Um Guia para
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

Published 11/07/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Moore, A. K., Wehr, M. A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons. J. Vis. Exp. (93), e51757, doi:10.3791/51757 (2014).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Um grande desafio em neurofisiologia tem sido a de caracterizar as propriedades de resposta e função dos inúmeros tipos de células inibitória no córtex cerebral. Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção estáveis, bem isoladas gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios identificadas no córtex anestesiado mouse usando um método desenvolvido por Lima e colaboradores um. As gravações são realizadas em ratinhos que expressam channelrodopsina-2 (ChR2) em subpopulações neuronais específicas. Os membros da população são identificados pela sua resposta a um breve flash de luz azul. Esta técnica - chamada de "PINP", ou Identificação fotoestimulação-assistida de Populações Neuronais - pode ser implementado com equipamento de gravação extracelular padrão. Ela pode servir como uma alternativa barata e acessível a imagiologia de cálcio ou patching visualmente-guiado, com o objectivo de direccionamento gravações extracelulares de células identificadas geneticamente. Here nós fornecemos um conjunto de diretrizes para a otimização do método na prática diária. Nós refinado nossa estratégia especificamente para alvejar as células parvalbumina-positivo (PV +), mas descobriram que ele funciona para outros tipos interneuron, bem como, tais como (CR +) interneurons expressando Calretinin-somatostatina expressando (SOM +) e.

Protocol

NOTA: O seguinte protocolo está de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde como diretrizes aprovados pela Universidade de Oregon Animal Care e do Comitê Use.

1. Cirurgia aguda

  1. Anestesiar o animal com um cocktail de cetamina-medetomidina, via intraperitoneal (ip) (Tabela 1).
    NOTA: Os ratos usados ​​nestas experiências são gerados pelo cruzamento de um ChR2-EYFP line10 transgénico dependente de cre a Interneuron linhas de driver (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Entrega Viral de ChR2 ou opsinas relacionados devem funcionar igualmente bem, assumindo níveis de expressão semelhantes são obtidos.
  2. Antes de iniciar a cirurgia, garantir que as exposições de animais não resposta a uma pitada toe suave. Re-administração de anestésicos durante todo o experimento como necessário para manter este profundidade da anestesia. Se usar anestésicos injetáveis, opcionalmente implantar um cateter ip para injeções de manutenção.
  3. Manter o animal hidratado com solução de Ringer com lactato ao longo da experiência (aproximadamente 3 ml / kg / h), por exemplo, utilizando um cocktail de anestésico apropriadamente diluído para injecções de manutenção (Tabela 1) ou solução salina.
  4. Colocar o animal em um aparelho de cabeça-holding estereotáxica ou outro. Certifique-se que o crânio é bem protegido. Isto é essencial para a manutenção de gravações de célula única estáveis.
  5. Aplicar pomada opthalamic aos olhos para evitar o ressecamento. Manter a temperatura corporal a 36,5-37 ° C.
  6. Realize um dreno cisternal para a estabilidade de gravação adicional. Usando uma lâmina de bisturi, remover o tecido a partir da face posterior do crânio para expor a cisterna magna. Faça um pequeno corte na dura para drenar o líquido cefalorraquidiano. Use somente a ponta da lâmina, e evitar entrar em contato com a haste cerebelo ou cérebro.
  7. Usando o bisturi, realizar uma craniotomia pequena (~ 2 milímetros 2) sobre a área cortical de interesse (por auditivocórtex, cerca de -2,3 mm posterior do bregma, 4.5 mm lateral da linha média).
  8. Remover a dura-máter e cobrir o córtex exposto, com uma camada de agarose a quente 0,5-1 mm de espessura (1,5% de agarose em solução salina, 0,9% de NaCl; aplicam-se a ~ 37 ° C). Manter a húmido de agarose ao longo da experiência pela aplicação periódica de várias gotas de solução salina.

2. Gravação de Set-up

  1. Prepare um eletrodo de tungstênio (14/07 mohms, 127 mm de diâmetro, 12 ° ponta cônica, epóxi-revestido). Supercola o eletrodo a um tubo capilar de vidro e adicione psiquiatra tubulação de calor para grip (Figura 1).
  2. Monte o eletrodo em um micromanipulator motorizada (ou hidráulica), definida para viajar ortogonal à superfície cortical. Deslize um fio terra sob a pele, contra o crânio. Evitar o contacto com os músculos do lado da cabeça e a parte de trás do pescoço enquanto eles podem gerar artefactos eletromiográficas.
  3. Amplificar o sinal elétrico usando um amplificador extracelularli er fi adequado para a gravação em uma única unidade, de preferência equipado com um modo de verificação de impedância. Monitorar a atividade spiking em curso (passa-banda 300 - 5000 Hz) com dois osciloscópios e um conjunto de alto-falantes. Aqui, os dados gravados são digitalizados de forma contínua a uma taxa de amostragem de 10 kHz; picos são extraídos off-line.
  4. Avance o eléctrodo através da agarose até que a ponta atinge a superfície do córtex. Observe este passo através de um microscópio. "Zero" esta posição no micromanipulator.
  5. Para aproximar melhor a profundidade de gravação, confirmar visualmente que a ponta do eléctrodo sai da superfície cortical, a uma profundidade de zero quando a retirada do eléctrodo na extremidade de uma penetração.
    NOTA: A discrepância entre a leitura do manipulador e da posição do eletrodo observado indica que ele se afastou em relação ao tecido. Isto pode ser causada pela instabilidade do cérebro ou animal, ou manipulador deriva.
    1. Como uma verificação adicional para garantir queeste conjunto de ponto zero corresponde à superfície do córtex, monitorizar potenciais de campo evocadas por estímulo enquanto avança através das primeiras várias centenas de micrómetros de tecido. Ao monitorar potenciais de campo, diminuir o menor corte do filtro passa-banda do amplificador extracelular para 10 Hz. Confirmar que a polaridade do potencial de campo local inverte em torno de uma profundidade de ~ 100 pm, perto da fronteira I / II 13 camada. Este é um ponto de referência confiável para o córtex auditivo, mas pode variar para outras áreas corticais.
  6. Montar uma fibra óptica acoplada a uma fonte de luz azul (Figura 2) para um micromanipulador manual. Utilizando o microscópio, posicionar a ponta da fibra tão perto da superfície da agarose quanto possível. Centrar o feixe em que o eléctrodo vai entrar no tecido.
  7. Regular a saída da fonte de luz com uma unidade de controle capaz de entregar um TTL (lógica transistor-transistor) trem de pulsos de largura e duratio especificadon- por exemplo, um Arduino (Figura 3), um cartão de computador de I / O (como mostrado), ou um gerador de impulsos disponíveis comercialmente.
    1. Monitorar o sinal em ambos os osciloscópios.
  8. Meça a potência total da luz (mW) na ponta da fibra óptica, utilizando um medidor de potência. Use esse valor para calcular a irradiância (mW / mm 2), dividindo pela área da secção transversal do núcleo da fibra. Comece com um valor de intensidade no intervalo de 10 - 15 mW / mm 2 e ajuste para baixo, se necessário, até artefactos são eliminados.
  9. Verifique a existência de artefatos de luz com o eletrodo na agarose, pronta para entrar no tecido. Comece a busca de trem de pulso (por exemplo, 30 pulsos de luz ms, 500 ms intervalo interstimulus (ISI)).
    1. Elimine artefactos de luz transitórios (Figura 4) por reposicionamento da fibra óptica relativa ao eléctrodo para mudar o ângulo da luz incidente. Se artefatos persistir, tente diminuir o poder da luz. Em the caso raro que os artefatos não podem ser completamente eliminados (apenas minimizado), prolongar a duração do pulso de pesquisa. Isto pode ajudar a identificar os verdadeiros pontos neuronais.

3. Em linha reta PINP-in '

  1. Avance o eléctrodo lentamente através do cérebro, a uma taxa de aproximadamente 1 mm / seg. Use um osciloscópio para monitorar a atividade em curso. Por outro lado, desencadear os pulsos de laser.
  2. Escutar para o 'de hash "fraco de picos de luz evocado no monitor de áudio, o que indica que o eléctrodo está a aproximar de uma célula ChR2 + e pode muitas vezes ser percebido bem antes de o sinal eléctrico é aparente no osciloscópio. Diminuir a taxa de antecedência.
    NOTA: Se a célula situa-se no caminho do eletrodo, a atividade de luz evocada vai crescer mais (e mais alto). À medida que o eléctrodo se aproxima de uma única interneurónio, vai resolver o hash em pequenos mas bem definidas picos de tamanho e forma uniforme.
  3. Assim que lispikes evocado-GHT são grandes o suficiente para desencadear de individualmente no osciloscópio, começar a fazer isso. Ajustar a escala no eixo horizontal para observar a forma exacta da forma de onda de pico.
  4. Pare e espere o tecido para resolver. Resistir à tentação para mover o eléctrodo mais perto da célula. Este passo é crítico para uma leitura estável. Se depois de vários minutos a relação sinal-para-ruído não melhorou - isto é, o tecido tem resolvido, mas não trouxe a célula mais perto da ponta do eléctrodo - 5 um avanço adicional e esperar de novo.
    1. Repita esse processo até que o pico ou a calha do potencial de ação pode ser capturada de forma confiável com um limiar de tensão definir bem acima do ruído de fundo (por exemplo, +/- 300 mV ou mais).
      NOTA: Há pouco risco de resultados falso-positivos ou ambigüidade quando PINPing interneurônios inibitórios. A maioria das células pode facilmente seguir um trem de pulsos com duração de 30 ms e inter-pulintervalo de 500 ms si só, ou mais rápido, com um primeiro pico de latência de confiança de 2-5 mseg (Figura 5). A maioria das células fotovoltaicas +, em particular, pode sustentar a disparar para um total de 1 seg (Figura 6). Porque estes são neurônios inibitórios, disynaptic ativação (indireto) não é uma grande preocupação.
  5. Durante a gravação, monitorar a atividade em curso no primeiro osciloscópio. Mantenha um olhar atento sobre o tamanho ea forma dos picos usando o segundo osciloscópio. Observe a qualidade de seu som no alto-falante.
    1. Ouça com atenção para mudanças abruptas, que indicam que a célula é qualquer desenho muito próximo ao eletrodo (onde corre o risco de ser empalado ou danificado), ou está se afastando. Se os picos se tornam grandes e distorcida, voltar para fora; se tornam menores, avançar o eletrodo. Mova-se lentamente em 2 mm etapas.
    2. Confirme a qualidade da gravação post-hoc sobrepondo todas as formas de onda de pico, alinhados ao pico ou vale. Variar os thres tensãosegurar. Através de uma ampla gama de valores de limiar, não só deve ser sempre uma forma consistente pico de altura uniforme (Figura 5a).
  6. Se em algum momento o sinal torna-se contaminado com pontas de um neurônio vizinho, seguir em frente. Avance lentamente, no off-chance de que o eletrodo vai passar fora do alcance da célula vizinha, mas permanecem na faixa do neurônio alvo. (Isto é geralmente sem sucesso.)
  7. Mover o eléctrodo através de toda a profundidade do córtex (900 + im) em cada penetração. Se nenhuma luz neurônios responsivos são encontradas depois de muitas penetrações ou, pelo contrário, as gravações são rotineiramente contaminados com picos de células ChR2- vizinhos, tente um novo eletrodo.
    NOTA: Mesmo dentro de um único lote, a geometria de impedância e ponta de eletrodos individuais podem variar consideravelmente. Ambos os fatores contribuem para a efetiva "Raio escuta" do eletrodo, o que deve ser grande o suficiente para detectar picos de luz evocados while pesquisa, ainda restringido o suficiente para permitir a gravação de um único interneurónio isoladamente.
  8. Teste a impedância de eléctrodos como desejado. Para evitar danificar o tecido, fazer isso com a ponta do eléctrodo na parte superior da camada de agarose, bem fora do cérebro. Dentro da faixa de 7-14 mohms, a impedância exata não é um preditor certeza de desempenho, ou rendimento, para esta aplicação. Dito isto, é um proxy razoável para o raio de escuta: eletrodos de baixa impedância pegar mais unidades; de alta impedância, menos.
  9. No fim do experimento, os animais a eutanásia por meio institucional-aprovados, tais como sobredosagem anestésica, ou luxação cervical sob um plano de anestesia profunda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nós aqui partilhar a nossa estratégia para a obtenção de gravações de uma única unidade de interneurônios inibitórios geneticamente classificados no córtex anestesiado rato, utilizando um método optogenetic desenvolvido por Lima et al. A Tabela 1 detalha o cocktail anestésico sugerido, quetamina-medetomidina-acepromazina (1 ". KMA "). A Figura 1 representa um microeléctrodo de tungsténio, preparado para a gravação. A figura 2 contém um diagrama de circuito para uma unidade de controlo simples LED. A Figura 3 contém o código de configuração e para modular a saída de luz com um microcontrolador Arduino. A Figura 4 mostra um exemplo de os artefatos elétricos induzida por luz discutido no Protocolo. Os artefatos são ocasionalmente encontrados (painel esquerdo), mas facilmente corrigido (painel direito). A Figura 5 mostra exemplos gravados a partir de três tipos de interneurônios identificados opticamente (PV +, CR +, e SOM +). O pa esquerdanel mostra traços de tensão cru e formas de onda alinhados, representante do tipo de sinal-para-ruído pode-se esperar obter com esta estratégia. Os picos são capturados de forma fiável com um limiar fixo de tensão de várias centenas de microvolts. Um gráfico raster (painel da direita) mostra a curta latência e confiabilidade das respostas claras evocadas, que permitem a identificação inequívoca dos interneurônios ChR2-positivos. A Figura 6 mostra tensão vestígios de três PV + interneurônios, respondendo a um pulso de luz de 1 seg. A maioria das células fotovoltaicas + pode sustentar-alta freqüência de disparo de centenas de milissegundos, tornando-as particularmente fácil de identificar.

A Figura 1
Figura 1. Preparar um eletrodo.   (A) Diagrama de um eletrodo preparado. O eletrodo é afixo para um tubo capilar de vidro, utilizando duas pequenas gotas de cola Super e uma quantidade mínima de acelerador (tais como Zap-It). Tubulação do psiquiatra de calor é adicionado para maior aderência, usando o calor muito baixo. Eletrodos são tipicamente enviados com uma. (B) Fotografia pinos pré-inscritos de microeletrodos de tungstênio preparado montado em um suporte do eletrodo.

A Figura 2
Figura 2. Esquema de circuito para uma unidade de controle de LED. Um circuito simples e barato para entrega luz. Um LED super-brilhante (475 nm) está ligado a um dissipador de calor e acoplado a outra extremidade de um cabo de fibra óptica (800 um de diâmetro). A saída do diodo emissor de luz está fechado com um impulso TTL. A unidade de controlo incorpora uma fonte de alimentação de modo de tensão para a intensidade de luz ajustável. 2K POT: potenciômetro para controlar a intensidade da luz. P / S: supp de energia DC ly (por exemplo, carregador de laptop). TIP 122: Darlington transistor. 4N35: isolador óptico. As peças listadas aqui custam <$ 10.

A Figura 3
Figura 3. Código e configuração Arduino. Um trem de pulsos TTL para modular a saída de luz pode ser gerado usando um microcontrolador Arduino. O programa especifica uma duração de pulso e ISI por um trem de pulsos looping. As instruções para carregar o programa na placa pode ser encontrada na página "Getting Started" do Arduino ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

igura 4 "fo: content-width =" "src =" 6 pol / files / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figura 4. artefato Luz eletrodos de metal são suscetíveis a artefatos de luz, presentes no início e no deslocamento de pulsos (painel esquerdo; sinal filtrado, 300 - 5000 Hz). Podem geralmente ser completamente eliminado (painel da direita) através do reposicionamento da fibra óptica relativa ao eléctrodo para mudar o ângulo da luz incidente, e / ou diminuindo a potência de luz.

A Figura 5
Figura 5. Exemplo células. (A) dos exemplos gravados típicas de interneurônios identificados opticamente, PV + (roxo), CR + (verde), SOM + (vermelho). As células respondem ao trem de busca de pulso (duração do pulso de 30 ms, 500 ms ISI), com uma explosão de confiança de spikes. O painel à direita mostra 100 pontos alinhados-cocho e. interpolados a forma de onda média (10x sobre-amostrado a partir de uma taxa de amostragem de 10 kHz) (B) parcelas Raster para os mesmos ficheiros de mostrar a latência curta (~ 2-5 mseg). temporização e consistente de picos de luz evocado (C) Média e desvio padrão das latências primeiro-pico (5-10 pulsos) para uma amostra de 44 PV + interneurônios (média média e desvio padrão: 3,4 +/- 2,6 ms). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 6
Figura 6. Exemplos de respostas sustentadas One pode ser especialmente confiante na identificação PV + interneurons como a maioria deles pode sustentar-alta freqüência de disparo de centenas de milissegundos -. Reminiscência de suas respostas à atualinjeção in vitro 14. Três células ChR2 / PV respondem a 1 segundo pulsos de luz: dois que disparam regularmente durante todo o período de duração do pulso, e um exemplo incomum de uma célula que não (<10% das células encontradas).

Tabela 1. Cetamina-Medetomidina-acepromazina ("KMA"). Knock-down e dose de manutenção de um rato adulto, diluído para manter a hidratação. O coquetel é re-administrada a cada 40-90 min, quando necessário.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Embora PINP é conceitualmente simples, ele pode ser um desafio na prática. Um dos principais determinantes do sucesso é a escolha do eletrodo. O raio de audição eléctrica é o parâmetro crítico. Ele deve ser suficientemente grande para detectar picos de luz evocado quando a ponta é ainda a certa distância a partir de uma célula ChR2 +, de modo que se pode ajustar a velocidade de avanço em conformidade. Ao mesmo tempo, deve ser restringido o suficiente para permitir um bom isolamento única unidade. Ou seja, o eletrodo não deve também pegar picos de vizinhos unidades ChR2-. Encontrar o equilíbrio certo em termos de raio de escuta será um desafio para qualquer tipo de célula-alvo, mas é especialmente verdadeiro para os interneurônios inibitórios, que são escassos, pequenos, e muitas vezes encontrados em estreita proximidade com piramidal células, o que que têm relativamente grande extracelular spikes. Mesmo usando as estratégias sugeridas aqui, o rendimento esperado não é alta. Nosso rendimento típico foi 0-2 PV + neurônios / animal, dada a nossa criteria de excelente isolamento única unidade e gravações com duração de mais de meia hora.

Quando PINPing neurônios inibitórios, disynaptic ativação (indireto) não é uma grande preocupação, porque os neurônios inibitórios são relativamente improvável que indiretamente ativar as células pós-sinápticas. Para PINPing neurônios excitatórios, ativação disynaptic é comum; muitos neurônios que disparam em resposta a luz não expressam ChR2, mas sim receber poderosa excitação sináptica daqueles que o fazem. Estratégias para directly- discriminador de neurónios indirectamente-activados são discutidos em detalhe em Lima et al. 1.

Considerações Eletrodo

Nós exploramos sistematicamente uma variedade de eletrodos e técnicas de gravação: pipetas de patch de vidro com pontas de tamanhos diferentes, variando em microeletrodos de tungstênio impedância e geometria da ponta, e arrays multi-canal (por exemplo, tetrodes). Angulares, de alta impedância microeletrodos de tungstênio(Como sugerido aqui) deu, de longe, o melhor rendimento. Uma discussão dos problemas encontrados com cada uma destas técnicas segue.

Usando matrizes tetrode baixa impedância e sondas multi-canal, que rotineiramente detectados picos de luz evocados; no entanto, eles eram raramente grande o suficiente para classificar de forma fiável. Em outras palavras, a relação sinal-para-ruído (SNR) não era satisfatória. Fizemos ocasionalmente obter excelentes gravações com tetrodes, mas o rendimento foi maior assintótica com microeletrodos de tungstênio individuais, bem como a qualidade das gravações era muito melhor. Dicas tetrodo são comparativamente sem corte, bem como, o que limitava o número total de possíveis penetrações por animal. Os problemas encontrados com o que as sondas multi-canal foram provavelmente agravada pelo uso de iluminação de superfície ampla. Ao contrário alvo, a estimulação de baixa potência a partir de uma fibra implantado, iluminação de superfície irá causar disparo síncrono em ChR2 + neurônios para além do local de gravação, levando a formas de onda de pico sobrepostosque são mais difíceis de classificar.

Eletrodos de patch de vidro, como os usados ​​para gravações ligado de células soltas padrão, também não foram bem adequada para a tarefa, mas por razões diferentes. Baixa resistência (<5 mohms) eletrodos patch são muito influenciadas pelas células piramidais, o que torna difícil atingir interneurônios inibitórios. Enquanto isso pode ser corrigido de alguma forma usando maior resistência (ponta menor) eletrodos, o maior problema com eletrodos de correção é o seu raio de audição extremamente restrito. Embora gravações de patch ligado de células fornecem uma SNR muito elevado, as células de luz que respondem não podem ser detectados do lado de fora de modo ligado à célula. A estratégia com eletrodos de patch é, inevitavelmente, ao acaso e sequencialmente obter gravações ligado à pilha, muito poucos dos quais são ChR2 expressando interneurônios inibitórios.

Com alta impedância eléctrodos de tungsténio pode-setanto detectar picos evocado-luz de distância, e alcançar um bom isolamento única unidade. A geometria da ponta é provavelmente o factor mais importante. Nós tentamos eléctrodos de tungsténio de dois fabricantes, com impedâncias que variam 2-14 mohms e ângulos de ponta 5-12 °. Descobrimos que 12 ° ângulos de ponta foram superiores, mas preciso que a impedância foi menos importante, dentro da gama de 7-14 mohms. Descobrimos que os eletrodos revestidos de vidro eram mais suscetíveis a artefatos de luz em comparação com eletrodos revestidos de epóxi, por isso recomendamos o último. Nós não tentar fazer nossos próprios eléctrodos de tungsténio personalizado. Como acontece com qualquer tipo de eletrodo, os modos comuns de falhas estão a perder o isolamento ou ferir um neurônio. Parâmetros de ponta diferentes não parecem ter muita influência sobre isso. Pelo contrário, espera para o tecido para resolver é o factor mais importante na manutenção da gravações de alta qualidade.

Entrega de Luz

Como a luz somente um é usadosa meios de identificação de células ChR2-positivos - mais do que regular sua produção de uma maneira específica - a gama de intensidades utilizáveis ​​para esta experiência é vasta. Um limite inferior é definido pelo facto de a intensidade deve ser suficiente para activar as células ChR2-positivos na profundidade máxima das suas células de interesse. Descobrimos que irradiâncias ponta> 5 mW / mm 2 (medido a 470 nm) foram suficientes para provocar respostas robustas do PV + células na camada profunda 6. irradiância em profundidades específicas dentro do cérebro pode ser estimada utilizando uma calculadora com base em medições diretas em mamíferos tecido cerebral (por exemplo, http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php ), mas recomendamos fortemente que determina o mínimo para suas próprias experiências empiricamente, utilizando um microeletrodo de baixa impedância (1 - 3 mohms, para a atividade multiunit). Um limite superior é definido pelo facto de elevada intensidades pode causar artefactos de luz, o que pode complicar a detecção de pontas evocadas. Em animais transgênicos, intensidades elevadas também podem causar artefatos eletromiográficas ativando ChR2 no PV exposta + muscular no pescoço e na cabeça.

Na construção de nosso próprio sistema de fornecimento de luz, descobrimos que um acoplamento de um LED para uma fibra óptica é, em última análise mais conveniente do que colocar o LED diretamente sobre o cérebro. Esta última é uma forma muito eficaz para proporcionar uma luz, mas tem alguns inconvenientes práticos. A corrente que flui através do dispositivo produz artefactos eléctricos que deve ser blindado, e o LED gera um calor considerável que deve ser dissipado com um dissipador de calor grande. Além disso, os artefatos leves (tanto fotovoltaicos e eletromiográficas) são muito mais difíceis de controlar com o amplo padrão de iluminação de LEDs. Acoplamento fibra resolve todos esses problemas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

KMA (20,0 ml)
2 ml de 100 mg / ml de cetamina (10 mg / ml, uma vez diluída)
0,4 ml de 1 mg / ml Dexdomitor (medetomidina; 0,02 mg / ml, uma vez diluída)
0,05 ml de 100 mg / ml de acepromazina (0,25 mg / ml, uma vez diluída)
17,55 ml de solução salina a 0,9%
Dosagem, rato adulto (15 - 40 g)
Knock-down: 0,012 ml / g * de massa corporal (Ketamina = 120 mg / kg)
Manutenção: 0,0025 ml / g de massa corporal * (= cetamina 25 mg / kg)
Name Company Catalog Number Comments
ChR2-EYFP Line Jackson Colonies 12569
Pvalb-iCre (PV) Line Jackson Colonies 8069
Sst-iCre (SOM) Line Jackson Colonies 13044
Cr-iCre (CR) Line Jackson Colonies 10774
Agarose Sigma-Aldrich A9793 Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook) FST 10066-15
Surgical Scissors FST 14084-09
Scalpel FST 10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment Foster & Smith 9N-76855
Homeothermic Blanket Harvard Apparatus 507220F
Tungsten Microelectrodes A-M Systems 577200 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing Warner Instruments G150TF-3
Heat Shrink Tubing DigiKey A332B-4-ND
Zapit Accelerator DVA SKU ZA/ZAA Use with standard Super Glue. 
Microelectrode AC Amplifier 1800 AM Systems 700000
MP-285 Motorized Micromanipulator Sutter MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes Tektronix TDS2000C
Powered Speakers Harman Model JBL Duet
Manual Manipulator Scientifica LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable ThorLabs FC/PC BFL37-800
Power Meter ThorLabs PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E DigiKey XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO DigiKey 1050-1024-ND

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
  2. Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
  3. Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
  4. Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
  5. Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
  6. Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
  7. Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
  8. Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
  9. Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
  10. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  11. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
  12. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  13. Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
  14. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats