Larve RNA-interferens i Den Røde rismelbille, * These authors contributed equally

Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

RNA-interferens (RNAi) -baserede gen knockdown teknikker er kernen i Tribolium forskning. Her giver vi et overblik over vores larvestadiet RNAi teknik Tribolium castaneum. Larve RNAi er en enkel, men kraftfuld teknik, der giver hurtig adgang til tab af funktion fænotyper, som giver forskerne at studere genfunktioner i forskellige sammenhænge.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. (92), e52059, doi:10.3791/52059 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den røde mel bille, Tribolium castaneum tilbyder et repertoire af eksperimentelle værktøjer til genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser, herunder en fuldt kommenteret genom sekvens, transposon-baserede transgenese og effektiv RNA-interferens (RNAi). Blandt disse fordele, RNAi-baserede gen knockdown teknikker er kernen i Tribolium forskning. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi reaktion, hvilket gør det muligt at udføre RNAi enhver livsfase ved blot at injicere dobbeltstrenget RNA (dsRNA) i bille kropskavitet.

I denne rapport giver vi en oversigt over vores larvestadiet RNAi teknik i T. castaneum. Protokollen omfatter (i) isolering af den korrekte fase af T. castaneum larver til injektion, (ii) forberedelse for indstillingen injektion, og (iii) dsRNA injektion. Larve RNAi er en enkel, men kraftfuld teknik, der giver os hurtig adgang til tab af funktion phenotypes, herunder flere gen knockdown fænotyper samt en række hypomorphic fænotyper. Da næsten alle T. castaneum væv er modtagelige for ekstracellulært dsRNA larvestadiet RNAi teknik gør det muligt for forskerne at studere en lang række væv i forskellige sammenhænge, ​​herunder genetiske grundlag for organismal svar på det udendørs miljø. Desuden enkelhed denne teknik stimulerer mere studerendes engagement i forskning, hvilket gør T. castaneum en ideel genetisk system til brug i et klasseværelse indstilling.

Introduction

Den røde mel bille, Tribolium castaneum, er stigende popularitet i forskellige områder af biologi dels på grund af den lethed udføre RNA-interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserede gen knockdown teknikker gør det muligt for forskerne at udføre tab af funktion analyser uden anvendelse af komplekse genetiske metoder. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, hvilket gør det muligt at udføre RNAi på noget tidspunkt gennem simpel indsprøjtning af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ind billen kropskavitet 4-6. Samtidig knockdown af multiple gener er også muligt i T. castaneum ved at injicere to eller flere forskellige dsRNA-molekyler samtidigt 7,8. Derudover kan en række hypomorphic fænotyper genereres ved at reducere koncentrationen af injiceret dsRNA 8. Disse funktioner gør RNAi-baserede reverse genetiske teknikker attraktive alternativer til traditionelle fremadrettede genetik i T. castaneum. Da næstenalle T. castaneum væv er modtagelige for ekstracellulære dsRNA molekyler 9, denne teknik gør det muligt for forskere at undersøge en lang række væv i forskellige sammenhænge. Hertil kommer, at selv om denne betænkning fokuserer på at udføre RNAi i T. castaneum, mange her beskrevne procedurer finder anvendelse på andre insekter. Derfor er denne protokol er nyttig for dem, der ønsker at udføre tab af funktion analyser i deres kontekst af interesse i T. castaneum, samt for forskere, der ønsker at anvende en RNAi-baseret teknik til andre insekter.

Injektion dsRNA til larver, tillader funktionel analyse på en række bille livsstadier, herunder larve, puppe og voksne stadier 4,5,10. Vi har tidligere rapporteret vores overordnede larve RNAi forsøgsprotokol inklusive molekylærbiologiske procedurer 11. I den aktuelle rapport, fokuserer vi på at beskrive de injektionsprocedurer dsRNA, der er bedst forklares med visuelle hjælpere. Vi levererdetaljerede trin-for-trin injektion procedurer samt gode og dårlige injektion eksempler. Denne visuelle protokol supplerer vores tidligere protokol, og når de kombineres, giver de en mere omfattende visning af larvernes RNAi procedurer i T. castaneum. Derudover diskuterer vi parametre for dsRNA molekyler, der kan påvirke succes RNAi, anvendelsen af ​​RNAi-baserede analyser for fysiologisk forskning, samt anvendeligheden af ​​larvestadiet RNAi-protokollen i en undervisningssituation laboratorium.

Protocol

1. T. castaneum Aktier og dyrkning

  1. Beslut dig for en T. castaneum belastning skal bruges til forsøget.
    BEMÆRK: Flere lab-etablerede T. castaneum stammer er tilgængelige. Ga-1 (Georgien-1) er den parentale stamme af Ga-2, der blev brugt til genomsekvensering 3. Da Ga-1-deler de fleste DNA-polymorfismer (såsom enlige cellekernepolymorfi SNPs) med Ga-2, og er sundere end Ga-2 på grund af mindre indavl, er det ideelt til RNAi eksperimenter. Pu-11 er en anden praktisk belastning at bruge , da dens unikke forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) udtryk i fremtiden fløj primordier giver os mulighed for at skelne mellem den sidste larve stadie fra andre instars (se figur S4 Clark-Hachtel et al. 2013 12). Det er vigtigt at dokumentere, hvilke bille-stammen blev anvendt i forsøget, som genetiske baggrunde tilsyneladende betydeligt affect RNAi Fænotypers 13.
  2. Forbered T. castaneum kultur mel ved tilsætning af 5% (efter vægt) af præ-sigtet ølgær til mel organisk helhed-hvede (efter blanding, opbevares kulturen mel ved -20 ° C). Alikvot mel kultur (ved stuetemperatur) i 6 ounce plast Drosophila stock flasker (ca. 40 g / flaske).
  3. Kultur T. castaneum ved 30 ° C med 70% fugtighed. Brug en Fugtkontrolleret inkubator, hvis muligt. Tilføj 30-40 voksne pr kultur flaske (mand: kvinde-forholdet 1: 1) for at starte kulturen.
    BEMÆRK: Selvom skimmel er sjældent et problem ved 30 ° C, lavere temperaturer (såsom 25 ° C) med 70% fugtighed kan forårsage skimmelvækst i kulturen mel. Sænk fugtighed, hvis dette forekommer.
  4. Overfør de voksne til en ny kultur flaske hver anden uge i subkultur (se trin 5,2-5,5 til hvordan man isolerer voksne fra kultur mel).
    BEMÆRK: Det tager omkring tre uger at få det sidste stadie larver. Alternatholdsvis T. castaneum kulturer kan holdes ved en lavere temperatur (20-25 ° C), men med en længere dyrkningsperiode (udviklingsmæssige tid ved 25 ° C er omtrent dobbelt så stor som ved 30 ° C).

2. Udarbejdelse af løsninger og instrumenter til Larver dsRNA Injection

  1. Syntetisere dsRNA-molekyler homologe med målgenet ved in vitro transkription. Opbevar ved -80 ° C. Se Philip og Tomoyasu 2011 11 personer for detaljerede molekylærbiologiske procedurer. Se også diskussionen af ​​en række parametre, som skal tages i betragtning ved udformningen dsRNA molekyler.
  2. Lav 10 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,6 ved 25 ° C) ved blanding af 8,5 ml 1 M Na-2 HPO 4 med 1,5 ml 1 M NaH 2 PO4. PH kontrolleres med en pH-meter og justeres i overensstemmelse hermed.
  3. Lav 1 ml 10x injektion buffer ved at blande 10 ul 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,6 ved 25 ° C), 100 _6 L 0,5 M KCI, 100 pi af grøn mad farvestof og 790 pi dobbelt-destilleret vand (Hedeselskabet 2 O). Fortynd 10x injektion buffer til at 2x injektion puffer (200 pi 10x injektion buffer + 800 pi dobbeltdestilleret 2 O). Opbevar både 10x og 2x injektion buffere ved 4 ° C indtil brug.
  4. Forbered Sticky objektglas.
    1. Dække en hel glasplade med en form for genanbringelig lim til larvernes injektioner. For voksne eller puppe injektioner, lave to tynde strimler af lim langs de længere kanter af dias.
    2. Lad limen tørre i flere dage, hvilket sikrer at limen stadig tarvelige nok til at klæbe biller på glasset, mens også resterende smidige nok til at lette deres fjernelse efter injektion.
      BEMÆRK: Hvis limen bliver for klistret, så brug en finger, og tryk på den lim, hvilket vil reducere klæbrighed. Hver side kan indeholde op til 40 eller 50 biller, og kan genbruges, indtil det ikke sikkert at holde dyrene. Alterntivt kan dobbeltklæbende tape også anvendes, selv om båndet er undertiden ikke klæbende nok til at holde larverne.
  5. Lav en æterisering Basket.
    1. Fjern stemplet fra en 10 ml engangssprøjte og skæres sprøjten i halvdelen omkring 6 ml linje.
    2. Kassér den nederste halvdel af sprøjten. Kort opvarme snitfladen af ​​den øverste del af sprøjten med en gasbrænder, og hurtigt skubbe smeltet plast på et stykke nylonnet at lime masken på sprøjten. Klippes overskydende maske Når plasten hærder.
  6. Forbered ether flaske. Tilsæt 30 ml ether i en smal mund 100 eller 250 ml glasflaske. Tilføj flere stykker silkepapir for at forbedre fordampningen af ​​ether.
    BEMÆRK: Ether præsenterer en brandfare, og er også skadeligt. Behandl altid æter under en emhætte. Luk låget stramt mens der ikke er i brug.
    BEMÆRK: Is kan anvendes som et sikrere alternativ (som i et klasseværelse indstilling), selvom sedation er mindre effektiv.

3. Fremstilling af Larve injektionsapparatet

  1. Placer en XY mekanisk etape på en dissektionsmikroskop.
    BEMÆRK: XY mekaniske etaper er tilgængelige fra de store mikroskop selskaber. Alternativt kan billige mikroskop etaper også bruges til de fleste Dissecting mikroskoper med visse ændringer (se Materialer tabellen for eksempel).
  2. Placer en mekanisk nål manipulator nær XY mekaniske fase.
  3. Saml en injektionssprøjte. Brug en fire-vejs stophane (med Luer-forbindelser) til at tilslutte en 30 ml engangssprøjte til et glas nålholder, så manipulation af injektionssprøjten uden at påvirke trykket i kanylen (se Philip og Tomoyasu 2011 11 personer for det detaljerede injektionssprøjte samling).

4. Pulling kanyler

  1. Træk borsilicatglashulsfærer nåle (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm længde) med ennål aftrækker.
    BEMÆRK: Sutter P-87 eller P-97, skal du bruge indstillingen "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90" eller følg kapitel 2 i pipetten Cookbook: Tilhænger Cell, C. elegans, Drosophila, og zebrafisk - Anbefalede programmer. De optimale indstillinger varierer afhængigt af modellen af ​​nålen aftrækker. Indstillingen for en generisk Drosophila kanyle er et godt udgangspunkt.
  2. Opbevares trak nåle i en plastik sag (fx en plastik cd-omslag) og fastgør med aftagelig montage kit.

5. Isolering og Udvælgelse af larver

  1. Placer en # 25 sigte på en si-modtager.
  2. Anbring indholdet i kulturen flaske (biller og kultur mel) på sigte og støvtætte indholdet straks. Efterlad ikke indholdet på sigten uden sigtning, da larverne hurtigt vil forsøge at grave sig ned gennem sigten og går i stå. Aggressivt finkæmme indholdet at lade melet faldeigennem og forlader ældre larver (typisk 6 og 7. stadiums larver), pupper og voksne (sammen med deres aflagte neglebånd, exuviae) bag på toppen af si.
  3. Overfør de resterende i sien (biller og exuviae) for at frøet pan materialer. Hold trykke på panden for at forhindre biller i at undslippe.
  4. Fjern exuviae og mel partikler tilbage på overfladen af ​​biller ved forsigtigt at blæse over frø pan.
  5. Tryk på frø pan at flytte indholdet til bunden af ​​gryden. Så, lad gryden uudnyttet i flere sekunder. Vent for de voksne, som er mere mobile end andre faser, til at komme ud fra bunken. Fjern voksne ved anvendelse af en art pensel (fx 1 cm bredde).
  6. Separat pupper ved forsigtigt at banke frø pan samtidig holde mundingen af ​​panden lidt nedad, som pupper tendens til at rulle hurtigere mod mundingen. Brug en pensel til at fjerne pupper, så kun larverne på seed panden.
  7. Place isoleret larver i en ren petriskål. Vælg et passende tidspunkt af larver til injektion og placere dem i en separat petriskål.
    BEMÆRK: Tidligt sidste stadie larver (1-2 dag efter den sidste larve fældningen) er ofte egnede, når man analyserer RNAi effekt på voksne morfologier samt metamorfose. Det er dog nogle gange nødvendigt at udføre RNAi på den næstsidste (eller endnu tidligere) tidspunkt at evaluere tidlige gen-funktion (fx figur 3E-3H. Se også Clark-Hachtel et al. 2013 12). Brug pupper som en størrelse reference til identificere stadiums larver. Det sidste stadie larver er lidt længere end pupper. Alternativt kan pu-11 anvendes til at identificere den sidste stadiums larver samt bestemme tidsforløbet for udviklingen af sidste stadiums larver (figur S4 Clark-Hachtel et al. 2013 12).
  8. Lad den valgte larver i en petriskål indtil æterisering. Anbring restenaf larver og andre etaper af biller (såsom pupper og voksne) tilbage i en kultur flaske med mel og returnere det til inkubatoren.

6. Fremstilling af kanyler

  1. Placer en tidligere trukket glas nål på et objektglas ved hjælp af enten klæbrig tack eller dobbeltklæbende tape. Ved hjælp af pincet, teste trak ende af nålen, mens du kigger gennem dissektionsmikroskop at se, hvor spidsen bøjninger. Grab området lidt mod spidsen side af, hvor nålen bøjer med pincet og drej for at bryde.
  2. Holde gode nåle og kassér andre. Overvej en god nål som har en åbning, der er hverken for stor eller for lille (ca. 0,05 mm i diameter. Figur 1A og 1B), og er vinklet til at gøre penetration af larvestadiet neglebånd lettere (figur 1B og 2A-2B). Overvej en dårlig nål som (i) for lille, hvilket gør optagelse af dsRNA løsning i nålen vanskecult (trin 7) (figur 1D og 2D), (ii), for stor, hvilket larvernes skade og eventuel letalitet efter injektion (figur 1C og 2F), (iii) stump, hvilket gør gennemtrængning af kutikula vanskelig og stigende skade.
  3. Stik nålen ind nåleholderen.
    1. Først skru spidsen af ​​nålen og placer den bagerste ende af kanylen ind i holderen drikkepenge. Derefter placere gummipakning under holderens spids (mindst 1 cm fra den bagerste ende af glasset nål).
    2. Sæt bagsiden af ​​nålen ind i holderen, med gummipakningen helt ind i åbningen af ​​nåleholderen. Skru spidsen tilbage i holderen.
  4. Placer de samlede nåleholder på nålen manipulator. Hold nåleholderen tæt på vandret. Justér manipulatoren, så spidsen af ​​nålen er placeret i centrum af den opfattelse, når man ser gennem MICRoscope.

7. Forhåndsudsendelse dsRNA opløsning ind i Needle

  1. Forbered dsRNA injektionsopløsning lige før injektion ved at justere koncentrationen med Hedeselskabet 2 O og blande dsRNA opløsningen med lige volumener af 2x injektion puffer (trin 2.3). Hold den blandede opløsning på is. Se diskussion om dsRNA koncentration.
  2. Skær spidsen af ​​en 20 ul éngangspipettespids. Afpipetteres 10 ul af opløsningen i den trimmede pipettespidsen. Fjern forsigtigt pipettespidsen fra pipetten samtidig holde væsken på spidsen ved at give modtryk. Alternativt fjern forsigtigt spidsen og derefter flytte løsningen på enden af ​​spidsen ved at give tryk ved hjælp af en finger.
  3. Anbring pipettespidsen med dsRNA løsning på mikroskopbordet hjælp klæbrig tack med åbningen vendt mod spidsen af ​​nålen.
  4. Ser gennem mikroskopet, flyt langsomt indlæst spids mod nålen, indtil spidsen afnålen er lige inden den indlæste pipettespidsen og i opløsningen.
  5. Mens du ser gennem mikroskopet, forsigtigt trække sig tilbage på stemplet i injektionssprøjten til langsomt at trække dsRNA'et opløsningen i nålen.
    BEMÆRK: Du må ikke overbelaste nålen. Da udgangen af ​​dsRNA opløsningen nærmer sig spidsen af ​​nålen, nedsætte hastigheden for at trække og stoppe indlæsning af opløsningen, før spidsen af ​​nålen ville nå luft. Hvis luft når spidsen, vil opløsningen hurtigt trukket ind i nåleholderen, hvilket resulterer i alvorlige problemer forurening. Detaljerede rengøring procedurer nåleholderen er beskrevet i Philip og Tomoyasu 2011 11 personer.
  6. Fjern trykket fra injektionssprøjten og nålholderen ved at åbne hanen. Derefter flyttes pipettespidsen væk fra spidsen af ​​nålen. Hæv nålen op fra scenen for at undgå utilsigtet at beskadige nålen mens placere larverne på scenen. Fjern den tømte pipettespidsen fra scenen.
  7. 8. dsRNA Injektion

    1. Placer larver i æterisering kurven. Brug mindre end 10 larver hvis lære teknikken. Brug 30-40 larver i en runde en gang komfortabel med teknikken.
    2. Anbring kurven med larver i æteren flaske og luk låget.
      BEMÆRK: Ether præsenterer en brandfare, og er også skadeligt. Udfør dette trin under en emhætte.
    3. Etherize larver til omkring 3 min. Kontroller larver bevægelse efter 3 min. Læg dem tilbage i æteren flaske til en anden 30 sek, hvis de stadig er i bevægelse. Må ikke etherize for mere end 5 min, da dette kan øge dødeligheden.
      BEMÆRK: Den optimale æterisering kan variere, afhængigt af temperatur og luftfugtighed.
    4. Overfør æteriseret larver fra kurven til non-stick kanten af ​​et glas klæbrig dias. Brug pincet og mens du kigger gennem mikroskopet, afhente hver larver én efter én og placere dem på diaset. Læg dem på tværs og forsigtigt trykke ned deres kroppe from hoved til hale med pincet, let strække dem som du går, for at sikre, at de er fastgjort på diaset.
    5. Placer klæbrig objektglas med larver på objektbordet.
    6. Sæt dsRNA'et indlæst nål forsigtigt ind i dorsalsiden af ​​larverne at undgå at beskadige centralnervesystemet. Også undgå ryg midterlinjen som larve hjerte er placeret her. I denne og de efterfølgende trin, skal du altid bruge scenen til at flytte larverne til nålen (i stedet for at bruge nålen manipulator at flytte nålen).
      BEMÆRK: Den specifikke injektionssted ligegyldigt som RNAi i T. castaneum synes at være systemisk. Det er dog som regel lettest at injicere i den dorsale side af thorax eller abdominal segmenter.
    7. Efter indsættelse nålen ind i larverne, træk nålen lidt tilbage for at give plads til dsRNA'et at indtaste larvernes kroppen hulrum.
    8. Skub forsigtigt på injektionssprøjten, indtil larverne turn grøn (eller farven på injektionsstedet buffer) og se stretched og fuld.
      BEMÆRK: Hvis lære teknikken, så prøv at injicere så meget som muligt at bestemme mængden af ​​løsning, der kan injiceres i en larve uden væsentlig dødelighed. Det er generelt omkring 0,5-0,7 ul.
    9. Fjern nålen fra larverne. Mens fjerne kanylen, let trække sig tilbage på sprøjten injektion for at undgå dsRNA'et tab (også passe på ikke at trække i luft).
    10. Injicere al larver på diaset. Sørg for at fjerne larver, der ikke var held injiceres. Komplet injektion før larver vågner (omkring 10 minutter).
    11. Fjern dias med injiceret larver fra injektionen mikroskop og lade dias for 5 flere minutter, indtil alle larver komme fra æterisering.
    12. Med pincet og under et dissektionsmikroskop, forsigtigt løfte larverne fra hoved til hale at frigøre dem fra den klæbrige dias. Placer nyligt udgivet larver i en ren petriskål. Lad larver på petriskålen i 10-15 minutter for at tillade injektion wound til at størkne.
    13. Placer larver i en ny flaske med rent mel og etiket passende herunder stamme-navn, typen af ​​dsRNA injiceret koncentration af dsRNA antal larver injiceret, og datoen.
    14. Kultur den injicerede larver ved 30 ° C med 70% fugtighed. Overhold larverne for RNAi fænotyper regelmæssigt.
      BEMÆRK: Det sidste stadie larver forpupper sig inden for 7 dage. Derefter vil pupper Eclose til voksne efter 7 dage (hvis der ikke er noget unormalt i timingen forårsaget af RNAi).

    9. Bekræftelse af Knockdown og fænotypiske analyser

    1. Overvej vurdere effektiviteten af ​​RNAi vælte af forskellige molekylærbiologiske teknikker, såsom kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR) og Western blotting. Se Miller et al. 2012 7 personer og Philip og Tomoyasu 2011 11 personer for detaljeret qPCR og Western Blot-protokollen, hhv.
    2. Analyser RNAi relaterede fænotyper.
      BEMÆRK: RNAi relateretfænotyper kan observeres på flere forskellige stadier og under forskellige dyrkningsbetingelser, afhængigt af de gener, der er målrettet mod. RNAi kan påvirke billen morfologi, metamorfose, fysiologi og adfærd. Hvor ofte tilstedeværelsen af ​​fænotype kontrolleres, og på hvilke betingelser biller opdrættes bør være skræddersyet til de specifikke spørgsmål, som undersøges gennem RNAi.

Representative Results

Et af de vigtigste skridt for en vellykket injektion er at gøre en god nål. Som beskrevet i trin 6, spidsen af nålen skal brydes inden injektion T. castaneum. Eksempler på gode og dårlige nåle er vist i figur 1. En god nål har en skarp og stiv spids, med en cirka 0,05 mm i diameter (Figur 1B).

Figur 2 viser en succesfuld injektion (figur 2A og 2B) samt flere tilfælde af mislykkede injektioner (figur 2C-2F). Med en passende størrelse kanyle nålespidsen trænger larvestadiet kutikula med minimal modstand (figur 2A), og dsRNA opløsning (grøn) strømmer ind i larver uden nogen lækage (figur 2B). Må ikke over-Inject, da det vil medføre overløb af dsRNA'et løsning, selv med en korrekt størrelse kanyle (Figur2C). Hvis spidsen af nålen er for tyndt, nålespidsen ofte ikke at trænge ind i larvernes kutikula og bøjninger, hvilket gør det vanskeligt injektion (figur 2D). Hvis dette sker, trimning nålespidsen undertiden hjælper. Større nåle er ofte stadig brugbar, end med nogle vanskeligheder i at trænge ind i larvernes neglebånd (Figur 2E). Imidlertid er en stor mængde af dsRNA opløsningen nemt skubbes ud fra nålen, selv med et let tryk på injektionssprøjten, hvilket ofte resulterer i en overflod af dsRNA opløsning (figur 2F).

Ved udførelse af RNAi, er det vigtigt at have en positiv kontrol for at vurdere, at RNAi fungerer korrekt, og en negativ kontrol for at verificere, at observerede effekt ikke er et ikke-specifik effekt af dsRNA eller en konsekvens af injektion procedurer (såsom skade forårsaget ved injektion, eller abnormitet fra æterisering). Injektion af dsRNA målretning EYFP kan tjene som engod positiv kontrol, når du bruger pu-11 stammen 5,7. Når EYFP dsRNA indsprøjtes i den sidste larvestadiet, kan der observeres en signifikant reduktion i EYFP signal i de fremtidige fløj primordier så tidligt som én dag efter injektion (figur 3A). Den knockdown af EYFP er fuldstændig to dage efter injektion af EYFP dsRNA (figur 3B), og denne knockdown fortsætter gennem puppestadiet (figur 3C og 3D), og gennem hele livet af billen hvis dsRNA'et koncentrationen er høj nok (såsom 1 pg / pl) 7. EYFP dsRNA kan også anvendes som en negativ kontrol, da det er en ikke-endogen gensekvens og skulle ikke forårsage morfologiske og fysiologiske forstyrrelser (figur 3A-3D).

Vi forudsat billeder af larvernes RNAi for vestigial (VG), en kritisk fløj gen 12, som et andet eksempel på, hvordan effektiv denne injektion-baserede RNAi teknik er i T. castaneum. Når dsRNA til vg injiceres i næstsidste stadie larver (ét trin før den sidste larvestadiet), kan der observeres et fuldstændigt tab af vingen strukturer i puppestadiet (figur 3E og 3F). Den resulterende voksne også helt mangler fløj strukturer (figur 3G og 3H). RNAI- resultat for vg eksemplificerer både robusthed og systemiske karakter RNAi i T. castaneum.

Figur 1
Figur 1: (A) Eksempler på ubrudte, gode og dårlige nåle (B) Spidsen af et godt brudt god nål (C) spidsen af en knækket kanyle, der er for stor og sløv (D) Spidsen... af et brød n nål, der er for tyndt. Skalapanelerne (rød) er 0,05 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:... (A) en korrekt størrelse kanyle indsat i det sidste stadium larve (B) Larver passende injiceret med grønne dsRNA opløsning (C) Overflow dsRNA opløsning ved injektionsstedet, forårsaget af over-injektion (D ) En tynd nål ikke at trænge ind i larvernes kutikula. (E) en stor kanyle indsat i det sidste stadium larve. (F) Larver injiceret med en stor nål, hvilket resulterer i overløb og lækage af dsRNA opløsning. Pile angiver nåle.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Eksempler på succesfulde RNAi i T. castaneum. (AD) Sidste larve injektion af EYFP dsRNA resulterer i en reduktion af EYFP ekspression. (A) Larver én dag efter injektionen. (B) Larver to dage efter injektion. (C) Kontrol pupper. (D) Pupper følger larvestadiet EYFP dsRNA injektion. De negative kontroller puffer injektion (A, B) og dsRed dsRNA injektion (C, D). Pilespidser og pile indikerer EYFP udtryk eller mangel på samme i den fløj primordier og øjne, hhv. (EH) Penultimative larvestadiet RNAi til vg. (E) Vild-typen puppe. (F) vg RNAi puppe. Den manglende fløj strukturer er allerede synlige på puppestadiet (pil). G) Vild-typen voksen. (H) vg RNAi voksen. Wing relaterede strukturer mangler helt (pil). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er en række vigtige spørgsmål, der skal tages i betragtning for at sikre succes for RNAi, herunder længden og koncentrationen af ​​de dsRNA molekyler, konkurrence mellem forskellige dsRNA-molekyler (når de forsøger flere banke ned), og muligheden for ikke-tilsigtede effekter (OTE).

dsRNA Længde

Længden af dsRNA molekyler påvirker effektiviteten af den systemiske RNAi reaktion med et længere dsRNA er mere effektive til at udløse RNAi 7,14,15 (selvom længere grænse for dsRNA er i øjeblikket ukendt). DsRNA længde skal være længere end 50 bp til at inducere effektiv RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellem 150 bp og 500 bp synes at være ideelt for RNAi eksperimenter. Selvom der også kan anvendes længere dsRNA molekyler, vil de have en øget chance for OTE og gen-kloning trin bliver stadig vanskeligere.

dsRNA Koncentration

ve_content "> Forskellige grader af gen knockdown kan opnås afhængigt af koncentrationen af ​​dsRNA. 1 pg / pl synes at være en rimelig startkoncentration, som ofte frembringer en nær-nul fænotype (kan variere afhængigt af genet (generne) af interesse ). RNAi kan udføres med en højere koncentration (fx 7-8 pg / pl) for at opnå en stærkere RNAi fænotype. RNAi med en seriel fortynding af dsRNA kan undertiden være fordelagtigt at producere en række hypomorphic fænotyper (Supplemental Information Tomoyasu et al. 2009 8, og Borràs-Castells upublicerede data).

RNAi Konkurrence

Multiple gen knockdown kan opnås i T. castaneum ved at injicere flere forskellige dsRNA molekyler samtidigt. Imidlertid er det også kendt at have flere forskellige dsRNA-molekyler til stede i organismen ofte resulterer i konkurrence mellem dsRNAs for adgang til RNAi komponenter (f.eks Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, og Yang et al. 2009 18). Selv om det er muligt, firedobbelt RNAi (eller flere) kan være udfordrende, da det sandsynligvis vil medføre en betydelig reduktion af RNAi effektivitet for alle fire målgener.

Off-målretning

OTE er en iboende bekymring for RNAi-baserede tilgange. En måde at minimere OTE at identificere regioner i målgenet, der deler lignende sekvenser med andre gener og undgå disse regioner ved udformningen dsRNA. En simpel BLAST analyse mod T. castaneum forudsagt gen sæt kan identificere sådanne regioner. Flere online værktøjer giver også evaluering af potentielle OTE (fx e-RNAi 19). Udførelse RNAi til to ikke-overlappende regioner af målgenet er en nem og effektiv måde at fjerne muligheden for, at observerede fænotyper er forårsaget af OTE. Muligheden for OTE minimeres, hvis RNAi til to ikke-overlappende regioner producere de samme fænotyper (medmindre de to ikke-overlappende regioner deler en lignende sekvens).

Evaluering gen knockdown af andre end fænotypiske analyser midler er ofte kritisk for effektivt stede RNAi-relaterede data. To store måder at evaluere gen knockdown er QRT-PCR og Western blot-analyse. QRT-PCR er en bekvem måde at måle niveauet af mål-mRNA, og er blevet anvendt i mange RNAi-relaterede undersøgelser, herunder dem i T. castaneum (se Miller et al. 2.012 7 for eksempel). Howevis, skal der udvises forsigtighed, da vi for nylig har set nogle tilfælde, hvor mål-mRNA-niveau er opreguleret af RNAi (selvom det protein produkt er nedreguleret) (Borràs-Castells upublicerede data). Det er i øjeblikket uvist, om dette RNAi inducerede mRNA opregulering kan være udbredt eller unikke for bestemte gener. Western blot-analyse er en anden måde at bekræfte gen knockdown. Denne fremgangsmåde er helt pålidelig som den måler størrelsen af ​​det endelige protein-produkt. Kravet om et specifikt antistof mod proteinet produkt af målgenet er en ulempe ved denne fremgangsmåde. Ved hjælp af flere uafhængige målinger foruden fænotypeanalyse vil øge tilliden hos de fænotypiske data opnået ved RNAi-baseret analyse.

Siden sin undfangelse i T. castaneum, RNAi er primært blevet brugt til at studere genfunktion i udvikling og mønster-dannelse. Disse T. castaneum udviklingsmæssige undersøgelser har været en stor succes i karakterizing evolutionært bevaret og afveg funktioner af gener (revideret i Denell 2008 1 og Klingler 2004 2). Men RNAi-baserede studier i T. castaneum er ikke begrænset til udviklingsmæssige biologi. For eksempel kan RNAi anvendes til at undersøge genfunktion i en lang række fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, herunder stress tolerance, rovdyr, aggression, valg af mage, aktivitetsmønstre og forsvarsmekanismer.

Et vanskeligt at anvende RNAi til disse sammenhænge er sandsynligheden for, pleiotropiske effekter. Ofte vil gener af interesse har en række roller hele T. castaneum livscyklus, hvilket gør fjernelse af gener uden utilsigtede fænotypiske virkninger vanskelig. Imidlertid kan evnen til nemt at udføre RNAi på forskellige stadier ofte være en effektiv strategi til at undgå disse pleiotrope virkninger. For eksempel kan udføre RNAi hos voksne i stedet for larver eller pupper tillade os at omgå util-tendens dødelighed forårsaget af gen knockdown under tidlig udvikling. Fleksibiliteten af RNAi respons T. castaneum således gør denne model til et attraktivt valg for at tilpasse RNAi til eksperimenter af genfunktion i fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner.

T. castaneum system er også ideel til brug i en undervisningssituation laboratorium. T. castaneum kan let dyrkes på et mel / gær blandingen ved stuetemperatur (25 ° C) uden hyppige subkultur og RNAi teknikker i T. castaneum er enkle nok til at blive tilpasset til et laboratorium med unge, læring forskere. Da RNAi er ved at blive en vigtig teknik i en række biologiske områder, er det afgørende, at de studerende er udsat for denne teknik. Den ligetil karakter larvestadiet RNAi teknik i T. castaneum opfordrer også flere studerende til at blive involveret i forskning, hvilket gør T. castaneum en oplagt kandidat til et klasseværelse orienteret genetisk system. </ P>

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Center for Bioinformatik og Functional Genomics (CBFG) på Miami University for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af Miami University opstart tilskud (YT), og National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organic whole wheat flour  Heartland Mill Inc. Kansas G1
Brewer’s yeast MP Biomedicals 2903312 Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.
6 oz plastic Drosophila stock bottles Fisher Scientific 11-888
Sieve Fisher Scientific  04-881N 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. 
Sieve Fisher Scientific  04 881 10P 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm)  Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.
Sieve receiver Fisher Scientific  04-866B 8 in. diameter
1.5 Quart spouted sample pan  Seedburo Equipment Co. Model 33 collection pan
Incubator BioCold Environmental Inc BC26-IN Keep it 30 °C with 70% humidity.
Na2HPO4 Fisher Scientific  S374500
NaH2PO4 Fisher Scientific S397-500
KCl Fisher Scientific  P217-500
Food dye  Kroger green, blue, or red preferable
Microscope glass slide  Fisher Scientific  22-038-103
Tack-It Over&Over Aleene's Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.
Plastic CD case Amazon
Boroslilicate glass capillary Sutter Instrument BF100-50-15 O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament
Needle puller Sutter Instrument P-87 or P-97 
Removable mounting putty  Loctite Fun-Tak
Compressed gas duster OfficeMax OM96091
Forceps Fine Science Tool 11231-30 Dumoxel #3 (to manipulate beetles)
Forceps Fine Science Tool 11252-20 INOX #5 (to break needle tips)
Ethyl ether, anhydrous  Fisher Scientific  E138-500
Nylon mesh Flystuff/Genessee Scientific 57-102 120 µm pore size/49% open area
Media bottle, 100 ml VWR 89000-926
Stereomicroscope Zeiss SteREO Discovery V12. Injection microscope.
Stereomicroscope Fisher/Zeiss 12-070-513  Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.
X-Y mechanical stage  Zeiss 4354600000000000
X-Y mechanical stage  Microscopenet.com A512 Inexpensive alternative
Manipulator Narishige M-152
Magnetic stand Narishige GJ-1 
Glass capillary holder Narishige IM-H1 
30 ml Disposable syringe BD syringe 309650 BD Luer-Lok Tip
Four-way stopcock  Cole-Parmer Instrument Co. EW-30600-03 Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip
Art paint brush Amazon Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece Any general paint brush will work.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Genetics. 180, 1779-1786 (2008).
  2. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
  3. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  4. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  5. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  6. Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
  7. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
  8. Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
  9. Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
  10. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
  11. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
  12. Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle. Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).
  13. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
  14. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).
  15. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).
  16. Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
  17. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  18. Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental biology. 333, 215-227 (2009).
  19. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

Step 4.1 was updated from:

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

to

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics