레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭, * These authors contributed equally

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Summary

RNA 간섭 (RNAi의) 기반의 유전자 녹다운 기술은 Tribolium 연구의 핵심이다. 여기서 우리는 Tribolium의 castaneum 우리의 애벌레의 RNAi 기술에 대한 개요를 제공합니다. 애벌레의 RNAi 연구자들이 다양한 상황에서 유전자의 기능을 연구 할 수 있도록, 기능 상실 표현형에 대한 빠른 액세스를 제공하는 간단하지만 강력한 기술이다.

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Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. (92), e52059, doi:10.3791/52059 (2014).

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Abstract

빨간 가루 딱정벌레, Tribolium의 castaneum는 완전히 주석 게놈 시퀀스, 트랜스포존 기반의 형질 전환 및 효율적인 RNA 간섭 (RNAi에) 포함하여 유전 및 발달 연구를위한 실험 도구의 레퍼토리를 제공합니다. 이러한 장점 중의 RNAi 기반의 유전자 녹다운 기술은 Tribolium 연구의 핵심이다. T. castaneum 가능 단순히 딱정벌레의 체강에 이중 가닥 RNA (dsRNA를)를 주입하여 모든 삶의 단계에서의 RNAi를 수행하고, 강력한 전신의 RNAi 반응을 보여줍니다.

이 보고서에서 우리는 T. 우리의 애벌레의 RNAi 기술에 대한 개요를 제공합니다 castaneum. 프로토콜 T.의 적절한 스테이지의 (ⅰ) 분리를 포함 주사 castaneum 유충, 사출 용 설정 (ⅱ) 제제, 및 (ⅲ) dsRNA를 주입. 애벌레의 RNAi는 기능 상실 phenotyp에 빠르게 액세스와 함께 우리를 제공하는 간단하지만 강력한 기술이다여러 유전자 녹다운 표현형뿐만 아니라 hypomorphic 표현형의 시리즈를 포함 에스. 거의 모든 T. 이후 castaneum 조직은 세포의 dsRNA에 취약, 유생의 RNAi 기술은 연구자들이 외부 환경에 반응 유기체의 유전 적 기초 등 다양한 상황에서 조직의 다양한 연구 할 수있다. 또한,이 기술의 단순함을 T., 연구 개 학생 참여를 촉진 교실 환경에서 사용하기에 이상적인 유전자 시스템을 castaneum.

Introduction

적색 밀가루 딱정벌레의 Tribolium castaneum 인해 RNA 간섭 (RNAi에) 1-3 수행 용이성 일부 생물학의 다양한 분야에서 인기를 얻고있다. RNAi에 기반 유전자 녹다운 기술은 과학자들이 기능 상실 복잡한 유전 적 방법을 이용하지 않고 분석을 수행 할 수 있습니다. T.를 castaneum 가능 딱정벌레의 체강 4-6에 이중 가닥 RNA (dsRNA에)의 주입을 통해 단순한 어떤 단계에서의 RNAi를 수행 할 수있어 견고한 전신의 RNAi 반응을 나타낸다. 여러 유전자의 동시 최저 또한 T.에서 가능하다 동시에 7,8 둘 이상의 dsRNA를 다른 분자를 주입함으로써 castaneum. 또한 hypomorphic 표현형의 일련의 dsRNA 8 주입의 농도를 감소시킴으로써 생성 될 수있다. 이러한 기능은 T. 전통 앞으로 유전학에의 RNAi 기반의 역 유전 기술 매력적인 대안을 castaneum. 이후 거의모든 T. castaneum 조직이 기술은 연구자들이 다양한 상황에서 조직의 다양한 연구 할 수 있으며, 세포의 dsRNA 분자 9에 민감하다. 또한,이보고는 T.에서 RNAi의 수행에 초점을 맞추고 있지만 castaneum, 여기에 설명 된 다양한 절차는 다른 곤충에 적용 가능하다. 하고자하는 사람들은 기능 상실은 T.에 대한 관심이 그 맥락에서 분석을 수행하는 데에 따라서,이 프로토콜은 유용 castaneum뿐만 아니라 다른 곤충의 RNAi 기반의 기술을 적용하고자하는 연구자.

애벌레로 dsRNA를 주입하는 애벌레, 번데기를 포함 딱정벌레 삶의 단계, 다양한에서 기능 분석을 허용하고, 성인 4,5,10 스테이지. 우리는 이전에 분자 생물학 절차 (11)를 포함하여 우리의 전반적인 애벌레의 RNAi 프로토콜을보고했다. 현재 보고서에서, 우리는 최고의 시각 보좌관으로 설명 dsRNA를 주입 절차를 기술에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 제공자세한 단계별 주입 절차뿐만 아니라 선과 악을 주입 예. 이 프로토콜은 시각 이전 프로토콜을 보완하고, 결합 될 때, 그들은 T.에서 유생의 RNAi 과정의보다 포괄적 인 뷰를 제공 castaneum. 또, RNAi의 생리적 연구의 RNAi 기반 분석법의 적용 성공뿐만 아니라, 교육 기관에서의 RNAi 유생 프로토콜의 적용 가능성에 영향을 줄 수있는 분자의 dsRNA에 대한 매개 변수를 논의한다.

Protocol

1 T. castaneum 주식 및 배양

  1. T. 결정 castaneum 변형 실험을 위해 사용합니다.
    참고 : 여러 실험실 설립 T. castaneum 균주를 사용할 수 있습니다. 조지아-1 (조지아-1) 게놈 염기 서열 3에 사용 된 가인이의 부모의 변형이다. 조지아-1 (예 : 단일 염기 다형성 등, SNP를) 공유 대부분의 DNA 다형성을 조지아-2와 인해 적은 근친 교배에 가인이보다 건강이기 때문에, RNAi의 실험에 적합하다. 푸 (11)가 사용하는 또 다른 편리한 변형입니다 미래 날개 primordia의 고유 한 강화 된 노란색 형광 단백질 (EYFP) 식을 다른 령충에서 마지막 애벌레 령을 구별 할 수있게 해준다으로, (클라크 Hachtel 등. 2,013 12의 그림 S4 참조). 유전 적 배경이 크게 AFF에 나타나는 그것은 실험에 사용 된 딱정벌레 변형 문서화하는 것이 중요하다요법의 RNAi는 13 표현형.
  2. T. 준비 (혼합 후, -20 ° C에서 문화 밀가루를 저장) 유기농 통밀 가루에 미리 체질 맥주의 효모의 (중량) 5 %를 추가하여 castaneum 문화 밀가루. 6온스 플라스틱 초파리 스톡 병 (약 40g / 병)에 (실온에서) 문화 밀가루를 나누어지는.
  3. 문화 T. 70 %의 습도가 30 ° C에서 castaneum. 습도 제어 인큐베이터 가능한 경우 사용합니다. 문화 병 당 30 ~ 40 성인 추가 (남성 : 여성 비율 1 : 1) 문화를 시작합니다.
    참고 : 곰팡이가 거의 문화 밀가루에 곰팡이가 발생할 수 있습니다 30 ° C 70 % 습도, 낮은 온도 (예 : 25 ° C에서)에서 문제가되지 않지만. 이 경우 습도를 낮 춥니 다.
  4. 계대 배양 (문화 가루 성인을 분리하는 방법에 대한 단계 5.2-5.5 참조) 모든 이주 새로운 문화 병으로 성인을 전송합니다.
    참고 : 마지막 령 유충을 얻기 위해 약 3 주 정도 소요됩니다. Alternatively, T. castaneum 문화가 더 이상 배양 기간 임에도 불구하고, 낮은 온도 (20 ~ 25 ° C에서)에서 유지 될 수있다 (25 ° C에서 개발 시간은 약 두 배에 30 ° C에서)입니다.

애벌레 dsRNA를 주입하기위한 솔루션 및 인스트루먼트의 2 준비

  1. 시험 관내 전사에 의해 표적 유전자 상동의 dsRNA 분자를 합성한다. -80 ° C에서 보관하십시오. 자세한 분자 생물학 절차 필립과 Tomoyasu 2011 11를 참조하십시오. 또한의 dsRNA 분자를 설계 할 때 고려해야 할 파라미터 번호 논의 참조.
  2. 1.5 ml의 1 M의 NaH 2 PO 4 8.5 ml의 1 M 나 2 HPO 4를 혼합하여 (25 ° C에서의 pH 7.6) 0.1 M 인산 나트륨 완충액을 확인합니다. pH 미터로 pH를 확인하고 그에 따라 조정합니다.
  3. 100 _, (25 ° C에서의 pH 7.6), 0.1 M 인산 나트륨 완충액 10 ㎕를 혼합하여 10 배 주사 완충액 1 ㎖를 확인6; 리터 0.5 M의 KCl, 녹색 식품 염료 100 ㎕ 두 번 증류수 790 μL (DDH 2 O). 배 주입 버퍼 (200 ㎕의 10 배 주입 버퍼 + 800 ㎕의 DDH 2 O)를 만들기 위해 10 배 주입 버퍼를 희석. 필요할 때까지 4 ° C에서 모두 10 배 및 2 배 주입 버퍼를 저장합니다.
  4. 스티커 유리 슬라이드를 준비합니다.
    1. 애벌레 주사제 다 repositionable 접착제의 형태와 전체 유리 슬라이드를 커버. 성인 또는 번데기 주사제, 슬라이드의 긴 모서리를 따라 접착제이 얇은 스트립을 확보.
    2. 또한 주사 후 자신의 제거를 용이하게하기에 충분 휘기 쉬운 유지하면서 접착제, 접착제 슬라이드에 딱정벌레를 준수 할만큼 볼품 유지되도록 몇 일 동안 건조시킵니다.
      참고 : 접착제가 너​​무 끈적 유지하는 경우, 손가락을 사용하여 점착성을 줄일 수있는 접착제를 누릅니다. 각 슬라이드는 40 또는 50 딱정벌레까지 수용 할 수 있으며 안전하게 동물을 잡아 실패 할 때까지 재사용 할 수 있습니다. Altern테이프가 때때로 유충을 저장하기에 충분히 접착되지 않는다 atively, 양면 테이프도 사용할 수있다.
  5. 에테르 마취 바구니를 확인합니다.
    1. 10 ㎖의 일회용 주사기에서 플런저를 제거하고 6 ml의 라​​인 주위에 반으로 주사기를 잘라.
    2. 주사기의 하단을 폐기하십시오. 간단히 가스 버너와 주사기의 상단 부분의 절단면을 가열하고 신속 주사기 위에 메쉬를 붙 나일론 메쉬 편 상에 용융 수지를 밀어. 플라스틱은 견고하게되면 초과 메쉬를 멀리 낸다.
  6. 에테르 병을 준비합니다. 좁은 입 100 또는 250 ㎖의 유리 병에 에테르 30 ML을 추가합니다. 에테르의 증발을 향상시키기 위해 휴지 여러 조각을 추가한다.
    참고 : 이더는 화재의 위험을 제시하고, 또한 유해. 항상 흄 후드 에테르을 처리합니다. 사용 긴밀하지 동안 뚜껑을 닫습니다.
    참고 : 얼음은 sedatio 있지만 (예 : 교실 환경에서와 같이) 안전한 대안으로 사용할 수 있습니다여기서 n은 덜 효과​​적이다.

유생의 사출 장치의 제조 3

  1. 해부 현미경에 XY 기계 무대를 놓습니다.
    참고 : XY 기계 단계 주요 현미경 회사에서 사용할 수 있습니다. 대안 적으로, 저렴 현미경 스테이지는 또한 일부 수정 대부분 해부 현미경에 사용될 수있다 (예를 들면 재료 표 참조).
  2. XY 메카니컬 스테이지 근처에있는 기계 바늘 매니퓰레이터를 놓습니다.
  3. 주입 주사기를 조립합니다. 주사 바늘의 압력에 영향을주지 않고 주입 주사기의 조작을 허용하는, 유리 바늘 홀더에 30 ml의 일회용 주사기를 연결하는 (루어 형 연결부)와 사 방향 스톱 콕을 사용하여 (자세한 주입 주사기 필립 Tomoyasu 2011 11 참조 조립).

(4) 당기 주입 바늘

  1. 에 의해 붕규산 유리 바늘 (0.5 mm, 15cm 길이 : 1mm, ID B100-50-15, OD)를 당겨바늘을 끌어 당기는.
    참고 : 셔터 P-87이나 P-97은, 설정 사용을 위해 "열 = 70 = 45, VEL = 75 시간 = 90을 당겨"또는 피펫 요리 책의 제 2 장을 따르 자기편 셀, C를 엘레 간스, 초파리, 제브라 피쉬 &가 - 프로그램을 추천합니다. 최적의 설정은 바늘 풀러의 모델에 따라 다릅니다. 일반 초파리 주사 바늘에 대한 설정은 좋은 출발점이다.
  2. 스토어는 플라스틱 케이스 (예를 들면, 플라스틱 CD 케이스)에 바늘을 뽑아 이동식 장착 퍼티 고정합니다.

(5) 분리 및 유충의 선택

  1. 체 수신기에 # 25 체를 놓습니다.
  2. 체의 문화 병 (딱정벌레와 문화 밀가루)의 내용을 놓고 즉시 내용을 선별. 유충 신속하게 체를 파고와 박히하려고합니다으로 선별하지 않고 자체에 대한 내용을 보관하지 마십시오. 적극적 밀가루 가을 수 있도록 내용을 선별를 통해 세 애벌레를 떠나 (일반적으로 여섯 번째와 일곱 번째 령 유충), 체의 상단에 뒤 (자신의 캐스트 오프 손톱, exuviae과 함께) 번데기 및 성인.
  3. 시드 팬에 체 (딱정벌레와 exuviae)에 남아있는 자료를 전송합니다. 탈출 딱정벌레를 방지하기 위해 팬을 눌러 보관하십시오.
  4. exuviae 부드럽게 시드 팬을 통해 불어 딱정벌레의 표면에 남아있는 밀가루 입자를 제거합니다.
  5. 팬의 바닥에 내용을 이동 시드 팬을 누릅니다. 그런 다음 몇 초 동안 미개발 팬을 둡니다. 더미에서 나올 다른 단계보다 더 많은 모바일 아르 성인 기다립니다. 미술 붓 (예를 들어, 1cm 폭)을 사용하여 성인을 제거합니다.
  6. 번데기로, 약간 아래쪽 팬의 입 유지하면서 부드럽게 시드 팬 노크하여 별도 번데기 빠르게 입 향해 굴러 경향이있다. 시드 팬에서만 애벌레를 떠나, 번데기를 제거하기 위해 붓을 사용합니다.
  7. 경기 수깨끗한 페트리 접시에 고립 된 유충 에이스. 주사 유충의 적절한 단계를 선택하고 별도의 페트리 접시에 배치합니다.
    참고 : 성인 형태학에뿐만 아니라 변태에 RNAi의 효과를 분석 할 때 초기 마지막 령 유충 (최종 애벌레 탈피 후 1~2일)는 종종 적합하다. 그것은, 그러나, 때때로 필요 (예를 들면, 3E-3H 피규어. 또한 클라크 Hachtel 등. 2,013 12 참조) 초기 유전자 기능을 평가하기 위해 끝에서 두 번째에 (또는 이전) 단계의 RNAi을 수행 할 수있다. 유충의 령을 식별 할 크기 기준으로 번데기를 사용합니다. 마지막 령 유충은 약간 더 번데기보다. 다르게는, PU-11은 최종 령 유충을 식별 할뿐만 아니라 최근 령 유충의 개발 (클라크 Hachtel 그림 S4 외. 2,013 12)의 시간 코스를 결정하는데 사용될 수있다.
  8. 에테르 마취까지 페트리 접시에 선택한 유충을 유지합니다. 나머지를 배치다시 밀가루와 문화를 병에 넣고 인큐베이터에 반환 유충 (예 : 번데기 및 성인과) 딱정벌레의 다른 단계.

주사 바늘의 6 준비

  1. 스티커 압정 또는 양면 테이프를 사용하여 유리 현미경 슬라이드 상에 미리 뽑아 유리 바늘을 놓는다. 여기서 팁 굽힘을 볼 수있는 해부 현미경을 통해 보는 동안 집게를 사용하여 바늘의 당겨 끝을 테스트합니다. 집게와 트위스트와 함께 바늘 굴곡이 분할하는 위치의 끝쪽으로 약간 영역을 잡아.
  2. 좋은 바늘을 유지하고 다른 사람을 버린다. 그가 너무 크지도 너무 작지 여는 것으로 좋은 바늘을 고려 (약 0.05 mm 직경. 1A 및도 1B), 및 유생 표피 쉽다 (도 1b 및도 2A-2B)의 침투를 만드는 각도된다. diffi 바늘로 dsRNA를 용액의 흡수를 만드는 등의 나쁜 바늘 (I)가 너무 작은 고려컬트 (7 단계) (그림 1D2D), (II) 너무 큰, 사출에 애벌레 부상하고 가능한 치사율의 원인 (그림 1C2 층), 표피 어렵고 증가 부상 (III) 무딘, 제작 침투.
  3. 니들 홀더에 바늘을 삽입합니다.
    1. 먼저, 바늘 홀더의 선단부의 나사 팁 홀더에 바늘의 후방 단부를 배치. 그리고, 홀더 선단에서 (유리 바늘의 후방 단부로부터 적어도 1cm)를 고무 패킹을 배치.
    2. 완전히 바늘 홀더의 개구부에 삽입 된 고무 개스킷 홀더에 바늘의이면을 삽입한다. 다시 홀더 위에 팁을 나사.
  4. 바늘 조작기에 조립 된 바늘 홀더를 놓습니다. 수평에 가까운 바늘 홀더를 유지합니다. MICR 통해 볼 때 매니퓰레이터의 위치를​​ 조정하므로 니들의 팁은 뷰의 중심에 위치하고oscope.

바늘에 7 Frontloading의 dsRNA 솔루션

  1. DDH 2 O와 농도를 조정하고 배 주입 버퍼 (단계 2.3) 같은 부피를 가진 dsRNA에 솔루션을 혼합하여 주입 직전에 dsRNA를 주입 솔루션을 준비합니다. 얼음에 혼합 용액을 보관하십시오. dsRNA에 농도에 대한 설명을 참조하십시오.
  2. 20 μL 일회용 피펫 팁의 끝을 잘라. 피펫 트리밍 피펫 팁에 용액 10 μL. 배압을 제공하여 팁의 유체를 유지하면서 조심스럽게 피펫 피펫 팁을 제거합니다. 선택적으로, 팁을주의 깊게 제거하고 손가락을 이용하여 압력을 제공하여 선단 단부에 용액을 이동.
  3. 바늘의 선단을 향하도록 개구 스티커 압정을 이용하여 현미경 스테이지 dsRNA를 용액으로 피펫 팁을 놓는다.
  4. 현미경을 통해 찾고, 천천히의 끝 때까지 바늘 방향으로로드 팁을 이동니들은로드 된 피펫 팁 내부 및 솔루션에 있습니다.
  5. 현미경을 통해 보면서 부드럽게 천천히 바늘에 dsRNA에 솔루션을 끌어 주입 주사기의 플런저를 다시 잡아 당깁니다.
    참고 : 바늘을 너무 많이 넣지 마십시오. dsRNA를 용액의 단부는 바늘의 팁에 접근하면, 인상 속도를 느리게하고 공기 도달 할 바늘의 선단부 전 용액로드를 중지. 공기가 팁에 도달하는 경우, 용액을 급속하게 오염이 심각한 문제를 초래 바늘 홀더로 흡입된다. 바늘 홀더의 자세한 청소 절차는 필립과 Tomoyasu 2011 11에 설명되어 있습니다.
  6. 꼭지를 열어 주입 주사기와 바늘 홀더에서 압력을 제거합니다. 그런 다음, 바늘의 끝에서 멀리 피펫 팁을 이동합니다. 무대에 유충을 배치하는 동안 실수로 바늘의 손상을 방지하기 위해 무대에서 바늘을 올립니다. 무대에서 비워 피펫 팁을 제거합니다.
  7. 8 dsRNA를 주입

    1. 에테르 마취 바구니에 애벌레를 놓습니다. 기술을 학습보다 작은 경우 10 유충을 사용합니다. 기술로 한 번 편안한 한 라운드에서 30 ~ 40 유충을 사용합니다.
    2. 에테르 병에 애벌레와 바구니를 놓고 뚜껑을 닫습니다.
      참고 : 이더는 화재의 위험을 제시하고, 또한 유해. 흄 후드에서이 단계를 수행합니다.
    3. 약 3 분 Etherize 애벌레. 3 분 후 이동을위한 유충을 확인합니다. 그들은 여전히​​ 이동하는 경우 다른 30 ​​초 동안 에테르 병을 다시 배치합니다. 이 치사 성을 높일 수 있으므로 이상 5 분 etherize하지 마십시오.
      참고 : 최적의 에테르 마취 시간은 온도와 습도에 따라 달라질 수 있습니다.
    4. 유리 스티커 슬라이드의 붙지 않는 가장자리로 바구니에서 에테르 화 유충을 전송합니다. 집게를 사용하여 현미경을 통해 보는 동안 한 각 유충 하나를 선택하고 슬라이드에 배치합니다. F 자신의 몸을 아래로 눌러 부드럽게 측면을 올려 놓고당신이가는대​​로 집게로 꼬리 롬 머리, 약간 그들은 슬라이드에 고정되어 있는지 확인하기 위해 그들을 스트레칭.
    5. 현미경 무대에서 유충으로 끈적 슬라이드를 놓습니다.
    6. 중추 신경계 손상을 방지하기 위해 유생의 등쪽으로 부드럽게 dsRNA를로드 바늘을 삽입합니다. 애벌레 마음이 여기에 위치해 있기 때문입니다 또한, 지느러미 중간 선을 피하십시오. 이 이후 단계에서는 항상 (대신 바늘을 이동하는 바늘 조작기를 사용하는) 바늘에 애벌레를 이동하는 단계를 사용합니다.
      주 : 특정 주사 부위가 T.에서의 RNAi으로 문제가되지 않습니다 castaneum 전신이 나타납니다. 그러나, 흉부 또는 복부 세그먼트의 등쪽에 주입하는 것이 가장 쉬운 방법입니다.
    7. 유충에 바늘을 삽입 한 후, dsRNA에이 애벌레 체강를 입력 할 수있는 공간을 확보하는 데 약간 뒤로 바늘을 빼냅니다.
    8. 유충 턴 녹색 (또는 사출 버퍼의 색)까지 주입 주사기에 부드럽게 밀어의 모습tretched 및 전체.
      NOTE : 기술을 학습하면, 상당한 치사율없이 애벌레에 주입 될 수있는 용액의 양을 결정하기 위해 가능한 한 많이 주입하려고. 그것은 일반적으로 약 0.5 ~ 0.7 μL이다.
    9. 애벌레에서 바늘을 제거합니다. 바늘을 제거하는 동안 약간 뒤로 dsRNA에 손실을 방지 할 수있는 주입 주사기에 당겨 (도 공중에 끌어하지 않도록주의).
    10. 슬라이드의 모든 애벌레를 주입. 성공적으로 주입되지 않은 유충을 제거해야합니다. 유충이 완료되기 전에 주사 (약 10 분)에서 일어나.
    11. 주사 현미경에서 주입 애벌레와 슬라이드를 제거하고 모든 애벌레 에테르 마취에서 회복 될 때까지 더 5 분 동안 슬라이드를 둡니다.
    12. 집게와 해부 현미경, 부드럽게 끈적 슬라이드으로부터 그들을 석방을 위해 머리부터 꼬리까지 애벌레를 들어 올립니다. 깨끗한 페트리 접시에서 새로 출시 된 애벌레를 놓습니다. w 주입을 허용하도록 10-15 분 동안 페트리 접시에 유충 남기기응고 ound.
    13. 적절히 변형 이름을 포함한 클린 밀가루와 새로운 레이블 병으로 유충을 배치하는 dsRNA의 유형은, dsRNA를 농도, 주입 된 유충의 수, 및 날짜를​​ 주입.
    14. 문화 70 %의 습도가 30 ° C에서 주입 된 유충. 정기적으로 RNAi의 표현형의 유충을 관찰한다.
      참고 : 7 일 이내 마지막 령 유충 번데기. (RNAi에 의한 타이밍에서 더 이상 존재하지 않는 경우) 다음에, 번데기 7 일후에 eclose 성인 것이다.

    넉다운 및 표현형 분석의 9 확인

    1. 이러한 정량적 역전사-PCR (QRT-PCR)과 서양의 모래 바닥과 같은 여러 가지 분자 생물학 기술에 의해 아래로 노크의 RNAi의 평가의 효율성을 고려한다. 각각 밀러 등. 2,012 7 필립 상세한 qPCR에 대한 Tomoyasu 2011 (11)과 서쪽 오점 프로토콜을 참조하십시오.
    2. RNAi에 관련 표현형을 분석합니다.
      참고 : 관련 RNAi에표현형은 표적 된 유전자에 따라 여러 다른 단계에서 및 다른 배양 조건 하에서 관찰 될 수있다. 의 RNAi는 딱정벌레의 형태, 변태, 생리학, 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 얼마나 자주 표현형의 존재가 확인되고 딱정벌레 양육 조건이 특정 질문에 맞게 조정되어야 하는지를 아래는 RNAi를 통해 조사되고.

Representative Results

성공적인 주입 주요 단계 중 하나는 좋은 바늘을 만드는 것이다. 단계 6에서 설명한 바와 같이, 니들의 팁은 종래 T. 주입로 세분화되어야 castaneum. 좋고 나쁜 바늘의 예를 그림 1에 나타내었다. 좋은 바늘은 약 0.05 mm 직경의 구멍 (그림 1B)로, 선명하고 단단한 팁이 있습니다.

도 2는 성공적인 주입 (도 2a 및도 2b)뿐만 아니라 실패한 주사 (도 2C-2F)의 몇몇 예를 나타낸다. 적절한 크기의 주사 바늘을 ​​사용, 바늘 끝은 최소한의 저항 (그림 2A)와 애벌레 표피를 관통하고, dsRNA에 용액 (녹색) 누출 (그림 2B)없이 유충으로 흐른다. 과다 주사로 그것을도 적절한 크기의 주사 바늘 (그림으로 dsRNA에 솔루션의 오버 플로우가 발생합니다하지 마십시오2C). 바늘의 선단이 너무 얇 으면, 바늘 끝이 어렵 주입 (도 2d)를 만들고, 유생 표피 및 굽힘을 침투하지 못한다. 이 경우, 트리밍 바늘 끝은 때때로 도움이됩니다. 큰 바늘 애벌레 표피 (그림 2E)를 관통에 어려움이기는하지만, 종종 계속 사용할 수 있습니다. 그러나, dsRNA를 용액의 많은 양이 쉽게 자주 dsRNA에 용액 (도 2F)의 오버플로의 결과에도 주입 주사기에 약간의 압력을 바늘로부터 압출된다.

RNAi를 수행 할 때의 RNAi가 정상적으로 작동하고, 음성 대조군 관찰 효과의 dsRNA의 비특이적 효과 나 인한 이러한 부상 사출 절차 (의 결과가 아님을 확인하는 것을 평가하기 위해 포지티브 컨트롤하는 것이 중요 ) 에테르 마취에서 분사, 또는 이상에 의해. dsRNA를 대상으로 EYFP의 주입 역할을 할 수 있습니다양성 대조군 좋은 것은 PU-11 스트레인 5,7 사용시. EYFP하는 dsRNA가 최종 애벌레 단계에서 주입 될 때, 미래의 날개 primordia EYFP 신호에서의 상당한 감소는 초기 하루 포스트 분사 (도 3a)으로서 관찰 될 수있다. EYFP의 최저는 이일 EYFP dsRNA에 (그림 3B)의 주사 후 완료되고이 최저는 dsRNA에 농도가 충분히 (예 : 1 높은 경우 번데기 (그림 3C3D)을 통해 딱정벌레의 전 생애에 걸쳐 지속 μg / μL) 7. EYFP dsRNA를 그것이 비 내인성 유전자 서열은 또한 같은 음성 대조군으로서 사용될 수 있고, 생리 학적 또는 중단 (도 3A-3D)를 일으키지한다.

우리는 어떻게 EF의 또 다른 예로서, 흔적 (VG)에 대한 애벌레의 RNAi의 이미지, 중요한 날개 유전자 (12)을 제공이 사출 기반의 RNAi 기술은 T.되어 fective castaneum. dsRNA에 대한 VG가 끝에서 두 번째 단계 유충 (최종 애벌레 단계 전에 1 단계)에 주입 될 때, 날개 구조의 완전한 손실 번데기 (도 3E3F)에서 관찰 될 수있다. 얻어진 성인도 완전히 날개 구조 (도 3G3H)으로 부족하다. VG에 대한 RNAi의 결과는 견고 함과 T.에서의 RNAi의 전신 한 자연을 예시 castaneum.

그림 1
그림 1 : 끊어지지 않는 좋은, 나쁜 바늘 (A)(B) 잘 깨진 좋은 바늘의 끝 (C)가 너무 크고 무딘 깨진 바늘의 끝 (D) 끝... 파산의 너무 얇은 n 개의 바늘입니다. 스케일 바 (빨간색)은 0.05 mm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림이
그림 2... (A)에 적당한 크기 주사 바늘이 지난 령 유충에 삽입 (B) 충 적절 녹색 dsRNA에 용액 주입, (C) 위에 주입에 의한 주입 지점에서 dsRNA를 용액의 오버플로 (D ) 유충 표피 침투하지 못하는 얇은 바늘. (E) 마지막 령 유충에 삽입 큰 주사 바늘. (F) 유충은 dsRNA를 용액 오버 플로우 및 누출의 결과, 큰 바늘 주사. 화살표는 바늘을 나타냅니다.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : T. 성공의 RNAi의 예 castaneum. (AD) EYFP 발현 감소 EYFP dsRNA를 결과의 최종 애벌레 사출.에서 얻어진 (A) 유충 주입 후 일일. (B) 유충 주 사후 2 일후. (C) 제어 번데기. (D) 번데기 애벌레 EYFP dsRNA를 주입. 음성 대조군은 주사 버퍼 (A, B) 및 DsRed의 dsRNA를 주입 (C, D)이다. 화살촉과 화살이 EYFP 식을 표시 또는 각각 날개 primordia 눈에 그 부족합니다. (EH)VG에 대한 궁극적 인 애벌레의 RNAi. (E) 야생 형 번데기. (F) VG의 RNAi 번데기. 날개 구조의 부족은 번데기 (화살표). G) 야생 형 성인. (H) VG RNAi의 성인에서 이미 볼 수 있습니다. 윙 관련 구조가 완전히 (화살표) 누락되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

거기 (노크 복수를 시도 할 때) 상이한 dsRNA를 분자에 길이 및 농도의 dsRNA 분자의 경쟁을 포함한의 RNAi의 성공을 보장하기 위해 고려해야 할 중요한 사항 중 다수가 있고, 표적 이탈 효과의 가능성 (OTE).

dsRNA에 길이

dsRNA를 분자의 길이가 더 긴 dsRNA에 (dsRNA에의 한계 이상이 현재 알려져 있지 않지만) 7,14,15의 RNAi를 유발하는 것이 더 효율적으로되고, 전신의 RNAi 반응의 효율에 영향을 미친다. dsRNA에 길이는 T. 효과적인의 RNAi를 유도하기 위해 50 bp의 이상 할 필요가 castaneum 7. 150 bp의 500 bp의 사이의 dsRNA는 RNAi를 이상적으로 나타납니다. 긴 dsRNA에 분자가 또한 사용될 수 있지만, 그들은 점차 어려워 질 것이다 OTE의 증가 가능성 및 유전자 클로닝 단계를 가질 것이다.

dsRNA에 집중

ve_content "> 유전자 녹다운의 다른 정도는 dsRNA에의 농도에 따라 달성 될 수는. 1 μg은 / μL (관심 유전자 (들)에 따라 달라질 수 종종 가까운 널 표현형을 생산하는 적당한 출발 농도를,로 나타나는 ). RNAi에 가끔 hypomorphic 표현형 (Tomoyasu의 기업 데이터 계열을 생성하는 데 도움이 될 수의 dsRNA의 일련 희석액과 강한의 RNAi 표현형.의 RNAi를 얻기 위해 더 높은 농도 (예를 들면, 7-8 μg / μL)과 함께 수행 될 수있다 등. 2009 8 및 Borràs - 카스텔되지 않은 데이터).

RNAi의 경쟁

다중 유전자 녹다운이 T. 달성 될 수있다 동시에 여러 가지의 dsRNA 분자를 주입함으로써 castaneum. 그러나, 또한 생체 내에 존재하는 여러 가지의 dsRNA 분자를 갖는 것이 종종 RNAi의 컴포넌트에 액세스하는 dsRNA에 간의 경쟁을 초래하는 것으로 알려져있다 (예를 들면, Tomoyasu 등. 2,005 16 Tomoyasu 등. 2,009 17 및 양 등. 2,009 18) 더블, 트리플 최저을 수행했습니다. 이 네 개의 표적 유전자의 RNAi 효율의 현저한 감소를 초래할 가능성 것처럼, 사중의 RNAi를 실현 (또는 그 이상)하면되지만, 문제가 될 수있다.

오프 대상

OTE는 RNAi의 기반 접근 방식에 대한 고유의 관심사입니다. OTE을 최소화하는 한 방법은 설계시의 dsRNA 이들 영역을 다른 유전자와 비슷한 염기 서열을 공유하는 표적 유전자의 영역들을 식별 및 방지하는 것이다. T.에 대한 간단한 BLAST 분석 castaneum 예측 유전자 세트는 영역을 식별 할 수 있습니다. 여러 온라인 도구는 잠재적 인 OTE (예를 들어, E-RNAi의 19)의 평가를 할 수 있습니다. 표적 유전자의 두 개의 비 중첩 영역의 RNAi를 위해 수행하면 OTE 표현형이 관찰에 의해 발생 가능성을 제거하는 쉽고 효과적인 방법이다. RNAi에 두 개의 비 중첩 영역이 동일한 표현형을 생성하는 경우에 대해 (이 비 중첩 영역이 유사한 서열을 공유하지 않는 한) OTE의 가능성이 최소화된다.

표현형 분석 이외의 방법으로 유전자 녹다운을 효과적으로 평가 본 RNAi에 관련 데이터 종종 중요하다. 유전자 최저를 평가하는 두 가지 주요 방법이 QRT-PCR과 웨스턴 블롯 분석이다. QRT-PCR은 표적 mRNA의 수준을 측정하는 편리한 방법이며, T.에서 RNAi를 포함한 많은 관련 연구에서 사용되어왔다 castaneum (밀러 외를 참조하십시오. 예를 들어 2012 7). Howev우리가 최근에 (단백질 제품은 아래로 조절 비록) 대상 mRNA의 수준 (Borràs - 카스텔되지 않은 데이터)까지 조절 RNAi에 의해 인 경우를 본 것처럼 어,주의,주의해야합니다. 최대 조절이 RNAi를 유도 mRNA의이 광범위하거나 특정 유전자에 고유 될 수 있다면 그것은 현재 알 수 없습니다. 웨스턴 블롯 분석은 유전자 최저을 확인하는 또 다른 방법입니다. 그것은 최종 단백질 생성물의 양을 측정하는이 방법은 상당히 안정적이다. 표적 유전자의 단백질 생성물에 대하여 특이 적 항체의 요건은이 방법의 단점이다. 표현형 분석 이외에 여러 독립적 인 측정을 이용하여 RNAi에 기반 분석에 의해 얻어진 표현형 데이터의 신뢰도를 증가시킬 것이다.

T.에서 그 개념부터 castaneum, RNAi에 주로 개발 및 패턴 형성에서의 유전자 기능을 연구하는데 사용되었다. 이러한 T. castaneum 발달 연구는 charac 매우 성공적이었다유전자의 진화 적으로 보존 및 발산 기능을 terizing (Denell 2008 1 Klingler 2004이 검토). T.에서 그러나, RNAi의 기반 연구 castaneum는 발생 생물학에 한정되지 않는다. 예를 들어, RNAi의 스트레스 내성, 포식, 공격성 ​​메이트 선택 활동 패턴 및 방어 메커니즘을 포함하여 생리적 행동 반응의 넓은 범위에서 유전자 기능을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

이러한 문맥에 RNAi를 도포 한 어려움다면 발현 효과의 가능성이다. 종종 관심의 유전자는 T.에 걸쳐 다양한 역할을해야합니다 castaneum 수명주기, 따라서 의도 어려운 표현형 효과없이 유전자의 제거를 만들기. 그러나, 용이하게 스테이지에서 RNAi의 다양한 수행 능력은 종종 이러한다면 발현 성 효과를 피하기위한 효과적인 전략이 될 수있다. 예를 들어, 대신 유충이나 번데기의 성인에서의 RNAi를 실행하면 우리가 unin 우회 할 수 있습니다초기 개발 단계에서 유전자 최저로 인한 치사율을 경향이 있었다. T.에서의 RNAi 반응의 유연성 castaneum 따라서 생리 학적 및 행동 반응의 유전자 기능의 실험에 RNAi에 적응이 모델에게 매력적인 선택을합니다.

T. castaneum 시스템은 교육 기관에서 사용하기에 이상적이다. T. castaneum은 T.에서의 RNAi 기술을 자주 계대 배양없이 실내 온도 (25 ° C)에서 밀가루 / 효모 혼합물에 쉽게 배양 될 수 있습니다 castaneum은 아주 간단 젊은, 학습 과학자 실험실에 적용 할 수 있습니다. RNAi의 생물학적 다양한 분야에서 필수적인 기술이되고, 그것은 학생들이 기술에 노출하는 것이 중요하다. T.에서 애벌레의 RNAi 기술의 솔직 자연 castaneum 또한 T.을, 연구에 참여하는 더 많은 학생들을 장려 유전 시스템 중심의 교실을위한 주요 후보를 castaneum. </ P>

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 기술 지원을 마이애미 대학에서 생물 정보학 및 기능 유전체학을위한 센터 (CBFG를) 감사합니다. 이 작품은 마이애미 대학 창업 보조금 (YT), 그리고 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (: IOS 0,950,964 YT)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organic whole wheat flour  Heartland Mill Inc. Kansas G1
Brewer’s yeast MP Biomedicals 2903312 Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.
6 oz plastic Drosophila stock bottles Fisher Scientific 11-888
Sieve Fisher Scientific  04-881N 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. 
Sieve Fisher Scientific  04 881 10P 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm)  Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.
Sieve receiver Fisher Scientific  04-866B 8 in. diameter
1.5 Quart spouted sample pan  Seedburo Equipment Co. Model 33 collection pan
Incubator BioCold Environmental Inc BC26-IN Keep it 30 °C with 70% humidity.
Na2HPO4 Fisher Scientific  S374500
NaH2PO4 Fisher Scientific S397-500
KCl Fisher Scientific  P217-500
Food dye  Kroger green, blue, or red preferable
Microscope glass slide  Fisher Scientific  22-038-103
Tack-It Over&Over Aleene's Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.
Plastic CD case Amazon
Boroslilicate glass capillary Sutter Instrument BF100-50-15 O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament
Needle puller Sutter Instrument P-87 or P-97 
Removable mounting putty  Loctite Fun-Tak
Compressed gas duster OfficeMax OM96091
Forceps Fine Science Tool 11231-30 Dumoxel #3 (to manipulate beetles)
Forceps Fine Science Tool 11252-20 INOX #5 (to break needle tips)
Ethyl ether, anhydrous  Fisher Scientific  E138-500
Nylon mesh Flystuff/Genessee Scientific 57-102 120 µm pore size/49% open area
Media bottle, 100 ml VWR 89000-926
Stereomicroscope Zeiss SteREO Discovery V12. Injection microscope.
Stereomicroscope Fisher/Zeiss 12-070-513  Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.
X-Y mechanical stage  Zeiss 4354600000000000
X-Y mechanical stage  Microscopenet.com A512 Inexpensive alternative
Manipulator Narishige M-152
Magnetic stand Narishige GJ-1 
Glass capillary holder Narishige IM-H1 
30 ml Disposable syringe BD syringe 309650 BD Luer-Lok Tip
Four-way stopcock  Cole-Parmer Instrument Co. EW-30600-03 Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip
Art paint brush Amazon Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece Any general paint brush will work.

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References

  1. Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Genetics. 180, 1779-1786 (2008).
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Erratum

Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

Step 4.1 was updated from:

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

to

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

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