دليل ل
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

Published 11/07/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons. J. Vis. Exp. (93), e51757, doi:10.3791/51757 (2014).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وثمة تحد رئيسي في الفسيولوجيا العصبية لتوصيف خصائص الاستجابة وظيفة من العديد من أنواع الخلايا المثبطة في القشرة الدماغية. نحن هنا نشارك إستراتيجيتنا للحصول مستقرة، معزولة جيدا تسجيلات وحدة واحدة من interneurons المثبطة التي تم تحديدها في القشرة الماوس تخدير باستخدام الطريقة التي وضعتها ليما و1 الزملاء. وتجرى التسجيلات في الفئران معربا عن Channelrhodopsin 2 (ChR2) فى فئة محددة العصبية. يتم التعرف على أفراد من السكان من قبل ردهم إلى مضة قصيرة من الضوء الأزرق. هذه التقنية - يطلق عليه "PINP"، أو تحديد ضوئي بمساعدة من السكان العصبية - يمكن تنفيذها مع المعدات القياسية تسجيل خارج الخلية. يمكن أن تكون بمثابة بديل رخيص الثمن وفي متناول التصوير الكالسيوم أو الترقيع الموجهة بصريا، لغرض استهداف التسجيلات خارج الخلية إلى الخلايا المحددة وراثيا. Hيحرث نحن نقدم مجموعة من الإرشادات لتحسين الأسلوب في الممارسة اليومية. نحن المكرر استراتيجيتنا خصيصا لاستهداف (PV +) خلايا parvalbumin إيجابي، ولكن وجدت أنه يعمل لأنواع عصبون أخرى أيضا، مثل (CR +) interneurons، معربا عن calretinin (SOM +)، معربا عن السوماتوستاتين و.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول التالي هو وفقا للمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية التي وافقت عليها جامعة ولاية أوريغون رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. جراحة الحاد

  1. تخدير الحيوانات مع كوكتيل الكيتامين medetomidine، عبر داخل الصفاق (IP) حقن (الجدول 1).
    ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذه التجارب تم إنشاؤها بواسطة عبور تعتمد على لجنة المساواة العرقية ChR2-EYFP المعدلة وراثيا line10 إلى عصبون خطوط سائق (Pvalb-iCre11، PV +، SST-iCre12، SOM +، الكروم، iCre12، CR +). تسليم الفيروسي من ChR2 أو opsins ذات الصلة يجب أن تعمل بشكل جيد على قدم المساواة، على افتراض يتم الحصول على مستويات التعبير مماثلة.
  2. قبل البدء في عملية جراحية، تأكد من أن المعروضات الحيوانية لا استجابة لقرصة أخمص قدميه لطيف. إعادة إدارة التخدير في كافة مراحل التجربة عند الضرورة للحفاظ على هذا عمق التخدير. إذا باستخدام التخدير عن طريق الحقن، زرع اختياريا قسطرة الملكية الفكرية لحقن الصيانة.
  3. الحفاظ على الحيوانات المائية مع المياه المالحة أو محلول رينغر اللاكتاتي في كافة مراحل التجربة (حوالي 3 مل / كغ / ساعة)، على سبيل المثال باستخدام كوكتيل مخدر المخفف مناسب لحقن الصيانة (الجدول 1).
  4. وضع الحيوان في الجهاز الرأس عقد التجسيمي أو غيرها. ضمان أن يتم تأمين الجمجمة جيدا. هذا أمر ضروري للحفاظ على استقرار تسجيلات خلية واحدة.
  5. تطبيق مرهم opthalamic للعيون لمنع جفاف. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 36،5 حتي 37 درجة مئوية.
  6. إجراء استنزاف الصهريج لاستقرار تسجيل إضافية. باستخدام شفرة مشرط، وإزالة أنسجة من وجه الخلفي من الجمجمة لفضح ماجنا صهريج. إحداث شق صغير في الجافية لتصريف السائل النخاعي. استخدام سوى غيض جدا من شفرة، وتجنب الاتصال المخيخ أو المخ الجذعية.
  7. باستخدام مشرط، إجراء حج القحف صغيرة (~ 2 مم 2) على المنطقة القشرية من الفائدة (لالسمعيةالقشرة، تقريبا -2.3 ملم الخلفي من bregma، 4.5 ملم الوحشي من خط الوسط).
  8. إزالة الجافية، وتغطي القشرة يتعرض مع طبقة من الاغاروز الدافئ 0،5-1 مم (1.5٪ الاغاروز في المياه المالحة، 0.9٪ كلوريد الصوديوم، وتطبيق في ~ 37 درجة مئوية). الحفاظ على رطوبة الاغاروز في كافة مراحل التجربة من خلال تطبيق دوري عدة قطرات من المياه المالحة.

2. تسجيل مجموعة المتابعة

  1. إعداد القطب التنغستن (7-14 MΩ، 127 ميكرون قطر، 12 ° طرف مدبب، الايبوكسي المغلفة). Superglue القطب إلى أنبوب الزجاج الشعرية وإضافة الانكماش الحراري أنابيب لقبضة (الشكل 1).
  2. جبل الكهربائي على micromanipulator بمحركات (أو الهيدروليكي)، المقرر أن يسافر متعامد على السطح القشري. الانزلاق على الأرض الأسلاك تحت الجلد، ضد الجمجمة. تجنب الاتصال مع العضلات على جانبي الرأس والجزء الخلفي من الرقبة لأنها يمكن أن تولد التحف electromyographic.
  3. تضخيم الإشارات الكهربائية باستخدام أمبير خارج الخليةلي فاي إيه مناسبة للتسجيل وحدة واحدة، ومجهزة يفضل مع وضع الاختيار مقاومة. مراقبة نشاط ارتفاعه المستمر (الفرقة تمرير 300 - 5000 هرتز) مع اثنين من الذبذبات ومجموعة من المتحدثين بالطاقة. هنا، ورقمنة البيانات المسجلة بشكل مستمر بمعدل عينة من 10 كيلو هرتز. يتم استخراج المسامير حاليا.
  4. دفع الكهربائي من خلال الاغاروز حتى يصل الطرف سطح القشرة. ملاحظة هذه الخطوة من خلال المجهر. "صفر" هذا الموقف على مياداة مجهرية.
  5. لتقريب أفضل عمق التسجيل، وتأكيد بصريا أن طرف القطب يخرج على السطح القشري على عمق الصفر عندما سحب القطب في نهاية الاختراق.
    ملاحظة: هناك اختلاف بين القراءة مناور والموقف القطب وحظ تشير أنه قد جنحت نسبة إلى الأنسجة. يمكن أن يكون سبب هذا عدم الاستقرار في المخ أو الحيوان، أو تتلاعب الانجراف.
    1. كما الاختيار إضافية لضمان أنهذه مجموعة الصفر نقطة يتوافق مع سطح القشرة، ومراقبة امكانات الحقل، أثار التحفيز في حين تقدم من خلال أول عدة مئات ميكرومتر من الأنسجة. عند رصد امكانات الحقل، وانخفاض أقل الفرقة تمرير مرشح قطع من مكبر للصوت خارج الخلية إلى 10 هرتز. تأكد من أن الاستقطاب من إمكانات الميدانية المحلية في جميع أنحاء عكس عمق ~ 100 ميكرون، بالقرب من الحدود طبقة I / II 13. هذا هو نقطة مرجعية موثوقة للقشرة السمعية، ولكن قد تختلف عن المناطق القشرية الأخرى.
  6. تركيب الألياف البصرية إلى جانب لمصدر الضوء الأزرق (الشكل 2) الصعود إلى مياداة مجهرية اليدوي. باستخدام المجهر، ضع غيض من الألياف أقرب إلى سطح الاغاروز ممكن. مركز شعاع القطب حيث سيدخل الأنسجة.
  7. تنظيم الانتاج من مصدر الضوء مع وحدة تحكم قادرة على توصيل TTL (الترانزستور الترانزستور المنطق) قطار نبض العرض المحدد وduratioN- على سبيل المثال، وهو اردوينو (الشكل 3)، بطاقة الكمبيوتر I / O (كما هو موضح)، أو مولد النبض متاحة تجاريا.
    1. مراقبة إشارة على كل الذبذبات.
  8. قياس إجمالي الطاقة ضوء (ميغاواط) في غيض من الألياف الضوئية باستخدام السلطة متر. استخدام هذه القيمة لحساب الإشعاع (ميغاواط / مم 2) بقسمة من مساحة المقطع العرضي للألياف الأساسية. تبدأ قيمة كثافة في حدود 15 - 10 ميغاواط / مم 2 وضبط الأسفل إذا لزم الأمر، حتى يتم التخلص من القطع الأثرية.
  9. تحقق من التحف الخفيفة مع القطب في الاغاروز، استعدادا لدخول الأنسجة. بدء تشغيل قطار نبض البحث (على سبيل المثال، 30 ميللي ثانية البقول ضوء، 500 مللي ثانية فاصل interstimulus (ISI)).
    1. القضاء التحف ضوء عابرة (الشكل 4) من خلال اعادة تموضع الألياف البصرية قريب إلى القطب لتغيير زاوية ضوء الحادث. إذا استمرت الأعمال الفنية، في محاولة خفض قوة الضوء. في اله حالة نادرة أن القطع الأثرية لا يمكن القضاء تماما (الحد الأدنى فقط)، وتمديد مدة نبض البحث. هذا يمكن أن تساعد في تحديد طفرات العصبية الحقيقية.

3. مستقيم PINP في '

  1. تقدم القطب ببطء من خلال الدماغ بمعدل حوالي 1 ميكرون / ثانية. استخدام الذبذبات واحد لمراقبة نشاط مستمر. من جهة أخرى، يؤدي قبالة نبضات الليزر.
  2. الاستماع ل 'التجزئة' باهتة من المسامير أثار ضوئية على شاشة الصوت، مما يدل على أن القطب يقترب خلية ChR2 + وكثيرا ما يمكن أن ينظر جيدا قبل إشارة كهربائية هو ظاهر على الذبذبات. إبطاء معدل مسبقا.
    ملاحظة: إذا كانت الخلية تقع مباشرة في طريق القطب، فإن النشاط أثار خفيفة تنمو أكبر (وبصوت أعلى). مع اقتراب القطب عصبون واحد، فإن التجزئة في حل المسامير صغيرة ولكن محددة جيدا من حجم الزي والشكل.
  3. حالما لىأثار المسامير-GHT هي كبيرة بما يكفي لتحريك قبالة بشكل فردي على الذبذبات، والبدء في القيام بذلك. ضبط القياس على المحور الأفقي لمراقبة الشكل الموجي الدقيق للارتفاع.
  4. توقف وانتظر الأنسجة ليستقر. مقاومة إغراء للتحرك القطب أقرب إلى الخلية. هذه الخطوة الحاسمة لتسجيل مستقرة. إذا بعد عدة دقائق لم تحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء - وهذا هو، استقر الأنسجة، لكنها لم ترفع أي خلية أقرب إلى غيض من القطب - 5 ميكرون مزيد من التقدم والانتظار مرة أخرى.
    1. كرر هذه العملية حتى إما الذروة أو القاع من إمكانات العمل يمكن التقاط موثوق مع عتبة الجهد وضع جيد فوق أرضية الضوضاء (على سبيل المثال، +/- 300 μV أو أكبر).
      ملاحظة: هناك خطر ضئيل من ايجابيات كاذبة أو غموض عند PINPing interneurons المثبطة. يمكن أن معظم الخلايا بسهولة تتبع القطار من البقول مع مدة 30 ميللي ثانية، وبين بولفترة ذاتها 500 ميللي ثانية أو أسرع، مع موثوقة الأول الكمون ارتفاع من 2-5 مللي ثانية (الشكل 5). غالبية الخلايا الكهروضوئية +، على وجه الخصوص، يمكن أن تحافظ على اطلاق كامل 1 ثانية (الشكل 6). لأن هذه الخلايا العصبية المثبطة، ثنائي التشابك تفعيل (غير المباشرة) ليست مصدر قلق كبير.
  5. أثناء التسجيل، ومراقبة نشاط مستمر على الذبذبات الأولى. تراقب عن كثب على حجم وشكل التموج باستخدام الذبذبات الثانية. ملاحظة نوعية الصوت على السماعة.
    1. الإنصات للتغييرات المفاجئة، والتي تشير إلى أن الخلية إما رسم قريبة جدا من القطب (حيث تواجه خطر مخوزق أو تالف)، أو ينجرف بعيدا. إذا المسامير تصبح كبيرة ومشوهة، التراجع. إذا كانت تنمو أصغر، تقدم القطب. تحرك ببطء في 2 ميكرومتر الخطوات.
    2. تأكيد جودة التسجيل بعد خاصة من قبل بتركيب جميع الطول الموجي السنبلة، الانحياز إلى الذروة أو القاع. تختلف thres الجهدعقد. عبر مجموعة واسعة من القيم الحدية، ينبغي ألا يكون هناك أي وقت مضى واحد شكل ارتفاع ثابت من الارتفاع موحد (الشكل 5A).
  6. إذا في أي نقطة إشارة تصبح ملوثة مع المسامير من الخلايا العصبية المجاورة، على هذه الخطوة. تقدم ببطء، وعلى خارج فرصة أن القطب سيمر من مجموعة من الخلايا المجاورة، ولكن تبقى في نطاق من الخلايا العصبية المستهدفة. (هذا هو عادة غير ناجحة.)
  7. نقل الكهربائي من خلال عمق كامل من القشرة (900+ ميكرون) في كل اختراق. إذا واجهت أي الخلايا العصبية تستجيب للضوء بعد العديد من الاختراقات أو، على العكس، هي ملوثة التسجيلات بشكل روتيني مع المسامير من خلايا ChR2- المجاورة، حاول القطب الجديد.
    ملاحظة: حتى في دفعة واحدة، ومقاومة وغيض هندسة كهربائية الفردية يمكن أن تختلف إلى حد كبير. وتسهم كل من العوامل في فعالية "الاستماع دائرة نصف قطرها" من القطب، التي يجب أن تكون كبيرة بما يكفي للكشف عن طفرات أثار ضوئية WHالبحث إيل، بعد تقييد بما يكفي لتمكين تسجيل عصبون واحد في العزلة.
  8. اختبار مقاومة من الأقطاب الكهربائية على النحو المرغوب فيه. لتجنب إتلاف الأنسجة، والقيام بذلك مع غيض من قطب كهربائي في الجزء العلوي من طبقة الاغاروز، وأيضا خارج الدماغ. ضمن مجموعة من 7-14 MΩ، ومقاومة بالضبط ليست مؤشرا على يقين من الأداء، أو العائد، لهذا التطبيق. أن قال، انها وكيل معقول للاستماع دائرة نصف قطرها: أقطاب-مقاومة أقل التقاط المزيد من الوحدات. -مقاومة أعلى، أقل.
  9. في نهاية التجربة، الموت ببطء الحيوان عن طريق افق مؤسسيا، مثل جرعة زائدة من التخدير، أو خلع عنق الرحم تحت التخدير العميق الطائرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن هنا نشارك إستراتيجيتنا للحصول على تسجيلات وحدة واحدة من interneurons المثبطة وراثيا المبوبة في القشرة الماوس تخدير، وذلك باستخدام طريقة optogenetic التي وضعتها ليما وآخرون 1. الجدول 1 تفاصيل كوكتيل مخدر المقترحة، الكيتامين-Medetomidine-آسيبرومازين (" KMA "). الشكل 1 يصور مسرى مكروي التنغستن، أعدت للتسجيل. الشكل 2 يحتوي على مخطط الرسم البياني للحصول على وحدة تحكم بسيطة LED الشكل 3 يحتوي على التكوين ورمز للالنابضة ناتج الضوء مع متحكم اردوينو. ويبين الشكل 4 مثالا لل التحف الكهربائية التي يسببها ضوء مناقشتها في البروتوكول. واجهت التحف أحيانا (اللوحة اليسرى)، ولكن تصحيح بسهولة (اللوحة اليمنى) ويبين الشكل 5 مثالا التسجيلات من ثلاثة أنواع من interneurons تحديدها بصريا (PV +، + CR، وSOM +). غادر السلطة الفلسطينيةنيل يظهر آثار الجهد الخام والطول الموجي الانحياز، ممثل نوع من إشارة إلى نسبة الضوضاء يمكن لأحد أن يتوقع الحصول مع هذه الاستراتيجية. يتم التقاط المسامير موثوق مع عتبة الجهد ثابتة من عدة مئات من microvolts. مؤامرة النقطية (اللوحة اليمنى) معارض الكمون قصيرة وموثوقية أثار ردود ضوئية، والتي تسمح للتعريف لا لبس فيه interneurons ChR2 إيجابية الشكل 6 يبين الجهد من آثار ثلاثة PV + interneurons، ردا على ضوء النبض 1 ثانية. غالبية PV + الخلايا يمكن الحفاظ ارتفاع وتيرة اطلاق النار على مئات من ميلي ثانية، مما يجعلها سهلة خاصة لتحديد.

الشكل 1
الشكل 1. إعداد إلكترود.   (A) رسم تخطيطي لقطب استعداد. القطب هو افىxed إلى أنبوب زجاجي الشعرية باستخدام اثنين من قطرات صغيرة من الغراء سوبر، والحد الأدنى من معجل (مثل زاب-IT). يضاف الانكماش الحراري أنابيب للقبضة، وذلك باستخدام حرارة منخفضة للغاية. السفينة عادة الأقطاب مع موصل دبوس ما قبل المرفقة. (ب) صورة من مسرى مكروي التنغستن استعداد شنت في حامل قطب كهربائي.

الرقم 2
الرقم 2. مخطط الرسم البياني لوحدة تحكم LED. دارة بسيطة وغير مكلفة للتسليم خفيفة. ومرفق LED فائقة مشرق (475 نانومتر) إلى بالوعة الحرارة ويقترن إلى الطرف الآخر من كابل الألياف الضوئية (800 ميكرون القطر). وبوابات إخراج الصمام مع نبض TTL. وتضم وحدة التحكم في الجهد وضع إمدادات الطاقة لشدة الضوء قابل للتعديل. 2K POT: الجهد للسيطرة على شدة الضوء. P / S: DC الملحق السلطة لاي (على سبيل المثال، شاحن الكمبيوتر المحمول). TIP 122: دارلينجتون الترانزستور. 4N35: المعزل البصري. الأجزاء المذكورة هنا تكلف <10 دولارا.

الرقم 3
الرقم 3. يمكن توليد كود اردوينو والتكوين. قطار النبض TTL لالنابضة ناتج الضوء باستخدام متحكم اردوينو. ويحدد البرنامج مدة النبض وISI للقطار النبض حلقات. تعليمات لتحميل البرنامج على لوحة يمكن العثور على الصفحة اردوينو في "الشروع" ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

igure 4 "FO: محتوى العرض =" 6in "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "العرض =" 600 "/>
. الرقم 4. قطعة أثرية ضوء أقطاب المعادن عرضة للالتحف الخفيفة، الحاضرة في بداية والإزاحة من البقول (اللوحة اليسرى، إشارة تصفيتها، 300 - 5000 هرتز). انهم عادة ما يمكن القضاء عليها كليا (اللوحة اليمنى) من خلال اعادة تموضع الألياف البصرية قريب إلى القطب لتغيير زاوية ضوء الحادث، و / أو خفض قوة الضوء.

الرقم 5
الشكل 5. الخلايا مثال. (A) تسجيلات مثال نموذجي من interneurons التعرف بصريا، PV + (الأرجواني)، CR + (الأخضر)، SOM + (الحمراء). خلايا تستجيب إلى القطار البحث النبض (النبض مدة 30 مللي، 500 مللي ISI) مع انفجار موثوق من المسامير. لوحة على اليمين يظهر 100 المسامير الانحياز الحوض و. الموجي متوسط ​​محرف (10X oversampled من معدل أخذ العينات من 10 كيلوهرتز) (B) المؤامرات النقطية لنفس الملفات تظهر الكمون قصيرة (~، 2 - 5 ميللي ثانية). وتوقيت ثابت من المسامير أثار ضوئية (C) يعني و الانحراف المعياري للارتفاع الإختفاء الأول (من 5 - 10 نبضات) لعينة من 44 PV + interneurons (المتوسط ​​الحسابي والانحراف المعياري: 3.4 +/- 2.6 ميللي ثانية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الشكل 6. أمثلة من ردود متواصلة يمكن للمرء أن يكون واثقا خصوصا في تحديد PV + interneurons حيث الغالبية منهم يمكن الحفاظ ارتفاع وتيرة اطلاق مئات ميلي ثانية - تذكر ردودهم على التيارالحقن في المختبر 14. ثلاث خلايا ChR2 / PV الاستجابة لنبضات الضوء 1 ثانية: أن اثنين من النار بانتظام طوال كامل مدة النبض، ومثال واحد غير عادي للخلية التي لا (<10٪ من خلايا اجه).

الجدول 1. الكيتامين-Medetomidine-آسيبرومازين ("KMA"). تدق إلى أسفل وجرعة الصيانة للماوس الكبار، مخففة للحفاظ على الماء. كوكتيل يتم إعادة تدار كل 40-90 دقيقة، حسب الضرورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من PINP واضح ومباشر من الناحية النظرية، يمكن أن يكون صعبا من الناحية العملية. والمحدد الرئيسي للنجاح هو اختيار القطب. في دائرة نصف قطرها الاستماع الكهربائي المعلمة حرجة. يجب أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية للكشف عن أثار المسامير الضوئية عند الطرف لا يزال على مسافة بعيدة من خلية ChR2 +، بحيث يمكن للمرء أن ضبط معدل مسبقا وفقا لذلك. في الوقت نفسه، يجب أن يقتصر بما فيه الكفاية لتمكين حسن حدة واحدة عزلة. وهذا يعني، ويجب ألا القطب ايضا التقاط المسامير من الوحدات المجاورة ChR2-. وتحقيق التوازن الصحيح من حيث الاستماع دائرة نصف قطرها يكون تحديا لأي نوع من الخلايا المستهدفة، ولكنه ينطبق بشكل خاص على interneurons المثبطة، والتي هي متناثرة، صغيرة، وغالبا ما توجد على مقربة من هرم الخلايا، والتي لديها خارج الخلية كبيرة نسبيا المسامير. حتى باستخدام الاستراتيجيات المقترحة هنا، فإن العائد المتوقع ليست عالية. كان لدينا العائد نموذجي 0-2 PV + الخلايا العصبية / الحيوانية، نظرا لدينا criterIA ممتازة من وحدة واحدة عزلة والتسجيلات دائم أكثر من نصف ساعة.

عندما PINPing الخلايا العصبية المثبطة، ثنائي التشابك تفعيل (غير المباشرة) ليست مصدر قلق كبير، لأن الخلايا العصبية المثبطة من غير المحتمل نسبيا لتنشيط خلايا بشكل غير مباشر بعد المشبكي. لPINPing الخلايا العصبية مثير، وتفعيل ثنائي التشابك هو شائع. العديد من الخلايا العصبية التي تطلق في استجابة للضوء لا تعبر عن ChR2، وإنما يحصل الإثارة متشابك قوية من تلك التي لا تفعل. وتناقش استراتيجيات لdirectly- التمييز من الخلايا العصبية تفعيلها بشكل غير مباشر في التفاصيل في ليما وآخرون 1.

اعتبارات القطب

بحثنا بشكل منهجي مجموعة متنوعة من الأقطاب الكهربائية وتقنيات التسجيل: الماصات الزجاج مع التصحيح نصائح من أحجام مختلفة، الميكروية التنغستن متفاوتة في مقاومة وهندسة طرف، ومتعددة القنوات صفائف (على سبيل المثال، tetrodes). الزاوي، وارتفاع المعاوقة-الميكروية التنغستن(كما هو مقترح هنا) أعطى، حتى الآن، أفضل عائد. يتبع مناقشة القضايا التي واجهتها مع كل من هذه التقنيات.

باستخدام منخفضة مقاومة صفائف صمام رباعي وتحقيقات متعددة القنوات، اكتشفنا بشكل روتيني أثار المسامير الخفيفة؛ ومع ذلك، وكانوا نادرا كبيرة بما يكفي لفرز موثوق. وبعبارة أخرى، كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) غير مرضية. أحيانا أننا لم تحصل على تسجيلات ممتازة مع tetrodes، ولكن العائد مقارب أعلى مع الميكروية التنغستن واحدة، وكانت نوعية التسجيلات أفضل بكثير. نصائح هي صمام رباعي حادة نسبيا أيضا، والتي تقتصر على عدد من الاختراقات المحتملة لكل حيوان. القضايا التي واجهناها مع تحقيقات متعددة القنوات ربما تفاقمت من خلال استخدام إضاءة سطح اسعة. عكس المستهدفة، وتحفيز الطاقة المنخفضة من الألياف المزروع، وإضاءة سطح تسبب إطلاق النار متزامن في ChR2 + الخلايا العصبية خارج الموقع وتسجيل، مما يؤدي إلى ارتفاع فرضه الطول الموجيالتي هي أكثر صعوبة لفرز.

أقطاب التصحيح الزجاج، مثل تلك المستخدمة في التسجيلات الخلية المرفقة فضفاض القياسية، تم أيضا غير ملائم لهذه المهمة، ولكن لأسباب مختلفة. مقاومة منخفضة (<5 MΩ) ومنحازة أقطاب التصحيح بقوة نحو الخلايا الهرمية، الأمر الذي يجعل من الصعب استهدافها interneurons المثبطة. في حين أن هذا يمكن تصحيحه إلى حد ما عن طريق استخدام مقاومة أعلى (رأس أصغر) الأقطاب الكهربائية، ومشكلة أكبر مع أقطاب التصحيح هو دائرة نصف قطرها الاستماع مقيدة للغاية بهم. على الرغم من أن التسجيلات التصحيح الخلية المرفقة توفر SNR عالية جدا، لا يمكن الكشف عن خلايا ضوئية استجابة خارج وضع الخلية المرفقة. الاستراتيجية مع أقطاب التصحيح هي، حتما، إلى عشوائيا وبالتتابع الحصول على التسجيلات الخلية المرفقة، وعدد قليل جدا منها، معربا عن ChR2 interneurons المثبطة.

مع مقاومة عالية الأقطاب الكهربائية التنغستن واحد يمكنكشف كل من المسامير، استحضر ضوء من بعيد، وتحقيق حسن حدة واحدة عزلة. هندسة طرف وربما كان العامل الأكثر أهمية. حاولنا التنغستن الأقطاب الكهربائية من مصنعين اثنين، مع ممانعات يتراوح 2-14 MΩ، وزوايا غيض 5-12 درجة. وجدنا أن 12 درجة زوايا طرف كانت متفوقة، إلا أن مقاومة دقيقة كانت أقل أهمية، ضمن مجموعة من 7 - 14 MΩ. وجدنا أن الأقطاب الكهربائية المغلفة الزجاج كانوا أكثر عرضة للالتحف الخفيفة بالمقارنة مع الأقطاب الكهربائية المغلفة الايبوكسي، ولذا فإننا نوصي الأخير. نحن لا محاولة لجعل منطقتنا الأقطاب الكهربائية التنغستن مخصصة. كما هو الحال مع أي نوع من القطب، وسائط مشتركة من الفشل إلى فقدان العزلة أو تصيب الخلايا العصبية. لا تظهر المعلمات طرف مختلفة لديهم تأثير كبير في هذا الشأن. بدلا من ذلك، في انتظار الأنسجة لتسوية هو العامل الأهم في الحفاظ على تسجيلات عالية الجودة.

ضوء تسليم

لأنه يتم استخدام الضوء فقطسا يعني تحديد خلايا ChR2 إيجابية - بدلا من تنظيم إنتاجها بطريقة معينة - مجموعة من شدة قابلة للاستخدام لهذه التجربة واسعة. يتم تعيين الحد الأدنى من خلال حقيقة أن كثافة يجب أن تكون كافية لتنشيط خلايا ChR2 إيجابية في أقصى عمق الخلايا الخاصة بك من الفائدة. وجدنا أن irradiances القمة> 5 ميغاواط / مم 2 (تقاس في 470 نانومتر) كانت كافية لتثير ردود قوية من PV + الخلايا في طبقة عميقة 6. كثافة تدفق الإشعاع على أعماق معينة داخل يمكن تقدير الدماغ باستخدام آلة حاسبة على أساس القياسات المباشرة في الثدييات أنسجة المخ (على سبيل المثال، http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php )، ولكن نحن نوصي بشدة تحديد الحد الأدنى للتجارب الخاصة بك تجريبيا، وذلك باستخدام مسرى مكروي مقاومة منخفضة (1 - 3 MΩ، عن النشاط المتعددة الوحدات). يتم تعيين الحد الأعلى من حقيقة أن inten عاليةيمكن أن يسبب sities التحف الخفيفة، والتي يمكن أن تعقد في الكشف عن أثار المسامير. في الحيوانات المعدلة وراثيا، ويمكن أيضا أن يسبب كثافات عالية التحف electromyographic من خلال تفعيل ChR2 في PV تتعرض + العضلات في الرقبة والرأس.

في بناء منطقتنا نظام توصيل الضوء، وجدنا أن اقتران هذا أدى إلى الألياف الضوئية في نهاية المطاف هو أكثر ملاءمة من وضع LED مباشرة على الدماغ. وهذا الأخير هو وسيلة فعالة جدا لإيصال الضوء، ولكن لديه بعض العيوب العملية. الحالية التي تتدفق من خلال الجهاز تنتج القطع الأثرية الكهربائية التي يجب أن تكون محمية، وLED يولد حرارة كبيرة التي يجب أن تبدد مع بالوعة الحرارة الكبيرة. وعلاوة على ذلك، والتحف الخفيفة (سواء الضوئية وelectromyographic) هي أكثر بكثير من الصعب السيطرة عليها مع نمط الإضاءة واسعة من المصابيح. الألياف اقتران يحل كل هذه القضايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

KMA (20.0 مل)
2 مل من 100 ملغ / مل الكيتامين (10 ملغ / مل، مرة واحدة مخففة)
0.4 مل من 1 ملغ / مل Dexdomitor (medetomidine، 0.02 ملغ / مل، مخففة مرة واحدة)
0.05 مل من 100 ملغ / مل آسيبرومازين (0.25 ملغ / مل، مخففة مرة واحدة)
17.55 مل من المياه المالحة 0.9٪
الجرعة، والكبار الماوس (15-40 غرام)
تدق إلى أسفل: 0.012 مل / ز * كتلة الجسم (الكيتامين = 120 ملغ / كغ)
الصيانة: 0.0025 مل / ز * كتلة الجسم (الكيتامين = 25 مغ / كغ)
Name Company Catalog Number Comments
ChR2-EYFP Line Jackson Colonies 12569
Pvalb-iCre (PV) Line Jackson Colonies 8069
Sst-iCre (SOM) Line Jackson Colonies 13044
Cr-iCre (CR) Line Jackson Colonies 10774
Agarose Sigma-Aldrich A9793 Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook) FST 10066-15
Surgical Scissors FST 14084-09
Scalpel FST 10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment Foster & Smith 9N-76855
Homeothermic Blanket Harvard Apparatus 507220F
Tungsten Microelectrodes A-M Systems 577200 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing Warner Instruments G150TF-3
Heat Shrink Tubing DigiKey A332B-4-ND
Zapit Accelerator DVA SKU ZA/ZAA Use with standard Super Glue. 
Microelectrode AC Amplifier 1800 AM Systems 700000
MP-285 Motorized Micromanipulator Sutter MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes Tektronix TDS2000C
Powered Speakers Harman Model JBL Duet
Manual Manipulator Scientifica LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable ThorLabs FC/PC BFL37-800
Power Meter ThorLabs PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E DigiKey XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO DigiKey 1050-1024-ND

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
  2. Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
  3. Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
  4. Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
  5. Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
  6. Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
  7. Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
  8. Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
  9. Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
  10. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  11. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
  12. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  13. Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
  14. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats