Valutare l'attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Immunology and Infection

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Summary

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

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Grimm, M. J., D'Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

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Abstract

Il polmone è un'interfaccia in cui cellule ospiti sono regolarmente esposti ai microbi e prodotti microbici. Macrofagi alveolari sono i fagociti di prima linea che incontrano i funghi per via inalatoria e altri microbi. Macrofagi e altre cellule immunitarie riconoscono motivi Aspergillus dai recettori di riconoscimento patogeno e avviare risposte infiammatorie a valle. Il ossidasi dei fagociti NADPH genera intermedi reattivi dell'ossigeno (ROI) ed è fondamentale per la difesa ospite. Anche se NADPH ossidasi è fondamentale per neutrofilo-mediato difesa ospite 1-3, l'importanza della NADPH ossidasi nei macrofagi non è ben definito. L'obiettivo di questo studio è stato quello di delineare il ruolo specifico della NADPH ossidasi nei macrofagi nel mediare difesa dell'ospite contro A. fumigatus. Abbiamo trovato che NADPH ossidasi in macrofagi alveolari controlla la crescita di fagocitato A. fumigatus spore 4. Qui, descriviamo un metodo per valutare la capacità di un topomacrofagi lveolar (AMS) per controllare la crescita delle spore di Aspergillus fagocitati (conidi). Macrofagi alveolari sono macchiati in vivo e dieci giorni più tardi isolati da topi da lavaggio broncoalveolare (BAL). I macrofagi sono placcati su vetrini, poi seminate con la proteina fluorescente verde (GFP) che esprimono A. spore fumigatus. A volte specificato, le cellule vengono fissate e il numero di macrofagi intatte con spore fagocitati è valutata mediante microscopia confocale.

Introduction

Macrofagi alveolari sono i fagociti di prima linea che incontrano i microbi inalati. I macrofagi riconoscono motivi Aspergillus dai recettori di riconoscimento patogeni, ingerire e limitano la crescita delle spore per via inalatoria (conidi), e avviare le risposte infiammatorie. Il ossidasi dei fagociti NADPH converte l'ossigeno molecolare per anione superossido e valle intermedi reattivi dell'ossigeno (ROI). Malattia granulomatosa cronica (CGD) è una malattia ereditaria della NADPH ossidasi caratterizzata da infezioni batteriche e fungine gravi e le risposte infiammatorie eccessive.

Anche se NADPH ossidasi è fondamentale per neutrofilo-mediato difesa ospite 1-3, l'importanza della NADPH ossidasi nei macrofagi non è ben definito. Precedenti studi hanno dimostrato che i macrofagi alveolari ingerire ed uccidere le spore di Aspergillus, considerando che i neutrofili principalmente di mira il palco ife 5. Tuttavia, ci sono stati Resul contrastantits come il ruolo della NADPH ossidasi in macrofagi nel controllare la crescita di A. fumigatus spore 6, 7.

L'obiettivo di questo metodo è stato quello di delineare il ruolo specifico della NADPH ossidasi nei macrofagi nel mediare difesa dell'ospite contro A. spore fumigatus. Abbiamo trovato che NADPH ossidasi in macrofagi alveolari controlla la crescita di fagocitato A. fumigatus spore 4. Per modellare più strettamente la risposta dell'ospite ai funghi per via inalatoria, abbiamo usato macrofagi alveolari raccolte da lavaggio broncoalveolare da topi non stimolati subito dopo il sacrificio. L'uso di isolati macrofagi alveolari ci ha consentito di concentrarsi sulla loro attività antifungina in assenza di altre cellule immunitarie (ad esempio, neutrofili reclutati) che difendersi Aspergillus in vivo. In questo metodo, macrofagi alveolari sono state colorate in vivo prima della raccolta in modo da minimizzare la quantità di manipolazione post-raccolta. </ P>

Un altro vantaggio di questo protocollo è l'uso di un GFP che esprimono A. ceppo fumigatus. Questo fungo esprime GFP dalla fase conidi attraverso la fase di ife e non ha bisogno di ulteriori colorazione. Per ottenere immagini con maggiore dettaglio, abbiamo scelto microscopia confocale che permette la ricostruzione di strutture tridimensionali delle immagini ottenute. Ricostruzione tridimensionale dà la capacità di distinguere tra ife crescono intorno piuttosto che in o attraverso un macrofago. Conidi può anche essere precisamente distinto come intracellulare contro extracellulare.

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Protocol

Tutte le procedure eseguite su animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato cura degli animali ed uso al Roswell Park Cancer Institute e rispettate tutte le statali, federali e istituti nazionali di regolamentazione di salute.

1. In vivo macrofagi Labeling

Nota: PHK26 è un colorante lipofilo che sarà ripreso da fagociti sia in circolazione e nei tessuti quando somministrato per via endovenosa (iv). PKH26 è stato utilizzato per l'etichettatura in vivo per minimizzare la quantità di manipolazione post-raccolta del macrofago. PKH-26 ha il vantaggio di accumulare stabilmente nei macrofagi alveolari per periodi prolungati. Attendere 10 giorni dopo la somministrazione permette per la liquidazione di tutte le cellule marcate dalla circolazione lasciando solo alveolare macrofagi stabile etichettati con PKH26 8, 9. PKH26 è un fluorocromo rosso che ha eccitazione (551 nm) ed emissioni (567 nm) caratteristiche compatibilicon i sistemi di rodamina o di rilevazione ficoeritrina. Qualsiasi procedura di etichettatura può introdurre artefatti, inclusa la perdita di vitalità. Tuttavia, dato che utilizziamo lo stesso approccio per l'etichettatura dei macrofagi in diversi genotipi del mouse (ad esempio, WT vs NADPH ossidasi-carenti), gli effetti di questi manufatti sarebbero uniforme.

  1. Diluire soluzione madre di PKH26 (1 x 10 -3 M in etanolo) 1:5 in diluente C fornito dal produttore.
  2. Carico: 100 ml di diluito PKH26 in una siringa da 1/2 ml insulina (29 G x 1/2 ") per ogni mouse.
  3. Somministrare a topi mediante iniezione ev (sia vena della coda o retro orbitale) almeno 10 giorni prima del raccolto.

2. Raccolta alveolari macrofagi di lavaggio broncoalveolare (BAL)

Il numero di topi da utilizzare per un esperimento può variare. Una resa tipica di un mouse non stimolato è nell'intervallo di 3-5 x 10 5 macrofagi alveolari, ma questo numero può variare notevolmente basEd da fattori quali la dimensione del mouse, esperienza della persona che effettua il lavaggio, e il numero di instillazioni di liquido di lavaggio e il volume prelevato dai polmoni. In questo protocollo lavaggio polmonare viene eseguita con una cavità toracica chiuso con ripetuti lavaggi 1 ml contribuisce ad aumentare la quantità di cellule.

  1. Euthanize topo somministrando una dose letale di anestetico avertin (12,5 mg) per via intraperitoneale (ip) utilizzando condizioni asettiche per conservare la soluzione sterile.
  2. Spray topo accuratamente con etanolo al 70%.
  3. Rimuovere pelle dall'estremità craniale animale esporre il torace (Figura 1A).
    1. Fare un piccolo taglio nella pelle appena sotto il diaframma.
    2. Inserire dito nel taglio e tirare pelle dall'estremità craniale dell'animale (Figura 1A).
    3. Premere leggermente sulla testa, estendendo la parte ventrale del collo (Figura 1A).
  4. Tagliare un piccolo foro attraverso la gabbia toracicanel lato destro del torace per sgonfiare i polmoni e anche permettere la visualizzazione dei polmoni durante le seguenti fasi.
  5. Individuare la trachea, e con attenzione sezionare il tessuto circostante.
    1. Rimuovere le ghiandole salivari, muscoli sterno-ioideo e laringe, ecc con pinze curve.
    2. Sollevare delicatamente con una pinza curve e tagliare con le forbici il tessuto sottile che copre la trachea (avventizia) rivelando la struttura cartilaginea anelli sottostante.
  6. Inserire il catetere nella trachea.
    1. Utilizzando pinze curve, posizionare una sutura dietro (dorsale a) la trachea e tirare una lunghezza 10 cm attraverso l'apertura.
    2. Avvio sopra la cricoide (l'anello ispessito della cartilagine) guida con attenzione un catetere G 22 lungo la trachea fermandosi dove la trachea scompare dietro lo sterno.
    3. Fermamente legare sutura intorno trachea e il catetere per una perfetta aderenza. Rimuovere l'ago dal catetere.
  7. Montare a 4 vie rubinetto.
    1. Riempireuno 6 ml siringa con DPBS, 1% FBS e attribuiscono al 4-way rubinetto come indicato nella figura 1B.
    2. Collegare un vuoto 6 ml siringa nella posizione indicata sul 4-way rubinetto (Figura 1B).
    3. Collegare la porta aperta sul 4-way rubinetto per catetere (Figura 1B). Fare attenzione a non rimuovere il catetere dalla trachea.
  8. Raccogliere liquido di lavaggio dai polmoni.
    Nota: Gli investigatori possono scegliere di utilizzare minori volumi di liquido di lavaggio per ridurre al minimo la possibilità di danni al tessuto. È importante che lo stesso approccio venga applicato coerentemente in tutti i gruppi di topo.
    1. Girare la maniglia sul rubinetto in modo che la siringa vuota è chiuso e iniettare lentamente ~ 1 ml DPBS, 1% FBS per gonfiare i polmoni. Osservare l'inflazione polmone attraverso il taglio foro nella fase 2.4.
    2. Fare attenzione a NON gonfiare eccessivamente i polmoni.
    3. Girare la maniglia del rubinetto in modo che l'intero siringa è chiuso, e prelevare con cautela l'influenza id dai polmoni.
    4. Osservare i polmoni si sgonfiano attraverso il foro praticato nel punto 1.4. Il catetere può essere necessario spostare leggermente in avanti o indietro per ottenere un buon pareggio. Prendere precauzioni speciali per mantenere il catetere all'interno della trachea.
    5. Ripetere i punti 2.8.1-2.8.4 5-6x finché tutto il DPBS, 1% FBS è stata immessa e prelevata dai polmoni. Nota: il recupero del fluido polmonare non sarà 100% del fluido iniettato.
  9. Siringa vuota con il liquido di lavaggio in una provetta da 50 ml. Mantenere le cellule a temperatura ambiente.
  10. Agglomerare cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e versare il surnatante. Questo può essere salvata per l'analisi di citochine, se lo desideri.
  11. Risospendere le cellule in 1-5 ml di RPMI 1640 con 10% di FBS e contare su un emocitometro. Nel topo non stimolato,> 95% di cellule raccolte da BAL sono ritenute macrofagi, che può essere confermata mediante citologia.

3. Coltura e raccolta funghi

"> L'Aspergillus fumigatus utilizzato in questo protocollo esprime GFP in tutte le fasi del suo ciclo di vita. Spore, germlings e ife di questo ceppo fungino sono state fornite dal Dott. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada.

  1. Piatto conidi di un ceppo di Aspergillus fumigatus esprimere GFP su Sabouraud cuore cervello infusione (BHI) slant agar con cloramfenicolo (0,05 g / L) e Gentamicina (0,5 g / L).
  2. Incubare al buio liberamente ricoperto per 7-10 giorni a temperatura ambiente.
  3. Harvest conidi mediante lavaggio slant con 10 ml di 0,01% di Tween 20 in DPBS. Leggermente raschiare il fungo con il stripette per allentare. Sciacquare l'inclinazione più volte per aumentare il rendimento.
  4. Passare sospensione conidi attraverso un colino cella 100 micron in una conica da 50 ml.
  5. Pellet conidi per centrifugazione a 400 xg per 10 min.
  6. Risospendere conidi in 50 ml DPBS e contare con un emocitometro.
  7. Lavare due volte con DPBS e diluire a concentrazione desideratistrazione.

4. Fungina Challenge e Microscopia confocale

Per studiare il ruolo dei macrofagi NADPH ossidasi in difesa ospite, la capacità dei macrofagi alveolari isolati da topi di tre genotipi per controllare la crescita delle spore di Aspergillus fagocitati è stata valutata. I genotipi utilizzati in questo studio includono; 1) topi wild-type, 2) Ncf1 * / * Mn-topi con una mutazione naturale Ncf1 (Ncf1 codifica per p47 phox, una componente necessaria del fagociti ossidasi NADPH) lasciando loro NADPH ossidasi carente, e 3) Ncf1 * / * Mn + topi transgenici (MN denota il transgene ospitare tipo selvatico Ncf1 sotto il controllo del promotore di CD68 umano) dove l'attività NADPH ossidasi è stato ricostituito nella popolazione di monociti / macrofagi 10, 11.

Microscopia confocale È più adatto per questo test per la presenzae la crescita di conidi non fagocitato sugli scivoli. Il microscopio confocale permetterà la visualizzazione di piani individuali all'interno l'asse Z, e consentire la differenziazione tra fungo cresce intorno piuttosto che all'interno dei macrofagi. Tutte le immagini confocale vengono acquisite con un obiettivo a immersione in olio 63X. Z-stack sono acquisiti con un fattore di zoom elettronico di 2.5. Lo spessore di un Z-stack è determinato utilizzando DAPI e immagini in campo chiaro per individuare la parte superiore e inferiore del campo. Z-stack variava da 14 a 24 micron, con singole sezioni ~ 1 micron di spessore. Per la quantificazione dei macrofagi, singole scansioni di zoom elettronico 1X sono stati eseguiti su 10 campi per genotipo. Macrofagi intatti sono stati identificati sulla base PKH26 e colorazione DAPI della membrana e nucleo rispettivamente. Conidi sono stati identificati in base all'immagine campo chiaro espressione FITC e.

  1. Preparare vetrini sterili e piastre
    1. Sotto una cappa di sicurezza biologica, immergere 22 x 22 mm coprioggetto di vetro nel 70% ethanol per 5-10 min.
    2. Sciacquare coprioggetto in PBS sterile.
    3. Utilizzando pinze sterili, posizionare delicatamente un singolo vetrino sul fondo di ciascun pozzetto di una singolarmente confezionati 6-pozzetti sterile.
  2. Seed ~ 1 x 10 6 raccolto PKH26 etichettato macrofagi alveolari sospesi in 300 ml RPMI 1640, 10% FBS su ogni vetrino. Il numero esatto può variare a seconda del rendimento del raccolto.
  3. Lasciare macrofagi di aderire incubando a 37 ° C con 5% di CO 2 durante la notte.
  4. La mattina seguente, aggiungere ~ 1 x 10 7-GFP che esprimono A. fumigatus conidi sospeso in 100 ml di pre-riscaldato (37 ° C) RPMI 1640, 10% FBS.
  5. Piastra Rientro a 37 ° C incubatore con il 5% di CO 2.
  6. Le cellule devono essere fissati per un minimo di 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. A 3, 7, e 14 hr cellule fix aggiungendo un volume uguale di 2% di formaldeide in ogni pozzetto (concentrazione finale 1% di formaldeide). Piastre posto per l'punti temporali presto a 4 ° C durante la notte. Per il punto finale di tempo (14 ore), fissare le cellule a temperatura ambiente per 2 ore.
  7. Dopo la fissazione, rimuovere delicatamente coprioggetto con pinze e sciacquare in DPBS.
  8. Rimuovere il liquido in eccesso ponendo il bordo del vetrino su un Kimwipe piegato.
  9. Applicare 6 mezzo di montaggio microlitri fluorescenza con DAPI ad un vetrino da microscopio in vetro.
  10. Posare un bordo del vetrino sul vetrino e rilasciare delicatamente con lato della cella giù nel mezzo di montaggio. Mezzo di montaggio si diffonderà e formare uno strato anche sotto il vetrino. Non c'è bisogno di premere sul vetrino.
  11. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente e lasciare asciugare all'aria.
  12. Conservare preparati vetrini in una scatola slitta (protetto dalla luce) a temperatura ambiente fino al momento di analizzare mediante microscopia confocale.

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Representative Results

Raccolta dei macrofagi alveolari da BAL da topi non stimolati si tradurrà in una popolazione pura> 95% in base citologia. Il 3 e 7 ore (Figura 2) punti temporali precedono la fase di ife di crescita fungina e consentono un confronto di efficienza fagocitaria dei conidi tra i genotipi. Il punto di tempo 14 hr è dove genotipi possono essere confrontati per quanto riguarda la capacità di inibire il passaggio di conidi fagocitato alla fase hyphal tessuto invasivo (Figura 3). Macrofagi intatto può essere identificato mediante microscopia confocale basato su PKH26 e colorazione DAPI della membrana e nucleo, rispettivamente (figure 2 e 3). Conidi ed ife sono identificati sulla base di GFP (figure 2 e 3).

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Sono mostrati Figura 1. Riferimenti anatomici direzionali e il 4-Way Rubinetto. A) I riferimenti direzionali anatomici per un mouse. Cranica è nella direzione della testa, mentre caudale è nella direzione della coda. Il lato ventrale di un quadrupede è verso il ventre o la superficie inferiore dell'animale, mentre il lato dorsale è verso la parte posteriore o la superficie superiore dell'animale. B) Il 4 vie rubinetto ha tre connessioni luer e una maniglia che ruota 360 ° per dirigere il flusso dei fluidi attraverso il rubinetto. Posizionamento della siringa vuota, piena siringa e il catetere sono indicati. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2 Figura 2. Fagocitosi di A. spore fumigatus è simile tra genotipi a 7 ore. Per valutare la capacità dei macrofagi alveolari isolati con attività NADPH ossidasi per limitare la crescita di conidi fagocitato, (A), wild-type, (B) Ncf1 * / * Mn +, e (C Ncf1) * / * Mn - topi è stata somministrata iv PKH26. Macrofagi alveolari sono state raccolte da BAL 10 giorni più tardi e seminati con conidi di GFP che esprimono A. fumigatus. Le cellule sono state fissate a 3, 7 e 14 ore dopo l'aggiunta di conidi. A 3 (dati non mostrati) e 7 ore sia il numero di macrofagi totali e macrofagi con ≥ 1 fagocitati conidi (frecce) erano simili tra i tre genotipi, riflettendo simile efficienza fagocitosi. Macrofagi intatte vengono identificati sulla base PKH26 (rosso) e DAPI (blu) colorazione di membrana anuclei nd rispettivamente. Le immagini di fluorescenza da un unico Z-plane sono sovrapposti all'immagine campo luminoso con. L'immagine campo luminoso costituito da luce trasmessa attraverso l'intero campione e così quando sovrapposta sul fluorescente Z-piana permette la visualizzazione di cellule e conidi all'interno dell'intero Z-stack. Barra della scala, 19 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Macrofagi NADPH ossidasi è necessaria per controllare la crescita di A. . spore fumigatus microscopia confocale di (A, D) wild-type, (B, E) Ncf1 * / * Mn +, e (C, F) Ncf1 * / * Mn - < / Sup> macrofagi alveolari a 14 ore dopo la semina con GFP + A. fumigatus conidi. Macrofagi intatte vengono identificati sulla base PKH26 (rosso) e DAPI (blu) colorazione delle membrane e dei nuclei, rispettivamente. Le frecce indicano Solid macrofagi intatte con almeno un conidi fagocitati e frecce vuote indicano ife. Numerosi AM con almeno 1 fagocitati conidi sono stati osservati con * / * + Mn cellule wild-type e Ncf1, ma non con le cellule ossidasi NADPH-carenti. Segnale GFP in ife è variabile basata sul piano dell'immagine z-stack mostrato AC) e immagini. Fluorescenza da un unico piano z dell'immagine campo luminoso con abilitare la visualizzazione di cellule e ife all'interno dell'intero stack Z DF) immagini di fluorescenza. da un unico piano z senza il campo sfondo luminoso consentire l'identificazione di cellule, ma non la relazione spaziale di cellule e funghi in z diversi piani. Barra della scala, 19 micron..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

Usando questo approccio ex vivo per analisi dell'attività antifungina di macrofagi insieme in vivo sfida fungina, abbiamo precedentemente dimostrato che NADPH ossidasi in macrofagi svolge un ruolo importante nella difesa contro A. fumigatus 4. L'uso di isolati macrofagi alveolari ci permette di concentrarsi sulla loro attività antifungina in assenza di altre cellule immunitarie (ad esempio, neutrofili reclutati) che difendersi Aspergillus in vivo.

Varie strategie di visualizzazione sono state utilizzate per valutare l'attività antifungina macrofagi in vivo ed ex vivo. Luther et al., Usato la microscopia confocale per lo studio fagocitosi di Aspergillus conidi da umani (raccolte da trapianto polmonare) e AMS topo 12. Geunes-Boyer et al. caratterizzato l'interazione tra Candida krusei e macrofagi murini seguente fagocitosi. Essiutilizzata una linea cellulare di macrofagi, RAW264.7 e macrofagi primario dal peritoneo 13. Garcia-Rodas et al. ha dimostrato che tensioattivo proteina-D si lega e facilita la fagocitosi e la sopravvivenza di Cryptococcus neoformans 14. SP-D binding è stato anche studiato in vivo utilizzando SP-D - / - mice intranasale inoculati con Alexa Fluor 488-marcato C. neoformans. Seguendo lavaggio polmonare, AMs stati immunofluorescently etichettato e microscopia confocale stato utilizzato per analizzare fagocitosi.

I macrofagi da diversi siti anatomici (es. alveolare, milza, peritoneale), generati con stimoli diversi (ad esempio, tioglicollato elicitation o in differenziamento in vitro), o da linee cellulari (ad esempio, RAW264.7) possono avere drasticamente diverse risposte antimicrobiche e infiammatorie 15 - 18. Pertanto, per modellare più strettamente la risposta dell'ospite al divertimento per inalazionegi, abbiamo utilizzato macrofagi alveolari raccolte da lavaggio broncoalveolare da topi non stimolati subito dopo il sacrificio.

Inizialmente abbiamo utilizzato live-cell imaging per valutare l'attività antifungina macrofagi 4. Macrofagi alveolari sono stati placcato in lastre di vetro a camera quindi seminato con GFP che esprimono Aspergillus. Dopo 3 ore, conidi non fagocitati sono stati rimossi dal lavaggio delicato per permettere la visualizzazione chiara del conidi fagocitato. Germinazione dei conidi è stato poi monitorato da time-lapse imaging ad intervalli di 30 min con immagini luminose per visualizzare macrofagi e fluorescenza GFP per visualizzare funghi. Questo metodo ha il vantaggio di acquisire immagini sequenziali della stessa coltura cellulare primaria. Tuttavia, la tendenza per il macrofago di migrare attraverso il campo di vista nel corso di acquisizione permesso una qualitativa piuttosto che una valutazione quantitativa dell'attività conidiocidal. Un altro svantaggio di live-cell imaging è tegli mancanza di chiarezza e dettaglio come cellule si muovono in e fuori dal piano di messa a fuoco.

Per ottenere immagini con maggiore dettaglio abbiamo scelto microscopia confocale che permette la ricostruzione di strutture tridimensionali delle immagini ottenute. Ricostruzione tridimensionale dà la capacità di distinguere tra ife crescono intorno piuttosto che in o attraverso un macrofago. Con questa capacità di visualizzare le cellule e funghi in tre dimensioni, la rimozione di conidi non fagocitato a 3 ore non è più un passo necessario. Conidi può anche essere precisamente distinto come intracellulare contro extracellulare.

Per la visualizzazione avanzata, macrofagi alveolari sono stati etichettati in vivo con PKH26. Questo colorante fluorescente ha una lunga coda alifatico che incorpora stabilmente nelle regioni lipidica delle membrane cellulari. Quando iniettato per via endovenosa, questo colorante lipofilo viene assorbito dalle cellule fagocitarie entrambi nel sangue e nei tessuti. Dopo 10 giorni, labefagociti guidati vengono eliminate dalla circolazione murino e rimangono solo nei tessuti 9, consentendo la raccolta di già etichettato macrofagi alveolari da BAL. Con l'uso di etichettatura in vivo, manipolazione post-raccolta dei macrofagi alveolari è minimizzato.

Un altro vantaggio di questo protocollo è l'uso di un GFP che esprimono A. ceppo fumigatus. Questo fungo esprime GFP dalla fase conidi attraverso la fase di ife e non ha bisogno di ulteriori colorazione. Con doppia colorazione dei macrofagi e Aspergillus, siamo in grado di identificare i conidi fagocitato.

Un fattore limitante in questo protocollo è il rendimento macrofago dal BAL. Una resa tipica di un mouse non stimolato è nell'intervallo di 3-5 x 10 5 macrofagi alveolari, ma questo numero può variare notevolmente in base a fattori quali la dimensione del mouse, esperienza della persona che effettua il lavaggio, e il numero di instillazioni di influenza lavandaid e il volume prelevato dai polmoni. In questo protocollo, lavaggio polmonare viene eseguita con una cavità toracica chiuso con 1 ml ripetute instillazioni contribuisce ad aumentare la quantità di cellule rispetto ad una cavità toracica aperta e meno instillazioni. Numeri mouse possono anche essere aumentati per aumentare il rendimento del raccolto.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Allergy and Infectious Disease di Grant R01AI079253 (a BHS), e dal National Cancer Institute Cancer Support Center Concessione CA016056 al Roswell Park Cancer Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4Cl Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter BD 381523 Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD 297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers BD Falcon 64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell culture incubator 37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6-well Cell culture plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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