Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

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Zhang, P., Xia, N., Reijo Pera, R. A. Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (91), e51737, doi:10.3791/51737 (2014).

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Abstract

Introduction

Dopaminergique (DA) des neurones peuvent être trouvés dans plusieurs régions du cerveau, y compris le mésencéphale, hypothalamus, la rétine et bulbes olfactifs. Les neurones DA A9 dans la substantia nigra pars compacta (SNpc) et un comportement de commande de mouvement en projetant dans le striatum du cerveau antérieur et formant le système moteur extrapyramidal. La dégénérescence des neurones DA A9 conduit à la maladie de Parkinson (PD), qui est la deuxième maladie neurodégénérative humaine la plus courante et actuellement incurable. la thérapie de remplacement cellulaire est l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement de PD 1, par conséquent, il ya eu un grand intérêt pour dériver neurones A9 DA à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et la cellules dernières anthropiques souches pluripotentes (hiPSCs).

Beaucoup de recherches ont tenté de tirer les neurones A9 DA de hPSCs en utilisant diverses méthodes. Les premiers rapports tous les neurones DA générés par un neuronalstade rosette progénitrices. En co-culture avec MS5 2 ou PA6 3-5 cellules stromales avec ou sans facteurs de croissance externe pour 2-4 semaines, L. Studer et collègues et trois autres groupes induits succès CSEh pour produire des rosettes de neurones. Ils ont ensuite enrichi ces rosettes par dissection mécanique ou digestion enzymatique pour une différenciation plus poussée. Dans d'autres rapports, les chercheurs ont généré des rosettes de neurones par corps embryoïdes (EB) la différenciation de culture 6-9 flottants. Par la suite, les chercheurs ont établi un procédé de différenciation de la monocouche à base de 10,11, où ils étalées cellules hES et hiPSCs sur la matrice extra-cellulaire, ajouter différents facteurs de croissance dans la culture pour induire la différenciation de hPSCs de neurones dopaminergiques, qui imite l'vivo DA embryonnaire du développement dans des neurones . Bien que toutes ces études obtenus tyrosine hydroxylase (TH) cellules exprimant certaines caractéristiques des neurones dopaminergiques, le processus de différenciation ensemble est temps et de travail consommant,généralement inefficaces, et plus important encore, l'identité A9 de ces neurones n'ont pas été démontrée dans la plupart des études, sauf celle avec Lmx1a expression ectopique 12. Récemment, une nouvelle plaque de plancher (FP) du protocole à base a été développé 13-16, dans lequel les précurseurs de PF avec DA potentiel de neurone ont d'abord été générés par l'activation de la sonic hedgehog et canoniques voies de signalisation Wnt au cours de la phase précoce de la différenciation, puis ces cellules PF ont été précisées pour les neurones dopaminergiques. Bien que ce protocole est plus efficace, il ya encore quelques problèmes; par exemple, l'ensemble du processus de différenciation prend beaucoup de temps (au moins 35 jours) et de cellules nourricières est dépendante 15, ou EB est dépendante de l'identité ou de 16 A9 14 n'a pas été démontrée.

Ici, sur la base de la connaissance de in vivo développement embryonnaire DA neurone et les résultats publiés d'autres chercheurs de, nous avons optimisé les conditions de culture pour l'effgénération isant des neurones dopaminergiques de deux CSEh et hiPSCs. Nous avons généré des cellules précurseurs première FP par l'activation de la signalisation Wnt canonique avec une petite molécule et CHIR99021 signalisation Sonic Hedgehog avec de petites molécules et purmorphamine SAG. Ces cellules expriment PF FOXA2, Lmx1a, CORIN, OTX2 et nestine. Nous avons ensuite précisé ces cellules PF à neurones dopaminergiques avec des facteurs de croissance, y compris BDNF, GDNF, etc. Les neurones dopaminergiques sont générés de A9 type de cellule car ils sont positifs pour GIRK2 tout négatif pour Calbindin 17. Ce protocole est une cellule d'alimentation ou EB indépendante, hautement efficace et reproductible. En utilisant ce protocole, on peut dériver neurones DA en moins de 4 semaines à partir de CSEh ou hiPSCs des personnes normales pour l'étude de la transplantation de cellules, ou de hiPSCs de patients parkinsoniens pour la modélisation in vitro de PD ou de tester des agents thérapeutiques potentiels pour PD.

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Protocol

1 Préparation de milieux de culture

  1. Préparer la souris fibroblastes embryonnaires (MEF) moyen en combinant la suivante: 445 ml de DMEM, 50 ml de sérum de veau fœtal (FBS), et 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 14 jours.
  2. Préparer le milieu de culture HPSC en combinant les éléments suivants contenant du sérum: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de remplacement de sérum de finale (KSR), 5 ml 100x non essentiels solution solution acide aminé d'achat d'actions, 5 ml 100x pénicilline / ampicilline actions, 5 ml 100x mercaptoéthanol solution mère, et 10 ng / ml de bFGF. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 10 jours.
  3. Préparer un milieu sans sérum mTeSR1 en combinant les éléments suivants: 400 ml mTeSR1 milieu de base, 100 ml 5x supplément, et 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Gardez milieu à 4 ° C pendant pas plus de 10 jours.
  4. Préparer IV solution mère 10x collagénase: peser 0,5 g puissance collagénase IV, etdissoudre avec 50 ml de DMEM / F12 et stériliser par filtration. Faire aliquotes et les stocker à -20 ° C pendant plusieurs mois.
  5. Préparer une solution de gélatine à 0,1%: peser 0,5 g de gélatine (peau de bovin, type B) de puissance et dissoudre avec de l'eau désionisée. Gardez solution stérilisée en autoclave à la température ambiante pendant des semaines.
  6. Préparer milieu de différenciation KSR en combinant la suivante: 410 ml de DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x solution non acide aminé essentiel actions, 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock, 5 ml 100X mercaptoéthanol solution de stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 10 jours.
    REMARQUE: KSR varie d'un lot à l', ce qui peut affecter l'efficacité de la différenciation. Il est donc préférable de tester plusieurs lots de KSR pour trouver la meilleure solution pour la différenciation.
  7. Préparer milieu de différenciation N2 en combinant les éléments suivants: 98 ml de DMEM, 1 ml 100x supplément N2 et 1 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4° C pendant au plus 10 jours.
  8. Préparer milieu de différenciation de B27 en combinant la suivante: 480 ml de milieu neurobasal, 10 ml 50x B27 supplément, 5 ml 100X Glutamax solution mère, et 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 10 jours.

2. culture des CSEh et hiPSCs sur des cellules nourricières MEF

Les CSEh H9 proviennent de l'Institut de recherche et WiCell hiPSCs ont été établis dans le laboratoire Reijo Pera par transduction rétrovirale médiation de Yamanaka facteurs OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-MYC 18.

  1. Au moins un jour avant le passage des cellules, la préparation des plaques de gélatine par addition de 1 ml de gélatine à 0,1% à 1 puits de plaques à 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 30 min.
  2. Après incubation, les plaques de gélatine aspiration, et l'irradiation des semences cellules MEF inactivées sur les plaques à la densité de 1,6 x 10 5 cellules/ Puits dans le milieu MEF utilisant un hémocytomètre pour compter les cellules.
    REMARQUE: préparer option mangeoires MEF dès 3 jours avant le passage de la cellule.
  3. cellules Passage d'un jour après l'étalement mangeoires MEF: Aspirer le milieu de hPSCs, ajouter 1 mg / ml de collagénase IV de cellules à 1 ml / puits et incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure.
  4. Pendant cette incubation, laver les mangeoires MEF fois avec du PBS, puis ajoutez chaud (37 ° C) HPSC milieu de culture contenant du sérum à 1,5 ml / puits.
  5. Après 1 heure, appuyez sur la plaque de culture une couple de fois de sorte que la plupart des colonies indifférenciées se détacher des plaques, tandis que les colonies différenciées restent attachés. Recueillir soigneusement les colonies flottantes, et de les transférer en tube de 15 ml.
  6. Lavez délicatement la plaque une fois avec chaud (37 ° C) DMEM / F12 et transférer DMEM / F12 dans le même tube de 15 ml.
  7. Centrifuger les tubes à 179 g pendant 3 min.
  8. Aspirer le milieu des tubes, en faisant attention de ne pas perturber le culot. Ajouter guerremilieu de culture m HPSC, la pipette les cellules de haut en bas plusieurs fois pour les briser en petits groupes et mélangez-les bien.
  9. Transférer les cellules sur de nouveaux départs MEF à 1: 3-1: 6 rapport.
  10. Changer le support chaque jour et le passage des cellules tous les 5-6 jours.

3 Préparation des cellules pour la différenciation

  1. Au moins un jour avant la préparation de cellules, préparer des plaques de Matrigel (typiquement 3 puits d'une plaque à 6 puits). Diluer avec du Matrigel froid (4 ° C) du milieu DMEM / F12 à 01:40 et ajouter 1 ml de Matrigel par puits de plaques à 6 puits. Incuber les plaques de Matrigel à 4 ° C pendant une nuit. NOTE: On peut sceller les plaques de Matrigel avec du Parafilm et les stocker à 4 ° C pendant aussi longtemps qu'une semaine.
  2. Utiliser des cellules (voir étape 2) 4 jours après le passage. Retirez toutes les colonies différenciées des plaques. Aspirer le milieu de la plaque de culture, ajouter 1 ml Accutase par puits, et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
  3. Pendant l'incubation, préparer quelques gelatin plaques par addition de 1 ml de gélatine à 1 puits de plaques à 6 puits. Placez ces plaques et les Matrigel plaques préparées la veille dans l'incubateur.
  4. Après la 5 minutes d'incubation ou lorsque les cellules sont devenues semi-flottant, les cellules de pipette de haut en bas plusieurs fois pour en faire des cellules individuelles.
  5. Recueillir des cellules individuelles dans tubes de 15 ml et centrifuger à 258 g pendant 3 min.
  6. Resuspendre les cellules avec suffisamment de sérum contenant du milieu de culture, et HPSC Thiazovivin ajouter à la concentration finale de 2 uM.
  7. Transfert des cellules sur des plaques recouvertes de gélatine à 1: 1, et les cellules incuber à 37 ° C pendant 30 min pour éliminer les mangeoires MEF.
  8. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml, ajouter un milieu contenant du sérum approprié HPSC et compter les cellules avec un hémocytomètre.
  9. Centrifuger les cellules à 258 g pendant 3 min.
  10. Au cours de centrifugeuse, ajouter Thiazovivin de s'approprier moyen mTeSR1 pour obtenir une concentration de 2 uM.
  11. Après centrifugation, unespirate le milieu et ajouter mTeSR1 milieu approprié avec Thiazovivin sorte qu'il n'y a 1,8 x 10 5 cellules / ml de milieu.
  12. Sortez les plaques Matrigel de l'incubateur, aspirer le Matrigel et ajouter 2 ml de cellules mixtes sur 1 puits des plaques de 6 puits.
    REMARQUE: La densité cellulaire doit être de 3,6 x 10 4 cellules / cm 2 de surface.
  13. Remettre les plaques de retour à l'incubateur, et que les cellules se fixent pendant 24 heures.
  14. 24 heures après l'étalement des cellules, aspirer ancien milieu et ajouter 2 ml nouveau média mTeSR1 par puits et laisser les cellules se développent pour un autre 24 heures avant le début de la différenciation.

La différenciation des cellules

  1. Lancer la différenciation 48 heures après les plaquant les cellules sur des plaques de Matrigel.
  2. Aspirer le milieu de culture de la plaque, se laver les cellules une fois avec du PBS, et ajouter 2 ml de milieu de différenciation suivante par puits: milieu de différenciation KSR complété avec 10 uM SB431542 et 100 nM LDN-193189. Marquer ce jour D0 de différenciation.
  3. Changer le milieu tous les jours de D0 à D20.
    NOTE: On peut préparer le milieu pour une utilisation pas plus de 2 jours à la fois.
  4. Utilisez le milieu suivant pour D1 et D2: milieu de différenciation KSR complété avec 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, et 50 ng / ml FGF8b.
  5. Utilisez le milieu suivant pour D3 et D4: milieu de différenciation KSR complété avec 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, et 3uM CHIR99021.
  6. Utilisation du support suivant pour D5 et D6: 75% de milieu de différenciation KSR plus 25% milieu de différenciation N2 complété avec 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, et 3 uM CHIR99021.
  7. Utilisez le milieu suivant pour D7 et D8: 50% de milieu de différenciation KSR plus 50% de milieu de différenciation N2 complété avec 100 nM LDN-193189 et 3 uM CHIR99021.
  8. Utilisez le milieu suivant pour D9 et D10: 25% KSR milieu de différenciation plus 75% de milieu de différenciation N2 complété avec 100 nM LDN-193189 et 3 uM CHIR99021.
  9. Utilisation du support suivant pour D11 et D12: milieu de différenciation B27 additionné de 3 uM CHIR99021, 10 ng / ml de BDNF, 10 ng / ml GDNF 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM d'acide ascorbique et 0,1 mM d'AMPc.
  10. Utilisation du support suivant pour le reste de la différenciation: milieu de différenciation B27 supplémenté avec 10 ng / ml de BDNF, 10 ng / ml GDNF 1 ng / ml TGF3, l'acide ascorbique 0,2 mM et 0,1 mM d'AMPc.
  11. A peu près à D16 de la différenciation, de préparer des poly-L-ornithine laminine / plaques / fibronectine. Diluer poly-L-ornithine solution stock de froid (4 ° C) PBS à 15 pg / ml, ajouter 1 ml à 1 puits de plaques 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
  12. Aspirer la solution poly-L-ornithine, laver les plaques 3 fois avec de l'eau stérile, puis sécher à l'air les plaques.
  13. Diluer la laminine stocks solution de froid (4 ° C) PBS à 1 pg / ml, ajouter 1 ml d'un puits de plaques 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
  14. Aspirer la solution de laminine, laver les plaques 3 fois avec de l'eau stérile, puis sécher à l'air les plaques.
  15. Diluer la solution de fibronectine du stock de froid (4 ° C) PBS à 2 pg / ml, ajouter 1 ml à 1 puits de plaques 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
  16. plaques d'étanchéité avec du parafilm et placer à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines.
  17. Après 20 jours de différenciation, Réensemencement cellules aux plaques / laminine / fibronectine Poly-L-ornithine. milieu de différenciation Aspirer, ajouter 1 ml chaude (37 ° C) Accutase à 1 puits de plaques 6 puits et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
  18. Au cours de l'incubation, placer les poly-L-ornithine laminine / plaques / fibronectine dans l'incubateur.
  19. Après la 5 minutes d'incubation ou lorsque les cellules sont devenues semi-flottant, en douceur les cellules de pipette de haut en bas plusieurs fois àrendre dans des cellules individuelles.
  20. Recueillir les cellules individuelles dans 15 ml tubes coniques, et ajouter la quantité appropriée de milieu neurobasal pour le comptage des cellules, qui varie en fonction de l'expansion (après 11 jours de différenciation, les cellules peuvent augmenter 15-20 fois). Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
  21. Centrifuger les cellules à 258 g pendant 3 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec du milieu de différenciation B27 de sorte que la concentration cellulaire est de 1 x 10 6 cellules / ml de milieu.
  22. Aspirer la fibronectine à partir des plaques, laver deux fois avec du PBS, et ajouter 2 ml de cellules à une puits de plaques à 6 puits.
    REMARQUE: La densité cellulaire pour réensemencement doit être de 2 x 10 5 cellules / cm 2 de surface.
  23. Changer le milieu de 24 heures plus tard pour enlever les cellules mortes seules.
  24. Changer le milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les points de temps souhaités pour une expérience donnée.

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Representative Results

Un aperçu du protocole de différenciation est représenté sur la Figure 1. L'efficacité du protocole de différenciation présentée ici se fonde sur l'état des cellules de départ. Par conséquent, il est essentiel de faire en sorte que, tout d'abord une supprime toutes les colonies différenciées avant dissociation hPSCs dans des cellules individuelles de la différenciation, et d'autre part, une épuise la plupart, si pas toutes, les cellules nourricières MEF par l'incubation des cellules sur des plaques revêtues de gélatine pendant 30 minutes, et la troisième, une des plaques les cellules individuelles HPSC à la densité appropriée sur la plaque Matrigel. Comme illustré sur la figure 2, replaquées cellules individuelles vont développer HPSC comme les grappes pendant 48 heures avant la différenciation, la formation d'environ 70% de confluence dans des plaques. Puis, après différenciation, ces cellules atteindre la pleine confluence en aussi peu que 3-4 jours, et à partir de autour de D16 à D17, ces cellules confluentes commencer à faire quelques places dans les plaques, et certains axones / neurites pouvait déjàobserver dans ces espaces et dans les couches de cellules. Après avoir été replaquées à D20, les cellules différenciées attachés et ont augmenté en petites touffes. Puis, pendant les 5 prochains jours, les axones beaucoup plus intensifs et morphologiquement intacts / neurites sortent des touffes, et les axones / neurites de différents massifs forment des connexions. Au cours de culture à long terme, les neurones dans un bouquet de générer plusieurs extensions, obtenir plus mature et avoir plus de connexions avec les neurones dans des amas voisins.

Après 11 jours de différenciation, hPSCs pourraient être efficacement convertis en précurseurs de PF, et comme illustré à la figure 3, presque toutes les cellules expriment la FP marqueurs de cellules précurseur nestine et FOXA2, et plus de 90% des cellules expriment trois autres marqueurs CORIN, OTX2 et Lmx1a. Puis, après plusieurs jours de différenciation, les cellules précurseurs de PF sont spécifiés pour les neurones dopaminergiques comme ils expriment Tuj1 et TH (figure 4A). Ces neurones dopaminergiques sont de l'identité A9 ils Express GIRK2 tout est négatif pour Calbindin (figure 4B). Expériences Immunocoloration montrent aussi qu'il n'y a pas de GFAP + astrocytes et très peu de neurones GABAergiques (figure 4C), indiquant que la différenciation est exclusivement spécifié vers le neurone lignée DA.

Figure 1
Figure 1: Vue d'ensemble du protocole de différenciation, des facteurs de croissance / petites molécules et milieu de culture utilisé pour chaque jour. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 morphologiqueal change au cours de la différenciation. hESC H9 ont été étalées dans des cellules individuelles de la densité cellulaire appropriée comme décrit, et 48 heures plus tard, ces cellules atteignent 70% de confluence de la plaque sous forme de colonies (D0). Pendant les quelques premiers jours de différenciation, les cellules se développent rapidement, atteignant plus de 90% de confluence après 24 heures de différenciation (D1), et deviennent alors confluence après 48 h de plus (D3). Cependant, la plupart de ces cellules présentent encore morphologie typique de CSEh à haute noyau rapport de cytoplasme (D3). Que la différenciation se poursuit, les cellules se dilatent plus et perdent peu à peu CSEh morphologie. A la fin de D11 de différenciation, il ya plus d'une couche de cellules dans de nombreuses parties de la plaque, comme en témoigne la couleur sombre de cellules dans certaines régions que dans les autres (D11). À partir d'environ D17 à D20, certaines cellules mortes, laissant des espaces dans la plaque, et des projections de neurones pourraient déjà être observés dans ces espaces une parfois sous la couche de cellules (D20). Après réensemencement des cellules à la fin de D20 pour faire plus de places pour les cellules à croissance et de la différenciation, les cellules s'agrègent par petits groupes, beaucoup plus axones / neurites se dégagent de ces groupes, et les axones / neurites de différents groupes forment des connexions dans le plus court 4-5 jours (D25). La barre d'échelle, 200 um.

Figure 3
Figure 3 Immunocoloration des marqueurs de PF à un stade précoce de la différenciation des CSEh. H9 ont été différenciées pendant 11 jours en utilisant le protocole décrit ici. Les cellules ont ensuite été fixées avec du paraformaldéhyde 4%, perméabilisées avec du Triton X-100, bloquées avec du sérum d'âne et puis colorées pour PF marqueurs de cellules précurseur. Comme le montre ici, presque tous les cellules expriment FOXA2 et nestine, et plus de 90% des cellules expriment Lmx1a, CORIN, etOTX2, indiquant une conversion à très haut rendement de cellules hES en cellules PF. La barre d'échelle, 200 um.

Figure 4
Figure 4 Immunocoloration des marqueurs de neurones DA à des stades tardifs de la différenciation. (A) CSEh H9 sont différenciées pendant 25 jours, et les cellules ont été soumises à une coloration immunologique pour le pan-neurone marqueur Tuj1 et la DA marqueur des neurones TH couramment utilisé. Comme représenté ici, bien qu'il n'y ait plus Tuj1 cellules positives que des cellules TH positives, toutes les cellules exprimant TH résidu dans les cellules exprimant Tuj1, et les cellules exprimant TH représentent au moins la moitié de toutes les cellules. (B). Les CSEh H9 étaient aussi différenciées pendant 25 jours (50 jours totalement), puis les cellules ont été soumises à l'immunomarquage. Les résultats ont montré qu'il n'y a plus grand pourcentage de cellules exprimant la TH-èmeun qu'au d25. La quasi-totalité de ces cellules TH exprimant également exprimer GIRK2 alors que la plupart d'entre eux sont négatifs pour Calbindin, indiquant l'identité du sous-type A9 des neurones DA générés, qui est le type de cellule qui se perd dans la MP. (C) Immunocoloration pour les cellules à D25 de différenciation a montré qu'il n'y a pas de cellules exprimant la GFAP, et très peu de cellules expriment GABA. La barre d'échelle, 200 um.

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Discussion

Les cellules souches pluripotentes humaines (y compris les cellules hES hiPSCs) et peuvent être différenciées in vitro afin de générer la plupart, sinon tous, les types de notre corps, y compris les neurones dopaminergiques, qui a été démontré dans des études précédentes 19 cellules. Ici, basée sur la connaissance de dopaminergique développement embryonnaire des neurones 20 et protocoles publiés par les autres laboratoires 14,15, nous avons optimisé les conditions de culture pour la production de neurones dopaminergiques de CSEh et hiPSCs. Ce protocole est efficace, reproductible et nous avons appliqué avec succès ce protocole décrit ici pour lignes H1 et H9 de CSEh et aux lignes hiPSC à la fois des patients parkinsoniens et des contrôles sains.

Dans notre protocole, il ya trois étapes clés pour obtenir le rendement élevé de différenciation: d'abord, il devrait y avoir aucune colonie HPSC différenciées dans la différenciation des cellules avant scène. Différenciation spontanée à tous les trois feuillets embryonnaires est souvent vu dans hCulture CFP, il est important d'éliminer ces colonies différenciées avant dissocier ces hPSCs en cellules individuelles. Deuxièmement, mangeoires MEF devraient être épuisées des hPSCs dissociées, comme les rapports précédents ont montré que les cellules MEF pouvez facteurs secrets qui favorisent l'auto-renouvellement et de différenciation inhibent 21. A cet effet, l'incubation des cellules MEF HPSC et mélanges sur des plaques recouvertes de gélatine pendant 30 minutes devrait suffire à éliminer la quasi-totalité des cellules MEF. Troisièmement, les hPSCs isolées doivent être étalées à la densité cellulaire appropriée pour la différenciation. L'augmentation de la densité cellulaire sera d'entraîner la mort de la plupart des cellules à environ D11 de différenciation, tout en abaissant la densité de cellules se traduira par le détachement et la mort des cellules dans le milieu de la plaque dans le plus court inférieure à 7 jours, bien que les cellules de le bord sera bien différencier (données non présentées). Si l'on observe l'ensemble de ces trois critères, il est facile d'obtenir efficacement à partir de neurones dopaminergiques hPSCs avec notre protocole par étapes.

Le protocole présenté ici est principalement basée sur un rapport précédent par L. Studer et ses collègues 14 avec quelques modifications. Tout d'abord, la différenciation ici a commencé 48 heures après l'étalement de la cellule unique lorsque les cellules atteignent seulement environ 70% de confluence, alors que dans son rapport, la différenciation a commencé lorsque les cellules atteignent leur pleine confluence (3 jours ou plus de la culture après une seule cellule de placage). Dans notre expérience, à partir de la différenciation des cellules confluentes sans un passage de cellule 20 jusqu'à ce jour conduit à la mort cellulaire sévère pendant le processus de différenciation. Deuxièmement, nous remplaçons la protéine SHH cher dans leur étude de la SAG, une petite molécule agoniste contenant de chlorobenzothiophene-HH voie 22. Par conséquent, par rapport aux protocoles publiés précédemment, celui-ci décrit ici est une cellule d'alimentation et la rosette de neurones indépendant et basé principalement sur de petites molécules pour la spécification FP; il est donc moins coûteux et moins de temps et de haute intensité de travail. Bien entendu, la limitation de ce protocole est l'utilisation de KSR pour les premiers jours de différenciation. KSR varie d'un lot à l', ce qui peut affecter l'efficacité de la différenciation. Par conséquent, il convient de tester les différents lots de KSR pour obtenir celle qui fonctionne le mieux dans l'induction de précurseurs de PF après 11 jours de différenciation.

En résumé, le protocole de différenciation aperçut ici devrait faciliter: (1) la production de neurones dopaminergiques à partir de CSEh ou hiPSCs des personnes normales pour la thérapie de remplacement cellulaire pour PD; (2) la production de neurones dopaminergiques du PD CSPi de patients pour la modélisation et tester des médicaments thérapeutiques potentielles pour PD in vitro; (3) l'étude des gènes / voies régulant le développement des neurones DA humain signalisation.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 10569-010
FBS Life Technologies 26140
penicillin/ampicillin Life Technologies 15140-122
DMEM/F12 Life Technologies 10565-018
KSR Life Technologies 10828-028
Non-essential amino acid Life Technologies 11140-050
b-mercaptoethanol Millipore ES-007-E
bFGF R&D Systems 233-FB-025
mTesR1 STEMCELL Technologies 5850
Collagenase IV Life Technologies 17104-019
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
N2 supplement Life Technologies 17502-048
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Neurobasal Life Technologies 21103-049
Glutamax Life Technologies 35050-061
PBS Life Technologies 10010-023
Growth factor reduced matrigel BD Biosciences 354230
Accutase MP Biomedicals 1000449
Thiazovivin Santa Cruz Biotechnology sc-361380
SB431542 Tocris Bioscience 1614
LDN-193189 Stemgent 04-0074
SAG EMD Millipore 566660-1MG
Purmorphamine Santa Cruz Biotechnology sc-202785
FGF8b R&D Systems 423-F8-025
CHIR99021 Cellagen Technology C2447-2s
BDNF R&D Systems 248-BD-025
GDNF R&D Systems 212-GD-010
TGF-beta3 R&D Systems 243-B3-002
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4034
cAMP Sigma-Aldrich D0627
Mouse anti human NESTIN antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23927 1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody Millipore AB9566 1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody R&D Systems AF2400 1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody Millipore AB10533 1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody Pel Freez P40101 1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody Millipore AB9702 1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody Covance MMS-435P 1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody Abcam ab30738 1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody Abcam ab25085 1/400 dilution
Centrifuge Eppendorf 5804

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References

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