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1Institute of Neuroscience, University of Oregon

Published 11/07/2014
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Neuroscience

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Summary

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Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons. J. Vis. Exp. (93), e51757, doi:10.3791/51757 (2014).

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Abstract

신경 생리에서 중요한 과제는 대뇌 피질의 다수의 억제 세포 유형의 응답 특성과 기능을 특성화하고있다. 우리는 여기 리마 1 동료들에 의해 개발 된 방법을 사용하여 마취 마우스 피질에서 확인 된 억제의 interneurons 안정적인, 잘 격리 된 단일 단위 기록을 얻기위한 우리의 전략을 공유 할 수 있습니다. 녹음은 특정 신경 세포의 소집단에 Channelrhodopsin-2 (ChR2)를 표현 생쥐에서 수행됩니다. 인구의 회원은 푸른 빛에 대한 간단한 플래시에 대한 반응으로 식별됩니다. "PinP의"이라, 또는 신경 세포 집단의 Photostimulation 이용한 식별 - -이 기술은 표준 세포 외 기록 장치로 구현 될 수있다. 이것은 유전자 식별 세포 외 기록 타겟팅 목적, 칼슘 이미징 또는 시각 유도 패치에 저렴하고 대안적인 접근이 될 수있다. H오히려 우리는 매일 연습하는 방법을 최적화하기위한 지침을 제공합니다. 우리는 parvalbumin 양성 (태양 광 +) 세포를 대상으로 특별히 우리의 전략을 정제하지만 이러한 소마토​​스타틴 (somatostatin) 발현 (SOM +)를하고 calretinin 발현 (CR +)의 interneurons으로뿐만 아니라 다른 interneuron 유형에 대해 작동하는 것을 발견했다.

Protocol

참고 : 오레곤 동물 관리 및 사용위원회의 대학 승인 한 다음 프로토콜은 건강 지침의 국립 연구소에 따른다.

1. 급성 수술

  1. 복강 내 (IP) 주사 (표 1)를 통해, 케타민 - medetomidine 칵테일 동물을 마취.
    참고 :이 실험에 사용 된 마우스는 드라이버 선 (; SST-iCre12, SOM의 +, CR-iCre12, CR + Pvalb-iCre11, PV +)를 interneuron하는 CRE에 의존 ChR2 - EYFP 형질 전환 line10 교차에 의해 생성됩니다. ChR2 또는 관련 opsins의 바이러스 배달 유사한 발현 수준이 얻어진다 가정, 동일하게 작동합니다.
  2. 수술을 시작하기 전에, 확인 동물 전시 부드러운 발가락 핀치에 대한 응답이. 이 깊이의 마취를 유지하기 위해 필요에 따라 실험을하는 동안 마취제를 다시 투여. 주 사용 마취제를 사용하는 경우, 선택적으로 유지 보수 주사에 대한 IP 카테터를 이식.
  3. 식염수 또는 유지 보수 주사 (표 1)에 대해 적절하게 희석 마취제 칵테일을 사용하여 예를 들어 실험을하는 동안 락 테이트 링거액 (약 3 ㎖ / ㎏ / 시간), 수화 동물을 유지합니다.
  4. 정위 또는 다른 헤드 유지 장치에서 동물을 놓습니다. 두개골이 잘 고정되어 있는지 확인합니다. 이는 안정적인 단일 세포 기록을 유지하기 위해 필수적이다.
  5. 건조를 방지하기 위해 눈에 opthalamic 연고를 적용합니다. 36.5-37 ° C의 체온을 유지한다.
  6. 추가 기록 안정성 조에 고인 드레인을 수행합니다. 메스 블레이드를 사용하여 치스 테르 나디 라티 나 마그나을 노출 두개골의 후방 얼굴에서 조직을 제거합니다. 뇌척수액을 배출하기 위해 두라에 작은 흠을 확인합니다. 블레이드 만 매우 팁을 사용하여 소뇌 나 뇌간에 문의하지 마십시오.
  7. 메스를 사용하여, 청각에 대한 (관심있는 대뇌 피질의 영역 위에 작은 개두술 (~ 2mm 2)을 수행피질, 브레 그마의 약 -2.3 mm 후방, 정중선의 4.5 mm의 측면).
  8. 경질을 제거하고 따뜻한 0.5 아가로 오스의 층으로 노출 된 피질 커버 - 1mm 두께 (식염수에 1.5 % 아가로 오스, 0.9 %의 NaCl을;에 적용 ~ 37 ° C). 주기적으로 생리 식염수를 몇 방울을 적용하여 실험을하는 동안 아가로 오스 습기를 유지합니다.

2. 녹화 환경

  1. 텅스텐 전극 준비 (7-14 MΩ, 127 μm의 직경, 12 ° 테이퍼 팁, 에폭시 코팅). 유리 모세관 튜브에 전극을 Superglue 그립 (그림 1)를위한 열 수축 튜브를 추가합니다.
  2. 대뇌 피질의 표면에 직각 여행 세트 모터 (또는 유압) 미세 조작기에 전극을 장착합니다. 두개골에 대해, 피부 아래에 지선을 밀어 넣습니다. 그들은 근전도 아티팩트를 생성 할 수있는 머리의 측면과 목 뒤쪽에 근육과의 접촉을 피하십시오.
  3. 세포 외 A를 이용하여 전기 신호를 증폭단일 단위 녹음에 적합한 리 파이 어은, 바람직하게는 임피던스 검사 모드를 갖추고 있습니다. 두 개의 오실로스코프 및 전원 스피커 세트 - 지속적인 스파이크 활동 (5,000 Hz의 대역 통과 300)를 모니터링합니다. 여기서, 기록 된 데이터는 10 kHz의 샘플링 속도로 연속적으로 디지털화되고; 스파이크는 오프라인 추출한다.
  4. 팁 피질의 표면에 도달 할 때까지 아가 통해 전극을 전진. 현미경을 통해이 단계를 관찰한다. "제로"미세 조작기에이 위치.
  5. 최고 기록의 깊이를 근사하기 위해, 시각적 침투 끝에 전극을 인출 할 때, 전극 팁은 제로의 깊이에 대뇌 피질을 종료 확인.
    참고 : 조작하는 읽기와 관찰 된 전극의 위치 사이의 불일치가 조직에 상대적으로 표류 나타냅니다. 이것은 뇌이나 동물, 또는 조작하는 드리프트의 불안정으로 인해 발생할 수 있습니다.
    1. 있는지 확인하기 위해 추가 검사로조직의 첫 번째 수백 마이크로 미터를 통해 진행하는 동안이 제로 세트 포인트가 대뇌 피질의 표면에 해당하고, 자극 유발 필드 전위를 모니터링 할 수 있습니다. 필드 전위를 모니터링 할 때, 10 Hz로 세포 외 증폭기의 하부 대역 통과 필터 컷오프 낮은. 로컬 필드 전위의 극성이 레이어 I / II 국경 근처에 13 ~ 100 ㎛의 깊이 주위에 반전 있는지 확인합니다. 이는 청각 피질 신뢰성 기준점이지만, 다른 피질 다를 수있다.
  6. 수동 미세 조작기에 푸른 빛 소스 (그림 2)에 결합 된 광섬유를 탑재합니다. 현미경을 사용하여 가능한 한 아가의 표면에 가깝게 섬유 팁의 위치. 전극이 조직을 입력 할 빔을 센터입니다.
  7. 지정된 폭과 duratio의 TTL (트랜지스터 - 트랜지스터 로직) 펄스열을 제공 할 수있는 제어 장치와, 광원의 출력을 레귤N- 아두 이노 (도 3), (도시 된 바와 같이) 컴퓨터 I / O 카드, 또는 시판 펄스 발생기.
    1. 모두 오실로스코프에 신호를 모니터링합니다.
  8. 파워 미터를 이용하여 광섬유의 선단부 전체 광선 전력 (MW)을 측정한다. 섬유 코어의 단면적으로 나누어 방사도 (Mw / mm 2)을 계산하기 위해이 값을 사용한다. 10의 범위의 강도 값으로 시작 - 15 mW의 / mm이 필요한 경우 생성물이 제거 될 때까지, 하향으로 조정한다.
  9. 조직을 입력 할 태세 아가로 오스의 전극, 빛 이슈를 확인합니다. 검색 펄스열을 시작합니다 (예를 들어, 30 밀리 광 펄스, 500 밀리 초 interstimulus 간격 (ISI)).
    1. 입사광의 각도를 변경하는 전극에 대하여 광섬유를 재배치함으로써 과도 광 아티팩트 (도 4)을 제거한다. 유물이 계속되면, 빛 전력을 감소하려고합니다. 일에즉 아티팩트가 완전히 (에만 최소화)을 제거 할 수없는 드문 경우에는, 탐색 펄스의 지속 기간을 연장. 이것은 사실이 신경 세포의 스파이크를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

3. 스트레이트 떠있을-에 '

  1. 약 1 ㎛ / 초의 속도로 뇌를 통해 천천히 전극을 전진. 지속적인 활동을 모니터링 한 오실로스코프를 사용합니다. 다른 한편으로, 레이저 펄스를 발생시킨다.
  2. 전극이 ChR2 + 셀을 접근 종종 전기 신호 오실로스코프에 분명 잘하기 전에 감지 할 수 있음을 나타냅니다 오디오 모니터에 빛을 유발 스파이크의 희미한 '해시'를 수신합니다. 사전의 속도를 느리게하는 효과가 있습니다.
    NOTE : 셀 전극의 경로에 직접적으로 놓여있는 경우, 광 - 유발 활성이 더 큰 (더 크게) 성장할 것이다. 전극은 단일 interneuron 접근하면, 해시는 균일 한 크기와 형태의 작지만 잘 정의 스파이크로 해결한다.
  3. 즉시 리튬 등GHT-유발 스파이크 개별적으로 오실로스코프의 오프 트리거 할만큼 큰, 그래서 일을 시작합니다. 스파이크 파형의 정확한 형상을 관찰 횡축 배율을 조정한다.
  4. 중지하고 조직이 정착 될 때까지 기다립니다. 가까운 셀에 전극을 이동하는 유혹에 저항. 이 단계는 안정된 기록 중요하다. 몇 분 후, 신호 대 잡음비가 개선되지 않은 경우 - 즉, 티슈가 가라 앉을되지만 가​​까이 전극의 선단에 세포를 가져 못한 - 미리 5 더 μm의 다시 기다린다.
    1. 피크 또는 활동 전위의 물마루 어느 확실 잡음 플로어 (예를 들어, +/- 300 μV 이상)보다 충분히 위에 설정된 전압 임계치로 캡처 될 수있을 때까지이 과정을 반복한다.
      참고 : 억제의 interneurons을 PINPing 때 가양 또는 모호함의 작은 위험이있다. 대부분의 세포는 쉽게 30 밀리의 기간 간 PUL과 펄스의 기차를 따를 수있다SE 간격 2-5 밀리 초 (그림 5)의 신뢰할 수있는 최초의 스파이크 대기 시간이 500 밀리 초, 또는 빠르고. PV + 세포의 대부분은, 특히, 전체 1 초 (그림 6)에 대한 발사 유지할 수 있습니다. 이러한 억제 뉴런 때문에, disynaptic (경유) 활성화는 큰 문제가되지 않습니다.
  5. 녹음하는 동안, 최초의 오실로스코프에 지속적인 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 크기와 두 번째 오실로스코프를 사용하여 스파이크의 모양에 눈을 떼지. 스피커에 자신의 소리의 품질을합니다.
    1. 셀이 중 하나 (이 찔려 죽은 또는 손상 위험이) 전극에 너무 가까이 도면을 나타냅니다 급격한 변화에 대해주의 깊게 듣거나 떨어져 표류한다. 스파이크가 크고 왜곡되는 경우, 백 아웃; 이들이 작은 커지면, 전극을 전진. 2 μm의 단계로 천천히 이동합니다.
    2. 정점 또는 저점에 정렬 된 모든 스파이크 파형을 중첩하여 기록 사후의 품질을 확인합니다. 전압 Thres를 비바리보유. 임계 값의 넓은 범위에 걸쳐, 오직 일정한 높이 (도 5a)의 일관된 스파이크 형상이 있어야한다.
  6. 어떤 지점에서 신호가 인접 신경 세포에서 스파이크에 오염 될 경우, 이동합니다. 전극은 인접 셀의 범위 밖에 통과하지만, 표적 뉴런의 범위 내에 남아있을 오프 기회에 천천히 전진. (이것은 일반적으로 성공하지 못합니다.)
  7. 각 침투 피질 (900+ μm의)의 전체 깊이를 통해 전극을 이동합니다. 더 빛 응답 뉴런 반대로, 녹음 정기적으로 이웃 ChR2- 세포의 스파이크에 오염 된 많은 침투 또는 후에 발생하지 않으면, 새로운 전극을보십시오.
    참고 : 단 한 번의 일괄 처리 내 개별 전극의 임피던스 및 팁 형상 상당히 다를 수 있습니다. 두 요인 ㅁ - 빛 유발 스파이크를 감지 할만큼 충분히 커야합니다 전극의 유효 "듣고 반경"에 기여ILE 검색은 아직 분리에서 하나의 interneuron을 기록 수 있도록 충분히 제한.
  8. 원하는대로 전극의 임피던스를 테스트합니다. 조직의 손상을 방지하기 위해, 아니라 뇌 밖에, 아가로 오스 층의 상부에 전극의 끝으로이 작업을 수행. 7-14 MΩ의 범위 내에서, 정확한 임피던스는이 애플리케이션에 대한 성능, 또는 수율의 확실한 예측 아니다. 즉, 수신 반경을위한 합리적인 프록시의 말했다 : 낮은 임피던스 전극 이상의 유닛을 선택, 높은 임피던스, 적은.
  9. 실험의 끝에, 이러한 마취 깊이 평면 아래 마취제 과다, 또는 경추 탈구 등 제도적으로 승인 된 수단에 의해 동물을 안락사.

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Representative Results

우리는 여기에 "리마 등. 한. 표 1 세부 제안 마취 칵테일, 케타민-Medetomidine - 아세 프로 마진을 (가 개발 한 optogenetic 방법을 사용하여, 마취 마우스 피질에서 유전 분류 억제의 interneurons에서 단일 단위 기록을 얻기위한 우리의 전략을 공유 KMA ").도 1은 도표 4. 3 아두 이노 마이크로 컨트롤러와 광 출력 게이팅위한 구성 및 코드를 포함하는도.도 2는 간단한 LED 제어부위한 회로도 포함 도표. 녹음 준비 텅스텐 미세 전극을, 도시의 예를 도시 빛에 의한 전기 유물 프로토콜에 대해 논의했다. 유물은 때때로 (왼쪽 패널)가 발생하지만, 쉽게 (오른쪽 패널) 수정됩니다. 5 광학 식별의 interneurons의 세 가지 유형 (태양 광 +, CR +,와 솜 +)에서 예를 들어 녹음을 보여줍니다. 왼쪽 PANel 보낸이 전략 수득 기대할 수 원시 전압 트레이스와 정렬 파형, 신호 대 잡음비 중 하나의 종류의 대표를 나타낸다. 스파이크는 안정적으로 수백 마이크로 볼트의 고정 전압 임계 값으로 캡처됩니다. 래스터 플롯 (오른쪽 패널) ChR2 양성의 interneurons의 명확한 식별을 허용 빛 유발 반응의 짧은 대기 시간과 신뢰성을 보여줍니다. 6은이 1 초 광 펄스에 응답, 세 PV +의 interneurons에서 흔적을 전압 그림. PV + 세포의 대부분은 수백 밀리 초에 대한 발사에 특히 쉽게 식별 할 수있게 고주파를 유지할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 전극을 준비.   준비된 전극 (A) 다이어그램. 전극 affi이고두 슈퍼 접착제의 작은 방울 (예 잽 - 잇 등) 촉진제의 최소량을 사용하여 유리 모세관에 XED. 열 수축 튜브는 매우 낮은 열을 사용하여 그립에 추가됩니다. 전극은 일반적으로 전극 홀더에 장착 준비 텅스텐 미세 전극의 커넥터 핀 사전 부착. (B) 사진과 함께 제공.

그림 2
그림 2. LED 제어 유닛에 대한 회로도. 광 전달을위한 간단하고 저렴한 회로. 고휘도 LED는 (475 ㎚) 히트 싱크에 부착 된 광섬유 케이블 (800 μm의 직경)의 타단에 연결된다. LED의 출력은 TTL 펄스 게이팅된다. 제어 유닛은 조정 가능한 광량에 대한 전압 - 모드 파워 서플라이를 포함한다. 2K POT : 빛의 강도를 제어하는​​ 가변 저항기. 의 P / S의 : DC 전원 좌약 LY (예를 들어, 노트북 충전기). TIP 122 : 달링턴 트랜지스터. 4N35 : 광 아이솔레이터. 여기에 나열된 부품은 <10 달러.

그림 3
그림 3. 아두 이노 코드 및 구성. 광 출력을 게이팅을위한 TTL 펄스 트레인은 아두 이노 마이크로 컨트롤러를 사용하여 생성 할 수 있습니다. 이 프로그램은 반복 펄스 트레인의 펄스 지속 시간 및 ISI를 지정합니다. 보드에 프로그램을로드하기위한 지침이 아두 이노의 "시작하기"페이지에서 찾을 수 있습니다 ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

igure 4 "FO : 콘텐츠 폭 ="6 인치 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "폭 ="600 "/>
. (- 5,000 Hz에서 필터링 된 신호, 300 왼쪽 패널) 그림 4. 빛 유물 금속 전극이 발병에서 현재와 펄스의 오프셋 (offset) 등 유물에 민감하다. 이들은 일반적으로 입사광의 각도를 변경하는 전극 광섬유 대하여 재 위치 및 / 또는 광 파워를 감소시켜 완전히 (오른쪽 패널) 제거 될 수있다.

그림 5
5. 실시 예 세포 그림. (A) 광학 식별의 interneurons, PV + (보라색), CR + (녹색), SOM의 + (적색)에서 전형적인 예를 녹음. 세포는 검색 펄스열에 스파이크의 신뢰할 수있는 버스트 (펄스 지속 시간 30 MS, ISI 500 밀리 초) 응답합니다. 오른쪽에있는 패널은 100 통 정렬 스파이크를 보여줍니다. 평균 보간 파형 (10 kHz의 샘플링 속도에서 오버 샘플링 된 10 배)과 동일한 파일 (B) 래스터 플롯은 짧은 대기 시간 (~ 2-5 밀리) 보여준다. 광 - 유발 스파이크 일관된 타이밍을 (C) 평균 및 첫 번째 스파이크 대기 시간의 표준 편차 - 44 PV +의 interneurons (평균 평균과 표준 편차 : 3.4 +/- 2.6 밀리 초)의 샘플 (5 10 펄스). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 지속적인 응답 6. 예 이들의 대부분은 수백 밀리 초에 대한 발사 고주파를 유지할 수있는 하나는 PV +의 interneurons을 식별 특히 확신 할 수 있습니다 -. 현재에 자신의 답변을 연상시험관 (14)에 주입. 1 초 광 펄스에 응답 세 ChR2 / PV 셀 : 펄스의 전체 기간에 걸쳐 규칙적으로 발광이,하지 않는 셀의 일 예를 특이 (<발생 세포의 10 %).

1. 케타민-Medetomidine - 아세 프로 마진 ( "KMA는"). 녹다운 수화를 유지하기 위해 희석 된 성인 마우스, 및 유지 용량을. 필요에 따라, 90 분 - 칵테일은 모든 40를 투여 재.

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Discussion

떠있을 개념적으로 간단하지만, 실제로 문제가 될 수 있습니다. 성공의 주요 결정은 전극의 선택입니다. 전기 청취 반경은 중요한 파라미터이다. 이것은 선단이 약간 먼 거리 ChR2 + 셀로부터 정지되었을 때에 하나 이에 따라 어드밴스의 속도를 조정할 수 있도록, 광 유발 스파이크를 검출하기에 충분히 커야한다. 동시에, 양호한 단일 유닛 분리 가능하도록 충분히 제한되어야한다. 즉, 전극은 이웃 ChR2- 단위에서 스파이크를 선택해서는 안된다. 듣기 반경의 관점에서 균형 눈에 띄는 것은 어떤 대상 세포 유형에 대한 도전이 될 수 있지만, 비교적 큰 세포가, 드문 드문 작은, 종종 세포 삼각뿔 부근에서 발견 억제의 interneurons, 특히 참됩니다 스파이크. 비록 여기에 제안 된 전략을 사용하여, 예상 수율이 높지 않다. 우리의 전형적인 수율은 우리의 criter 주어진, 0-2 PV + 신경 세포 / 동물이었다우수한 단일 단위 분리의 IA 및 녹음 반 시간 이상 지속.

억제 뉴런을 PINPing 때 억제 신경이 간접적으로 시냅스 후 세포를 활성화 상대적으로 가능성이 있기 때문에, disynaptic (경유) 활성화, 큰 문제가되지 않습니다. 흥분성 신경 세포를 PINPing를 들어, disynaptic 활성화가 일반적이다; 빛에 반응하여 화재 많은 신경 ChR2을 표현하는 것이 아니라 않는 것과 강력한 시냅스 여기가 나타나지 않습니다. 간접적으로 활성화 된 신경 세포에서 차별 directly-위한 전략 리마 등. (1)에서 자세히 설명합니다.

전극 고려 사항

우리는 체계적 전극 및 기록 다양한 기술 탐구 : 다양한 크기의 팁 유리 패치 피펫, 임피던스 및 팁 구조 및 다 채널 배열 (예 tetrodes)에서 가변 텅스텐 미소 전극. 각도 높은 임피던스 텅스텐 마이크로 전극(여기에) 제안, 지금까지 최고의 수익률을했다. 이러한 기술의 각각 발생하는 문제에 대한 논의는 다음과 같다.

저임피던스 사극 어레이 및 멀티 채널 프로브를 사용하여, 우리는 일상적 광 유발 스파이크를 검출; 그러나, 그들은 안정적으로 분류 할만큼 거의 컸다. 즉, 신호 대 잡음비 (SNR)가 불만족이었다. 우리는 때때로 tetrodes와 우수한 기록을 얻을 않았지만, 점근 수율은 하나의 텅스텐 미세 전극으로 높은, 그리고 녹음의 품질은 훨씬 더이었다. 사극 팁 마리당 가능한 관통의 총 수를 제한 할뿐만 아니라, 비교적 평활하다. 우리는 멀티 채널 프로브 조우 문제는 아마도 넓은 표면 조도의 사용에 의해 악화되었다. 주입 된 섬유로 타겟팅 저전력 자극 달리, 표면 조도가 중첩 스파이크 파형 선도, 기록 위치 이후 ChR2 + 뉴런 동기 소성 발생할정렬하기가 더 어렵다 그.

표준 느슨한 세포 부착 녹음에 사용되는 것과 같은 유리 패치 전극, 또한 작업에 적합하지만, 다른 이유로하지 않았다. 낮은 저항 (<5 MΩ) 패치 전극을 강하게 어려운 억제의 interneurons을 대상으로 할 수있는 피라미드 세포 치우쳐있다. 이것은 높은 저항 (작은 팁) 전극, 그들의 매우 제한된 청취 반경 패치 전극 큰 문제를 사용하여 어느 정도 보정 할 수 있지만. 세포 부착 된 패치 녹음이 매우 높은 SNR을 제공하지만, 빛에 반응 세포는 세포 부착 된 모드의 외부에서 감지 할 수 없습니다. 패치 전극 전략은 필연적으로, 무작위로 순차적으로 억제의 interneurons을 ChR2 - 표현되는 거의있는 세포 부착 녹음을 얻을 수있다.

고 임피던스 텅스텐 전극으로 한 캔모두 거리에서 빛을 유발 스파이크를 감지하고 좋은 하나의 단위 분리를 얻을 수 있습니다. 팁의 형상은 아마도 가장 중요한 요소이다. 5-12 °에서 14 MΩ, 팁 각도 - 우리는 2에 이르기까지 임피던스로, 두 개의 제조 업체 텅스텐 전극을 시도했다. 우리는 12 ° 팁 각도가 우수한 것으로 나타났다, 그러나 정확한 임피던스 (7)의 범위 내에서 덜 중요하다고 - 14 MΩ. 우리는 유리 코팅 전극 에폭시 코팅 된 전극에 비해 빛 유물에 더 민감 것을 발견했다, 그래서 우리는 후자를 추천합니다. 우리는 우리 자신의 사용자 정의 텅스텐 전극을 시도하지 않았다. 임의 유형의 전극과 마찬가지로, 실패의 공통 모드 절연을 잃거나 신경을 손상한다. 다른 팁 매개 변수는이에 많은 영향을 나타나지 않습니다. 오히려 정착 조직 기다리고 고품질 기록을 유지하는 중요한 요인이다.

빛 배달

빛에만 사용되기 때문에보다는 특정 방법으로 자신의 출력을 조절 - - SA는 ChR2 양성 세포를 식별하는 수단이 실험을 위해 사용 가능한 농도의 범위가 넓다. 하한은 강도가 관심있는 셀의 최대 깊이 ChR2 양성 세포를 활성화하기에 충분해야한다는 사실에 의해 설정된다. 우리는 팁 irradiances> 5 메가 와트 / mm (2) 뇌가 포유류의 직접 측정을 기반으로 계산기를 사용하여 추정 할 수있다 내의 특정 깊이에서 깊은 층에서 6 조도를 강력한 PV의 응답 + 세포를 유도하기에 충분했다 (470 nm에서 측정) 발견 뇌 조직 (예를 들면, http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php ), 그러나 우리는 강하게 (낮은 임피던스 미세 전극을 사용하여, 경험적으로 자신의 실험을위한 최소를 결정하는 1 추천 - 3 MΩ) 멀티 유닛 활동. 상한은 사실에 의해 설정된다 높은 INTEN잇고가 유발 스파이크의 검출을 복잡하게 빛 유물을 일으킬 수 있습니다. 형질 전환 동물에서, 높은 강도 또한 목과 머리에 노출 된 PV + 근육에 ChR2을 활성화하여 근전도 유물의 원인이 될 수 있습니다.

우리의 광 전달 시스템을 구축에서는 광섬유 LED 결합 뇌 바로 위에 LED를 배치하는 것보다 궁극적으로 더 편리하다는 것을 발견. 후자는 빛을 제공하는 매우 효과적인 방법이지만, 실제적인 단점이있다. 소자에 흐르는 전류 보호막이 전기 아티팩트를 생성하고, LED가 큰 방열판 소산되어야 상당한 열을 생성한다. 또한, (태양 광 및 근전도 모두) 등 유물이 훨씬 더 어렵 LED의 다양한 조명 패턴을 제어 할 수 있습니다. 섬유 커플 링은 이러한 모든 문제를 해결합니다.

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Materials

KMA (20.0 ㎖)
100mg을 2 ㎖ / ㎖ 케타민 (10 ㎎ / ㎖, 회 희석)
1 mg을 0.4 ㎖ / ml의 Dexdomitor (medetomidine 0.02 ㎎ / ㎖, 회 희석)
100mg을 0.05 ㎖ / ml의 아세 프로 마진 (0.25 ㎎ / ㎖, 회 희석)
0.9 % 식염수 17.55 ml의
복용량, 성인 마우스 (15-40g)
노크 다운 : 0.012 ㎖ / g * 신체 질량 (케타민 = 120 ㎎ / ㎏)
유지 보수 : 0.0025 ㎖ / g * 신체 질량 (케타민 = 25 ㎎ / ㎏)
Name Company Catalog Number Comments
ChR2-EYFP Line Jackson Colonies 12569
Pvalb-iCre (PV) Line Jackson Colonies 8069
Sst-iCre (SOM) Line Jackson Colonies 13044
Cr-iCre (CR) Line Jackson Colonies 10774
Agarose Sigma-Aldrich A9793 Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook) FST 10066-15
Surgical Scissors FST 14084-09
Scalpel FST 10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment Foster & Smith 9N-76855
Homeothermic Blanket Harvard Apparatus 507220F
Tungsten Microelectrodes A-M Systems 577200 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing Warner Instruments G150TF-3
Heat Shrink Tubing DigiKey A332B-4-ND
Zapit Accelerator DVA SKU ZA/ZAA Use with standard Super Glue. 
Microelectrode AC Amplifier 1800 AM Systems 700000
MP-285 Motorized Micromanipulator Sutter MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes Tektronix TDS2000C
Powered Speakers Harman Model JBL Duet
Manual Manipulator Scientifica LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable ThorLabs FC/PC BFL37-800
Power Meter ThorLabs PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E DigiKey XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO DigiKey 1050-1024-ND

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References

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