एक गाइड
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

Published 11/07/2014
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Neuroscience

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Summary

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Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons. J. Vis. Exp. (93), e51757, doi:10.3791/51757 (2014).

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Abstract

Neurophysiology में एक बड़ी चुनौती सेरेब्रल कॉर्टेक्स में कई निरोधात्मक प्रकार की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया गुण और समारोह चिह्नित करने के लिए किया गया है. हम यहाँ लीमा और 1 सहयोगियों द्वारा विकसित एक विधि का उपयोग anesthetized माउस कॉर्टेक्स में पहचान निरोधात्मक interneurons से स्थिर, अच्छी तरह से पृथक एकल इकाई रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारी रणनीति का हिस्सा है. रिकॉर्डिंग विशिष्ट neuronal उप-जनसंख्या में Channelrhodopsin-2 (ChR2) व्यक्त चूहों में प्रदर्शन कर रहे हैं. जनसंख्या के सदस्य नीले प्रकाश की एक संक्षिप्त फ्लैश करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया से पहचाने जाते हैं. "PINP" करार दिया, या neuronal आबादी के photostimulation की सहायता की पहचान - - इस तकनीक मानक कोशिकी रिकॉर्डिंग उपकरण के साथ लागू किया जा सकता है. यह आनुवंशिक रूप से पहचान की कोशिकाओं को कोशिकी रिकॉर्डिंग को निशाना बनाने का उद्देश्य के लिए, कैल्शियम इमेजिंग या नेत्रहीन निर्देशित पट्टी के लिए एक सस्ता और सुलभ विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं. एचअरे हम हर रोज अभ्यास में विधि के अनुकूलन के लिए दिशा निर्देशों का एक सेट प्रदान करते हैं. हम parvalbumin पॉजिटिव (पीवी +) कोशिकाओं को लक्षित के लिए विशेष रूप से हमारी रणनीति परिष्कृत, लेकिन यह इस तरह सोमेटोस्टैटिन व्यक्त (सोम +) और calretinin व्यक्त (सीआर +) interneurons के रूप में, साथ ही अन्य interneuron प्रकार के लिए काम करता है कि मिल गया है.

Protocol

नोट: ओरेगन पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित के रूप में निम्नलिखित प्रोटोकॉल स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार है.

1. तीव्र सर्जरी

  1. Intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) (1 टेबल) के माध्यम से, एक ketamine-medetomidine कॉकटेल के साथ पशु anesthetize.
    नोट: इन प्रयोगों में इस्तेमाल चूहों चालक लाइनों (; SST-iCre12, सोम +; सीआर-iCre12, सीआर + Pvalb-iCre11, पी.वी. +) interneuron करने के लिए एक रचनात्मक निर्भर ChR2-EYFP ट्रांसजेनिक line10 पार करने से उत्पन्न कर रहे हैं. ChR2 या संबंधित opsins के वायरल वितरण समान अभिव्यक्ति के स्तर प्राप्त कर रहे हैं, यह सोचते हैं उतना ही अच्छी तरह से काम करना चाहिए.
  2. सर्जरी शुरू करने से पहले, यह सुनिश्चित पशु दर्शाती एक कोमल पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए कोई जवाब नहीं है. संज्ञाहरण की इस गहराई को बनाए रखने के लिए आवश्यक के रूप में प्रयोग भर एनेस्थेटिक्स पुनः प्रशासन. इंजेक्शन anesthetics का उपयोग करते हैं, तो वैकल्पिक रूप से रखरखाव इंजेक्शन के लिए एक आईपी कैथेटर प्रत्यारोपण.
  3. खारा या रखरखाव इंजेक्शन (1 टेबल) के लिए एक उचित पतला संवेदनाहारी कॉकटेल का उपयोग करके उदाहरण के लिए प्रयोग भर Lactated घंटी समाधान (लगभग 3 मिलीग्राम / किग्रा / घंटा), के साथ हाइड्रेटेड पशु रखें.
  4. एक stereotaxic या अन्य सिर पकड़ तंत्र में पशु रखें. खोपड़ी अच्छी तरह से सुरक्षित है सुनिश्चित करें. यह स्थिर एकल कक्ष रिकॉर्डिंग को बनाए रखने के लिए आवश्यक है.
  5. सूखापन को रोकने के लिए आंखों को opthalamic मरहम लागू करें. 36.5-37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखें.
  6. अतिरिक्त रिकॉर्डिंग स्थिरता के लिए एक cisternal नाली प्रदर्शन करना. एक स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, महाकुण्ड बेनकाब करने के लिए खोपड़ी के पीछे चेहरे से ऊतक को हटा दें. मस्तिष्कमेरु द्रव नाली ड्यूरा में एक छोटा सा निक बनाओ. ब्लेड से ही बहुत टिप का उपयोग करें, और सेरिबैलम या ब्रेन स्टेम से संपर्क करने से बचें.
  7. स्केलपेल का उपयोग करना, श्रवण के लिए (ब्याज की cortical क्षेत्र के ऊपर एक छोटे craniotomy (~ 2 मिमी 2) प्रदर्शनकॉर्टेक्स, शीर्षस्थान के लगभग -2.3 मिमी पीछे, midline की 4.5 मिमी पार्श्व).
  8. ड्यूरा निकालें और गर्म 0.5 agarose की एक परत के साथ संपर्क में कॉर्टेक्स कवर - 1 मिमी मोटी (खारा में 1.5% agarose, 0.9% सोडियम क्लोराइड, पर लागू ~ 37 डिग्री सेल्सियस). समय-समय पर खारा की कई बूँदें लागू करने के द्वारा प्रयोग भर agarose नम रखें.

2. रिकॉर्डिंग सेट अप

  1. एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड तैयार (7-14 MΩ, 127 माइक्रोन व्यास, 12 डिग्री पतला टिप, epoxy लेपित). एक गिलास केशिका ट्यूब इलेक्ट्रोड superglue और पकड़ (चित्रा 1) के लिए गर्मी टयूबिंग हटना जोड़ें.
  2. Cortical सतह के orthogonal यात्रा करने के लिए सेट एक मोटर चालित (या हाइड्रोलिक) micromanipulator पर इलेक्ट्रोड, माउंट. खोपड़ी के खिलाफ, त्वचा के नीचे एक तार जमीन स्लाइड. वे electromyographic कलाकृतियों उत्पन्न कर सकते हैं के रूप में सिर के पक्ष और गर्दन के पीछे की मांसपेशियों के साथ संपर्क से बचें.
  3. एक बाह्य amp का उपयोग बिजली के संकेत बढ़ानाएकल इकाई रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त ली फाई एर, अधिमानतः एक प्रतिबाधा चेक मोड से लैस. दो oscilloscopes के साथ और शक्ति वक्ताओं का एक सेट - चल रहे spiking गतिविधि (5000 हर्ट्ज बैंड पास 300) की निगरानी. इधर, दर्ज आंकड़ों 10 kHz के एक नमूना दर में लगातार डिजीटल है; spikes के ऑफ़लाइन निकाले जाते हैं.
  4. टिप कॉर्टेक्स की सतह तक पहुँच जाता है जब तक agarose के माध्यम से इलेक्ट्रोड अग्रिम. एक माइक्रोस्कोप के माध्यम से इस कदम का पालन. "शून्य" micromanipulator पर इस स्थिति.
  5. सबसे अच्छा रिकॉर्डिंग की गहराई लगभग नेत्रहीन एक प्रवेश के अंत में इलेक्ट्रोड वापस लेने जब इलेक्ट्रोड टिप शून्य की गहराई पर cortical सतह से बाहर निकालता है कि पुष्टि.
    नोट: जोड़तोड़ पढ़ने और मनाया इलेक्ट्रोड स्थिति के बीच एक विसंगति यह ऊतक के सापेक्ष हो गए कि इंगित करता है. यह मस्तिष्क या पशु, या जोड़तोड़ बहाव की अस्थिरता की वजह से हो सकता है.
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त चेक के रूप मेंऊतक के पहले कई सौ माइक्रोमीटर के माध्यम से आगे बढ़ रहा है, जबकि यह शून्य सेट सूत्री कॉर्टेक्स की सतह से मेल खाती है, उत्तेजना पैदा क्षेत्र क्षमता की निगरानी. क्षेत्र क्षमता की निगरानी करते हैं, तो 10 हर्ट्ज के लिए बाह्य एम्पलीफायर के निचले बैंड पास फिल्टर कटऑफ कम है. स्थानीय क्षेत्र क्षमता के polarity परत मैं / द्वितीय सीमा 13 पास, ~ 100 माइक्रोन की गहराई आसपास पराजयों कि पुष्टि करें. यह श्रवण प्रांतस्था के लिए एक विश्वसनीय संदर्भ बिंदु है, लेकिन यह अन्य cortical क्षेत्रों के लिए अलग हो सकता है.
  6. एक पुस्तिका micromanipulator पर एक नीले प्रकाश स्रोत (चित्रा 2) के लिए मिलकर एक ऑप्टिकल फाइबर माउंट. माइक्रोस्कोप का उपयोग करना संभव के रूप में agarose की सतह के करीब फाइबर की नोक स्थिति. इलेक्ट्रोड ऊतक में प्रवेश करेंगे जहां बीम केंद्र.
  7. निर्दिष्ट चौड़ाई और duratio की एक टीटीएल (ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर लॉजिक) पल्स ट्रेन देने में सक्षम एक नियंत्रण इकाई के साथ प्रकाश स्रोत के उत्पादन को विनियमितएन जैसे, एक Arduino (चित्रा 3), (दिखाया गया है) एक कंप्यूटर मैं / हे कार्ड, या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पल्स जनरेटर.
    1. दोनों oscilloscopes पर संकेत मॉनिटर.
  8. एक बिजली मीटर का उपयोग ऑप्टिकल फाइबर की नोक पर कुल प्रकाश शक्ति (मेगावाट) को मापने. फाइबर कोर के पार के अनुभागीय क्षेत्र से विभाजित करके विकिरण (मेगावाट / 2 मिमी) की गणना करने के लिए इस मान का उपयोग करें. 10 की रेंज में एक तीव्रता मूल्य के साथ शुरू - 15 मेगावाट / 2 मिमी और यदि आवश्यक हो तो कलाकृतियों समाप्त हो जाते हैं, जब तक नीचे समायोजित.
  9. ऊतक में प्रवेश करने की ओर अग्रसर agarose में इलेक्ट्रोड, साथ प्रकाश कलाकृतियों के लिए जाँच करें. खोज पल्स ट्रेन प्रारंभ (जैसे, 30 मिसे प्रकाश दालों, 500 मिसे interstimulus अंतराल (आईएसआई)).
    1. घटना के प्रकाश के कोण बदलने के लिए इलेक्ट्रोड के लिए ऑप्टिकल फाइबर रिश्तेदार repositioning से क्षणिक प्रकाश कलाकृतियों (चित्रा 4) को हटा दें. कलाकृतियों जारी रहती है, तो प्रकाश की शक्ति कम प्रयास करें. वें मेंई कलाकृतियों पूरी तरह से (केवल कम से कम) समाप्त नहीं किया जा सकता है कि दुर्लभ मामला है, खोज नाड़ी की अवधि का विस्तार. यह सच न्यूरोनल spikes के पहचान करने में सहायता कर सकते हैं.

3. सीधे PINP में '

  1. लगभग 1 माइक्रोन / सेकंड की दर से मस्तिष्क के माध्यम से धीरे धीरे इलेक्ट्रोड अग्रिम. चल रही गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक आस्टसीलस्कप का उपयोग करें. दूसरी ओर, लेजर दालों बंद ट्रिगर.
  2. इलेक्ट्रोड एक ChR2 + सेल से आ रहा है और अक्सर बिजली के संकेत आस्टसीलस्कप पर स्पष्ट है अच्छी तरह से पहले माना जा सकता है कि इंगित करता है जो ऑडियो मॉनिटर पर प्रकाश पैदा spikes के बेहोश 'हैश', के लिए सुनो. अग्रिम की दर धीमी.
    नोट: सेल इलेक्ट्रोड के रास्ते में सीधे निहित है, तो प्रकाश पैदा गतिविधि बड़ा (और ज़ोर से) विकसित होगा. इलेक्ट्रोड एक एकल interneuron दृष्टिकोण, हैश समान आकार और आकार की छोटी लेकिन अच्छी तरह से परिभाषित spikes के में हल करेंगे.
  3. जैसे ही ली के रूप मेंght पैदा spikes के अलग-अलग आस्टसीलस्कप पर के बंद को गति प्रदान करने के लिए काफी बड़े हैं, ऐसा करने से शुरू करते हैं. स्पाइक तरंग की सटीक आकार निरीक्षण करने के लिए क्षैतिज अक्ष पर स्केलिंग को समायोजित करें.
  4. बंद करो और ऊतक व्यवस्थित करने के लिए प्रतीक्षा करें. करीब सेल करने के लिए इलेक्ट्रोड स्थानांतरित करने के लिए प्रलोभन का विरोध. यह कदम एक स्थिर रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण है. कई मिनट के बाद संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार नहीं किया गया है - कि, ऊतक बस गई है, लेकिन यह किसी भी करीब इलेक्ट्रोड की टिप करने के लिए सेल नहीं लाया गया है - अग्रिम 5 आगे माइक्रोन और फिर इंतजार.
    1. शिखर या संभावित कार्रवाई के गर्त या तो मज़बूती से शोर मंजिल (जैसे, +/- 300 μV या अधिक) से ऊपर अच्छी तरह से सेट एक वोल्टेज सीमा के साथ कब्जा कर लिया जा सकता है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएं.
      नोट: निरोधात्मक interneurons PINPing जब झूठी सकारात्मक या अस्पष्टता का थोड़ा जोखिम है. अधिकांश कोशिकाओं को आसानी से 30 मिसे की अवधि और अंतर पुल के साथ दालों की एक ट्रेन का पालन कर सकते हैंएसई अंतराल 2-5 मिसे (चित्रा 5) की एक विश्वसनीय पहली कील विलंबता के साथ 500 मिसे, या तेज,. पीवी + कोशिकाओं का बहुमत है, विशेष रूप से, एक पूर्ण 1 सेकंड (चित्रा 6) के लिए फायरिंग बनाए रख सकते हैं. इन निरोधात्मक न्यूरॉन्स होते हैं, क्योंकि disynaptic (अप्रत्यक्ष) सक्रियण एक प्रमुख चिंता का विषय नहीं है.
  5. जबकि रिकॉर्डिंग, पहले आस्टसीलस्कप पर चल रही गतिविधियों पर नज़र रखते. आकार और दूसरा आस्टसीलस्कप का उपयोग spikes के आकार पर कड़ी नजर रखें. स्पीकर पर उनकी आवाज की गुणवत्ता पर ध्यान दें.
    1. सेल या तो (यह impaled या क्षतिग्रस्त किया जा रहा जोखिम जहां) इलेक्ट्रोड को भी बंद आ रहा है कि संकेत मिलता है जो आकस्मिक परिवर्तन, के लिए ध्यान से सुनो, या दूर बहती है. Spikes के बड़े और विकृत हो जाते हैं, तो वापस बाहर; वे छोटे हो जाना है, तो इलेक्ट्रोड अग्रिम. 2 माइक्रोन चरणों में धीरे-धीरे ले जाएँ.
    2. चोटी या गर्त के लिए गठबंधन सभी कील waveforms, superimposing द्वारा रिकॉर्डिंग के बाद हॉक की गुणवत्ता की पुष्टि करें. वोल्टेज thres वैरीपकड़ो. सीमा मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में, केवल कभी वर्दी ऊंचाई (चित्रा 5A) के एक सुसंगत कील आकार होना चाहिए.
  6. किसी भी बिंदु पर संकेत एक पड़ोसी न्यूरॉन से spikes के साथ दूषित हो जाता है, पर चलते हैं. इलेक्ट्रोड पड़ोसी सेल की सीमा के बाहर जाते हैं, लेकिन लक्ष्य न्यूरॉन की रेंज में रहेगा कि बंद मौका पर, धीरे से अग्रिम. (यह आमतौर पर असफल है.)
  7. प्रत्येक पैठ में कोर्टेक्स (900 + माइक्रोन) की पूरी गहराई के माध्यम से इलेक्ट्रोड ले जाएँ. कोई प्रकाश-उत्तरदायी न्यूरॉन्स विपरीत, रिकॉर्डिंग नियमित पड़ोसी ChR2- कोशिकाओं से spikes के साथ दूषित कर रहे हैं कई पेनेट्रेशन या, बाद सामना कर रहे हैं, एक नए इलेक्ट्रोड का प्रयास करें.
    नोट: यहां तक ​​कि एक ही बैच के भीतर, व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा और टिप ज्यामिति काफी भिन्न हो सकते हैं. दोनों कारकों क प्रकाश पैदा spikes के पता लगाने के लिए काफी बड़े होने चाहिए जो इलेक्ट्रोड के प्रभावी "सुन त्रिज्या", में योगदानइले खोज, अभी तक अलगाव में एक भी interneuron रिकॉर्डिंग सक्षम करने के लिए पर्याप्त प्रतिबंधित.
  8. वांछित के रूप में इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा का परीक्षण करें. ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए, अच्छी तरह से मस्तिष्क के बाहर, agarose परत के ऊपरी भाग में इलेक्ट्रोड की नोक के साथ ऐसा. 7-14 MΩ की सीमा के भीतर, सटीक प्रतिबाधा इस आवेदन के लिए प्रदर्शन, या उपज का एक निश्चित कारक नहीं है. यह बात सुन त्रिज्या के लिए एक उचित प्रॉक्सी है, ने कहा: कम प्रतिबाधा इलेक्ट्रोड अधिक इकाइयों लेने; उच्च प्रतिबाधा, कम.
  9. प्रयोग के अंत में, इस तरह के संज्ञाहरण की गहरी विमान के तहत संवेदनाहारी अधिक मात्रा, या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के रूप में संस्थागत मंजूरी दे दी साधन, द्वारा पशु euthanize.

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Representative Results

हम यहाँ "लीमा एट अल. 1. 1 टेबल विवरण सुझाव दिया संवेदनाहारी कॉकटेल, Ketamine-Medetomidine-Acepromazine (द्वारा विकसित एक optogenetic विधि का उपयोग, anesthetized माउस कॉर्टेक्स में आनुवंशिक रूप से वर्गीकृत निरोधात्मक interneurons से एकल इकाई रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारी रणनीति का हिस्सा KMA "). चित्रा 1 4 चित्रा. 3 एक Arduino microcontroller के साथ प्रकाश उत्पादन gating के लिए विन्यास और कोड शामिल हैं चित्रा. 2 एक साधारण एलईडी नियंत्रण इकाई के लिए एक सर्किट चित्र शामिल हैं चित्रा. रिकॉर्डिंग के लिए तैयार एक टंगस्टन microelectrode, को दर्शाया गया है की एक उदाहरण से पता चलता है प्रकाश प्रेरित बिजली कलाकृतियों प्रोटोकॉल में चर्चा की. कलाकृतियों कभी कभी (बाएं पैनल) का सामना करना पड़ा, लेकिन आसानी से (सही पैनल) सही कर रहे हैं. 5 ऑप्टिकली-पहचान interneurons के तीन प्रकार (पीवी + सीआर + और ​​सोम +) से उदाहरण रिकॉर्डिंग से पता चलता है. बाएं देहातनेल इस रणनीति के साथ प्राप्त करने के लिए उम्मीद कर सकते हैं कच्चे वोल्टेज निशान और गठबंधन waveforms, संकेत करने वाली शोर अनुपात एक की तरह का प्रतिनिधि से पता चलता है. Spikes मज़बूती से कई सौ microvolts की एक निश्चित वोल्टेज सीमा के साथ कब्जा कर रहे हैं. एक रेखापुंज साजिश (सही पैनल) ChR2 पॉजिटिव interneurons की स्पष्ट पहचान के लिए अनुमति देते हैं जो प्रकाश पैदा प्रतिक्रियाओं का कम विलंबता और विश्वसनीयता से पता चलता है. 6 से पता चलता है एक 1 सेकंड प्रकाश नाड़ी का जवाब देने, तीन पी.वी. + interneurons से निशान वोल्टेज चित्रा. पीवी + कोशिकाओं के बहुमत, मिसे के सैकड़ों के लिए फायरिंग उन्हें विशेष रूप से आसान पहचान के लिए बना उच्च आवृत्ति बनाए रख सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक इलेक्ट्रोड की तैयारी.   एक तैयार इलेक्ट्रोड की (ए) आरेख. इलेक्ट्रोड Affi हैदो सुपर गोंद की छोटी बूंदों और (जैसे जैप-यह रूप में) त्वरक की एक न्यूनतम राशि का उपयोग कर एक गिलास केशिका ट्यूब xed. गर्मी टयूबिंग हटना बहुत कम गर्मी का उपयोग कर, पकड़ के लिए जोड़ा गया है. इलेक्ट्रोड आम तौर पर एक इलेक्ट्रोड धारक में रखा एक तैयार टंगस्टन microelectrode की एक कनेक्टर पिन पूर्व संलग्न. (बी) के तस्वीर के साथ जहाज.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक एलईडी नियंत्रण इकाई के लिए सर्किट चित्र. प्रकाश डिलीवरी के लिए एक सरल और सस्ती सर्किट. एक सुपर उज्ज्वल एलईडी (475 एनएम) एक गर्मी सिंक से जुड़ी है और एक फाइबर ऑप्टिक केबल (800 माइक्रोन व्यास) के दूसरे छोर से युग्मित है. एलईडी का उत्पादन एक टीटीएल नाड़ी के साथ gated है. नियंत्रण इकाई समायोज्य प्रकाश तीव्रता के लिए एक वोल्टेज मोड बिजली की आपूर्ति शामिल है. 2K पॉट: प्रकाश की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए तनाव नापने का यंत्र. पी / एस: डीसी बिजली supp ly (जैसे, लैपटॉप चार्जर). टिप 122: Darlington ट्रांजिस्टर. 4N35: ऑप्टिकल अलगाने. यहां सूचीबद्ध भागों <10 डॉलर की लागत.

चित्रा 3
चित्रा 3. Arduino कोड और विन्यास. प्रकाश उत्पादन gating के लिए एक टीटीएल पल्स ट्रेन एक Arduino microcontroller का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता. कार्यक्रम एक पाशन पल्स ट्रेन के लिए एक नाड़ी की अवधि और आईएसआई निर्दिष्ट करता है. बोर्ड पर प्रोग्राम लोड करने के लिए निर्देश Arduino के "प्रारंभ करना" पृष्ठ पर पाया जा सकता है ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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. (; - 5000 हर्ट्ज फ़िल्टर्ड संकेत, 300 बाएं पैनल) चित्रा 4. प्रकाश विरूपण साक्ष्य धातु इलेक्ट्रोड शुरुआत में वर्तमान और दालों की भरपाई प्रकाश कलाकृतियों, जल्दी हो जाता है. वे आम तौर पर घटना प्रकाश के कोण बदलने के लिए इलेक्ट्रोड के लिए ऑप्टिकल फाइबर रिश्तेदार repositioning, और / या प्रकाश की शक्ति कम से पूरी तरह से (सही पैनल) का सफाया किया जा सकता है.

चित्रा 5
5. उदाहरण कोशिकाओं चित्रा. (ए) ऑप्टिकली-पहचान interneurons, पी.वी. + (बैंगनी), सीआर + (हरा), सोम + (लाल) से विशिष्ट उदाहरण रिकॉर्डिंग. प्रकोष्ठों खोज पल्स ट्रेन को spikes के एक विश्वसनीय फट साथ (स्पंद अवधि 30 एमएस, आईएसआई 500 एमएस) जवाब. सही करने के लिए पैनल 100 गर्त गठबंधन के spikes से पता चलता है और. औसत interpolated तरंग (10 kHz के एक नमूना दर से oversampled 10x) एक ही फाइल के लिए (बी) रेखापुंज भूखंडों कम विलंबता (~ 2-5 मिसे) दिखा. प्रकाश पैदा spikes के और लगातार समय (सी) मतलब और पहली कील सुप्तावस्था का मानक विचलन - 44 पीवी + interneurons (औसत माध्य और मानक विचलन: 3.4 +/- 2.6 मिसे) का एक नमूना के लिए (5 से 10 दालों). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा निरंतर प्रतिक्रियाओं के 6. उदाहरण उनमें से अधिकांश मिसे के सैकड़ों के लिए फायरिंग उच्च आवृत्ति बनाए रख सकते हैं के रूप में एक पीवी + interneurons की पहचान करने में विशेष रूप से विश्वास किया जा सकता है -. वर्तमान को अपनी प्रतिक्रिया की याद ताजाइन विट्रो 14 में इंजेक्शन. 1 सेकंड प्रकाश दालों का जवाब देने के तीन ChR2 / PV कोशिकाओं: नाड़ी की पूरी अवधि के दौरान नियमित रूप से आग कि दो, और नहीं करता है कि एक सेल का एक असामान्य उदाहरण (<सामना करना पड़ा कोशिकाओं का 10%).

तालिका 1. Ketamine-Medetomidine-Acepromazine ("KMA"). तोड़े नीचे जलयोजन बनाए रखने के लिए पतला एक वयस्क माउस, के लिए और रखरखाव खुराक. आवश्यक के रूप में, 90 मिनट - कॉकटेल हर 40-प्रशासित रहे है.

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Discussion

PINP धारणा स्पष्ट है, यह अभ्यास में चुनौतीपूर्ण हो सकता है. सफलता का एक प्रमुख निर्धारक इलेक्ट्रोड का विकल्प है. बिजली सुन त्रिज्या महत्वपूर्ण पैरामीटर है. यह टिप कुछ दूरी पर एक ChR2 + सेल से अब भी है जब एक तदनुसार अग्रिम की दर को समायोजित कर सकते हैं, ताकि प्रकाश पैदा spikes के पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से बड़े होना चाहिए. एक ही समय में, यह अच्छा एकल इकाई अलगाव को सक्षम करने के लिए पर्याप्त प्रतिबंधित किया जाना चाहिए. यही इलेक्ट्रोड भी पड़ोसी ChR2- इकाइयों से spikes लेने नहीं चाहिए, है. सुनने त्रिज्या के संदर्भ में सही संतुलन कायम करने के लिए किसी भी लक्षित सेल प्रकार के लिए एक चुनौती हो, लेकिन यह अपेक्षाकृत बड़े कोशिकी है कि जो, विरल छोटे, और अक्सर कोशिकाओं पिरामिड के पास पाए जाते हैं निरोधात्मक interneurons, के लिए विशेष रूप से सच है करेगा spikes के. यहां भी सुझाव दिया रणनीतियों का उपयोग, उम्मीद की उपज अधिक नहीं है. हमारे ठेठ उपज हमारे criter दिया, 0-2 पीवी + न्यूरॉन्स / पशु थाउत्कृष्ट एकल इकाई अलगाव की आइए और रिकॉर्डिंग आधे घंटे से अधिक समय तक चलने वाले.

निरोधात्मक न्यूरॉन्स PINPing जब निरोधात्मक न्यूरॉन्स परोक्ष रूप से पोस्टअन्तर्ग्रथनी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए अपेक्षाकृत संभावना नहीं है, क्योंकि disynaptic (अप्रत्यक्ष) सक्रियण, एक प्रमुख चिंता का विषय नहीं है. उत्तेजक न्यूरॉन्स PINPing के लिए, disynaptic सक्रियण आम है; प्रकाश के जवाब में आग है कि कई न्यूरॉन्स ChR2 व्यक्त, बल्कि ऐसा लगता है कि उन लोगों से शक्तिशाली अन्तर्ग्रथनी उत्तेजना प्राप्त नहीं है. परोक्ष रूप से सक्रिय न्यूरॉन्स से भेदभाव directly- के लिए रणनीतियाँ लीमा एट अल. 1 में विस्तार से चर्चा कर रहे हैं.

इलेक्ट्रोड विचार

हम व्यवस्थित इलेक्ट्रोड और रिकॉर्डिंग तकनीकों की एक किस्म का पता लगाया: विभिन्न आकार के सुझावों के साथ कांच पैच pipettes, प्रतिबाधा और टिप ज्यामिति, और मल्टी चैनल सरणियों (जैसे, tetrodes) में बदलती टंगस्टन microelectrodes. कोणीय, उच्च प्रतिबाधा टंगस्टन microelectrodes(यहाँ सुझाव के रूप में), दूर से, सबसे अच्छा उपज दे दी है. इन तकनीकों में से प्रत्येक के साथ सामना करना पड़ा मुद्दों की चर्चा इस प्रकार है.

कम प्रतिबाधा टेट्रोड सरणियों और मल्टी चैनल जांच का उपयोग करना, हम नियमित रूप से प्रकाश पैदा spikes के पता चला; हालांकि, वे मज़बूती से सॉर्ट करने के लिए पर्याप्त शायद ही कभी बड़े थे. दूसरे शब्दों में, संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) असंतोषजनक था. हम कभी-कभी tetrodes साथ उत्कृष्ट रिकॉर्डिंग मिला, लेकिन उपगामी उपज एकल टंगस्टन microelectrodes साथ अधिक था, और रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता काफी बेहतर था. टेट्रोड सुझावों पशु प्रति संभव पेनेट्रेशन की कुल संख्या सीमित है, जो के रूप में अच्छी तरह से तुलनात्मक रूप से कुंद कर रहे हैं. हम मल्टी चैनल जांच के साथ सामना करना पड़ा मुद्दों शायद व्यापक सतह रोशनी के उपयोग के द्वारा exacerbated किया गया. एक प्रत्यारोपित फाइबर से लक्षित, कम बिजली की उत्तेजना के विपरीत, सतह रोशनी आरोपित कील waveforms के लिए अग्रणी, रिकॉर्डिंग साइट परे ChR2 + न्यूरॉन्स में तुल्यकालिक फायरिंग का कारण होगासॉर्ट करने के लिए और अधिक कठिन हैं.

मानक ढीला सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों की तरह, ग्लास पैच इलेक्ट्रोड, भी कार्य करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, लेकिन विभिन्न कारणों से नहीं किया गया. कम प्रतिरोध (<5 MΩ) पैच इलेक्ट्रोड दृढ़ता से यह मुश्किल निरोधात्मक interneurons लक्षित करने के लिए है, जो पिरामिड कोशिकाओं की ओर पक्षपाती हैं. इस उच्च प्रतिरोध (छोटे टिप) इलेक्ट्रोड है, उनके अत्यंत सीमित सुन त्रिज्या पैच इलेक्ट्रोड के साथ अधिक से अधिक समस्या का उपयोग करके कुछ हद तक सुधारा जा सकता है. सेल संलग्न पैच रिकॉर्डिंग एक बहुत उच्च SNR प्रदान हालांकि, प्रकाश जिम्मेदार कोशिकाओं सेल संलग्न मोड के बाहर नहीं पाया जा सकता. पैच इलेक्ट्रोड के साथ रणनीति अनिवार्य रूप से, बेतरतीब ढंग से और क्रमिक रूप से निरोधात्मक interneurons ChR2 व्यक्त कर रहे हैं बहुत कुछ है जो की सेल-संलग्न रिकॉर्डिंग, प्राप्त करने के लिए, है.

उच्च प्रतिबाधा टंगस्टन इलेक्ट्रोड एक कर सकते हैंदोनों एक दूरी से प्रकाश पैदा spikes के पता लगाने, और अच्छा एकल इकाई अलगाव हासिल. टिप की ज्यामिति शायद सबसे महत्वपूर्ण कारक है. 5-12 डिग्री से 14 MΩ, और टिप कोण - हम 2 से लेकर impedances के साथ, दो निर्माताओं से टंगस्टन इलेक्ट्रोड की कोशिश की. हम 12 डिग्री टिप कोण बेहतर पाया गया कि, लेकिन सटीक प्रतिबाधा 7 की सीमा के भीतर, कम महत्वपूर्ण था कि - 14 MΩ. हम कांच लेपित इलेक्ट्रोड epoxy लेपित इलेक्ट्रोड की तुलना में प्रकाश कलाकृतियों के लिए अतिसंवेदनशील थे पाया, तो हम बाद की सलाह देते हैं. हम अपने स्वयं के कस्टम टंगस्टन इलेक्ट्रोड बनाने के लिए प्रयास नहीं किया. इलेक्ट्रोड के किसी भी प्रकार के साथ के रूप में, विफलता के आम मोड अलगाव खोना या एक न्यूरॉन घायल हैं. विभिन्न टिप मापदंडों इस पर ज्यादा प्रभाव नहीं दिखाई देते. बल्कि, व्यवस्थित करने के लिए ऊतक के लिए इंतजार कर उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग को बनाए रखने में अधिक महत्वपूर्ण कारक है.

लाइट डिलिवरी

प्रकाश केवल एक प्रयोग किया जाता हैबजाय एक विशिष्ट तरीके से अपने उत्पादन को विनियमित - - सा ChR2 पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान का मतलब है इस प्रयोग के लिए प्रयोग करने योग्य तीव्रता के रेंज विस्तृत है. एक कम सीमा तीव्रता ब्याज की अपनी कोशिकाओं की अधिकतम गहराई में ChR2 पॉजिटिव कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए कि तथ्य द्वारा निर्धारित है. हम चाहते हैं कि टिप irradiances> 5 मेगावाट / 2 मिमी मस्तिष्क स्तनधारी में प्रत्यक्ष माप के आधार पर एक कैलकुलेटर का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता भीतर विशिष्ट गहराई में गहरी परत में 6. विकिरण मजबूत पी.वी. से प्रतिक्रियाएं + कोशिकाओं को प्रकाश में लाना करने के लिए पर्याप्त थे (470 एनएम पर मापा) पाया मस्तिष्क के ऊतकों (जैसे, http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php ), लेकिन हम दृढ़ता से (एक कम प्रतिबाधा microelectrode का उपयोग, अनुभव से अपने खुद के प्रयोगों के लिए न्यूनतम निर्धारित करने 1 की सिफारिश - 3 MΩ,) multiunit गतिविधि के लिए. एक ऊपरी सीमा तथ्य द्वारा निर्धारित है कि उच्च इरादेsities पैदा spikes के पता लगाने जटिल हो सकता है जो प्रकाश कलाकृतियों, पैदा कर सकता है. ट्रांसजेनिक जानवरों में, उच्च तीव्रता भी गर्दन और सिर पर उजागर पीवी + मांसपेशी में ChR2 सक्रिय द्वारा electromyographic कलाकृतियों का कारण बन सकता है.

हमारे अपने प्रकाश वितरण प्रणाली के निर्माण में, हम एक ऑप्टिकल फाइबर के लिए एलईडी एक युग्मन एक मस्तिष्क पर सीधे एलईडी रखने से अंततः अधिक सुविधाजनक है कि पाया. उत्तरार्द्ध प्रकाश देने के लिए एक बहुत प्रभावी तरीका है, लेकिन कुछ व्यावहारिक नुकसान है. डिवाइस के माध्यम से बह वर्तमान परिरक्षित किया जाना चाहिए कि बिजली कलाकृतियों का उत्पादन, और एलईडी एक बड़ी गर्मी सिंक के साथ व्यस्त जाना चाहिए कि पर्याप्त गर्मी उत्पन्न करता है. इसके अलावा, (फोटोवोल्टिक और electromyographic दोनों) प्रकाश कलाकृतियों और अधिक कठिन एल ई डी का व्यापक रोशनी पैटर्न के साथ नियंत्रित करने के लिए कर रहे हैं. फाइबर युग्मन इन मुद्दों के सभी हल करती है.

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Materials

KMA (20.0 मिलीलीटर)
100 मिलीग्राम के 2 मिलीग्राम / मिलीलीटर Ketamine (10 मिलीग्राम / एमएल, एक बार पतला)
1 मिलीग्राम की 0.4 मिलीग्राम / मिलीलीटर Dexdomitor (medetomidine, 0.02 मिलीग्राम / एमएल, एक बार पतला)
100 मिलीग्राम की 0.05 मिलीग्राम / मिलीलीटर Acepromazine (0.25 मिलीग्राम / एमएल, एक बार पतला)
0.9% खारा के 17.55 मिलीलीटर
खुराक, वयस्क माउस (15 - 40 ग्राम)
नॉक-डाउन: 0.012 मिलीग्राम / छ * शरीर द्रव्यमान (Ketamine = 120 मिलीग्राम / किग्रा)
रखरखाव: 0.0025 मिलीग्राम / छ * शरीर द्रव्यमान (Ketamine = 25 मिलीग्राम / किग्रा)
Name Company Catalog Number Comments
ChR2-EYFP Line Jackson Colonies 12569
Pvalb-iCre (PV) Line Jackson Colonies 8069
Sst-iCre (SOM) Line Jackson Colonies 13044
Cr-iCre (CR) Line Jackson Colonies 10774
Agarose Sigma-Aldrich A9793 Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook) FST 10066-15
Surgical Scissors FST 14084-09
Scalpel FST 10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment Foster & Smith 9N-76855
Homeothermic Blanket Harvard Apparatus 507220F
Tungsten Microelectrodes A-M Systems 577200 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing Warner Instruments G150TF-3
Heat Shrink Tubing DigiKey A332B-4-ND
Zapit Accelerator DVA SKU ZA/ZAA Use with standard Super Glue. 
Microelectrode AC Amplifier 1800 AM Systems 700000
MP-285 Motorized Micromanipulator Sutter MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes Tektronix TDS2000C
Powered Speakers Harman Model JBL Duet
Manual Manipulator Scientifica LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable ThorLabs FC/PC BFL37-800
Power Meter ThorLabs PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E DigiKey XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO DigiKey 1050-1024-ND

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References

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