Die Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie und einer Kundendatenbank zu den Bakterien Indigene auf eine einzigartige Höhle Umwelt (Kartchner Caverns, AZ, USA) Charakterisieren

Biology

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Zhang, L., Vranckx, K., Janssens, K., Sandrin, T. R. Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA). J. Vis. Exp. (95), e52064, doi:10.3791/52064 (2015).

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Abstract

Protocol

Achtung: Nicht identifizierte Bakterien aus jeder Umgebung kann pathogen sein und müssen mit Vorsicht mit geeigneten Biosicherheit Protokolle behandelt werden. Arbeit mit lebenden Kulturen müssen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank mit biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Verfahren durchgeführt werden. Mehr Informationen über BSL-2 Verfahren ist im CDC / NIH-Handbuch mit dem Titel "Biosicherheit in Mikrobiologischen und Biomedizinischen Laboratorien", Seiten 33 bis 38 zur Verfügung. Das Dokument ist im Internet unter http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Geeignete Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Laborkittel / Kleider, Schutzbrille und Nitril oder Latex-Handschuhe, zu tragen. Standard mikrobiologische Verfahren und Vorsichtsmaßnahmen sind zu beachten, und biologischer Abfälle müssen fachgerecht entsorgt werden.

Bakterien in dieser Demonstration verwendet wurden Kartchner Caverns isoliert,AZ, USA, aus vier Umgebungen, einschließlich Trockenhöhlensinter, Flussstein, feuchten Höhlensinter und Stalaktiten Tropf (Tabelle 1). Alle Isolate wurden von 16S rDNA identifiziert und bei -80 ° C in 25% Glycerin-R 2 B-Medium gehalten. Alle Experimente wurden bei RT abgeschlossen.

Hinweis: Wir empfehlen mit dem gleichen Probenvorbereitungsmethode auf Massenspektren für die Datenbankerstellung und Massenspektren der Unbekannten zu erwerben. Probenvorbereitungsverfahren wurde zuvor auf Spektrum Qualität und Reproduzierbarkeit 3 beeinflussen gezeigt. Die Verwendung eines anderen Probenvorbereitung kann falsche Identifizierung der Unbekannten, vor allem bei höheren taxonomischen Auflösung (zB, auf Stammebene) führen gewünscht wird.

1. Die Ablagerung auf der MALDI-Target

Achtung: Mehrere Protokolle zu erhalten Proteinextrakte erfordern die Verwendung von Säuren und organischen Lösungsmitteln, die in Übereinstimmung mit GUID verwendet werden müssenelines und Informationen in ihren jeweiligen Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS) enthalten. Geeignete PSA müssen getragen werden kann und von Art und Menge der verwendeten Chemikalien variieren (zB Laborkittel / Kleider, Handschuhe, Schutzbrille und Atemschutz muss bei der Arbeit mit erheblichen Mengen an toxischen, brennbaren Lösungsmitteln, wie Acetonitril verwendet werden, und korrosiven Säuren, wie Ameisensäure und Trifluoressigsäure).

  1. Kaution 1 ul Proteinextrakt, die keine lebensfähigen Zellen auf eine Edelstahlplatte MALDI-Target und trocknen lassen (unter Verwendung von geeigneten, zuvor beschriebenen Protokolle 11-13 erhalten). Überlagern der getrockneten Protein-Extrakt mit 1 ul Matrixlösung (α-cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure Lösung) und trocknen lassen.
  2. Für jede biologische Replikation, vor Ort eine entsprechende Anzahl von technischen Wiederholungen (5-20 technische Replikate). Hier, vor Ort 10 technische Wiederholungen für jede biologische Replikation und 3 biologischen Replikaten were vorbereitet.
    Hinweis: Wir empfehlen, mit einem polierten Stahl MALDI Zieltafel bei der Verwendung der Proteinextraktion Probenvorbereitung. Mit geschliffenem Stahl Zieltafeln kann zu verbreiten und unabsichtlichen Vermischung der verschiedenen Proben außerhalb der einzelnen Probenvertiefungen.
  3. Kaution 1 ul Eichsubstanz Standard auf die Zielplatte und lassen Sie ihn trocknen. Overlay mit 1 ul Matrixlösung und lassen Sie ihn trocknen.
  4. Deposit 2 ul Matrixlösung auf die Zielplatte als negative Kontrolle.

2. Massenspektren Acquisition

  1. Verwenden Sie ein MALDI-TOF-Massenspektrometer mit einem Stickstofflaser (λ = 337 nm) ausgestattet und mit Bruker Flexcontrol-Software betrieben.
  2. Sammeln jedes Massenspektrum in positive linearen Modus durch die Ansammlung von 500 Laserschüsse in 100 Schuss-Schritten. Stellen Sie den Spannungsionenquelle 1 bis 20 kV; Ionenquelle 2 Spannung auf 18,15 kV; und der Linsenspannung auf 9,05 kV. Beachten Sie, dass diese Parameter Instrument spezifischenFIC und könnten Anpassung auf andere Instrumente benötigen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  3. Setze die Masse-Ladungs-Bereich für die automatische Spektrenauswertung 2-20 kDa pro Ladung. Verwenden Sie die Schwerpunktspitzenerkennungsalgorithmus. Stellen Sie die Mindestauflösung Schwelle bei 100 Da. Stellen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (S: N) Schwelle bei 2. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle bei 100.

3. Aufbau von Datenbanken

  1. Datenbankdesign
    1. Erstellen Sie eine neue Datenbank in BioNumerics 7.1 mit dem "Neue Datenbank-Assistent".
    2. Erstellen Sie ein Spektrum Experiment Art, zB Maldi, mit Befehlen in der "Experiment Typen" Panel.
    3. Erstellen Sie die Ebenen mit dem "Datenbank-Design-Panel". Fügen Sie eine neue Ebene mit dem "Ebene> Neue Ebene ..." Befehl im Menü "Datenbank". Hier erstellen "Species" Ebene "Biologische replizieren" Niveau "und" Technische replizieren "Ebene JEWEILIGENely.
  2. Importieren und Vorverarbeitung von rohen Massenspektren
    1. Exportieren Sie die rohen Massenspektren als .txt-Dateien mit FlexAnalysis indem Sie im Menü "Datei" die "Export> Massenspektrum" -Befehl.
    2. Importieren Sie die rohen Massenspektren (.txt-Dateien) in die Datenbank in der Ebene der technischen Replikaten.
    3. Vorverarbeitung der rohen Massenspektren.
      1. Import und resample (unter Verwendung einer quadratischen Anpassungsalgorithmus).
      2. Führen Sie eine Basis Subtraktion (mit einer Walz Scheibe mit einer Größe von 50 Punkten).
      3. Berechne Lärm [Continuous Wavelet-Transformation (CWT)], glatt (Kaiser-Fenster mit einer Fenstergröße von 20 Punkten und beta von 10 Punkten), und führen Sie eine zweite Basisliniensubtraktion (Rollscheibe mit einer Größe von 200 Punkten).
      4. Detektieren Peaks [CWT mit einer minimalen Signal-Rausch-Verhältnis (S: N) von 10].
    4. Nach Vorverarbeitung, speichern charakteristische Muster jedes Massenspektrum, wie zum Beispiel Peaklisten Peak,Größen Spitzenintensitäten, S: N, usw., die in der Datenbank.
  3. Erstellen von Verbundmassenspektren
    1. Erstellen Sie zusammengesetzte Spektrum von vorverarbeiteten Spektren mit Hilfe des "Fassen Sie ..." Befehl im Menü "Analyse". Wählen Sie die "biologische Replikation" als Zielniveau.
    2. Hier kombinieren Massenspektren von 10 technische Replikate der gleichen Kolonie, ein Verbundmassenspektrum für die Kolonie zu erhalten, was zu drei Verbundmassenspektren für diesen Isolat an der "Biologische replizieren" Ebene.
    3. Hier eine Zusammenfassung der drei zusammengesetzten Spektren zu einem Verbundspektrum für die in der "Species" Ebene zu isolieren erstellen.
      Hinweis: Der zusammengesetzte Spektrum ist die Punkt-für-Punkt-Mittelwert der technische Replikate. Repliziert mit Ähnlichkeit (Pearson-Korrelation) auf den Mittelwert von weniger als 95% (Standardeinstellung) aus dem Verbund ausgeschlossen. Peaks auf der zusammengesetzten Spektren sind nur aufgerufen, wenn sie vorhanden sind, in 75% (Default-Einstellung) der enthaltenen Wiederholungen. Für die biologischen Replikate wurden diese Einstellungen 90 und 60% betragen.

4. Massenspektrum Data Analysis

  1. Wählen Sie die Einträge in der Datenbank, und erstellen Sie einen Vergleich, indem Sie in der "Vergleiche" Feld den Befehl "Neue Vergleich".
  2. Hier verwenden Sie den Massenspektren an der "Technischen replizieren" und / oder "Biologische replizieren" Ebenen, um Vergleiche und Analysen zeigen.
  3. Similarity-Cluster-Analyse und mehrdimensionale Skalierung (MDS)
    1. Erstellen von Gruppen mit Farben. Wählen Sie die drei biologischen Verbundmassenspektren und klicken Sie auf "Neue Gruppe erstellen aus Auswahl" Befehl im Menü "Gruppen", um eine Gruppe für die entsprechende Isolat erstellen. Bestimmen Sie automatisch eine Farbe für diese drei Massenspektren verwendet.
    2. Alternativ definieren Feld Staaten mit entsprechenden Farben mit den Befehlen in der "Datenbankeinträge "Panel, so dass jede Gruppierung auf der Grundlage dieser definierten Feld verwendet die gleiche Farbe für diese Gruppe definiert.
    3. Führen Sie die Clusteranalyse. Klicken Sie auf den "Berechnen Clusteranalyse" Befehl im Menü "Clustering". Auf der Vergleich Einstellungen Seite 1, wählen Sie die "Pearson-Korrelation" und lassen Sie andere Parameter als Standard. Auf Seite 2 wählen Sie "UPGMA". Klicken Sie dann auf "Fertig stellen".
    4. Erhalten MDS Grundstück mit dem "Multi-dimensionale Skalierung ..." Befehl im Menü "Statistik".
  4. Peak-Matching
    1. Klicken Sie auf das Spektrum Typ "Maldi" in der "Experimente" Panel. Wählen Sie dann "Layout> Bild anzeigen". Spectra als Gelbanden angezeigt.
    2. Führen Spitzenanpassung mit dem "Do Spitzen Matching" Befehl im Menü "Spectra".
  5. Ermittlung von Spitzenklassen
    1. Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse (PCA). Markieren Sie die "Maldi "Experiment Typ in der" Experimental "Platte und verwenden Sie die" Hauptkomponentenanalyse ... "Befehl im Menü" Statistische "PCA durchzuführen.
    2. Führen bidirektionale Clustering. Klicken Sie auf die "Statistik> Matrix Mining" ... im Fenster "Vergleich". Die Intensität der Peaks zu den Spitzenklassen abgestimmt ist vertreten mit verschiedenen Farben (Heatmap).

5. Bakterien Identifikation mit einer Kundendatenbank

  1. Ähnlichkeit Koeffizient-basierte Verfahren
    1. Erstellen Sie einen Vergleich und erzeugen ein Dendrogramm auf Basis von Massenspektren an der "Technischen replizieren" Niveau wie in Schritt 4.3.3 beschrieben. Speichern Sie die Dendrogramm zum Vergleich der Ähnlichkeit.
    2. Wählen Sie eine unbekannte Massenspektrum, und klicken Sie auf "Analysis> Identifizieren Sie ausgewählte Einträge". Das Dialogfeld Identifikation erscheint.
    3. Wählen Sie den "Vergleich auf der Basis" Sichter des Typs (oder ein gespeichertes classifier) und klicken Sie auf "Weiter". Auf der nächsten Seite wählen Sie die gespeicherte Dendrogramm als Referenz Vergleich und klicken Sie dann auf "Weiter".
    4. Wählen Sie die "Grund Ähnlichkeit" als Kennzeichnungsmethode und klicken Sie dann auf "Weiter".
    5. Wählen Sie die "maximale Ähnlichkeit" als Bewertungsmethode. Geben Sie in den entsprechenden Schwellenwerten und Minimaldifferenzwerte für jeden Parameter und klicken Sie auf "Weiter".
    6. Wenn die Berechnungen abgeschlossen sind, wird das Identifikationsfenster. In der "Ergebnisse" Panel werden die Mitglieder der Datenbank, die am besten die unbekannt aufgeführt.
    7. Speichern Sie die Projektidentifikation und Validierung der Identifizierung mit dem "Kreuzvalidierung Analyse" -Befehl in der "Identifikation Projekt" Panel.
  2. Potenzielle Biomarker-basierte Verfahren
    1. Definieren Spitzenklassen. Im Fenster "Matrix Mining", wählen Sie Gruppen von Gipfeln, die gemeinsame Eigenschaften und definieren Sie diese Spitzen als Spezific Spitzenklassen (potentielle Biomarker) mit "Spectra> Verwalten Spitzenklassentypen ..." im "Vergleichsfenster".
    2. Hier definieren spezifisch für jedes Isolat für alle 15 Isolate Spitzenklassen.
    3. Wählen Sie die Massenspektren der Unbekannten und passen die Spitzen dieser Spektren zu den definierten Spitzenklassen wie zuvor beschrieben.

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Representative Results

Die in dieser Demonstration gebaut Datenbanken hatte vier Ebenen, vom höchsten zum niedrigsten Ebene, einschließlich "Alle Ebenen", "Species", "Biologische replizieren" und "Technische Replikation" bezeichnet (Abbildung 1A). Die "Technische replizieren" Ebene enthalten alle vorverarbeiteten Spektren technische Replikate. Die "biologische Replikation" und "Species" Ebenen enthielt die Verbund (Zusammenfassung) Spektren. "Alle Ebenen" enthalten alle technischen Wiederholungsspektren sowie die ganze zusammengesetzte Spektrum.

Spectrum Zusammenfassungsverfahren sind in Abbildung 1 mit repräsentativen Peaks angezeigt. Jedes Mitglied Massenspektrum erscheint als dünne graue Linie. Das zusammengesetzte Spektrum wird als Linie rot gefärbt dargestellt. Benachbarten Spitzen werden mit einer anderen Farbe gekennzeichnet, um einfacher Sichtprüfung (1B) zu ermöglichen.

Tabelle 1 dargestellt. Die höchste Reproduzierbarkeit betrug 98,0 ± 1,4 für Bacillus-Arten B und die niedrigsten Reproduzierbarkeit betrug 89,4 ± 7,8 für Curvibacter Arten (Tabelle 1).

Clusteranalyse auf der biologischen replicate Ebene erleichtert die Visualisierung der hierarchischen Struktur in der komplexen Massenspektren-Daten. Wie in Figur 2 gezeigt, biologischen Replikate dicht beieinander, und 15 Arten von Bakterien gebildeten 15-Clustern. Eng verwandten Arten, zum Beispiel B. sp. A, B, D und E, neigten dazu, zusammen zu gruppieren. Jedoch Ausreißer zum Beispiel B. sp. C und F, wurden ebenfalls beobachtet. MDS Parzellen auf der Grundlage der Massenspektren an den "technischen und biologischen" Levels sind in Abbildung 3. MDS p gezeigtviele ergab eine klare, 3-D-Visualisierung der Ähnlichkeiten zwischen Spektren dieser Bakterien. Sowohl technische Replikate und biologischen Wiederholungen zeigte eine ähnliche Gruppierung (Abbildung 3 A und B).

Spitzenanpassung wurde verwendet, um Sätze von Peaks im Massenspektren unterscheiden. Spitzenanpassungsparameter einschließlich konstanter Toleranz (Punkte auf der x-Achse), lineares Toleranz (ppm) und die Spitzenerfassungsrate müssen vom Benutzer angegeben werden. Constant Toleranz und lineare Toleranz sind die Faktoren, die bei der Positionstoleranz der Spitzen unter Verwendung der Gleichung berechnen: Positionstoleranz = konstant Toleranz + lineare Toleranz × m / z. Mit zunehmender m / z, die Bedeutung der Konstante Toleranz vermindert. Spitzenerfassungsrate bedeutet, dass nur dann, wenn ein Spitzenwert an dieser Position für mehr als die festgelegte Rate des Spektrums gefunden wird, wird ein Spitzenklasse hergestellt. Ein Peak für ein oder mehrere Muster darstellt, eine Spitzenklasse. Wenn zum Beispiel der Spitzenwerterfassungsrate equals 10%, kann eine Spitzenklasse nur gemacht werden, wenn mehr als 10% der Spektren haben Peaks bei der Position. Davon ausgenommen sind niedrige Prävalenz Gipfel (in der Regel Geräuschspitzen) im Set mit technischen Replikaten. Wenn der Satz auf der zusammengesetzten Spektren biologischer Replikaten basiert, muss diese Zahl geringer sein als niedrige Prävalenz Peaks wurden bereits bei der Erstellung des zusammengesetzten Spektren gefiltert. In dieser Demonstration wurde Spitzenanpassung erfolgt über Massenspektren an der "Technischen replizieren" Niveau und die Werte dieser Parameter waren 1,9, 550 und 10%, respectively. Anhand ausgewählter Parameter wurden Peaks als entsprechen bzw. nicht entsprechen, was zu unterschiedlichen Spitzengruppen berücksichtigt. Ein Beispiel eines Spitzenpassenden Ergebnisse ist in Figur 4 mit 30 Wiederholungen eines einzigen Isolats (Bacillus Spezies A) gezeigt. Die entsprechenden Ergebnisse wurden in Form einer Tabelle, in der die rohe Intensität wie Farben vorhanden sind, visualisiert. Blau zeigt geringer Intensität und Rot zeigt hohe intensity. Basierend auf den Peakpassenden Ergebnisse können Benutzer Peak-Klassen, die Folgeanalysen erleichtern definieren.

Sowohl die Hauptkomponentenanalyse (PCA) (Supplementary Figur 1) und zwei Wege Clustering können die Komplex-Spitzenklassen analysieren. Ein Vertreter Zwei-Wege-Clustering Ergebnis mit Massenspektren an der "Technischen replizieren" Ebene ist in Abbildung 5 dargestellt. Zwei Dendrogramme angezeigt. Einer ist neben dem m / z-Werte und die andere oberhalb der Bakterien Einträge (Abbildung 5). Spitzenintensität wurde von Farben, in dem Grün zeigt geringer Intensität und Rot zeigt hohe Intensität vertreten. Zum Beispiel B. sp. A und F Aktien nur sehr wenige Spitzenklassen B. sp. B und D (Figur 5). Eine genaue Untersuchung hat gezeigt, dass B. sp. B und D haben auch Sätze von artspezifischen Spitzenklassen (Bild 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass die spezifische Spitzensätze Sharing cert ain Eigenschaften als Arten-Ebene potenzielle Biomarker definiert werden. Zum Beispiel dreizehn Spitzensätze, die zu B. sp. D ausgewählt und definiert als Spitzenklassen (potentielle Biomarker) von B. sp. D, darunter 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1 und 7849,1 (Tabelle 2). Peak Klassen verschiedene Isolate können in verschiedenen Farben (Supplementary Figur 2) dargestellt werden. Spezifisch für jede Spitze Klassen Isolat wurden in Tabelle 2 tabelliert. Definierter Peak-Klassen wurden weiter manuell überprüft, um sicherzustellen, dass sie in allen technischen Wiederholungen mit einer Mindeststärke von 100 au Weiterhin erschien könnte Subsets von Peak-Klassen auch gespeichert werden, um eine Charakterisierung der Bakterien zu erleichtern an den Unterarten und / oder Dehnungsniveaus, beispielsweise pathogene Stämme von nicht-pathogenen Stämmen zu unterscheiden und / oder zu Antibiotikaresistenz / Empfindlichkeit zu prüfen.

ent "> Hinsichtlich Identifikations wurden Massenspektren von Sackcodierten Isolate gesammelt und in der gleichen Weise wie die Referenzmassenspektren in den Datenbanken vorverarbeitet. Zur Identifizierung basierend auf einem Vergleich des Ähnlichkeitskoeffizienten wurden spezifizierten Parameter, einschließlich des maximalen Ähnlichkeits auf 95,0% und die durchschnittliche Ähnlichkeit 87%. Mindest Ähnlichkeit wurde nicht angegeben (dh nicht gegengesteuert wird). Die minimale Differenz Werte wurden als 5 sowohl für die maximale Ähnlichkeit und durchschnittliche Ähnlichkeit festgelegt. Diese Werte können müssen weiter optimiert werden, um zu vergrößern die Rate der korrekten Identifizierung dar. 6 zeigt die Identifizierungsergebnisse basierend auf Vergleichen des Ähnlichkeitskoeffizienten (Abbildung 6). Der passende Ergebnis legte nahe, daß dieser blinde codierten Bakterium war wahrscheinlich B. sp. A. Diese Identifikation Projekt basierend auf dem Vergleich von Ähnlichkeit Koeffizient wurde durch Kreuzvalidierung (Ergänzende 3 validiert (Ergänzende Abbildung 3). Interessanterweise ist der Kreuzvalidierung zur Identifizierung Projekte basierend auf dem Vergleich der Spitzenklassen wesentlich schneller als solche, die auf dem Vergleich von Ähnlichkeitskoeffizienten.

Die Identifizierung kann auch basierend auf Spitzenklasse-Anpassung (Ergänzende Abbildung 4) abgeschlossen sein. Jedoch inkongruente Peaks beobachtet wurden (Supplementary Abbildung 4). Die Fehlanpassungen aufgrund einer Massenverschiebung von Aminosäureaustauschen in den jeweiligen Proteine ​​entstehen. Die Spitzen nicht abgestimmt könnte auch Spitzen, die nicht diskriminierend auf Artenebene, sondern sind spezifisch für diesen Stamm oder zu isolieren. Zusammengenommen our Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Kennzeichnungsmethoden - Ähnlichkeit Koeffizienten und Biomarker-basierte - leicht identifizieren Bakterien auf Artenebene aus Karst Umgebungen mit dem Probenvorbereitung, Spektrenaufnahme und Datenanalyse-Workflow beschrieben.

Figur 1
Abbildung 1: Aufbau von Datenbanken und Massenspektren Zusammenfassung Struktur der Datenbanken in dieser Demonstration (A) aufgebaut. Abbildung der Spitzen Verdichtung über Spitzen von 10 technischen Replikaten Aminobacter Spezies A (B).

Abbildung 2
Abbildung 2. Dendrogram des VerbundMassenspektren auf der biologischen Ebene replizieren. Der Datensatz enthält Spektren von 15 verschiedenen Arten, mit drei zusammengesetzten Spektren für jede Spezies. Jede Spezies wurde mit einer Farbe codiert.

Figur 3
Abbildung 3. Mehrdimensionale Skalierung (MDS) Darstellungen der Massenspektren auf der technischen Ebene Replikat mit 30 Spektren für jede Art (A) und biologische Replikation Ebene mit drei zusammengesetzten Spektren für jede Art (B). Farben wurden als die gleichen Farben codiert wie in Figur 2 verwendet.

4
Abbildung 4. Ein Beispiel für Spitzenpassenden Tisch. Tabelle wurde auf der Grundlage Massenspektren von Bacillus-Arten A an der Technischen replizieren leve erzeugtl. Die Werte der Spitzenanpassungsparameter waren 1,9 für konstante Toleranz, 550 für lineare Toleranz und 10% für die Spitzenerkennungsrate auf. Blau bedeutet niedrige Spitzenintensität und Rot zeigt hohe Spitzenintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Ein Beispiel für Zwei-Wege-Clustering. Bild wurde mit Massenspektren auf der technischen Ebene Replikat erzeugt. Farben Isolate wurden als die gleichen Farben codiert, wie in Abbildung 2 verwendet. Spitzenintensität wird durch Farben, Grün Bedeutung geringer Intensität und rot Bedeutung hoher Intensität vertreten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.


Abbildung 6. Bakterium Identifikation basierend auf dem Vergleich der Ähnlichkeit Koeffizient mit benutzerdefinierten Datenbank.

ID a Quelle Nächster relativen b / Phylum / Klasse Accession # (nächste Verwandte b) % Ähnlichkeit BioNumerics Schlüssel Reproduzierbarkeit (%)
D2 Dry Höhlensinter Bacillus sp. E-257 / Firmicutes FJ764776.1 98,8 Bacillus-Arten A 94,9 ± 4,0
D7 Dry speleotSaum Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes FJ348039.1 99,0 Bacillus-Arten B 98,0 ± 1,4
F1 Flussstein Bacillus Niacin Stamm M27 / Firmicutes KC315764.1 99,2 Bacillus species C 96,5 ± 2,4
F4 Flussstein Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes FJ348046.1 99,1 Bacillus Spezies D 89,8 ± 8,8
F9 Flussstein Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes EU124558.1 99,4 Bacillus species E 96,5 ± 1,9
R10 Stalaktiten Tropf Bacillus sp. K1 / Firmicutes GU968734.1 99,8 Bacillus species F 95,4 ± 3,9
D11 Dry Höhlensinter Brevibacillus brevis-Stamm IMAU80218 / Firmicutes GU125635.1 99,5 Brevibacillus Arten 94,3 ± 5,8
F14 Flussstein Exiguobacterium sp. ZWU0009 / Firmicutes JX292087.1 99,3 Exiguobacterium Arten 96,5 ± 2,5
M7 Feuchten Höhlensinter Brevibacterium sp. N78 / Actinobacteria HQ188605 97,6 Brevibacterium-Arten A 97,5 ± 2,0
M14 Feuchten Höhlensinter Kocuria rhizophila Belastung Ag09 / Actinobacteria EU554435.1 100 Kocuria Arten 95,2 ± 4,1
M15 Feuchten Höhlensinter Brevibacterium sp. MN3-3 / Actinobacteria JQ396535.1 99,5 Brevibacterium-Arten B 92,1 ± 4,9
R4 Stalaktiten Tropf Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-Proteo FJ711220.1 99,9 Aminobacter Spezies A 95,4 ± 2,7
F5 Flussstein Comamonas testosteroni Belastung NBRC 12047 / β-Proteobakterien AB680219 100 Comamonas Arten 96,4 ± 2,6
R8 Stalaktiten Tropf Curvibacter Feinwäsche / β-Proteobakterien AB680705 97,0 Curvibacter </ Em> Arten 89,4 ± 7,8
F8 Flussstein Moraxella sp. 19,2 KSS / γ-Proteobakterien HE575924.1 99,9 Moraxella Arten 92,6 ± 4,9

ein Bakterien wurden aus Kartchner Caverns, AZ, USA isoliert und identifiziert mit 16S rDNA-Sequenzierung. Zwei Primer, 27f (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') und 1492r (5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'), wurden verwendet, um annähernd 1400 bp-16S-rRNA-Gen-Sequenzen zu erhalten.
b Basierend auf einer BLAST-Suche der NCBI-Datenbank.
c Die angegebenen Werte sind die durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 30 Wiederholungen (drei biologischen Replikaten je 10 technische Replikate) ± einer Standardabweichung.

Tabelle 1: Bakterien-Isolate in Demonstration verwendet.

BioNumerics Schlüssel Spitzenklassen / potentielle Biomarker (Da)
Bacillus-Arten A 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3
Bacillus-Arten B 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2
Bacillus species C 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3
Bacillus Spezies D 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1
Bacillus species E 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2
Bacillus species F 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9
Brevibacillus Arten 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2
Exiguobacterium Arten 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2
Brevibacterium-Arten A 3053,3, 6104,8, 6146,5
Kocuria Arten 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7
Brevibacterium-Arten B 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3
Aminobacter Spezies A 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4
Comamonas Arten 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6
Curvibacter Arten 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7
Moraxella Arten 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6

Tabelle 2. Spitzenklassen (potentielle Biomarker) (Da) für jede Art definiert.

Ergänzende Abbildung 1. Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Massenspektren bei the technischen replizieren Ebene (A) und die Spitzenklassen (B). Farben wurden als die gleichen Farben codiert, wie in Abbildung 2 verwendet.

Ergänzende Abbildung 2. Eine Abbildung Spitzenklassen auf der Grundlage des Zwei-Wege-Clustern ausgewählt. Haupt-Klassen mit der gleichen Etikett mit der gleichen Farbe gefärbt.

Ergänzende Abbildung 3. Kreuzvalidierung Ergebnisse der Identifizierung Projekt auf die kundenspezifischen Datenbanken in BioNumerics.

Ergänzende Abbildung 4. Bakterium Identifikation basierend auf Spitzen passende Verwendung von benutzerdefinierten Datenbanken.

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Discussion

Diese Demonstration zeigt detaillierte Verfahren der Charakterisierung und Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS und eine benutzerdefinierte Datenbank. Im Vergleich zu herkömmlichen molekularbiologischen Methoden, beispielsweise der 16S rDNA, MALDI-TOF MS-basierten Fingerabdruckverfahren erleichtern schnelleren Identifizierung der verschiedenen Bakterien. Wegen seiner Robustheit, wird diese Technik häufig verwendet, um Bakterien, Viren, Pilzen und Hefe, die aus der Umgebung und im klinischen Umfeld 1,14-16 charakterisieren. Außerdem MALDI-TOF MS wurde berichtet, dass sich leisten, in einigen Fällen höheren taxonomischen Auflösung 1. Zum Beispiel B. sp. A, B, D und E, wenn neigt zusammen in Cluster (Abbildung 2), waren deutlich getrennt, und die Ähnlichkeit zwischen den Spektren von unterschiedlichen B. sp. weniger als 80% (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu sind die 16S-rDNA-Sequenzen dieser Isolate hatten hohe Ähnlichkeit, die nicht verwendet werden können, um die Isolate zu unterscheidenauf Artenebene. Die 16S rDNA Sequenzen von B. sp. B und D 99% Ähnlichkeit basierend auf multiplen Alignment-Analyse, während die Sequenzen von B. sp. A und E zeigen, 95% und 96% Ähnlichkeit, die jeweils mit den Sequenzen aus B. sp. Auch wurden B und D Ausreißer beobachtet. Zum Beispiel B. sp. C und F von anderen B. sp gruppiert. (Abbildung 2). Das Aussehen der Ausreißer Isolate zeigt, dass die Cluster-Analyse von Massenspektren nicht unbedingt zu etablieren phylogenetischen Beziehungen. Die Umwelt vor, die isoliert wurden erhalten, kann auch Auswirkungen auf Massenspektren Clustering. Zum Beispiel Brevibacterium-Arten B und Kocuria Arten, die aus feuchten Höhlensinter und B. sp wurden. F, die von Stalaktiten Tropf isoliert wurde tendenziell zusammen (Tabelle 1, Abbildung 2) Cluster, aber weitere Forschung ist notwendig, um zu prüfen, ob dies in einer größeren Sammlung von isol beobachtetates.

Diese Bibliothek-basierte Technik hat auch einige Einschränkungen. Charakterisierung der Regel auf Datenbanken. Gegenwärtige kommerzielle Datenbanken werden hauptsächlich von Bakterienstämmen, insbesondere pathogenen zusammensetzt. Diese kommerziellen Datenbanken sind sehr nützlich in der klinischen Mikrobiologie-Labor-Einstellungen. Um Umweltisolaten sowie Viren, Pilze und Hefe zu charakterisieren, müssen kundenspezifische Datenbanken mit großen Stammsammlungen errichtet werden. Die in den Follow-up-Analysen verwendeten Parameter müssen unter Umständen auch optimiert, um die taxonomische Auflösung zu erhöhen, insbesondere bei den Unterarten und Belastungsniveaus werden. Zum Beispiel kann die S: N für Spitzenwerterfassung in dieser Demonstration verwendete 10. Dieser Wert für die Artenebene Identifizierung geeignet ist, aber für die Stammebene Identifizierung, muss dieser Wert gesenkt werden. Da diese Verarbeitungsparameter sowie Datenverarbeitungsabläufe werden manchmal in viele Softwarepakete benutzerdefinierten zB ClinProTools und Bionumerics wird eine Optimierung der Parameterwerte und die Auswahl der entsprechenden Workflows wahrscheinlich erforderlich, um die Datenanalyse zu optimieren. In dieser Demonstration Spitzenpassenden Parameter, bei der Identifizierung Projekt Schwellenwerte und Kreuzvalidierung alle erforderlichen Optimierung, um eine korrekte Identifizierung Raten zu verbessern. , Ein Verfahren und / oder Verfahren, um diese Parameter zu optimieren, zu finden, ist von großem Interesse für unser Labor. Zum Beispiel könnte ein Ansatz beinhalten statistische faktoriellen Design, die wir vor kurzem zur Optimierung MALDI-TOF automatische Datenerfassung 17. Weitere zukünftige Anwendungen und Verbesserung der MALDI-TOF MS-basierte mikrobielle Fingerabdruck umfassen Bau weit verbreitet, größere Datenbanken des Umwelt Bakterien und / oder nicht-bakteriellen Mikroorganismen sowie Charakterisierung von Mischkulturen 18 und mikrobiellen Gemeinschaften.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid ACROS Organics 163440050 ≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software Bruker Daltonics version 3.0
Bruker FlexAnalysis software Bruker Daltonics version 3.0
Bionumerics software Applied Maths version 7.1

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References

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