L'utilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA)

Biology

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Zhang, L., Vranckx, K., Janssens, K., Sandrin, T. R. Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA). J. Vis. Exp. (95), e52064, doi:10.3791/52064 (2015).

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Abstract

Protocol

Attention: les bactéries non identifiés de ne importe quel environnement peuvent être pathogènes et doivent être manipulés avec prudence en utilisant des protocoles de biosécurité appropriées. Travailler avec des cultures vivantes doit être effectuée dans une armoire de biosécurité de classe II en utilisant de sécurité biologique de niveau 2 (BSL-2) procédures. Plus d'informations sur BSL-2 procédures est disponible dans le manuel CDC / NIH intitulé «prévention des risques biotechnologiques en laboratoires microbiologiques et biomédicaux», pages 33-38. Le document est disponible en ligne à http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Équipement de protection individuelle (EPI), y compris les sarraus de laboratoire / robes, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile ou en latex, doit être porté. Pratiques et précautions microbiologiques standards doivent être respectées, et des déchets biologiques dangereux doivent être éliminés de façon appropriée.

Bactéries utilisées dans cette démonstration ont été isolés à partir Kartchner,AZ, États-Unis, à partir de quatre environnements, y compris spéléothème sèche, la pierre de flux, spéléothème humide et stalactite goutte à goutte (tableau 1). Tous les isolats ont été identifiés par séquençage de l'ADNr 16S et conservés à -80 ° C dans 25% de glycérol-R milieu 2B. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante.

Note: Nous vous recommandons d'utiliser la même méthode de préparation d'échantillon d'acquérir des spectres de masse pour la construction de base de données et les spectres de masse d'inconnues. Méthode de préparation des échantillons a été montré précédemment affecter la qualité du spectre et la reproductibilité 3. En utilisant une méthode de préparation d'échantillon différent peut provoquer une mauvaise identification d'inconnus, surtout quand résolution taxonomique plus élevé (par exemple, au niveau de la souche) est souhaitée.

1. dépôt sur la cible MALDI

Attention: Plusieurs protocoles d'obtenir des extraits de protéines nécessitent l'utilisation d'acides et de solvants organiques qui doivent être utilisé conformément aux guidElines et informations contenues dans leurs fiches respectives de données de sécurité des matériaux (MSDS). EPI approprié doit être porté et variera en fonction des type et le volume des produits chimiques utilisés (par exemple, sarraus de laboratoire / robes, des gants, des lunettes de sécurité, et la protection respiratoire doit être utilisée lorsque vous travaillez avec des quantités importantes de solvants toxiques et inflammables, tels que l'acétonitrile, et des acides corrosifs, tels que les acides formique et trifluoroacétique).

  1. Dépôt de 1 pi d'extrait de protéine ne contenant pas de cellules viables (obtenues à l'aide de protocoles appropriés, décrits précédemment 11 à 13) sur une plaque de cible MALDI en acier inoxydable et le laisser sécher. Superposer l'extrait protéinique séchée avec une solution de matrice ul (α-cyano-4-hydroxy-cinnamique solution d'acide), et laisser sécher.
  2. Pour chaque répétition biologique, repérer un nombre approprié de répétitions techniques (5-20 réplicats techniques). Ici, repérer 10 répétitions techniques pour chaque répétition biologique et trois répétitions biologiques were préparé.
    Note: Nous recommandons d'utiliser un MALDI plaque cible en acier poli en utilisant la méthode de préparation des échantillons d'extraction de protéines. Utilisation des plaques cibles de masse d'acier peut provoquer une contamination accidentelle et la propagation des différents échantillons à l'extérieur du puits d'échantillon individuels.
  3. Dépôt 1 ul norme d'étalonnage sur la plaque cible et laisser sécher. Superposition avec une solution de matrice de pi et laisser sécher.
  4. Dépôt solution de 2 ul de matrice sur la plaque cible en tant que témoin négatif.

2. Acquisition spectres de masse

  1. Utilisez un spectromètre de masse MALDI-TOF équipé d'un laser d'azote (λ = 337 nm) et exploité en utilisant un logiciel Bruker FlexControl.
  2. Recueillir chaque spectre de masse en mode linéaire positive par l'accumulation de 500 tirs laser par incréments de 100 tir. Régler la tension source d'ions 1 à 20 kV; tension de la source d'ions 2 18,15 kV; et la tension de la lentille à 9,05 kV. A noter que ces paramètres sont instrument spécific et pourrait nécessiter un ajustement sur d'autres instruments pour obtenir des résultats optimaux.
  3. Définissez la plage de masse-charge pour l'évaluation automatisée du spectre 2-20 kDa par charge. Utiliser l'algorithme de détection de pic centroïde. Réglez le seuil minimum de la résolution à 100 Da. Réglez le rapport signal sur bruit (S: N) seuil à 2. Réglez le seuil d'intensité minimum à 100.

3. Base de données Construction

  1. la conception de base de données
    1. Créer une nouvelle base de données dans BioNumerics 7.1 utilisant le "Nouvel assistant de base de données".
    2. Créer un type d'expérimentation du spectre, par exemple, Maldi, en utilisant les commandes dans le panneau "Types de Experiment".
    3. Créez les niveaux en utilisant le "panneau de conception de base de données". Ajouter de nouveaux niveaux en utilisant le "Niveau> Ajouter nouveau niveau ..." commande dans le menu "Base de données". Ici, créer des "espèces" niveau ", réplique biologique" niveau "et" répétition technique "niveau, respectivEly.
  2. Importation et prétraitement des spectres de masse brute
    1. Exporter les spectres de masse brute sous forme de fichiers .txt utilisant Flexanalysis en cliquant sur le "Exporter> Spectre de masse" dans le menu "Fichier".
    2. Importez les spectres de masse brute (fichiers .txt) dans la base de données dans le niveau des répétitions techniques.
    3. Prétraiter les spectres de masse brute.
      1. Importation et rééchantillonnage (en utilisant un algorithme d'ajustement quadratique).
      2. Effectuer une soustraction de ligne de base (avec un disque de roulement avec une taille de 50 points).
      3. Calculer le bruit [transformation en ondelettes continue (CWT)], lisse (Kaiser Fenêtre avec une taille de fenêtre de 20 points et bêta de 10 points), et effectuer une seconde soustraction de base (laminage disque avec la taille de 200 points).
      4. Détecter des pics [CWT avec un signal minimum sur bruit (S: N) 10].
    4. Après prétraitement, mémoriser les motifs caractéristiques de chaque spectre de masse, tels que les listes de pointe contenant pictailles, des intensités de pointe, S: N, etc., dans la base de données.
  3. Création spectre de masse composite
    1. Créer spectres composite à partir des spectres prétraités à l'aide de la commande "Résumer ..." dans le menu "Analyse". Choisissez l'option "répétition biologique» comme niveau cible.
    2. Ici, combiner les spectres de masse de 10 répétitions techniques de la même colonie pour obtenir un spectre de masse composite pour cette colonie, résultant en trois spectres de masse composite pour que isolat au niveau "répliqué biologique".
    3. Ici, résumer les trois spectres composite pour créer une spectre composite pour qui isolent au niveau «espèces».
      Remarque: Le spectre composite est la moyenne de point par point des répétitions techniques. Réplique d'une similitude (de corrélation de Pearson) à la moyenne inférieure à 95% (réglage par défaut) sont exclus du composite. Les pics sur le spectre composite sont appelés seulement se ils sont présents dans 75% (réglage par défaut) des répétitions incluses. Pour les répétitions biologiques, ces paramètres étaient de 90 et 60%, respectivement.

Analyse 4. Spectre de masse de données

  1. Sélectionnez les entrées dans la base de données et de créer une comparaison en cliquant sur la commande "Créer un nouveau rapport" dans le panneau "comparaisons".
  2. Ici, utiliser les spectres de masse à la "répétition technique" et / ou les niveaux "répétés biologique" pour montrer des comparaisons et des analyses.
  3. Analyse de cluster basé similarité et l'analyse multidimensionnelle (MDS)
    1. Créer des groupes avec des couleurs. Sélectionnez les trois biologique spectre de masse composite et cliquez sur "Créer un nouveau groupe de la sélection" commande dans le menu "Groupes" pour créer un groupe pour l'isolat correspondante. Désigner une couleur automatiquement utilisé pour ces trois spectres de masse.
    2. Alternativement, définir des états de terrain avec des couleurs correspondantes en utilisant les commandes dans le "Base de données entrées panel "de telle sorte que tout groupement basée sur ce champ défini utilise la même couleur définie pour ce groupe.
    3. Effectuer une analyse cluster. Cliquez sur la commande "Calculer l'analyse de cluster» dans le menu «Clustering». Sur la comparaison des paramètres Page 1, sélectionnez le «corrélation de Pearson" et laissez les autres paramètres par défaut. À la page 2, sélectionnez "UPGMA". Puis cliquez sur "Terminer".
    4. Obtenir un complot MDS utilisant la "mise à l'échelle multidimensionnelle ..." commande dans le menu "Statistiques".
  4. Appariement pic
    1. Cliquez sur le type de spectre "Maldi" dans le panneau "expériences". Ensuite, sélectionnez "Mise en page> Voir l'image". Spectra sont présentés comme des bandes de gel.
    2. Effectuer une comparaison pic en utilisant la commande "faire de la correspondance pic" dans le menu "Spectra".
  5. Identification des classes de pointe
    1. Effectuer l'analyse en composantes principales (ACP). Mettez en surbrillance le "Maldi "type de l'expérience dans le" expérimentale "panneau et utiliser le" Analyse en Composantes Principales ... "dans le menu" statistique "pour effectuer PCA.
    2. Effectuer regroupement dans les deux sens. Cliquez sur le "Statistiques> minière Matrix" ... dans la fenêtre "Comparaison". L'intensité des pics appariés aux classes de pointe est représenté en utilisant des couleurs différentes (carte de chaleur).

5. Les bactéries d'identification avec une base de données personnalisée

  1. Méthode fondée sur la similarité coefficient-
    1. Créer une comparaison et de générer un dendrogramme basé sur des spectres de masse au niveau "répliqué technique" tel que décrit à l'étape 4.3.3. Enregistrez le dendrogramme de comparaison de similitude.
    2. Sélectionnez un spectre de masse inconnue, et cliquez sur le "Analyse> Identifier entrées sélectionnées". La boîte de dialogue d'identification apparaît.
    3. Sélectionnez le "Comparaison basée" type de classificateur (ou un classif stockéeIER) et cliquez sur "suivant". Sur la page suivante, choisissez le dendrogramme enregistré comme une comparaison de référence, puis cliquez sur "Suivant".
    4. Choisissez l'option "similitude de base" comme une méthode d'identification et puis cliquez sur "Suivant".
    5. Choisissez l'option "similitude maximale» comme méthode de notation. Tapez les valeurs de seuil appropriées et valeurs de différence minimum pour chaque paramètre, puis cliquez sur "Suivant".
    6. Une fois les calculs sont terminés, la fenêtre d'identification apparaît. Dans le panneau "Résultats", les membres de la base de données qui correspondent le mieux l'inconnu sont répertoriés.
    7. Enregistrez le projet d'identification et valider l'identification en utilisant le "analyse de validation croisée" dans le panneau "projet d'identification".
  2. Méthode basée sur les biomarqueurs potentiel
    1. Définir des classes de pointe. Dans la fenêtre «Matrix Mining", sélectionner des ensembles de pics des caractéristiques communes et de définir ces pics que spéciles classes fic de pointe (biomarqueurs potentiels) en utilisant "Spectra> Gérer les types de classe de pointe ..." dans la fenêtre "Comparaison".
    2. Ici, définir des classes de pointe spécifiques pour chaque isolent pour tous les 15 isolats.
    3. Sélectionner les spectres de masse d'inconnues et faire correspondre les sommets de ces spectres pour les classes de pointe définis comme précédemment décrit.

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Representative Results

Les bases de données construites à cette manifestation avaient quatre niveaux, du plus haut au plus bas niveau, y compris "tous les niveaux", "répétition biologique" "Species" et "répétition technique", respectivement (figure 1A). La "répétition technique" niveau contenait tous les spectres prétraitée de répétitions techniques. La "répétition biologique" et les niveaux «espèce» contenaient le composite (résumé) spectres. "Tous les niveaux" contenaient tous les spectres répliqué technique ainsi que tous les spectres composite.

Spectre procédures de résumé sont présentés sur la figure 1 en utilisant des pics représentatifs. Chaque spectre de masse membre apparaît comme une fine ligne grise. Le spectre composite est représentée par une ligne colorée en rouge. Pics adjacents sont marqués avec une couleur différente pour permettre une inspection visuelle plus facile (figure 1B).

le tableau 1. La plus haute reproductibilité était de 98,0 ± 1,4 pour les espèces de Bacillus B, et le plus bas reproductibilité était de 89,4 ± 7,8 pour les espèces Curvibacter (tableau 1).

L'analyse par grappes à la visualisation niveau répliqué biologique facilité de la structure hiérarchique dans les données complexes de spectres de masse. Comme le montre la Figure 2, réplicats biologiques regroupés, et 15 espèces de bactéries formées 15 grappes. Espèces étroitement liées, par exemple, B. sp. A, B, D et E, a eu tendance à se regrouper. Cependant, les valeurs aberrantes, par exemple, B. sp. C et F, ont été également observées. MDS parcelles basées sur les spectres de masse aux niveaux "techniques et biologiques" sont présentés dans la figure 3. MDS pbeaucoup ont donné, une visualisation claire 3-D des similitudes entre les spectres de ces bactéries. Les deux répétitions techniques et répétitions biologiques ont montré un regroupement similaire (figure 3 A et B).

Appariement pic a été utilisé pour distinguer ensembles de pics dans les spectres de masse. Paramètres correspondants de pointe, y compris la tolérance constante (des points sur l'axe-x), la tolérance linéaire (ppm) et le taux de détection de crête doivent être spécifiés par l'utilisateur. La tolérance et la tolérance constante linéaire sont les facteurs utilisés pour calculer la tolérance de position des pics en utilisant l'équation: la tolérance de position de tolérance = constante + tolérance linéaire × m / z. Avec l'augmentation de m / z, l'importance de la tolérance constante diminue. Désigne le taux de détection de crête que seulement si un pic est trouvé à cette position de plus que le taux des spectres défini, une classe de crête est effectuée. Un pic sur un ou plusieurs motifs représente une classe de crête. Par exemple, si l 'équation de taux de détection de picls 10%, une classe de pointe peut être faite que si plus de 10% des spectres ont des pics à la position. Cela exclut les pics à faible prévalence (généralement des pics de bruit) dans un ensemble avec répétitions techniques. Si le jeu est basé sur le spectre composite de répétitions biologiques, ce nombre peut être plus faible besoin en tant que pics de faible prévalence ont déjà été filtré au cours de la création du spectre composite. Dans cette démonstration, l'appariement pic a été réalisée en utilisant les spectres de masse au niveau "répliqué technique» et les valeurs de ces paramètres étaient 1,9, 550 et 10%, respectivement. Sur la base des paramètres sélectionnés, les pics ont été considérées comme correspondant ou ne correspondant pas, résultant en différents groupes de crêtes. Un exemple des résultats correspondants de pointe est illustré à la figure 4 en utilisant 30 répétitions d'un seul isolat (espèces de Bacillus A). Les résultats correspondants ont été visualisées sous forme de tableau dans lequel les intensités brutes sont présents en tant que couleurs. Bleu indique une faible intensité et rouge indique haute intensity. Basé sur les résultats pic correspondant, les utilisateurs peuvent définir des classes de pointe facilitant les analyses de suivi.

Tant l'analyse en composantes principales (ACP) (Figure 1 supplémentaire) et le regroupement de deux voies peut être utilisé pour analyser les classes de pointe complexes. Un résultat de regroupement de deux manière représentative en utilisant les spectres de masse au niveau "répliqué technique" est illustré à la figure 5. Deux dendrogrammes sont présentés. On est à côté des valeurs m / z et l'autre est au-dessus des entrées de bactéries (Figure 5). Pic d'intensité a été représentée par des couleurs dans laquelle verte indique une faible intensité et rouge indique haute intensité. Par exemple, B. sp. A et F part très peu de classes de pointe avec B. sp. B et D (figure 5). Un examen a montré que B. sp. B et D ont également des ensembles de classes de pic spécifique de l'espèce (figure 5). Ces résultats indiquent que les ensembles de pics spécifiques partage cert ain caractéristiques peuvent être définies comme des biomarqueurs potentiels au niveau des espèces. Par exemple, treize ensembles de pointe appartenant à B. sp. D ont été sélectionnés et défini comme les classes de pointe (biomarqueurs potentiels) de B. sp. D, y compris 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1 et (Tableau 2). Les classes de pointe de différents isolats peuvent être affichés en différentes couleurs (Figure 2) supplémentaires. Les classes de crête spécifiques pour chaque isolat sont consignés dans le tableau 2. Classes de pic déterminées ont été vérifiés en outre manuellement pour se assurer qu'elles sont apparues dans toutes les répétitions techniques avec une intensité minimale de 100 au plus, des sous-ensembles de classes de pic peuvent également être stockées pour faciliter la caractérisation des bactéries à la sous-espèce et / ou les niveaux de déformation, par exemple, de distinguer les souches pathogènes de souches non pathogènes et / ou pour examiner la résistance antibiotique / sensibilité.

ent "> En ce qui concerne l'identification, spectres de masse des isolats aveugles codés ont été recueillis et prétraité de la même manière que le spectre de masse de référence dans les bases de données. Pour l'identification basée sur la comparaison des coefficients de similarité, les valeurs des paramètres ont été spécifiés, y compris la similitude maximale à 95,0% et la similitude moyenne à 87%. similitude minimum n'a pas été spécifié (ce est à dire, rien ne est fait). Les valeurs de différence minimales ont été définies comme 5 à la fois la similitude maximale et la similitude moyenne. faudra peut-être encore optimisé pour augmenter Ces valeurs le taux d'identification correcte. La figure 6 montre les résultats de l'identification sur la base de comparaisons de coefficients de similarité (figure 6). Le résultat n'a suggéré que cette bactérie aveugle codé était probablement B. sp. A. Ce projet d'identification basée sur la comparaison de coefficient de similitude a en outre été validée par la validation croisée (Figure 3 supplémentaire (figure 3) supplémentaire. Il est intéressant de validation croisée pour des projets d'identification sur la base de la comparaison des catégories de pointe est beaucoup plus rapide que celles basées sur la comparaison du coefficient de ressemblance.

L'identification peut également être réalisée sur la base correspondante de classe crête (Figure 4 supplémentaire). Cependant décalages de pics ont été observés (Figure 4 supplémentaire). Les décalages peuvent être dues à un changement de masse résultant des échanges d'acides aminés dans les protéines respectives. Les pics ne se accompagne pas pourraient également être pics qui ne sont pas discriminatoire au niveau de l'espèce mais qui sont spécifiques à cette souche ou isolent. Pris ensemble, our résultats suggèrent que les deux méthodes d'identification - coefficient et basée biomarqueurs similitude - peuvent facilement identifier les bactéries au niveau du milieu karstique à l'aide de la préparation de l'échantillon, l'acquisition du spectre espèces, et l'analyse de données flux de travail décrit ici.

Figure 1
Figure 1. la construction de base de données et de spectres de masse résumé structure des bases de données construites à cette manifestation (A). Illustration de résumé de pointe utilisant des pics de 10 répétitions techniques de Aminobacter espèce A (B).

Figure 2
Figure 2. Dendrogramme du compositespectres de masse au niveau répliqué biologique. L'ensemble de données comprend des spectres de 15 espèces différentes avec trois spectres composite pour chaque espèce. Chaque espèce a été codés avec une couleur.

Figure 3
Figure 3. analyse multidimensionnelle (MDS) représentations de spectres de masse au niveau répliqué technique avec 30 spectres pour chaque espèce (A) et biologique niveau répliqué avec trois spectres composite pour chaque espèce (B). Couleurs ont été codées que les mêmes couleurs tel qu'il est utilisé dans la figure 2.

Figure 4
Figure 4. Une illustration de la table pic de même niveau. Le tableau a été généré sur la base des spectres de masse des espèces de Bacillus A à la réplique leve techniquel. Les valeurs des paramètres correspondants de pointe ont été de 1,9 pour la tolérance constant, linéaire 550 à la tolérance et de 10% de taux de détection de pic, respectivement. Bleu indique une faible intensité maximale et rouge indique le pic d'intensité élevée. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 5
Figure 5. Une illustration de regroupement dans les deux sens. Figure été généré en utilisant des spectres de masse au niveau répliqué technique. Couleurs d'isolats ont été codées comme les mêmes couleurs que utilisée dans la figure 2. Intensité maximale est représentée par des couleurs, vert sens faible intensité et le sens rouge de haute intensité. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.


Figure 6. Bactérie identification basée sur la comparaison du coefficient de similarité en utilisant la base de données personnalisée.

Un ID Source Plus proche parent b / Phylum / Classe Accession # (le plus proche de b relative) % De similarité Clé BioNumerics Reproductibilité (%)
D2 Spéléothème sec Bacillus sp. E-257 / Firmicutes FJ764776.1 98,8 Une espèce Bacillus 94,9 ± 4,0
D7 Speleot secourlet Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes FJ348039.1 99,0 espèces de Bacillus B 98,0 ± 1,4
F1 pierre de débit Bacillus niacine souche M27 / Firmicutes KC315764.1 99,2 espèces de Bacillus C 96,5 ± 2,4
F4 pierre de débit Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes FJ348046.1 99,1 espèces de Bacillus D 89,8 ± 8,8
F9 pierre de débit Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes EU124558.1 99,4 espèces de Bacillus E 96,5 ± 1,9
R10 Goutte à goutte stalactite Bacillus sp. K1 / Firmicutes GU968734.1 99,8 espèces de Bacillus F 95,4 ± 3,9
D11 Spéléothème sec Brevibacillus souche brevis IMAU80218 / Firmicutes GU125635.1 99,5 Espèces Brevibacillus 94,3 ± 5,8
F14 pierre de débit Sp Exiguobacterium. ZWU0009 / Firmicutes JX292087.1 99,3 Espèces Exiguobacterium 96,5 ± 2,5
M7 Spéléothème Moist Brevibacterium sp. N78 / Actinobacteria HQ188605 97,6 Une espèce Brevibacterium 97,5 ± 2,0
M14 Spéléothème Moist Souche Kocuria rhizophila Ag09 / Actinobacteria EU554435.1 100 Espèces Kocuria 95,2 ± 4,1
M15 Spéléothème Moist Brevibacterium sp. MN3-3 / Actinobacteria JQ396535.1 99,5 Brevibacterium espèces B 92,1 ± 4,9
R4 Goutte à goutte stalactite Sp Aminobacter. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria FJ711220.1 99,9 Une espèce Aminobacter 95,4 ± 2,7
F5 pierre de débit Comamonas testosteroni souche NBRC 12047 / β-Proteobacteria AB680219 100 Espèces Comamonas 96,4 ± 2,6
R8 Goutte à goutte stalactite Délicats Curvibacter / β-Proteobacteria AB680705 97,0 Curvibacter </ em> espèces 89,4 ± 7,8
F8 pierre de débit Sp Moraxella. 19,2 KSS / γ-protéobactéries HE575924.1 99,9 Espèces Moraxella 92,6 ± 4,9

une bactérie ont été isolés à partir Kartchner, AZ, USA et identifiés en utilisant le séquençage de l'ADNr 16S. Deux amorces, 27f (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CCT AG 3') et 1492r (5 'TAC TAC GGT CTT GTT ACG LOI T 3'), ont été utilisés pour obtenir près de 1 400 pb de longueur des séquences de gènes 16S ARNr.
b Basé sur une recherche BLAST de la base de données NCBI.
c Les valeurs indiquées sont les coefficients de corrélation moyenne de 30 répétitions (trois réplicats biologiques chacune avec 10 répétitions techniques) ± un écart-type.

Tableau 1. Les bactéries isolats utilisés dans la démonstration.

Clé BioNumerics Les classes de pointe / biomarqueurs potentiels (Da)
Une espèce Bacillus 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3
espèces de Bacillus B 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2
espèces de Bacillus C 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3
espèces de Bacillus D 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1
espèces de Bacillus E 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2
espèces de Bacillus F 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9
Espèces Brevibacillus 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2
Espèces Exiguobacterium 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2
Une espèce Brevibacterium 3053,3, 6104,8, 6146,5
Espèces Kocuria 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7
Brevibacterium espèces B 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3
Une espèce Aminobacter 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4
Espèces Comamonas 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6
Espèces Curvibacter 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7
Espèces Moraxella 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6

Tableau 2. Classes de pointe (biomarqueurs potentiels) (Da) définies pour chaque espèce.

Figure 1. complémentaire d'analyse Principe de composantes principales (ACP) des spectres de masse au ee niveau technique de répétition (A) et les classes de pointe (B). Couleurs ont été codées comme les mêmes couleurs que utilisée dans la figure 2.

Figure 2. Une supplémentaire illustration des classes de pointe sélectionnés sur la base du regroupement dans les deux sens. Catégories pic ayant la même étiquette sont colorées avec la même couleur.

Figure 3. supplémentaire des résultats de la Croix-de validation du projet d'identification basé sur les bases de données personnalisées dans BioNumerics.

Figure complémentaire identification 4. Bactérie basée sur la correspondance utilisant pic bases de données personnalisées.

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Discussion

Cette démonstration a montré des procédures détaillées de caractérisation et d'identification des bactéries utilisant MALDI-TOF MS et une base de données personnalisée. En comparaison avec les méthodes moléculaires classiques, par exemple, les méthodes d'empreintes digitales MS-séquençage de l'ADNr 16S, MALDI-TOF de faciliter une identification plus rapide des diverses bactéries. En raison de sa robustesse, cette technique est largement utilisée pour caractériser les bactéries, les virus, les champignons et la levure et de l'environnement dans un contexte clinique 1,14-16. En outre, SM MALDI-TOF a été rapporté pour permettre, dans certains cas, une résolution plus élevée taxonomique. Par exemple, B. sp. A, B, D et E, mais qui tend à se regrouper (figure 2) ont été clairement séparées et la similitude entre les spectres des différents B. sp. était inférieure à 80% (Figure 2). En revanche, les séquences d'ADNr 16S de ces isolats présentaient une similarité élevée, qui ne pouvait pas être utilisé pour différencier ces isolatsau niveau de l'espèce. Les séquences d'ADNr 16S de B. sp. B et D ont 99% de similarité basé sur une analyse d'alignement multiple, tandis que les séquences de B. sp. A et E montrent 95% et 96% de similarité, respectivement, pour les séquences de B. sp. Outliers B et D. ont également été observées. Par exemple, B. sp. C et F regroupés loin des autres B. sp. (Figure 2). L'apparition d'isolats aberrantes indique que l'analyse de clustering de spectres de masse ne établit pas nécessairement des relations phylogénétiques. L'environnement à partir de laquelle ont été obtenus des isolats peut également affecter le regroupement de spectres de masse. Par exemple, Kocuria espèces qui ont été isolés à partir de B. spéléothème humide et Brevibacterium sp espèce hôte. F qui a été isolé à partir de stalactite goutte à goutte a tendance à se regrouper (tableau 1, figure 2), mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour examiner si ce est observée dans une grande collection de isolAtes.

Cette technique basée sur la bibliothèque a aussi quelques limitations. Caractérisation est généralement basé sur des bases de données. Bases de données commerciales actuelles sont principalement composées de souches bactériennes, en particulier les pathogènes. Ces bases de données commerciales sont les plus utiles dans les paramètres de laboratoire de microbiologie clinique. Pour caractériser isolats environnementaux ainsi que les virus, les champignons et la levure, bases de données personnalisées doivent être construits en utilisant des grandes collections de souches. Les paramètres utilisés dans les analyses de suivi peuvent également être optimisé pour augmenter la résolution taxonomique, en particulier dans les sous-espèces et les niveaux de déformation. Par exemple, le S: N utilisé pour la détection de pointe dans cette démonstration était 10. Cette valeur est appropriée pour l'identification au niveau des espèces, mais pour la souche identification de niveau, cette valeur peut avoir besoin d'être abaissé. Depuis ces paramètres de traitement ainsi que des données de traitement des flux de travail sont parfois définis par l'utilisateur dans de nombreux logiciels, par exemple, ClinProTools et BionumeRICS, une optimisation des valeurs et de la sélection des flux de travail appropriées paramètres sera probablement nécessaire pour optimiser l'analyse des données. Dans cette démonstration, les paramètres correspondants de pointe, des valeurs seuils utilisés dans le projet d'identification et validation croisée tous tenus d'optimisation pour améliorer les taux d'identification correctes. Pour trouver une méthode et / ou de la procédure d'optimiser ces paramètres est d'un grand intérêt pour notre laboratoire. Par exemple, une approche pourrait impliquer plan factoriel statistique, que nous avons utilisé récemment pour optimiser MALDI-TOF automatisé d'acquisition de données 17. Applications futures supplémentaires et l'amélioration de l'empreinte microbienne MS MALDI-TOF comprennent la construction d'largement disponibles, les grandes bases de données de bactéries de l'environnement et / ou des micro-organismes non-bactériennes ainsi que la caractérisation des cultures mixtes et 18 communautés microbiennes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid ACROS Organics 163440050 ≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software Bruker Daltonics version 3.0
Bruker FlexAnalysis software Bruker Daltonics version 3.0
Bionumerics software Applied Maths version 7.1

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References

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