Экс Vivo Препараты неповрежденной вомероназального органа и аксессуаров обонятельная луковица

1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Department of Anatomy and Neurobiology, Washington University in St. Louis
Published 8/04/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Мышь аксессуар обонятельная луковица (АОВ) было трудно изучать в контексте сенсорной кодирования. Здесь мы демонстрируем рассечение, который производит Экс Vivo препарат, в котором AOB нейроны остаются функционально связан с их периферийных входов, содействия научным исследованиям в обработке информации феромонов мыши и kairomones.

Cite this Article

Copy Citation

Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Мышь аксессуар обонятельная система (АОС) является специализированным сенсорная тропа для обнаружения энергонезависимые социальные запахи, феромоны и kairomones. Первый нейронной цепи в пути AOS, называется аксессуар обонятельная луковица (АОВ), играет важную роль в установлении секс-типичный поведения, такие как территориальной агрессии и спаривания. Этот небольшой (<1 мм 3) схема обладает способностью различать уникальные поведенческие состояния, такие как секс, процедить, и стресс от хемосенсорных киев в выделениями и экскрементами из сородичей. В то время как компактный организация этой системы представляет уникальные возможности для записи с большими участками цепи одновременно, исследование сенсорной обработки в АОБ остается сложной, во многом благодаря его экспериментально невыгодное расположение в мозгу. Здесь мы демонстрируем многоступенчатую рассечение, которое удаляет нетронутыми AOB в пределах одного полушария переднего черепа мыши, оставляя подключенияионы в обеих периферической вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs) и местного нейронной цепи нетронутыми. Процедура предоставляет поверхность AOB направить визуальный осмотр, облегчая электрофизиологических и оптические записи из элементов АОБ цепи в отсутствие анестетиков. После вставки тонкий канюли в вомероназального органа (ВНО), в котором находится VSNs, можно непосредственно подвергать периферию к социальным запахов и феромонов время записи вниз по течению активность в АОБ. Эта процедура позволяет контролируемых расследований AOS обработки информации, которые могут пролить свет на механизмы, связывающие феромона рисков в случае изменения поведения.

Introduction

Сенсорная обработка в мозге млекопитающих обычно занимает несколько взаимно соединенных-нейрональные цепи, каждая из которых извлекает особенности от сенсорного ввода. В сенсорных путей, рано обработки информации является жизненно важным для нормального восприятия и поведения. В принадлежностей обонятельной системы (AOS), аксессуар обонятельная луковица (АОВ) является основным нейронной цепи увязки сенсорную периферию для последующих структур, которые диктуют гормональный баланс 1,2, агрессию 3 и возбуждение 4. Таким образом, обработка информации в рамках этой схемы, тесно связана с изменениями в поведении животных.

Аксессуар обонятельная луковица находится у мышей и крыс в спинной / хвостовой / задней поверхности основного обонятельной луковице (MOB) под плотным, васкуляризации носовой пазухи. АОВ получает афферентный иннервации от аксонов периферических вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs), которые находятся в вомероназального органа (ВНО), маленькийл слепой состава трубки в передней морды чуть выше мягкого неба. Эти аксоны пересекают тонкий лист перегородки ткани на медиальной границе носовые проходы. Несколько исследований исследовали AOB нервные реакции к источникам AOS запахов (например, мыши мочи) в естественных условиях с использованием анестезированных мышей 5-7 или свободно-исследуя животных 8. Героическая наркозом в естественных условиях исследования, участвующих (а) tracheotomies для обеспечения глубокого наркоза и предотвращения аспирации жидкости стимулов 5-7, (б) стимуляции симпатической шейного ганглия 6 или прямой катетеризации вомероназального органа 5,7 ввести энергонезависимые запахи и (с) краниотомии с или без лобных абляции лепестков, чтобы электрода продвижение в АОБ 6. Пробудитесь / себя исследования 8-10 участвующие хирургической имплантации микродисков. В целом, эти экспериментальные парадигмы являются мощным, но крайне сложно и часто требует анестезии.

(экс естественных условиях) с некоторым успехом 11-15. Поскольку связи между ВНО и АОБ остаются на той же стороне, и потому, что по средней линии перегородки ткань может подвергаться воздействию кислородом superfusate в одном полушарии, мы стремились разработать такую ​​одного полушария Экс Vivo подход, чтобы изолировать эти структуры при сохранении их функциональную связь. Недавно мы преуспели в достижении этой цели 16. Этот препарат сохраняет обе VNO и АОВ в живых и функционально соединен, по крайней мере 4 - 6 ч, так как оба аксоны (вдоль средней линии мягкой ткани перегородки АОВ) и сравнительно мелкой <600 мкм особенности, которые доступны для орошали кислородом искусственную спинномозговую жидкость ( ACSF). Это ВНО-АОВ экс естественных подготовка позволяет введение контролируемой стимулы в ВНО через тонкий катетер, ипрямого визуального доступа к небольшой АОБ для целенаправленной размещения электродов и / или живой флуоресцентной микроскопии. Этот способ является предпочтительным, если кто-то желает изучать эти схемы в отсутствие анестезии. Поскольку такой подход разрывает центробежные связи, он не очень хорошо подходит для расследований центробежной модуляции функции АОБ. ВНО-АОВ экс естественных подготовка трудно учиться, но как только достигнут производит надежную платформу, на которой по расследованию организации цепи, обработки информации и нейронной пластичности в этой мощной сенсорной цепи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Юго-Западного институционального комитета UT уходу и использованию животных на, и были выбраны таким образом, чтобы свести к минимуму стресс, дискомфорт и боли, испытываемой экспериментальных животных.

1. Вскрытие палата

Пользовательский рассечение камера и небольшой, тонкий пластик доска необходимы для достижения наилучших результатов (рис. 1). Построить или получить такую ​​камеру заранее пытается этот протокол.

2. Препарирование Решения

  1. Подготовка 1 л стандартной искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) для использования в шагах 3.22-5.4. Добавить NaCl 125 мм, KCl 2,5 мм, CaCl 2 2 мм, MgCl 2 1 мм, NaHCO 3 25 мм, NaH 2 PO 4 1,25 мм, мио-инозитол 3 мм, пируват натрия 2 мм, аскорбат натрия 0,4 мм, и глюкозы 25 мМ до 1 л пирогенов воды.
  2. Подготовка начальное рассечение ACSF (200 мл) в течениеиспользовать в шагах 3.3-3.22. Возьмите 200 мл Standard ACSF и повысить концентрацию MgCl 2 по 9 мм, добавив 0,366 г MgCl 2 гексагидратом.
  3. Приготовьте раствор стандартного Рингера нести стимулы к ВНО через канюли для использования на этапах 4.11-5.4 содержащей NaCl 115 мм, KCl, 5 мм, CaCl 2, 2 мм, MgCl 2, 2 мм, NaHCO 3 25 мм, HEPES 10 мм, глюкоза 10 мм.
  4. Пузырь 0.8 л стандартной ACSF и 0,5 л Рингера с 95% О 2, 5% СО 2 газа в бане 37 ° С на водяной течение как минимум 15 мин до использования.
  5. Пузырь в 200 мл исходной рассечение ACSF с 95% O 2, 5% СО 2 газ на льду в течение 15-20 мин, пока не достигнет 4 ° С.

3. Первичная Рассечение

  1. Подготовьте область рассечение. Поместите три блюда 35 мм Петри, кислородом ACSF, обезглавливающий ножницы, изогнутые рассекает ножницы, прямые рассечения ножницы, Adson щипцы, с # 11 головыэль лезвие и ручка и лезвие на льду.
  2. После кислородом ACSF остынет до 4 ° С, глубоко обезболить животное в высыхания камеры, используя 2-5 мл Isothesia (99,9% изофлуораном). Выполните хвост и ноги тесты прижимные для обеспечения животное глубоко под наркозом.
  3. После того, как глубоко анестезия подтвердил, обезглавить животное и немедленно поместить голову в чашке Петри, заполненной охлажденной рассечение ACSF. ПРИМЕЧАНИЕ: Погрузите ткань в охлажденной рассечение ACSF чтобы держать его прохладным на протяжении всей процедуры, когда он не используется.
  4. Снимите нижнюю аспект (вентральной глотки, нижней челюсти и языка) с изогнутыми ножницами.
  5. Использование Adson щипцов deglove (корки) поверхностную кожу и мышечные вложения из черепа. Пил кожу головы от хвостового чтобы ростральнее пока единственный месте прикрепления не закончится передних зубов. Разрежьте ткань в точке крепления с помощью изогнутой ножницы. Удалить глаза, держа его пинцетом и вытащить его от подготовки. Nухо конец скальпирующий процедуры избежать избыточного усилие на деликатной носового хряща с помощью щипцов Adson к свободным вложений мускулатуры из верхних челюстных костей. ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите кожу головы от каудальной части черепа с прямыми ножницами.
  6. С прямыми ножницами, сократить среднюю линию черепа из каудальнее ростральнее пока кончики ножницами не несколько миллиметров в лобных костей (только до начала носовой пазухи).
  7. Снимите теменной и лобной кости черепа, используя Adson щипцов. ПРИМЕЧАНИЕ: Кусочки лобной кости часто остаются прикрепленными к носовых костей хвостовых к носовой пазухи. Удалить эти куски с осторожностью, принятые не связываться обонятельные луковицы.
  8. Используйте скальпель, чтобы сделать корональной разрез через лобной доли 2 мм каудально пазух, а затем удалить хвостового мозга, чтобы разреза. Убедитесь, что кончик скальпеля контактов костлявая контурных вентральной черепа, чтобы полностью разорвать заднюю ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяетудаление большинства мозга, не подвергая механической нагрузки на боковых обонятельных путей или обонятельных луковиц.
  9. Удалить открытые каудальные аспекты брюшной черепа с прямыми ножницами. Оставьте пазух и оставшиеся нервную ткань.
  10. Удалить скуловой дуги и мышцы лица на анатомической правой стороне черепа, используя прямые ножницы
  11. Поверните морду над (вентральной стороной вверх), чтобы выставить на крышу рта.
  12. Отрежьте неба сразу каудальнее резцов. Сделайте это, вставив кончик лезвие скальпеля под неба параллельно крыше рот, а затем перейти лезвие к резцов.
  13. Возьмитесь за освобождения (ростральной) край небе с Adson пинцетом и удалить, потянув каудально.
  14. На анатомической левой стороне черепа, используйте лезвие скальпеля расширить небные отверстия каудально, начиная от небольших отверстия вблизи коренных зубов. Достижение это, вставив кончик скальпеля бладе в пустоту возле моляров и поворачивать запястье руки. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, чтобы использовать только кончик лезвия - глубокий вырез может повредить перегородки ткани.
  15. Использование кончик лезвие скальпеля, вырезанные из небных отверстия через резцов, начиная ростральнее анатомической левой вомероназального органа. Использование нескольких сокращений скоринга. Не повредите перегородки ткани и вомероназальных нервы, вставив лезвие слишком глубоко.
  16. Поверните ткань так спинной череп стороной вверх, а затем ориентировать прямой лезвие вертикально (параллельно к средней линии) на хвостовом краю подготовки.
  17. В брюшного края ткани, прикоснуться режущую кромку лезвия бритвы сразу слева от средней линии. Осторожно покачайте лезвие и двигаться вдоль левого небных отверстия (вырезать область, введенный в шаге 3.14).
  18. В спинном краю ткани, поместить режущую кромку бритвы непосредственно слева от средней линии (менее 1 мм).
  19. Хранениелезвие параллельно средней линии, раскачивать лезвие медленно с давлением по направлению к передней части ткани. Обратите внимание, сопротивление на решетчатой ​​пластине. Немедленно прекратите после пробития этого сопротивления. Примечание: В этой точке, правое полушарие ослаблен от левого полушария. Единственный оставшийся связь между полушариями вдоль спинной рыла передней к решетчатой ​​пластине.
  20. Отделите полушария, держа их рядом каудальных сторон в перчатках пальцы и осторожно вращая их в стороны и вперед. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является источником экспериментальной изменчивости, особенно у мышей с наклонных или хрупких мордами (например, старые мыши). Кроме того, при попытке повернуть полушария друг от друга, если сильное сопротивление встречается забить спинной морду (переднюю к решетчатой ​​пластине), чтобы ослабить соединительной ткани. Делая это, принять крайнюю осторожность, чтобы не вставить скальпель глубоко, что может привести к повреждению перегородки тиСГУП и вомероназальные нервы.
  21. Нанесите небольшое количество (50-100 мкл) ткани клеем к доске и аккуратно разместить боковой край правого полушария на клей с помощью щипцов Adson. Удаление избытка влаги с боковой стороны препарата, используя бумажное полотенце, чтобы предотвратить преждевременное клей полимеризации и свободную адгезию к доске. ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите несколько капель охлажденной рассечение ACSF на образец для ускорения клей полимеризации после ткани помещают на клей. Это гарантирует, что ткань остается плотно, удерживаемые до доски.
  22. Поместите небольшое количество (диаметр 3-5 мм, глубокий 2 мм) вакуумной смазки в середине вторичного вскрытия камеры и поместить на сторону доски напротив ткани прочно против смазки. Сразу заполнить рассечение камеру с охлажденной рассечение ACSF, трансфер в тонкой области рассечение и начать перфузии с кислородом стандартной ACSF. Расположите доску таким образом, чтобы обонятельная луковица находится непосредственно впоток недавно окисленной стандартной ACSF.

4. Вторичный Рассечение

  1. Удалите все видимые контралатеральный (слева) обонятельной луковицы или ткани коры от подготовки с использованием тонких щипцов. Зажмите вместе тонкий пинцет (образующие полу тупой точку), а затем поместить его в спинной и хвостовой части ткани вблизи средней линии. Аккуратно запустить ущипнул щипцы вдоль средней линии, пилинг ткани от правого полушария медленно в движении передней. Удалите все противоположной ткани, в том числе противоположной обонятельной луковицы ткани. Проявляйте особую осторожность, чтобы не ударить через ткань, которая может привести к повреждению АОБ или вомероназального нерва.
  2. Соблюдайте белый твердую мозговую оболочку вдоль спинной / медиальной поверхности обонятельной луковице. Снести этот твердую мозговую оболочку вдоль спинной / хвостового края обонятельной луковице, держа в белоснежной части твердой мозговой оболочки с двумя парами тонких щипцов и тянуть их от этой точки. Твердая мозговая плотнообернутые вокруг обонятельных луковиц, и может легко сам срез ткани во время ее удалить. Избегайте повреждения медиальной поверхности обонятельной луковице и самой АОБ. ПРИМЕЧАНИЕ: Если длительность сопротивляется разрыву легко в этот момент, ввести небольшой разрез с прекрасными подсказка весны рассечение ножницами, чтобы облегчить отделение.
  3. Медленно и осторожно удаляйте лобной коры с тонким пинцетом, не повреждая основные обонятельные луковицы. Соблюдайте коллекцию кровеносных сосудов, входящих в полупрозрачной сеткой сразу хвостового к АОБ. Удалить эту сеть с тонким пинцетом для облегчения проникновения электрода в электрофизиологических экспериментах. Возьмитесь за вычетом щипцами, как она отделяется от АОБ во фронтальной коре втягивания и снимите ее, потянув каудально и медиально, стараясь не прикасаться к AOB. После того, как лобная кора была отделена от обонятельных луковиц, удалить его, сокращая щипцами вентральной и задней на АОВ. ПРИМЕЧАНИЕ: Примите эксTreme уход с чистой удаления, потому что если это делается слишком грубо клубочковой слой может быть поврежден.
  4. В открытой противоположной носовой полости, удалите оставшуюся контралатеральный перегородки ткани (надуманные желтовато лист, содержащий кровеносные сосуды), используя тонкий пинцет. Возьмитесь за ткань на области хвостовой / спинной (около перегородки кости), а затем потяните / снять ткань к передней стороне. ПРИМЕЧАНИЕ: контралатеральный перегородки ткань может быть случайно удалены во время стадии гемисекции (этап 3.20). В таком случае, наблюдать белый, аваскулярный перегородки хряща и слегка прозрачный, васкуляризованной перегородки кости. Если это так, шаг 4,4 может быть пропущен.
  5. Осторожно снимите контралатеральный ВНО, запустив одну точку из тонких щипцов между перегородки хряща и ВНО "крыло" (тонкий кусок костной ткани, который проходит вдоль верхнего края как ВНО.
    1. После крыла отрыва от хряща, переместите кончик пинцетом вентральнов противоположную VNO вблизи средней линии. Повторите этот шаг в нескольких местах вдоль ростральной / хвостового оси противоположной ВНО, чтобы ослабить его, что позволяет ему быть удалены путем захвата пинцетом и подъема далеко.
  6. Подготовка к отключению перегородки хряща, сделав разрез в брюшной / хвостового края (где она сужается до белого аваскулярного работающем полосы вдоль брюшного края перегородки кости) с тонким пинцетом.
  7. Снимите перегородки хряща, зажимая вместе тонкий пинцет, чтобы сделать полу тупой точку. Определить разрез сделали в шаге 4.6, вставьте ущипнул щипцы позади (боковой) с этой разреза, а затем медленно поднимите хрящ от перегородки ткани и исходя рострально. ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушить основной перегородки ткани. Как хрящ поднимается, наблюдать за основной лист перегородки ткани стрейч из-за сыпучих спаек в хряще. Периодическая, нежный, и стабильный движение ущипнул тонким пинцетом вдоль этого участка потерятьdhesion может значительно облегчить успешное разделение двух структур.
  8. Используйте пару # 3 пинцетом с загнутым кончиком, чтобы удалить перегородки кости. Подход перегородки кости под углом почти параллельно плоскости перегородки кости. Вставьте изогнутый зуб между перегородки ткани и перегородки кости. Возьмитесь за кость пинцетом и аккуратно переместить кость назад и вперед, пока она трещин вблизи решетчатой ​​пластине. ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, перегородки кости будут сопротивляться нарушая рядом с решетчатой ​​пластиной. В этом случае, используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно забить перегородки кости вдоль спинной / вентральной оси просто впереди на решетчатой ​​пластине, а затем повторите шаг 4,8.
  9. Удалите белую хрящ просто ростральная к ВНО, зажимая с одной парой тонких щипцов у входа и потянув рострально с другим пинцета.
  10. Прикрепите полиимидную канюли для быстрой перфузии устройство и запустите поток раствора Рингера (0,1-0,3 мл / мин) через полиимидной канюли.ПРИМЕЧАНИЕ: Расход Мера с в линию, расходомера малого объема. Использование компьютерным управлением переключающего устройства пневматические стимулом уменьшает изменения расхода во время стимуляции. Сравните нервные реакции, чтобы проверить стимулы с ответами на макет стимула (контролировать раствор Рингера) для обеспечения ответы стимул конкретным.
  11. Сориентируйте канюли параллельно входа ВНО. Когда канюля удовлетворительно параллельно к входу VNO, смотреть, как давление на выходе приводит к VNO "надуть", что приводит к эвакуации кровеносного сосуда. Сразу вставить канюлю в VNO, сохраняя угол постоянной канюли таким образом, что она остается параллельно с открытием VNO. ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно провести канюли с одной парой тонких щипцов против пластиковой доски и использовать другую пару тонких щипцов для угла конец канюли немного вверх. Если случайно помещает канюли за ВНО, отток может также вызвать ВНО кровеносного сосудаэвакуировать, что приводит к впечатлению надлежащий катетеризация была выполнена. Правильное расположение может быть подтверждено путем включения краситель в растворе Рингера. Когда канюля установлена ​​правильно, краситель должен только выход через вход VNO. Кроме того, можно утверждать, правильное размещение, гарантируя, что канюля хорошо просматривается через полупрозрачной медиальной части ВНО.
  12. Перемещение пластиковую доску медленно, пока АОВ не находится в прямой поток стандартного ACSF, стараясь не выбить канюли от ВНО. Рассечение является полной и оценка физиологической функции может начаться немедленно. Шаг 5 кратко описывает один подход для принятия такой оценки.

5. Оценка

  1. Проникают в поверхность АОВ с 2-4 МОм боросиликатного стекла микроэлектрода, прикрепленной к внеклеточной усилителя и осциллографа.
  2. Медленно микроэлектрода на глубину 100-200 мкм отповерхность со скоростью 50 мкм / мин. ПРИМЕЧАНИЕ: На этой глубине ткани, один столкнетесь случайные спонтанные действия потенциальных сигналов, примерами которых острыми, краткие (~ 1-2 мс) отклонений в напряжении микроэлектродной.
  3. После столкновения потенциал действия сигнала, остановить продвижение микроэлектрод.
  4. Заметим, и / или записи потенциальную скорость действий при изменении доставки стимул раствора из контроль Рингера к известному активатора VSN активность (например, раствор Рингера, содержащем 50 мМ KCl). Если рассечение было успешным, изменение стимул-зависимой в потенциальной скорости действий или потенциала локального поля можно наблюдать. Примечание: Не все AOB нейроны будет реагировать на любой раздражитель с увеличением скорости стрельбы (включая раствор Рингера, содержащем 50 мМ KCl). Стимул-зависимой снижение скорости стрельбы также указывает функциональную связь и успешный рассечение. В случае, когда два или больше нейронов, которые встречаютсяне реагируют на ВНО стимуляции, или если нет потенциалы действия не наблюдается после нескольких проникновений электродами, это говорит о том неудачную рассечение. Если это так, то новый рассечение может быть инициирована на шаге 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Достижение успеха с этим препаратом занимает обширную практику, и имеет несколько этапов, на которой он может потерпеть неудачу. Следует ожидать, требовать много попыток, прежде чем добиться успеха. Обычай рассечение камера необходима для успешного завершения этого протокола, и должны быть получены до начала более поздние стадии вскрытия. Конструкция камеры представлены на рисунке 1 является достаточным для этой цели, и может быть изготовлена ​​из относительно недорогих пластиков с минимальными требований обработки. Если не хватает потенциала для создания такого камеру, местные или интернет-компаний обрабатывающие можно ознакомиться и можно построить камеру за отдельную плату.

Большая источник изменчивости по подготовке плотность и хрупкость костей черепа и морды подопытных животных. Во время шагов гемисекции (шаги 3,14-3,20), цель изолировать обе вомероназальных органы наряду с ипсилатеральном перегородки ткани иипсилатеральная аксессуар обонятельная луковица. Тем не менее, это не редкость для перегородки ткани остаются прикрепленными к противоположной полушарии, особенно вблизи точки крепления к спинной кости рыла. Рисунок 2 показывает пример эффективной и неэффективной гемисекции.

Другие общие возникать ошибки во время рассечение тонкой диссекции, в течение которого аксоны вомероназального нерва могут быть повреждены в ткани вблизи перегородки вомероназального органа (фиг.3А и 3В) или вблизи АОВ (фиг. 3С и 3D). Эти и подобные мероприятия будут привести к неполному связи между VSNs и АОБ, оказание препараты непригодными для использования.

Последнее препятствие к успеху подготовке является катетеризация шаг ВНО (Шаг 4,11). Правильное размещение канюли VNO приведет к герметизации просвета VNO, в результате чего немедленное изгнание остаточная кровь из вомероназального насоса. Канюли должна быть четко видны под относительно прозрачной вомероназального эпителия и появление канюли должна быть однородной по всей его длине внутри VNO. После успешного завершения процедуры, можно убедиться, функциональную связь с использованием физиологического анализа, таких как единое целое электрофизиологических записей нейронной активности в ответ на ВНО стимуляции с известным источником ВСН пахучих веществ (рис. 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. A) Инженерные чертежи на заказ рассечение камере используется на этапах 3.22-5.4. ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие отверстия могут быть просверлены для размещения решения и газообразования входы и выходы как лучшего B) Пример фотографии вскрытия камеры, используемой в этом протоколе.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. A, B) Типичные изображения успешной (а) и неудачные (B) препараты после стадии гемисекции (Шаг 3,20). ВНО, перегородки ткани, и обонятельные луковицы (ОВ) все должны быть сохранены от ипсилатеральном полушарии (в данном случае, право (внизу) полушарии. Если видны на ипсилатеральной полушарии носовых раковин, рассечение не удалось. Деления являются 1 мм друг от друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

d/51813/51813fig3highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 3. A, B) Типичные изображения неповрежденной и поврежденной перегородки ткани между ВНО и АОБ. В В, острый пинцет сделал случайного контакта с тканью, повреждая В.Н. аксонов трактаты. C, D) Интактные и поврежденные AOBS. В D, удаление твердой мозговой оболочки, окружающей ипсилатеральную OB привело отсечения вомероназального нерв возле АОБ, вызывая видимых каплю ткани около медиальной АОБ. Масштабные бары 1 мм в длину.

Рисунок 4
Рисунок 4.) Пример растровых участок потенциалов действия, записанных от АОВ нейрона (внеклеточный записи единое целое) в успешной подготовки. Следы в черном шоу никаких изменений в скорострельность при контрольного раствора Рингера был доставлен в ВНО в течение 5 сек (серый ббык). Следы в красном шоу ответ того же нейрона к стимуляции VNO линии BALB / C женской моче мышей разводили в 100 раз в солевом растворе. B Рингера) пери-стимул временной гистограммы из тех же самых реакций в. Планки погрешностей представляют стандартные ошибки среднего значения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ВНО-АОВ экс естественных получение описано в данном протоколе является полезной альтернативой наркозом в естественных условиях 5-7 и острой живой срез 17 экспериментов функции АОБ. В отличие от острых опытах АОВ срезов, которые также подвергнуть элементы схемы для электрофизиологических и оптических записей, этот препарат сохраняет все сенсорные афференты и внутри-AOB соединения. Хотя это также можно сказать и о наркозом в естественных подходов, наличие анестетиков обязательно изменяет нейронные функции, а именно возбуждающую / тормозящее баланс, который имеет решающее значение для обработки информации в этой и других обонятельных схем 18. Поскольку препарат позволяет избежать использования анестетиков, а потому, что поверхность АОВ полностью подвержены superfusate, это поддаются фармакологических запросов в локальной нейронной обработки.

Существуют, конечно, некоторые ограничения этого препарата. Существует евidence для постепенного вырождения самых глубоких АОБ слоев, а именно глубоких частях внутреннего слоя клеток, в котором находится много ингибирующие зернистых клеток 16. Кроме того, центробежные входы разорваны во время вскрытия, исключая их из активного участия в функции АОБ. Канюли в VNO обходит нормальный действие вомероназального насоса и смывает эндогенные жидкостей, присутствующих в просвете VNO.

Критические шаги в достижении успеха с помощью этого метода являются деликатный гемисекция (Шаг 3,20) и ВНО катетеризация (Шаг 4.11). Можно ожидать, требовать обширную практику, чтобы надежно производить функционально-связанных Экс Vivo препараты. Вторичный рассечение камера используется здесь, могут быть использованы для оценки функционального соединения с помощью одного электрода записи во время стимуляции VNO с источниками феромонов мыши (например, разбавленной мочи). 13,15 Модификации вторичного вскрытия камеры можно бе отмечено, что позволит подготовка к повернут в углах, пригодных для других целей, таких как визуализации многофотонной.

Многие технические препятствия к изучению живой AOB уже давно поставил барьер для нашего понимания социальной запахом и феромонов сенсорной обработки. По рассечения от самых ранних нервные компоненты этой сенсорной пути в этом протоколе вскрытия, человек способен получить экспериментальную доступ к этим труднодоступных исследования цепей. Мы использовали этот препарат для подробных расследований вомероназального сенсорной обработки 19 и сенсорной отображения (Hammen соавт., Не опубликовано). Эта техника будет полезным для будущих исследований в сенсорной обработки в АОБ, особенно тех, которые требуют оптического доступа к ткани (например, изображений многофотонном и Optogenetics). Преимущества этого подхода дополняют мероприятия естественных условиях подходов в, и улучшить наше инструментарий для исследования нейронных механизмов вомероназального опосредованного таксоциальной и репродуктивное поведение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких существенных конфликтов интересов раскрывать.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) и запуска средств UT Юго-Западного (JPM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight Scissors Fine Science Tools 14002-14
Fine Scissors-Straight Fine Science Tools 14060-10
Fine Scissors-Curved Fine Science Tools 14061-10
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Scalpel Blades Fisher Scientific 3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades Fisher Scientific 12-640
35 mm Petri Dish Fisher Scientific 08-772-21
Dissection Chamber Custom  N/A See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm Custom  N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease Fisher Scientific 146355D
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip Fine Science Tools 11295-10
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
1/16" Male Luer Cole-Parmer EW-45505-00
1/16" Tubing Fisher Scientific 14-171-129
Two ton epoxy Grainger 5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit AutoMate Scientific 09-16
ValveLink digital/manual controller AutoMate Scientific 01-18
NaCl Sigma-Aldrich various
KCl Sigma-Aldrich various
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich various
MgCl2 hexahydrate Sigma-Aldrich various
NaHCO3 Sigma-Aldrich various
NaH2PO4 Sigma-Aldrich various
myo-inositol Sigma-Aldrich various
Na-pyruvate Sigma-Aldrich various
Na-ascorbate Sigma-Aldrich various
HEPES buffer Sigma-Aldrich various
Glucose Sigma-Aldrich various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
  2. Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
  3. Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
  4. Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
  5. Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
  6. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
  7. Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
  8. Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
  9. Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
  10. Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
  11. Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
  12. Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
  13. Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
  14. Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
  15. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  16. Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
  17. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  18. Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
  19. Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats