Ex vivo Tilberedninger af den intakte Vomeronasal orgel og tilbehør lugtekolben

1Department of Neuroscience, UT Southwestern Medical Center, 2Department of Anatomy and Neurobiology, Washington University in St. Louis
Published 8/04/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Musen tilbehør lugtekolben (AOB) har været vanskeligt at studere i forbindelse med sensoriske kodning. Her viser vi en dissektion, der producerer en ex vivo præparat, hvori AOB neuroner forbliver funktionelt forbundet til deres perifere indgange, lette forskning i behandling af oplysninger af muse feromoner og kairomones.

Cite this Article

Copy Citation

Doyle, W. I., Hammen, G. F., Meeks, J. P. Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb. J. Vis. Exp. (90), e51813, doi:10.3791/51813 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Musen tilbehør olfaktoriske system (AOS) er en specialiseret sensorisk vej til påvisning af ikke-flygtige sociale lugte, feromoner og kairomones. Den første neurale kredsløb i AOS vej, kaldet tilbehøret lugtekolben (AOB), spiller en vigtig rolle i etableringen af ​​sex-typiske adfærd, såsom territorial aggression og parring. Denne lille (<1 mm 3) kredsløb besidder evnen til at skelne mellem unikke adfærdsmæssige tilstande, såsom køn, stamme, og stress fra chemosensory signaler i sekreter og ekskreter fra artsfæller. Mens den kompakte organisation af denne ordning giver unikke muligheder for optagelse fra store dele af kredsløbet samtidig efterforskning af sensorisk forarbejdning i AOB stadig en udfordring, hovedsagelig på grund af sin eksperimentelt ufordelagtig placering i hjernen. Her viser vi en etapevis dissektion, der fjerner den intakte AOB i en enkelt halvkugle af den forreste mus kraniet, så tilslutioner til både de perifere vomeronasal sensoriske neuroner (VSNs) og lokale neuronal kredsløb intakte. Proceduren udsætter AOB overflade til direkte visuel inspektion, lette elektrofysiologiske og optiske optagelser fra AOB kredsløbselementer i fravær af bedøvelsesmidler. Ved at indsætte en tynd kanyle ind i den vomeronasal Organ (VON), som huser VSNs, kan man direkte udsætte periferien til sociale lugte og feromoner, mens du optager nedstrøms aktivitet i AOB. Denne procedure gør det muligt for kontrollerede undersøgelser AOS informationsbehandling, der kan kaste lys over mekanismer, der forbinder feromon eksponering over for ændringer i adfærd.

Introduction

Sensorisk forarbejdning i pattedyrs hjerne typisk strækker sig over flere gensidigt forbundne neuronale kredsløb, som hver udtrækker særlige kendetegn fra sanseindtryk. I følenerverne, tidlig informationsbehandling er afgørende for normal perception og adfærd. I tilbehøret olfaktoriske system (AOS), tilbehøret lugtekolben (AOB) er den primære neurale kredsløb, der forbinder den sensoriske periferien til downstream strukturer, der dikterer hormonbalance 1,2, aggression 3 og ophidselse 4.. Som sådan er informationsbehandling inden for denne kreds stærkt knyttet til ændringer i dyrs adfærd.

Tilbehøret lugtekolben ligger i mus og rotter ved den dorsale / caudale / posteriore aspekt af de vigtigste lugtekolben (MOB) under den tætte, vaskulariseret rhinal sinus. Den Eventuelt modtager afferente innervation fra axoner på perifer vomeronasal sensoriske neuroner (VSNs), der bor i vomeronasal Organ (VON), en lilll blind-ended rør i den forreste snude lige over den bløde gane. Disse axoner krydse sarte ark septal væv ved den mediale grænse af den nasale passager. Adskillige undersøgelser har aftestede AOB neurale reaktioner på kilder AOS lugte (såsom mus urin) in vivo ved hjælp af bedøvede mus 5-7 eller frit udforske dyr 8. Den heroiske bedøvet in vivo studier involverede (a) tracheotomies at sikre dyb anæstesi og forhindre maveindhold stimuli 5-7, (b) stimulering af det sympatiske cervikale ganglion 6 eller direkte kanylering af vomeronasal orgel 5,7 for at indføre ikke-flygtige lugt og (c) craniotomies med eller uden frontallappen ablations at tillade elektrode avancement i AOB 6. Awake / opfører undersøgelser 8-10 involveret kirurgisk implantation af et mikrodrev. I sum, disse eksperimentelle paradigmer er kraftfuld, men yderst vanskelig og kræver ofte anæstesi.

(ex vivo) med en vis succes 11-15. Fordi forbindelserne mellem VNO og AOB forblive ipsilateral, og fordi midterlinjen septal væv kan blive udsat for iltet superfusate i en enkelt halvkugle, vi søgt at udvikle en sådan enkelt-halvkugle ex vivo metode til at isolere disse strukturer og samtidig bevare deres funktionelle tilslutningsmuligheder. Vi har for nylig lykkedes at nå dette mål 16. Dette præparat holder både VNO og AOB live og funktionelt forbundet til på mindst 4 - 6 timer, fordi begge axoner (langs midterlinjen blødt septal væv) og AOB er forholdsvis lavvandet <600 um funktioner, der er tilgængelige for superfusioneret iltet kunstig cerebrospinalvæske ( aCSF). Dette VNO-Eventuelt ex vivo forberedelse tillader introduktion af kontrollerede stimuli i VNO via en tynd kanyle, ogdirekte visuel adgang til den lille AOB for målrettet elektrode placering og / eller live fluorescens mikroskopi. Denne metode er fordelagtig, hvis man ønsker at studere disse kredsløb i fravær af anæstetika. Fordi denne fremgangsmåde skærer centrifugal-forbindelser, er det ikke velegnet til undersøgelser af centrifugal modulering af AOB funktion. VNO-Eventuelt ex vivo forberedelse er svært at lære, men når nået producerer en pålidelig platform, som man kan undersøge kredsløb organisation, informationsbehandling, og neurale plasticitet i denne kraftfulde sensoriske kredsløb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af UT Southwestern Institutional Animal Care og brug Udvalg, og blev valgt for at minimere stress, ubehag og smerter opleves af forsøgsdyr.

1.. Dissektion Chamber

En brugerdefineret dissektion kammer og små, tynde plastik planke er nødvendige for de bedste resultater (figur 1). Konstruere eller opnå en sådan afdeling på forhånd forsøger denne protokol.

2. Dissektion Solutions

  1. Forbered 1 L standard kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) til brug i trin 3,22-5,4. Tilføj NaCI 125 mM, KCI 2,5 mM, CaCI2 2 mM, MgCI2 1 mM, NaHCO3 25 mM, NaH 2 PO4 1.25 mM, myo-inositol 3 mM natriumpyruvat 2 mM, natriumascorbat 0,4 mM og glucose 25 mM til 1 liter pyrogenfrit vand.
  2. Forbered indledende dissektion aCSF (200 ml) forbrug i trin 3,3-3,22. Tag 200 ml Standard aCSF og hæve MgCl2 koncentrationen ved 9 mM ved tilsætning af 0,366 g MgCl2 hexahydrat.
  3. Forbered standard Ringers opløsning til at bære stimuli VNO gennem kanylen til brug i trin fra 4,11 til 5,4, der indeholder NaCl 115 mM, KCI 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2, 2 mM, NaHCO3 25 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM.
  4. Bubble 0,8 L standard aCSF og 0,5 L af Ringers med 95% O2, 5% CO 2-gas i et 37 ° C vandbad i mindst 15 minutter før brug.
  5. Bubble 200 ml oprindelige dissektion aCSF med 95% O2, 5% CO 2-gas på is i 15-20 minutter, indtil det når 4 ° C.

3.. Primær Dissektion

  1. Forbered dissektion området. Placer tre 35 mm petriskåle, iltet aCSF, decapitation saks, buede dissekere saks, lige dissekere saks, Adson pincet, en # 11 hovedbundel klinge og håndtag og et barberblad på is.
  2. Efter iltet aCSF er afkølet til 4 ° C, dybt bedøve dyret i en udtørring kammer ved hjælp af 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluoran). Udfør hale og fod knivspids tests for at sikre at dyret er dybt bedøvet.
  3. Når dyb anæstesi er bekræftet, halshugge dyret og straks placere hovedet i en petriskål fyldt med kølede dissektion aCSF. BEMÆRK: Fordyb vævet i kølede dissektion aCSF at holde det køligt hele proceduren, når den ikke er i brug.
  4. Fjern det nederste aspekt (ventrale svælg, underkæben og tungen) med en buet saks.
  5. Brug Adson pincet deglove (skræl) overfladiske hud og muskel vedhæftede filer fra kraniet. Skræl hovedbunden fra caudale til rostralt indtil det eneste sted for tilknytning er over fortænderne. Skær vævet ved den vedhæftede fil punkt ved hjælp af en buet saks. Fjern øjnene ved at tage fat i den med en pincet, og træk det væk fra præparatet. Nøre slutningen af ​​degloving procedure undgå overskydende kraft på sarte nasal brusk ved hjælp af Adson pincet til frie muskel vedhæftede filer fra overkæben knogler. BEMÆRK: Tag hovedbunden fra den caudale del af kraniet med lige saks.
  6. Med den lige saks, skære ned midterlinjen af ​​kraniet fra caudale til rostral indtil saks tips er et par mm ind i de frontale knogler (lige før rhinal sinus).
  7. Fjern parietale og frontale knogler i kraniet ved Adson pincet. BEMÆRK: Stykker af pandebenet vil ofte blive siddende på nasal knogler caudale til rhinal sinus. Fjern disse stykker med omhu ikke at kontakte de olfaktoriske pærer.
  8. Brug skalpel til at lave en koronale snit gennem frontallappen 2 mm caudale til bihulerne og derefter fjerne hjernen caudale til snittet. Sørg for spidsen af ​​skalpellen kontakter den benede kontur af den ventrale kraniet helt afskære den bageste væv. BEMÆRK: Dette gør det muligt forfjernelse af størstedelen af ​​hjernen uden at sætte mekaniske belastning af de laterale olfaktoriske skrifter eller olfaktoriske pærer.
  9. Fjern de udsatte caudale aspekter af ventrale kraniet med lige saks. Lad bihuler og resterende nervevæv.
  10. Fjern Kindbuen og ansigtsmusklerne på den anatomiske højre side af kraniet ved lige saks
  11. Drej snude derover (ventrale side op) for at afdække ganen.
  12. Klip og fjerne ganen umiddelbart caudale til fortænderne. Gør dette ved at indsætte spidsen af ​​skalpelblad under ganen parallelt med ganen og derefter flytte bladet mod fortænderne.
  13. Tag fat i befriet (rostral) kant ganen med Adson pincet og fjerne ved at trække caudally.
  14. På den anatomiske venstre side af kraniet, bruge skalpelblad at udvide Palatine foramen caudally, startende fra de små foramen nær kindtænder. Opnå dette ved at indsætte spidsen af ​​skalpel blabe ind i tomrummet nær kindtænder og dreje håndleddet. BEMÆRK: Brug ekstrem forsigtighed til kun at bruge spidsen af ​​bladet - en dyb udskæring kan beskadige septal væv.
  15. Brug spidsen af ​​skalpelbladets, skåret fra Palatinerhøjen foramen gennem fortænder, startende rostralt til den anatomiske venstre vomeronasal orgel. Brug flere scoring nedskæringer. Må ikke beskadige septal væv og vomeronasal nerver ved at indsætte bladet for dybt.
  16. Vend væv, så den dorsale kraniet vender opad, og derefter orientere straight barberblad lodret (parallelt med midterlinjen) på caudale kant af præparatet.
  17. På den ventrale kant af vævet, røre forkant med barberblad umiddelbart til venstre for midterlinjen. Vip forsigtigt kniven og bevæger sig langs venstre palatine foramen (afskårne region introduceret i trin 3.14).
  18. På den dorsale kant af vævet placere skæret af barbermaskine umiddelbart til venstre for midterlinjen (mindre end 1 mm).
  19. Føringbladet parallelt med midterlinjen rock barberblad langsomt med pres mod forreste af vævet. Bemærk modstanden på cribriform plade. Stands straks efter at bryde igennem denne modstand. BEMÆRK: På dette tidspunkt er den højre hjernehalvdel løsnes fra venstre hemisfære. Den eneste tilbageværende forbindelsen er mellem de halvkugler langs ryggens snude forreste til cribriform pladen.
  20. Adskil halvkugler ved at gribe dem i nærheden af ​​caudale sider med behandskede fingre og forsigtigt dreje dem sideværts og anteriort. BEMÆRK: Dette trin er en kilde til eksperimentel variabilitet, især i mus med devierede eller sprøde tryne (f.eks ældre mus). Også, mens forsøger at rotere halvkugler væk fra hinanden, hvis stærk modstand er stødt score dorsale snude (anterior til cribriform plade) svække bindevæv. Mens du gør det, tage ekstrem forsigtighed for ikke at indsætte skalpel dybt, hvilket kan beskadige septal tissue og vomeronasal nerver.
  21. Anvende en lille mængde (50-100 ul) af væv lim på planke og anbring forsigtigt den laterale kant af den højre hjernehalvdel på limen ved hjælp af Adson pincet. Overskydende fugt fjernes fra den laterale side af præparatet ved hjælp af en papirserviet for at forhindre præmatur lim polymerisation og løs vedhæftning til planke. BEMÆRK: Påfør et par dråber af den kølede dissektion aCSF på prøven for at fremskynde den lim polymerisation efter væv placeres på lim. Dette sikrer, at væv forbliver stramt holdt på planken.
  22. Placer en lille mængde (3-5 mm diameter, 2 mm dyb) af vakuum fedt i midten af ​​det sekundære dissektion kammer og placere den side af planken modsat vævet fast mod fedt. Umiddelbart udfylde dissektion kammer med kølet dissektion aCSF, overføres til den fine dissektion området og begynde perfusion med iltet standard aCSF. Vend planken, så lugtekolben er direkte istrøm af frisk oxygeneret standard aCSF.

4.. Sekundær Dissektion

  1. Fjern eventuel synlig kontralaterale (venstre) lugtekolben eller cortexvæv fra præparatet ved hjælp af fine tænger. Knib sammen de fine pincet (danner en semi stump punkt), og derefter placere den på ryg og caudale del af væv i nærheden af ​​midterlinjen. Forsigtigt køre klemte tang langs midterlinien, skrælning vævet væk fra den højre hjernehalvdel langsomt i forreste bevægelse. Fjern alle kontralaterale væv, herunder den kontralaterale lugtekolben væv. Vær meget forsigtig ikke at stikke gennem vævet, hvilket kan forårsage skader på AOB eller vomeronasal nerve.
  2. Overhold hvide dura mater langs ryggens / mediale overflade af lugtekolben. Riv denne dura mater langs ryggens / caudale kant lugtekolben ved at tage fat på de hvideste del af dura med to par fine tænger og trække dem væk fra dette punkt. Dura er tætviklet rundt olfaktoriske pærer, og kan nemt selv skære gennem væv, mens den bliver fjernet. Undgå skader på mediale overflade lugtekolben og AOB selv. BEMÆRK: Hvis dura modstår rive let på dette punkt, at indføre et lille snit med fine forår tip dissektion saks til at lette adskillelsen.
  3. Langsomt og forsigtigt skræl væk den frontale cortex med fin pincet uden at beskadige de underliggende olfaktoriske pærer. Overhold en samling af blodkar optræder som en semi-transparent net umiddelbart caudale til AOB. Fjern dette net med fine pincet til at lette elektrode indtrængen i elektrofysiologiske eksperimenter. Tag fat i nettet med en pincet, da det adskiller fra AOB under frontale cortex tilbagetrækning, og fjern den ved at trække caudally og medialt, være omhyggelig med ikke at røre ved AOB. Når den frontale cortex er blevet adskilt fra de olfaktoriske pærer, fjernes den ved at skære med en pincet ventrale og posteriore til AOB. BEMÆRK: Tag extreme forsigtig med netto fjernelse, for hvis det sker for omtrent den glomerulære lag kan blive beskadiget.
  4. I den udsatte kontralaterale næsehulen, fjerne enhver resterende kontralateral septal væv (spinkelt gullig blad indeholder blodkar) ved hjælp af fine tænger. Tag fat i vævet ved caudale / rygregionen (nær septal knogler), og træk / løft vævet mod den forreste side. BEMÆRK: kontralaterale septal væv kan uforvarende fjernes under hemisection trin (trin 3.20). I sådanne tilfælde iagttage en hvid, avascular septal brusk og den lidt gennemsigtige, vaskulariseret septal knogle. Hvis dette er tilfældet, kan Trin 4.4 springes over.
  5. Fjern forsigtigt kontralaterale VNO ved at køre et enkelt punkt af de fine pincet mellem septal brusk og VNO "fløj" (et tyndt stykke knoglevæv, der løber langs ryggens kant både VNOs.
    1. Efter fløj løsrivelse fra brusk, flytte spidsen af ​​tang ventralti den kontralaterale VNO nær midterlinjen. Gentag dette trin på flere steder langs den rostral / caudale akse af den kontralaterale VNO at løsne det, der gør det muligt at blive fjernet ved at tage fat med en pincet og løfte væk.
  6. Forbered dig på at fjerne septal brusk ved at lave et snit på den ventrale / caudale kant (hvor den indsnævres til en hvid avascular stribe løber langs den ventrale kant af septal knogle) med fine tænger.
  7. Fjern septal brusk ved at knibe sammen de fine pincet til at lave en semi stump punkt. Identificer snittet foretages i trin 4.6, skal du indsætte den sammenklemte pincet bag (lateral) til at klippe, og derefter langsomt løfte brusk væk fra septal væv og fortsætter rostrally. BEMÆRK: Du må ikke forstyrre den underliggende septal væv. Da brusk løftes, observere det underliggende ark septal væv strækning på grund af løs sammenvoksninger til brusk. En periodisk, blid og stabil bevægelse af klemt fine tænger langs denne stedet for løst etdhesion kan i høj grad lette vellykket adskillelse af de to strukturer.
  8. Brug et par af # 3 pincet med en bøjet spids til at fjerne septal knogle. Approach den septale knogle ved en vinkel næsten parallelt med planet af den septale knogle. Sæt den buede tand mellem den septale væv og septal knogle. Tag fat i knoglen med pincet og forsigtigt flytte knoglen og tilbage, indtil det revner nær cribriform plade. BEMÆRK: I nogle tilfælde vil det septal knogle modstå bryde nær cribriform plade. I dette tilfælde skal du bruge fin pincet til forsigtigt at score septal knogle langs ryggens / ventrale akse lige foran den cribriform plade, derefter gentage trin 4.8.
  9. Fjern den hvide brusk lige rostralt VNO ved at klemme med et par fine tænger ved indgangen og trække rostrally med et andet par af fine tænger.
  10. Fastgør polyimid kanyle til en hurtig perfusion enhed og starte strømmen af ​​Ringers opløsning (0,1-0,3 ml / min) gennem polyimid kanyle.OBS: Målt flow med et in-line, lille volumenstrømsapparat. Brug af computer styrede pneumatiske stimulus skifte enheden reducerer flow renteændringer i løbet af stimulation. Sammenlign neurale reaktioner til at teste stimuli med svar på en mock stimulus (styre Ringers opløsning) for at sikre svar er stimulus specifikke.
  11. Vend kanylen parallelt VNO indgangen. Når kanylen tilfredsstillende parallelt VNO indgangen, se som udløbstrykket forårsager VNO til "puste" fører til evakuering af blodkarret. Læg straks kanylen ind VNO, holde vinklen af ​​kanylen konstant, så at det er parallelt med VNO åbning. BEMÆRK: Det kan være nyttigt til at holde kanylen med et par fine tænger mod plast planke og bruge et andet par af fine tænger at vinkle ende af kanylen lidt opad. Hvis man uforvarende placerer kanylen bag VNO kan udstrømningen også forårsage VNO blodkarat evakuere, der fører til det indtryk, en passende kanyle blev udført. Korrekt placering kan bekræftes ved at inkorporere et farvestof i Ringers opløsning. Når kanylen er korrekt placeret, skal farvestoffet kun udrejse via VNO indgangen. Derudover kan man bekræfte korrekt placering ved at sikre, at kanylen er let synligt gennem den semi-transparente mediale aspekt af VNO.
  12. Flyt plastik planke langsomt, indtil AOB er i direkte strøm af standard aCSF, pas på ikke at fjerne kanylen fra VNO. Dissektion er komplet og vurdering af fysiologiske funktioner kan begynde med det samme. Trin 5 beskriver kort én tilgang til at gøre en sådan vurdering.

5.. Evaluering

  1. Trænge ind i overfladen af ​​AOB med 2-4 MOhm borsilikatglas mikroelektrode fastgjort til et ekstracellulært forstærker og oscilloskopet.
  2. Langsomt fremme mikroelektrode til en dybde på 100-200 um fraoverflade med en hastighed på 50 mM / min. BEMÆRK: På dette væv dybde, vil man støde lejlighedsvis spontan handling potentiale bølgeformer eksemplificeret ved skarpe, korte (~ 1-2 msek) nedbøjninger i mikroelektroden spænding.
  3. Efter oplevelsen af ​​en handling potentiale bølgeform, stop fremrykkende mikroelektroden.
  4. Observere og / eller optage handlingen potentielle vækst, mens du udskifter stimulus levering løsning fra kontrol Ringer til en kendt aktivator af VSN aktiviteter (f.eks Ringers opløsning indeholdende 50 mM KCL). Hvis dissektion var en succes, kan der observeres en stimulus-afhængig ændring i handling potentiale sats eller lokale potentiale felt. Bemærk: Ikke alle AOB neuroner vil reagere på hver stimulus med en stigning i skudhastighed (inklusive Ringers opløsning indeholdende 50 mM KCL). En stimulus-afhængig reduktion i skudhastighed indikerer også funktionelle tilslutningsmuligheder og en vellykket dissektion. I tilfælde af at to eller flere neuroner er stødt på, atreagerer ikke på VNO stimulation, eller hvis der ikke virkningspotentialer observeres efter multiple elektrode gennemføringer, dette tyder på en mislykket dissektion. Hvis dette er tilfældet, kan der indledes en ny dissektion på Trin 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

At opnå succes med dette præparat tager omfattende praksis, og har flere trin, hvor det kan mislykkes. Man skal forvente at kræve mange forsøg, før at opnå succes. Den brugerdefinerede dissektion kammer er nødvendig for en vellykket gennemførelse af denne protokol, og bør indhentes før start de senere faser af dissektion. Kammeret design vist i figur 1 er tilstrækkelig til dette formål, og kan være fremstillet af forholdsvis billige plastmaterialer med minimal bearbejdning krav. Hvis man mangler kapacitet til at producere en sådan afdeling, kan lokale eller online spåntagende virksomheder høres og kan konstruere kammeret for et gebyr.

En stor kilde til variation på tværs af forberedelserne er massefylden og sprødhed af knoglerne i kraniet og snude af forsøgsdyrene. Under hemisection trin (Steps 3,14-3,20), er målet at isolere både vomeronasale organer sammen med den ipsilaterale septal væv ogipsilateral tilbehør lugtekolben. Men det er ikke ualmindeligt 2 viser et eksempel på en effektiv og ineffektiv hemisection for den septale væv til at forblive fastgjort til den kontralaterale hemisfære, især i nærheden af fastgørelsespunkter til de dorsale knogler snuden. Figur.

Andre almindelige dissektion fejl opstå under den fine dissektion, hvor axoner af vomeronasal nerve kan blive beskadiget i den septale væv i nærheden af vomeronasal organ (figur 3A og 3B) eller i nærheden af AOB (figurerne 3C og 3D). Disse og lignende arrangementer vil resultere i ufuldstændig forbindelse mellem VSNs og AOB, rendering forberedelserne ubrugelig.

Den sidste hindring for forberedelse succes er VNO kanylering trin (Trin 4.11). Korrekt placering af VNO kanylen vil resultere i trykforøgelse på VNO lumen, der forårsager øjeblikkelig udvisning af resterende blod fra vomeronasal pumpen. Kanylen bør være klart synlig under forholdsvis gennemsigtigt vomeronasal epitel og udseendet af kanylen bør være ensartet i hele sin længde inde i VNO. Efter en vellykket afslutning af proceduren, kan man kontrollere funktionel konnektivitet ved hjælp af en fysiologisk assay som enkelt enhed elektrofysiologiske optagelser af neurale aktivitet i respons på VNO stimulering med en kendt kilde til VSN lugtstoffer (Figur 4).

Figur 1
Figur 1.. A) Tekniske tegninger af brugerdefinerede dissektion kammer anvendt i trin 3,22-5,4. BEMÆRK: Små huller kan bores til at rumme løsning og gasning indgange og udgange som ønsket B) Eksempel fotografi af dissektion kammer anvendt i denne protokol.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2.. A, B) Repræsentative billeder af succes (A) og mislykkede (B) tilberedninger efter hemisection fase (trin 3.20). VNO, septumdefekter væv, og olfaktoriske pærer (OBS) skal alle vedligeholdes fra den ipsilaterale halvkugle (i dette tilfælde, til højre (nederst) halvkugle. Hvis nasale muslingebenene er synlige på ipsilaterale halvkugle har dissektion mislykkedes. Aksemærker er 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

d/51813/51813fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3.. A, B) Repræsentative billeder af ubeskadiget og beskadiget septal væv mellem VNO og AOB. I B, dissekere pincet lavet utilsigtet kontakt med vævet, beskadige VN Axon skrifter. C, D) ubeskadiget og beskadiget AOB'er. I D, fjernelse af dura omkring ipsilaterale OB resulterede i, at den vomeronasal nerve nær AOB, hvilket medfører en synlig klat væv i nærheden af mediale AOB. Skalapanelerne er 1 mm i længden.

Figur 4
Figur 4.. A) Eksempel raster plot af virkningspotentialer optaget fra en AOB neuron (ekstracellulær enkelt enhed optagelse) i en vellykket forberedelse. Spor i sort viser ingen ændring i fyring sats, når kontrol Ringers opløsning blev leveret til VNO for 5 sek (grå box). Spor i rødt viser respons samme neuron til VNO stimulation med BALB / c hunmus urin fortyndet 100 gange i Ringers saltvand. B) Peri-stimulus time histogram af de samme reaktioner i A. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser af middelværdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VNO-Eventuelt ex vivo, der er beskrevet i denne protokol er et nyttigt alternativ til bedøvet in vivo 5-7 og akut levende skive 17 eksperimenter af AOB funktion. I modsætning til akutte AOB skive eksperimenter, som også udsætte kredsløbselementer for elektrofysiologiske og optiske optagelser, dette præparat bevarer alle sensoriske afferente og intra-AOB forbindelser. Selv om dette også kan siges om bedøvede in vivo metoder, tilstedeværelsen af bedøvelsesmidler nødvendigvis ændrer neural funktion, nemlig stimulerende / hæmmende balance, hvilket er afgørende for informationsbehandling i denne og andre olfaktoriske kredsløb 18. Fordi præparatet undgår brugen af ​​bedøvelsesmidler, og fordi AOB overflade er fuldstændigt udsat for superfusate, er det muligt at foretage farmakologiske undersøgelser lokal neural forarbejdning.

Der er naturligvis nogle begrænsninger af dette præparat. Der er evidence gradvis degeneration af de dybeste AOB lag, nemlig de dybe dele af det indre cellelag, som huser mange inhibitoriske granulceller 16. Derudover er centrifugale indgange skåret under dissektion, fjerne dem fra aktiv deltagelse i AOB funktion. Kanylering af VNO omfartsveje den normale virkning af vomeronasal pumpe, og skyller væk de endogene væsker til stede i VNO lumen.

Kritiske skridt til at opnå succes med denne metode er den fine hemisection (Trin 3.20) og VNO kanylering (trin 4.11). Man kan forvente at kræve omfattende praksis til pålideligt at producere funktionelt forbundet ex vivo præparater. Det sekundære dissektion kammer udnyttes her, kan bruges til at vurdere funktionel konnektivitet anvendes enkelt-elektrode optagelser under stimulering af VNO med kilder mus feromoner (såsom fortyndet urin). 13,15 Ændringer af det sekundære dissektion kammer kan be gjort at tillade forberedelse til at drejes til vinkler velegnet til andre formål, såsom multiphoton billeddannelse.

De mange tekniske forhindringer til at studere den levende AOB længe har udgjort en barriere for vores forståelse af social lugt og feromon sensorisk forarbejdning. Ved at dissekere væk de tidligste neurale komponenter i denne sensoriske vej i denne dissektion protokol, man er i stand til at få eksperimentel adgang til disse svære at studiet kredsløb. Vi har udnyttet denne forberedelse for detaljerede undersøgelser vomeronasal sensorisk forarbejdning 19 og sensoriske kortlægning (Hammen et al., Upubliceret). Denne teknik vil være nyttig for fremtidige undersøgelser af sensorisk forarbejdning i AOB, især dem, der kræver optisk adgang til væv (f.eks multiphoton billedbehandling og optogenetics). Fordelene ved denne fremgangsmåde supplerer dem af in vivo metoder, og forbedre vores værktøjskasse til at undersøge de neurale mekanismer vomeronasal-medieret såsielle og reproduktive adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen væsentlige interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgements

Denne forskning blev støttet af R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) og UT Southwestern startproblemer midler (JPM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight Scissors Fine Science Tools 14002-14
Fine Scissors-Straight Fine Science Tools 14060-10
Fine Scissors-Curved Fine Science Tools 14061-10
Adson Forceps Fine Science Tools 11006-12
#3 Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
#11 Scalpel Blades Fisher Scientific 3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades Fisher Scientific 12-640
35 mm Petri Dish Fisher Scientific 08-772-21
Dissection Chamber Custom  N/A See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm Custom  N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease Fisher Scientific 146355D
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip Fine Science Tools 11295-10
#5 Forceps, Student Fine Science Tools 91150-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
1/16" Male Luer Cole-Parmer EW-45505-00
1/16" Tubing Fisher Scientific 14-171-129
Two ton epoxy Grainger 5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit AutoMate Scientific 09-16
ValveLink digital/manual controller AutoMate Scientific 01-18
NaCl Sigma-Aldrich various
KCl Sigma-Aldrich various
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich various
MgCl2 hexahydrate Sigma-Aldrich various
NaHCO3 Sigma-Aldrich various
NaH2PO4 Sigma-Aldrich various
myo-inositol Sigma-Aldrich various
Na-pyruvate Sigma-Aldrich various
Na-ascorbate Sigma-Aldrich various
HEPES buffer Sigma-Aldrich various
Glucose Sigma-Aldrich various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
  2. Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
  3. Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
  4. Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
  5. Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
  6. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
  7. Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
  8. Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
  9. Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
  10. Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
  11. Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
  12. Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
  13. Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
  14. Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
  15. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  16. Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
  17. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  18. Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
  19. Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats