereras med olika stimuli (t.ex. tioglykollat ​​elicitation eller in vitro differentiering), eller från cellinjer (t.ex., RAW264.7) kan ha dramatiskt olika antimikrobiella och inflammatoriska svar 15 - 18. Därför, för att närmast modelvärd svar på inandning kulgi, använde vi alveolära makrofager skördas av lungsköljning från ostimulerade möss omedelbart efter offer.

Till en början använde vi live-cell imaging att utvärdera makrofag svampdödande aktivitet 4. Alveolar makrofag ströks i chambered glas såddes sedan med GFP uttrycka Aspergillus. Efter 3 timmar, var icke-fagocyterade konidier avlägsnas genom försiktig tvättning för att tillåta obehindrad visualisering av fagocyteras konidier. Konidial groning sedan övervakas av time-lapse avbildning med 30 minuters intervall med hjälp av starkt ljus bilder för att visualisera makrofager och GFP fluorescens för att visualisera svampar. Denna metod har fördelen av att förvärva sekventiella bilder av samma primära cellkulturen. Dock är tendensen för makrofag migrera över synfältet under förvärv tillåts för en kvalitativ snarare än kvantitativ bedömning av conidiocidal aktivitet. En annan nackdel med live-cell imaging är than bristen på tydlighet och detaljerat som celler rör sig in och ut ur planet i fokus.

För att erhålla bilder med större detalj vi valde konfokalmikroskopi som möjliggör rekonstruktion av tredimensionella strukturer från de erhållna bilderna. Tredimensionell rekonstruktion ger förmågan att differentiera mellan hyfer växer runt i stället för i eller genom en makrofag. Med denna förmåga att se cellerna och svamp i tre dimensioner, är avlägsnande av fagocyteras konidier på 3 timmar inte längre ett nödvändigt steg. Konidier kan också vara exakt särskiljas som intracellulär kontra extracellulärt.

För förbättrad visualisering, var alveolär makrofag märks in vivo med PKH26. Denna fluorescerande färg har en lång alifatisk svans som stabilt inkorporerar in i fettregioner cellmembran. När injiceras intravenöst, detta lipofila färgämne tas upp av fagocyterande celler både i blodet och i vävnaderna. Efter 10 dagar, labeledda fagocyter rensas från mus cirkulationen och förblir endast i vävnaderna 9, vilket möjliggör insamling av redan märkt alveolära makrofager av BAL. Med hjälp av in vivo-märkning, efter skörd manipulation av alveolära makrofager minimeras.

En annan fördel med detta protokoll är användningen av en GFP-uttryckande S. fumigatus stam. Denna svamp uttrycker GFP från konidiala stadiet genom hyfal ledet och har inget behov av ytterligare färgning. Med dubbla färgning av makrofager och Aspergillus, kan vi identifiera fagocyteras konidier.

En begränsande faktor i detta protokoll är makrofagen utbyte från BAL. En typisk avkastning från en ostimulerad musen är i intervallet 3-5 x 10 5 alveolära makrofager, men detta antal kan variera kraftigt baserat på faktorer som storleken på musen, erfarenhet av den som utför sköljning, och antalet instillationer av lavage influensaid och volymen avlägsnas från lungorna. I detta protokoll, är lungsköljning utförs med ett stängt brösthålan, som tillsammans med upprepade 1 ml instillationer hjälper till att öka cell avkastning jämfört med en öppen brösthålan och färre instillationer. Mus nummer kan också höjas för att öka skördeavkastningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar Grant R01AI079253 (till BHS), och av National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA016056 till Roswell Park Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
  2. Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
  3. Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
  4. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
  5. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
  6. Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
  7. Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
  8. Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
  9. Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
  10. Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
  11. Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
  12. Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
  13. Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
  14. García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
  15. Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
  16. Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
  17. Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
  18. Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics