Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अलग वायुकोशीय मैक्रोफेज की एंटी फंगल गतिविधि का आकलन

Immunology and Infection

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Summary

Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा phagocytosed Aspergillus बीजाणुओं की वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए अलग माउस वायुकोशीय मैक्रोफेज की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि.

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Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

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Abstract

फेफड़ों मेजबान कोशिकाओं नियमित रोगाणुओं और सूक्ष्म उत्पादों को उजागर कर रहे हैं, जहां एक अंतरफलक है. वायुकोशीय मैक्रोफेज साँस कवक और अन्य रोगाणुओं मुठभेड़ कि पहली पंक्ति phagocytic कोशिकाओं रहे हैं. मैक्रोफेज और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा Aspergillus रूपांकनों को समझते हैं और नीचे की ओर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं आरंभ. भक्षककोशिकीय NADPH oxidase प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती (ROIs) उत्पन्न करता है और मेजबान सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण है. NADPH oxidase महत्वपूर्ण है न्युट्रोफिल की मध्यस्थता मेजबान बचाव के लिए 1-3, मैक्रोफेज में NADPH oxidase के महत्व को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है. इस अध्ययन का लक्ष्य के खिलाफ मेजबान बचाव मध्यस्थता में मैक्रोफेज में NADPH oxidase की विशिष्ट भूमिका चित्रित करना था fumigatus. हम वायुकोशीय मैक्रोफेज में NADPH oxidase phagocytosed के विकास को नियंत्रित पाया कि fumigatus 4 spores. यहाँ, हम माउस एक की क्षमता का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णनphagocytosed Aspergillus बीजाणुओं (conidia) की वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए lveolar मैक्रोफेज (एम्स). वायुकोशीय मैक्रोफेज विवो में दाग और दस दिन बाद ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) द्वारा चूहों से अलग कर रहे हैं. मैक्रोफेज कांच coverslips पर चढ़ाया जाता है, तो हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त के साथ वरीयता प्राप्त fumigatus बीजाणुओं. निर्दिष्ट समय पर, कोशिकाओं तय कर रहे हैं और phagocytosed बीजाणुओं के साथ बरकरार मैक्रोफेज की संख्या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया है.

Introduction

वायुकोशीय मैक्रोफेज साँस रोगाणुओं मुठभेड़ कि पहली पंक्ति phagocytic कोशिकाओं रहे हैं. मैक्रोफेज, रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा Aspergillus रूपांकनों पहचान निगलना और साँस बीजाणुओं (conidia) के विकास की सीमा, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं आरंभ. भक्षककोशिकीय NADPH oxidase superoxide आयनों और नीचे की ओर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती (ROIs) के लिए आणविक ऑक्सीजन धर्मान्तरित. पुरानी granulomatous रोग (सीजीडी) गंभीर बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण से और अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं द्वारा विशेषता NADPH oxidase की एक विरासत में मिला विकार है.

NADPH oxidase महत्वपूर्ण है न्युट्रोफिल की मध्यस्थता मेजबान बचाव के लिए 1-3, मैक्रोफेज में NADPH oxidase के महत्व को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है. पूर्व अध्ययनों neutrophils मुख्य hyphal चरण 5 को लक्षित जबकि वायुकोशीय मैक्रोफेज, निगलना और Aspergillus बीजाणुओं को मारने दिखाया है. हालांकि, परस्पर विरोधी resul वहाँ किया गया है की वृद्धि को नियंत्रित करने में बृहतभक्षककोशिका में NADPH oxidase की भूमिका के रूप में टीएस fumigatus 6, 7 spores.

इस पद्धति का लक्ष्य के खिलाफ मेजबान बचाव मध्यस्थता में मैक्रोफेज में NADPH oxidase की विशिष्ट भूमिका चित्रित करना था fumigatus बीजाणुओं. हम वायुकोशीय मैक्रोफेज में NADPH oxidase phagocytosed के विकास को नियंत्रित पाया कि fumigatus 4 spores. सबसे निकट साँस कवक के लिए मेजबान प्रतिक्रिया मॉडल के लिए, हम unstimulated चूहों से तुरंत त्याग निम्नलिखित ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना द्वारा काटा वायुकोशीय मैक्रोफेज इस्तेमाल किया. पृथक वायुकोशीय मैक्रोफेज का उपयोग vivo में Aspergillus के खिलाफ की रक्षा है कि अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, भर्ती neutrophils) की अनुपस्थिति में उनके रोधी गतिविधि पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सक्षम होना चाहिए. इस विधि में, वायुकोशीय मैक्रोफेज के बाद फसल में गड़बड़ी की मात्रा को कम करने के रूप में तो फसल के लिए पूर्व vivo में दाग रहे थे. </ P>

इस प्रोटोकॉल के लिए एक और लाभ यह एक GFP-व्यक्त का इस्तेमाल होता है fumigatus तनाव. यह कवक hyphal मंच के माध्यम से conidial मंच से GFP व्यक्त किया और आगे धुंधला के लिए कोई जरूरत नहीं है. अधिक से अधिक विस्तार के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए, हम प्राप्त की छवियों से तीन आयामी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है जो confocal माइक्रोस्कोपी चुना है. तीन आयामी पुनर्निर्माण hyphae एक बृहतभक्षककोशिका में या माध्यम से चारों ओर बढ़ रहा है बजाय के बीच अंतर करने की क्षमता देता है. Conidia भी बाह्य बनाम intracellular के रूप में ठीक से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.

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Protocol

इस अध्ययन में जानवरों पर प्रदर्शन सभी प्रक्रियाओं Roswell पार्क कैंसर संस्थान में पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित और संघीय सभी राज्य, के साथ पालन किया, और स्वास्थ्य के नियमों के राष्ट्रीय संस्थानों थे.

1. में vivo मैक्रोफेज लेबल

नोट: PHK26 (चतुर्थ) नसों के द्वारा प्रशासित जब संचलन में और ऊतकों में दोनों phagocytic कोशिकाओं द्वारा किया जाएगा कि एक lipophilic डाई है. PKH26 बृहतभक्षककोशिका के बाद फसल में गड़बड़ी की मात्रा को कम करने में विवो लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था. PKH-26 stably लंबे समय से अधिक वायुकोशीय मैक्रोफेज में जमते का लाभ दिया है. 10 दिनों के बाद प्रशासन प्रतीक्षा की जा रही PKH26 8, 9 के साथ ही वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका stably लेबल छोड़ने के प्रचलन से सभी लेबल कोशिकाओं की निकासी के लिए अनुमति देता है. PKH26 उत्तेजना (551 एनएम) और उत्सर्जन (567 एनएम) विशेषताओं संगत है कि एक लाल fluorochrome हैrhodamine या phycoerythrin का पता लगाने प्रणालियों के साथ. कोई लेबलिंग प्रक्रिया व्यवहार्यता के नुकसान सहित, विरूपण साक्ष्य को पेश कर सकते हैं. हम अलग माउस जीनोटाइप में मैक्रोफेज की लेबलिंग के लिए एक ही दृष्टिकोण का उपयोग हालांकि, बाद से (जैसे, गुम्मट बनाम NADPH oxidase की कमी), इन कलाकृतियों का प्रभाव एक समान होना होगा.

  1. PKH26 के शेयर समाधान (इथेनॉल में 1 एक्स 10 -3 एम) निर्माता द्वारा प्रदान मंदक सी में 01:05 पतला.
  2. प्रत्येक माउस के लिए एक 1/2 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज (29 जी एक्स 1/2 ") में पतला PKH26 का लोड 100 μl.
  3. फसल के लिए कम से कम 10 दिन पूर्व चतुर्थ इंजेक्शन (पूंछ नस या रेट्रो कक्षीय या तो) द्वारा चूहों के लिए प्रशासन.

ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage द्वारा 2. फसल काटने वायुकोशीय मैक्रोफेज (बाल)

एक प्रयोग के लिए उपयोग करने के लिए चूहों की संख्या भिन्न हो सकती हैं. एक unstimulated माउस से एक ठेठ उपज 3-5 x 10 5 वायुकोशीय मैक्रोफेज की सीमा में है, लेकिन इस संख्या बास बहुत भिन्न हो सकते हैंऐसे पानी से धोना प्रदर्शन व्यक्ति के माउस, अनुभव का आकार, और पानी से धोना तरल पदार्थ और फेफड़ों से वापस ले लिया मात्रा के instillations की संख्या जैसे कारकों पर एड. इस प्रोटोकॉल में फेफड़ों के पानी से धोना दोहराया 1 मिलीलीटर lavages के साथ सेल उपज बढ़ाने में मदद करता है जो एक बंद वक्ष गुहा के साथ किया जाता है.

  1. बाँझ समाधान रखने की सड़न रोकनेवाला शर्तों का उपयोग Avertin संवेदनाहारी की एक घातक खुराक (12.5 मिलीग्राम) intraperitoneally (आईपी) प्रशासन द्वारा माउस euthanize.
  2. 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से माउस का छिड़काव करें.
  3. छाती (चित्रा 1 ए) को उजागर पशु का कपाल के अंत से त्वचा निकालें.
    1. बस डायाफ्राम के नीचे त्वचा में एक छोटा सा कटौती करें.
    2. कटौती में उंगली डालने और दूर जानवर (चित्रा 1 ए) के कपाल के अंत से त्वचा खींच.
    3. गर्दन के उदर पक्ष (चित्रा 1 ए) का विस्तार, सिर पर ऊपर से थोड़ा पुश.
  4. रिब पिंजरे के माध्यम से एक छोटे से छेद में कटौतीछाती के दाहिने हिस्से में फेफड़ों खंडन करना और भी निम्न चरणों के दौरान फेफड़े के दृश्य की अनुमति.
  5. श्वासनली जानें, और ध्यान से आसपास के ऊतकों दूर काटना.
    1. घुमावदार संदंश के साथ लार ग्रंथियों, sternohyoid मांसपेशियों और गला, आदि को हटा दें.
    2. ध्यान से एक घुमावदार संदंश के साथ उठा और कैंची के साथ अंतर्निहित चक्राकार उपास्थि संरचना खुलासा ट्रेकिआ (बाह्यकंचुक) को कवर पतली ऊतक दूर कटौती.
  6. श्वासनली में कैथेटर डालें.
    1. घुमावदार संदंश का प्रयोग, ट्रेकिआ (के लिए पृष्ठीय) के पीछे एक सीवन जगह और खोलने के माध्यम से एक 10 सेमी लंबाई खींच.
    2. वृत्ताकार (उपास्थि का गाढ़ा अंगूठी) ऊपर शुरू ध्यान से श्वासनली उरोस्थि के पीछे गायब हो जाता है, जहां रोक ट्रेकिआ नीचे एक 22 जी कैथेटर गाइड.
    3. दृढ़ता से एक सुखद फिट के लिए ट्रेकिआ और कैथेटर के आसपास सीवन टाई. कैथेटर से सुई निकालें.
  7. 4 तरह पानी निकलने की टोंटी को इकट्ठा करो.
    1. भरनाएक 6 मिलीलीटर DPBS, 1% FBS के साथ सिरिंज और चित्रा 1 बी में संकेत के रूप में 4 तरह पानी निकलने की टोंटी को देते हैं.
    2. 4 तरह पानी निकलने की टोंटी (चित्रा 1 बी) पर संकेत स्थिति पर एक खाली 6 मिलीलीटर सिरिंज देते हैं.
    3. कैथेटर के लिए 4 तरह पानी निकलने की टोंटी (चित्रा 1 बी) पर खुला बंदरगाह देते हैं. श्वासनली से कैथेटर बेदखल नहीं करने के लिए सावधान रहें.
  8. फेफड़ों से पानी से धोना तरल पदार्थ ले लीजिए.
    नोट: जांचकर्ता ऊतकों को नुकसान की संभावना को कम करने के लिए पानी से धोना तरल पदार्थ की कम मात्रा का उपयोग करने के लिए विकल्प चुन सकते हैं. यह एक ही दृष्टिकोण लगातार सभी माउस समूहों में लागू किया है कि महत्वपूर्ण है.
    1. इसलिए खाली सिरिंज बंद है पानी निकलने की टोंटी पर संभाल बारी और धीरे धीरे फेफड़ों में हवा के लिए ~ 1 मिलीलीटर DPBS, 1% FBS इंजेक्षन. 2.4 चरण में कटौती छेद के माध्यम से फेफड़ों मुद्रास्फीति को ध्यान से देखें.
    2. फेफड़ों overinflate के प्रति सावधान रहें.
    3. पूर्ण सिरिंज बंद हो गया है कि इतना पानी निकलने की टोंटी पर संभाल बारी, और ध्यान से फ्लू वापस ले फेफड़ों से आईडी.
    4. फेफड़ों 1.4 चरण में कटौती छेद के माध्यम से खंडन निरीक्षण करें. कैथेटर एक अच्छा ड्रा पाने के लिए थोड़ा पीछे या आगे ले जाया जा करना पड़ सकता है. श्वासनली के भीतर कैथेटर रखने के लिए विशेष एहतियात रखना.
    5. दोहराएँ FBS 1% इंजेक्शन और फेफड़ों से वापस ले लिया गया है सभी DPBS, जब तक 2.8.1-2.8.4 5-6X कदम. नोट: फेफड़ों के तरल पदार्थ की वसूली इंजेक्शन तरल पदार्थ की 100% नहीं होगा.
  9. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पानी से धोना तरल पदार्थ के साथ खाली सिरिंज. कमरे के तापमान पर कोशिकाओं रखें.
  10. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला बंद डालना. यदि चाहें तो इस साइटोकाइन विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है.
  11. 10% FBS के साथ 1-5 मिलीलीटर RPMI 1640 में कोशिकाओं Resuspend और एक hemocytometer पर गिनती. Unstimulated माउस में, बाल द्वारा काटा कोशिकाओं की> 95% कोशिका विज्ञान से इसकी पुष्टि की जा सकती है जो मैक्रोफेज, होने की उम्मीद कर रहे हैं.

3. संवर्धन और कटाई कवक

"> इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता Aspergillus fumigatus अपने जीवन चक्र के सभी चरणों के दौरान GFP व्यक्त:. बीजाणुओं, germlings और hyphae यह फंगल तनाव डा. मार्गो मूर, साइमन फ्रेजर विश्वविद्यालय, Burnaby, ई.पू., कनाडा द्वारा प्रदान किया गया.

  1. Chloramphenicol (0.05 छ / एल) और Gentamicin (0.5 ग्राम / एल) के साथ slants अगर Sabouraud मस्तिष्क दिल निषेचन (भी) पर व्यक्त GFP एक Aspergillus fumigatus तनाव की प्लेट conidia.
  2. शिथिल कमरे के तापमान पर 7 से 10 दिनों के लिए छाया अंधेरे में सेते हैं.
  3. DPBS में 0.01% बीच 20 से 10 मिलीलीटर के साथ धोने तिरछा द्वारा हार्वेस्ट conidia. हल्के से ढीला करने के लिए stripette साथ कवक परिमार्जन. उपज बढ़ाने के लिए तिरछा कई बार कुल्ला.
  4. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से conidial निलंबन गुजरती हैं.
  5. 10 मिनट के लिए 400 XG पर centrifuging द्वारा गोली conidia.
  6. Resuspend 50 मिलीलीटर DPBS में conidia और एक hemocytometer का उपयोग गिनती.
  7. DPBS के साथ दो बार धोने और वांछित ध्यान केंद्रित करने के लिए पतलाtration.

4. फफूंद चैलेंज और confocal माइक्रोस्कोपी

मेजबान बचाव में बृहतभक्षककोशिका NADPH oxidase की भूमिका की जांच करने के लिए, phagocytosed Aspergillus बीजाणुओं की वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए तीन जीनोटाइप के चूहों से अलग वायुकोशीय मैक्रोफेज की क्षमता का मूल्यांकन किया गया था. इस अध्ययन में इस्तेमाल जीनोटाइप में शामिल हैं, एक स्वाभाविक रूप से होती Ncf1 उत्परिवर्तन (Ncf1 उन्हें NADPH oxidase कमी छोड़ने P47 phox, भक्षककोशिकीय NADPH oxidase की एक आवश्यक घटक) के लिए encodes, और 3) Ncf1 * / 1) जंगली प्रकार चूहों, 2) Ncf1 * / * करोड़ चूहों * करोड़ + ट्रांसजेनिक चूहों NADPH oxidase गतिविधि monocyte / बृहतभक्षककोशिका आबादी 10, 11 में पुनर्गठन किया गया है, जहां (एम.एन. मानव CD68 प्रमोटर के नियंत्रण में wildtype Ncf1 शरण transgene अर्थ).

Confocal माइक्रोस्कोपी सर्वश्रेष्ठ कारण उपस्थिति के लिए इस परख के लिए अनुकूल हैऔर स्लाइड पर गैर phagocytosed conidia का विकास. confocal खुर्दबीन Z-अक्ष के भीतर व्यक्तिगत विमानों के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, और बृहतभक्षककोशिका अंदर के आसपास के बजाय बढ़ रही कवक के बीच भेदभाव सक्षम हो जाएगा. सभी confocal छवियों एक 63x तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर हासिल किया है. Z-ढेर 2.5 की एक इलेक्ट्रॉनिक ज़ूम कारक के साथ हासिल किया है. एक Z-ढेर की मोटाई क्षेत्र के ऊपर और नीचे का पता लगाने के लिए DAPI और उज्ज्वल क्षेत्र छवियों का उपयोग निर्धारित किया जाता है. Z-ढेर ~ 1 माइक्रोन मोटी 14 से व्यक्तिगत स्लाइस के साथ 24 माइक्रोन तक बताया गया. मैक्रोफेज की मात्रा का ठहराव के लिए, 1X इलेक्ट्रॉनिक ज़ूम के एकल स्कैन जीनोटाइप प्रति 10 क्षेत्रों पर प्रदर्शन किया गया. बरकरार मैक्रोफेज क्रमशः PKH26 और झिल्ली और नाभिक के DAPI धुंधला के आधार पर पहचान की गई. Conidia FITC अभिव्यक्ति और उज्ज्वल क्षेत्र छवि के आधार पर पहचान की गई.

  1. बाँझ coverslips और प्लेटों की तैयारी
    1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत, 70% ethano में 22 X 22 मिमी कांच coverslips सोख5-10 मिनट के लिए एल.
    2. बाँझ पीबीएस में coverslips कुल्ला.
    3. बाँझ संदंश का प्रयोग, धीरे एक बाँझ अकेले पैक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे में एक एकल coverslip जगह.
  2. बीज ~ 1 एक्स 10 6 PKH26 प्रत्येक coverslip पर वायुकोशीय 1640 RPMI 300 μl में निलंबित मैक्रोफेज, 10% FBS के लेबल काटा. सही संख्या फसल उपज के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
  3. बृहतभक्षककोशिका रातोंरात 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा पालन करने की अनुमति.
  4. अगली सुबह, ~ 1 10 x 7 GFP-व्यक्त जोड़ fumigatus conidia 100 μl पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) RPMI 1640, 10% FBS में निलंबित कर दिया.
  5. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली लौटें.
  6. कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान या रात में 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए तय की जानी चाहिए एक बराबर प्रत्येक के लिए 2% formaldehyde की मात्रा अच्छी तरह से (अंतिम एकाग्रता 1% formaldehyde) जोड़कर 3, 7, और 14 घंटा तय की कोशिकाओं में. के लिए जगह प्लेटें4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर जल्दी समय अंक. अंतिम समय बिंदु (14 घंटे) के लिए, 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को ठीक.
  7. निर्धारण के बाद, धीरे संदंश का उपयोग coverslips निकालें और DPBS में कुल्ला.
  8. एक मुड़ा हुआ Kimwipe पर coverslip के किनारे रखकर अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटा दें.
  9. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड के लिए DAPI के साथ 6 μl प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम लागू करें.
  10. स्लाइड पर coverslip के एक किनारे लेट गया और धीरे बढ़ते मध्यम नीचे में सेल की ओर से ड्रॉप. बढ़ते मध्यम फैल और coverslip के नीचे एक भी परत के रूप में होगा. Coverslip पर प्रेस करने के लिए कोई जरूरत नहीं है.
  11. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं.
  12. स्टोर confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण करने के लिए तैयार है जब तक कमरे के तापमान पर (प्रकाश से सुरक्षित) एक स्लाइड बॉक्स में तैयार स्लाइड.

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Representative Results

Unstimulated चूहों से बाल द्वारा वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका एकत्रित कोशिका विज्ञान पर आधारित एक> 95% शुद्ध आबादी में परिणाम होगा. 3 और 7 घंटा (चित्रा 2) के समय अंक कवक विकास की hyphal चरण पूर्व में होना और जीनोटाइप के बीच conidia की phagocytic दक्षता की तुलना के लिए अनुमति देते हैं. जीनोटाइप ऊतक इनवेसिव hyphal चरण के लिए phagocytosed conidia के संक्रमण (चित्रा 3) को बाधित करने की क्षमता के संबंध में तुलना की जा सकती है, जहां 14 घंटा समय बिंदु है. बरकरार बृहतभक्षककोशिका क्रमशः झिल्ली और नाभिक के PKH26 और DAPI धुंधला, (आंकड़े 2 और 3) के आधार पर confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है. Conidia और hyphae GFP अभिव्यक्ति (आंकड़े 2 और 3) के आधार पर पहचाने जाते हैं.

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चित्रा 1. शारीरिक दिशात्मक संदर्भ और 4 मार्ग पानी निकलने की टोंटी. ए) एक माउस के लिए संरचनात्मक दिशात्मक संदर्भ दिखाए जाते हैं. दुम पूंछ की दिशा में है, जबकि कपाल, सिर की दिशा में है. पृष्ठीय पक्ष वापस या जानवर. बी) की ऊपरी सतह 4 तरह पानी निकलने की टोंटी तीन luer कनेक्शन है और एक संभाल की ओर है, जबकि एक चौपाया के उदर पक्ष, पेट या पशु के निचले सतह की ओर है कि घूमता 360 ° पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से तरल पदार्थ का प्रवाह को निर्देशित करने के लिए. खाली सिरिंज, पूर्ण सिरिंज और कैथेटर की नियुक्ति संकेत कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2 के चित्रा 2. Phagocytosis fumigatus बीजाणुओं 7 घंटा पर जीनोटाइप के बीच इसी तरह की है. (ए) जंगली प्रकार, (बी) Ncf1 * / * करोड़ +, और (सी, phagocytosed conidia के विकास को सीमित करने के लिए NADPH oxidase गतिविधि के साथ अलग वायुकोशीय मैक्रोफेज की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए ) Ncf1 * / * MN - चूहों चतुर्थ PKH26 दिलाई गई. वायुकोशीय मैक्रोफेज 10 दिन बाद बाल द्वारा काटा और GFP-व्यक्त के conidia साथ वरीयता प्राप्त थे fumigatus. कोशिकाओं 3, 7 में तय की, और 14 घंटा conidia के अलावा के बाद किया गया. 3 में (डेटा) नहीं दिखाया और 7 घंटा कुल मैक्रोफेज की संख्या और बृहतभक्षककोशिका ≥ 1 के साथ दोनों समान phagocytosis दक्षता को दर्शाती है, तीन जीनोटाइप के बीच समान थे conidia (तीर) phagocytosed. बरकरार मैक्रोफेज PKH26 (लाल) और DAPI झिल्ली एक के (नीला) धुंधला के आधार पर पहचाने जाते हैंक्रमशः ND नाभिक. एक एकल जेड विमान से प्रतिदीप्ति छवियों उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ मढ़ा जाता है. उज्ज्वल क्षेत्र छवि पूरे नमूना के माध्यम से प्रेषित प्रकाश के होते हैं और फ्लोरोसेंट जेड मैदान पर overlain इसलिए जब पूरे Z-ढेर के भीतर कोशिकाओं और conidia के दृश्य की अनुमति देता. स्केल बार, 19 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. मैक्रोफेज NADPH oxidase के विकास को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है . (ए, डी) के fumigatus बीजाणुओं Confocal माइक्रोस्कोपी जंगली प्रकार, (बी, ई) Ncf1 * / * करोड़ +, और (सी, एफ) Ncf1 * / * MN - < GFP + A के साथ बोने के बाद 14 घंटे में / sup> वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका fumigatus conidia. बरकरार मैक्रोफेज क्रमशः PKH26 (लाल) और DAPI झिल्ली और नाभिक (नीला) धुंधला हो जाना, के आधार पर पहचाने जाते हैं. ठोस तीर कम से कम एक phagocytosed conidia और खोखले तीर hyphae को प्वाइंट के साथ बरकरार मैक्रोफेज दिखा. कम से कम 1 के साथ कई एम्स conidia जंगली प्रकार और Ncf1 * / * करोड़ + कोशिकाओं के साथ मनाया गया phagocytosed, लेकिन नहीं NADPH oxidase की कमी कोशिकाओं के साथ. Hyphae में GFP संकेत चर पूरे Z-ढेर भीतर कोशिकाओं के दृश्य और hyphae सक्षम उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ एक एकल जेड विमान से. एसी) प्रतिदीप्ति छवियों दिखाया Z-खड़ी छवि के विमान पर आधारित था. लोमो) प्रतिदीप्ति छवियों एक एकल जेड विमान से उज्ज्वल क्षेत्र पृष्ठभूमि के बिना कोशिकाओं की पहचान कर सकें, लेकिन नहीं अलग जेड विमानों में कोशिकाओं और कवक के स्थानिक रिश्ता. स्केल बार, 19 माइक्रोन..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

साथ में इन विवो फंगल चुनौती से मैक्रोफेज की रोधी गतिविधि के पूर्व vivo विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम पहले से मैक्रोफेज में NADPH oxidase के खिलाफ रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि प्रदर्शन fumigatus 4. पृथक वायुकोशीय मैक्रोफेज का उपयोग vivo में Aspergillus के खिलाफ की रक्षा है कि अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, neutrophils भर्ती) की अनुपस्थिति में उनके रोधी गतिविधि पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सक्षम बनाता है.

विभिन्न दृश्य रणनीतियों विवो और पूर्व vivo में बृहतभक्षककोशिका रोधी गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. लूथर एट अल., मानव (फेफड़ों प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से काटा) और माउस एम्स के 12 से Aspergillus conidia की phagocytosis अध्ययन करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया. Geunes-बोयर एट अल. phagocytosis निम्नलिखित Candida krusei और murine मैक्रोफेज के बीच बातचीत होती है. वेएक बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन, RAW264.7 और पेरिटोनियम 13 से प्राथमिक बृहतभक्षककोशिका इस्तेमाल किया. गार्सिया-Rodas एट अल. surfactant प्रोटीन डी को बांधता है और क्रिप्टोकोकस neoformans 14 के phagocytosis और जीवित रहने की सुविधा दिखाया. सपा डी बाध्यकारी भी सपा डी का उपयोग vivo में जांच की गई - / - intranasally एलेक्सा Fluor 488 लेबल सी. के साथ inoculated चूहों neoformans. फेफड़ों के पानी से धोना के बाद एम्स immunofluorescently लेबल रहे थे और confocal माइक्रोस्कोपी phagocytosis का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ (जैसे, thioglycollate निकालना या इन विट्रो भेदभाव में) उत्पन्न विभिन्न शारीरिक साइटों (जैसे वायुकोशीय, प्लीहा, पेरिटोनियल), से मैक्रोफेज, या सेल लाइनों से (जैसे, RAW264.7) नाटकीय रूप से अलग रोगाणुरोधी और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 15 हो सकता है - 18. इसलिए, सबसे निकट साँस मज़ा करने के लिए मेजबान प्रतिक्रिया मॉडल परसैनिक, हम तुरंत बलिदान निम्नलिखित unstimulated चूहों से ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना द्वारा काटा वायुकोशीय मैक्रोफेज इस्तेमाल किया.

शुरू में हम बृहतभक्षककोशिका रोधी गतिविधि 4 का मूल्यांकन करने के लिए जीना सेल इमेजिंग का इस्तेमाल किया. वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका संभाग गिलास स्लाइड में चढ़ाया गया तो 3 घंटे के बाद, गैर phagocytosed conidia phagocytosed conidia के अबाधित दृश्य की अनुमति कोमल धोने से हटा दिया गया. Aspergillus व्यक्त GFP के साथ वरीयता प्राप्त. Conidial अंकुरण तो कवक कल्पना करने बृहतभक्षककोशिका और GFP प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए उज्ज्वल प्रकाश छवियों का उपयोग कर 30 मिनट के अंतराल पर समय चूक इमेजिंग द्वारा नजर रखी थी. इस विधि में एक ही प्राथमिक सेल संस्कृति की अनुक्रमिक छवियों को प्राप्त करने का लाभ दिया है. हालांकि, बृहतभक्षककोशिका के लिए प्रवृत्ति बल्कि conidiocidal गतिविधि का एक मात्रात्मक आकलन की तुलना में एक गुणात्मक के लिए अनुमति दी अधिग्रहण के दौरान देखने के क्षेत्र में प्रवास करने के लिए. जीना सेल इमेजिंग का एक और नुकसान टी हैस्पष्टता और विस्तार की वह कमी कोशिकाओं ध्यान के विमान के अंदर और बाहर ले जाने के रूप में.

अधिक से अधिक विस्तार के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए हम प्राप्त की छवियों से तीन आयामी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है जो confocal माइक्रोस्कोपी चुना है. तीन आयामी पुनर्निर्माण hyphae एक बृहतभक्षककोशिका में या माध्यम से चारों ओर बढ़ रहा है बजाय के बीच अंतर करने की क्षमता देता है. तीन आयामों में कोशिकाओं और कवक को देखने के लिए इस क्षमता के साथ, 3 घंटा पर गैर phagocytosed conidia को हटाने अब एक आवश्यक कदम है. Conidia भी बाह्य बनाम intracellular के रूप में ठीक से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.

बढ़ाया दृश्य के लिए, वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका PKH26 साथ vivo में लेबल थे. इस फ्लोरोसेंट डाई stably कोशिका झिल्ली के लिपिड क्षेत्रों में शामिल किया गया है, जो एक लंबे स्निग्ध पूंछ. नसों में इंजेक्शन है, इस lipophilic डाई खून में और ऊतकों में दोनों phagocytic कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है. 10 दिन, labe के बादनेतृत्व में फ़ैगोसाइट murine प्रचलन से मंजूरी दे दी है और बाल द्वारा पहले से ही लेबल वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका के संग्रह के लिए अनुमति देता है, ऊतकों 9 में ही रहते हैं. Vivo में लेबलिंग, वायुकोशीय मैक्रोफेज के बाद फसल में गड़बड़ी के उपयोग को कम से कम रहा है.

इस प्रोटोकॉल के लिए एक और लाभ यह एक GFP-व्यक्त का इस्तेमाल होता है fumigatus तनाव. यह कवक hyphal मंच के माध्यम से conidial मंच से GFP व्यक्त किया और आगे धुंधला के लिए कोई जरूरत नहीं है. मैक्रोफेज और Aspergillus की दोहरी धुंधला के साथ, हम phagocytosed conidia की पहचान करने में सक्षम हैं.

इस प्रोटोकॉल में एक सीमित कारक बाल से बृहतभक्षककोशिका उपज है. एक unstimulated माउस से एक ठेठ उपज 3-5 x 10 5 वायुकोशीय मैक्रोफेज की सीमा में है, हालांकि इस संख्या को इस तरह के पानी से धोना प्रदर्शन व्यक्ति के माउस, अनुभव का आकार, और instillations की संख्या जैसे कारकों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं पानी से धोना फ्लू कीआईडी और फेफड़ों से वापस ले लिया मात्रा. इस प्रोटोकॉल में, फेफड़ों के पानी से धोना दोहराया 1 मिलीलीटर instillations के साथ एक खुले वक्ष गुहा और कम instillations की तुलना में जब सेल उपज बढ़ाने में मदद करता है जो एक बंद वक्ष गुहा के साथ किया जाता है. माउस संख्या भी फसल की उपज बढ़ाने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोग अनुदान R01AI079253 (बीएचएस के लिए) द्वारा समर्थित था, और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान में कैंसर केंद्र सहायता अनुदान CA016056 द्वारा Roswell पार्क कैंसर संस्थान के.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

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References

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