Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA)

Biology

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Zhang, L., Vranckx, K., Janssens, K., Sandrin, T. R. Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA). J. Vis. Exp. (95), e52064, doi:10.3791/52064 (2015).

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Abstract

Protocol

Cuidado: bactérias não identificados a partir de qualquer ambiente pode ser patogênica e devem ser manuseados com cuidado, utilizando protocolos de biossegurança adequadas. Trabalhar com culturas vivas deve ser realizada em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando Biológica nível de segurança 2 (BSL-2) procedimentos. Mais informações sobre BSL-2 procedimentos está disponível no manual do CDC / NIH intitulado, "Biossegurança em microbiológicos e Biomédicas Laboratories", páginas 33-38. O documento está disponível online em http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo jalecos / vestidos, óculos de segurança e de borracha nitrílica ou luvas de látex, deve ser usado. Práticas microbiológicos padrão e precauções devem ser seguidas, e os resíduos de risco biológico deve ser descartado de forma adequada.

As bactérias usadas nesta demonstração foram isolados a partir de Kartchner,AZ, EUA, a partir de quatro ambientes, incluindo speleothem seco, pedra fluxo, espeleotemas úmido e gotejamento estalactite (Tabela 1). Todos os isolados foram identificados por sequenciação de 16S rDNA e mantidos a -80 ° C em glicerol a 25% 2-B R médio. Todas as experiências foram concluídas à TA.

Nota: Recomenda-se utilizar o mesmo método de preparação da amostra para adquirir espectros de massa para a construção do banco de dados e de massa de incógnitas. Método de preparação da amostra foi mostrado anteriormente para afetar a qualidade de espectro e reprodutibilidade 3. Usando um método diferente preparação da amostra pode causar a identificação incorrecta de desconhecidos, especialmente quando maior resolução taxonómica (por exemplo, no nível de tensão) é desejado.

1. Deposição sobre o alvo de MALDI

Cuidado: Vários protocolos para obter extractos de proteínas requerem a utilização de ácidos e solventes orgânicos, que deve ser utilizado de acordo com guidElines e informações contidas em suas respectivas Fichas de Dados de Segurança de Materiais (FDSP). Apropriada PPE deve ser usado e vai variar de acordo com tipo e volume de produtos químicos usados ​​(por exemplo, jalecos / batas, luvas, óculos de segurança e de proteção respiratória devem ser utilizados ao trabalhar com quantidades significativas de solventes inflamáveis, tóxicos, tais como acetonitrilo, e ácidos corrosivos, tais como os ácidos fórmico e trifluoroacético).

  1. Depósito 1 ml extrato de proteína não contendo células viáveis ​​(obtidos utilizando adequadas, protocolos anteriormente descritos 11-13) sobre uma chapa de aço inoxidável alvo MALDI e deixe-a secar. Overlay o extrato de proteína seca com solução de matriz 1 ml (solução de ácido α-4-hidroxi-cinâmico-ciano), e deixe-a secar.
  2. Para cada repetição biológica, manchar um número apropriado de repetições técnicas (5 a 20 repetições técnicas). Aqui, spot 10 repetições técnicos para cada repetição biológica e 3 repetições biológicas were preparado.
    Nota: Recomendamos a utilização de uma placa de MALDI-alvo de aço polido ao usar o método de preparação de amostras extração de proteínas. Usando placas de aço alvo solo pode causar difusão e de mistura não intencional das diferentes amostras fora dos poços individuais da amostra.
  3. Depósito 1 ml de calibração padrão para a placa-alvo e deixe-a secar. Overlay com solução matriz 1 ul e deixe-a secar.
  4. Depósito de solução de matriz 2 uL para a placa de destino como um controlo negativo.

2. Espectros de Massa Aquisição

  1. Use um espectrômetro de massa MALDI-TOF equipado com um laser de nitrogênio (λ = 337 nm) e operado usando software Bruker FlexControl.
  2. Recolha cada espectro de massa no modo linear positiva pelo acúmulo de 500 disparos de laser em incrementos de 100 tiro. Defina a fonte de íons 1 tensão de 20 kV; fonte iónica de 2 a tensão de 18,15 kV; e a tensão de lente e 9,05 kV. Note-se que estes parâmetros são instrumento-especific e pode necessitar de reajuste em outros instrumentos para obter os melhores resultados.
  3. Defina o intervalo de massa-carga para avaliação automática espectro de 2 a 20 kDa por carga. Use o algoritmo de detecção de pico centroid. Defina o limite mínimo de resolução a 100 Da. Defina a relação sinal-ruído (S: N) limiar a 2. Defina o limite mínimo de intensidade em 100.

3. Construção de banco de dados

  1. Design de banco de dados
    1. Criar um novo banco de dados no BioNumerics 7.1 usando o "assistente de banco de dados New".
    2. Criar um tipo de experimento de espectro, por exemplo, Maldi, usando os comandos no painel "Tipos Experiment".
    3. Crie os níveis usando o "painel de banco de dados de design". Adicionar novos níveis usando o "Nível> Adicionar novo nível ..." comando no menu "Banco de Dados". Aqui, criar "Espécies" nível, nível de "replicar Biológica" "e" repetição técnica "nível, respectivEly.
  2. Importação e pré-processamento de espectros de massa crua
    1. Exportar o espectro de massa crua como arquivos .txt usando FlexAnalysis clicando no comando "Export> Espectro de massa" no menu "File".
    2. Importar o espectro de massa crua (.txt) no banco de dados no nível das repetições técnicas.
    3. Preprocess os espectros de massa crua.
      1. Importação e resample (usando um algoritmo de ajuste quadrático).
      2. Realizar uma subtracção da linha de base (com um disco do rolamento com um tamanho de 50 pontos).
      3. Calcule o ruído [Transformation Wavelet Contínua (CWT)], liso (Janela Kaiser com um tamanho de janela de 20 pontos e beta de 10 pontos), e realizar uma segunda subtração de base (disco rolando com tamanho de 200 pontos).
      4. Detectar picos [CWT com um sinal mínimo de ruído (S: N) de 10].
    4. Depois de pré-processamento, salvar padrões característicos de cada espectro de massa, tais como listas de pico contendo picotamanhos, as intensidades dos picos, S: N, etc, no banco de dados.
  3. Criação de espectro de massa compósito
    1. Criar espectros composta a partir de espectros pré-processados ​​usando o comando "Resumir ..." no menu "Análise". Escolha a opção "replicar Biológica", como nível de alvo.
    2. Aqui, combinar os espectros de massa de 10 repetições técnicos da mesma colónia, para se obter um espectro de massa compósito para que colónia, resultando em três espectros de massa compósito para esse isolado no nível "réplica biológica".
    3. Aqui, resumir os três espectros combinados para criar um espectro composto para que o isolado no nível "Espécies".
      Nota: O espectro de compósito é a média de ponto-a-ponto das repetições técnicas. Replica com uma similaridade (correlação de Pearson) com a média de 95% menor do que (configuração padrão) são excluídos do compósito. Os picos nos espectros compósito só são chamados, se estiverem presentes em 75% (configuração padrão) das repetições incluídos. Para as réplicas biológicas, estas definições foram de 90 e 60%, respectivamente.

4. Massa de Análise de Dados do Espectro

  1. Selecione as entradas no banco de dados e criar uma comparação clicando no comando "Criar nova comparação" no painel "As comparações".
  2. Aqui, use o espectro de massa na "repetição técnica" e / ou níveis de "reproduzir Biológica" para mostrar comparações e análises.
  3. Análise de cluster baseada em similaridade e de escala multi-dimensional (MDS)
    1. Crie grupos com cores. Selecione o espectro de massa compósito biológica três e clique no botão "Criar novo grupo da seleção" comando no menu "Grupos" para criar um grupo para o isolado correspondente. Designar uma cor automaticamente utilizado para estes três espectros de massa.
    2. Como alternativa, definir estados de campo com as cores correspondentes, utilizando os comandos no "Base de dados entradas "painel de tal modo que qualquer agrupamento com base neste campo definido usa a mesma cor definida para este grupo.
    3. Realizar análise de cluster. Clique no comando "Calcular análise de cluster" no menu "Clustering". No configurações Comparação Page 1, selecione a opção "correlação de Pearson" e deixar outros parâmetros como padrão. Na página 2, selecione "UPGMA". Em seguida, clique em "Finish".
    4. Obter um enredo MDS usando o "dimensionamento Multi-dimensional ..." comando no menu "Estatísticas".
  4. Coincidindo Peak
    1. Clique no tipo de espectro "Maldi" no painel "Experiências". Em seguida, selecione "Layout> Mostrar imagem". Os espectros são apresentados como bandas de gel.
    2. Executar a correspondência de pico usando o comando "Faça a correspondência de pico" no menu "Spectra".
  5. Identificação de classes de pico
    1. Realizar análise de componentes principais (PCA). Realce o "Maldi "tipo de experimento no" Experimental "painel e use a" Análise de Componentes Principais ... "comando no menu" Estatística "para realizar PCA.
    2. Execute bidirecional clustering. Clique no botão "Estatísticas> mineração Matrix" ... na janela "Comparação". A intensidade dos picos correspondentes às classes de pico é representado usando cores diferentes (mapa de calor).

5. As bactérias Identificação com um banco de dados personalizada

  1. Método baseado em coeficiente de similaridade
    1. Criar uma comparação e gerar um dendrograma baseado no espectro de massa no nível "replicar técnicos", como descrito no passo 4.3.3. Salve o dendrograma para comparação da similaridade.
    2. Selecione um espectro de massa desconhecida, e clique no botão "Análise> Identificar as entradas selecionadas". A caixa de diálogo identificação aparece.
    3. Selecione a opção "Comparação baseada" tipo de classificador (ou um classif armazenadoier) e clique em "next". Na página seguinte, escolha o dendrograma salvo como uma comparação de referência e, em seguida, clique em "next".
    4. Escolha a opção "semelhança Basic" como um método de identificação e clique em "next".
    5. Escolha a opção "semelhança máxima" como método de pontuação. Escreva em valores limiares adequados e os valores mínimos de diferença para cada parâmetro e clique em "next".
    6. Uma vez que os cálculos são concluídas, aparece a janela de identificação. No "Resultados" do painel, os membros do banco de dados que melhor combinam com o desconhecido são listados.
    7. Salve o projeto de identificação e validar a identificação usando o comando "de validação cruzada análise" no painel "projeto de Identificação".
  2. Método baseado biomarcador potencial
    1. Definir classes de pico. Na janela "Matrix Mining", selecionar os conjuntos de picos com características comuns e definir esses picos como especiaulas fic de pico (de potenciais biomarcadores) usando "Spectra> Gerenciar tipos de classe de pico ..." na "janela de comparação".
    2. Aqui, definir classes específicas de pico de cada isolado para todos os 15 isolados.
    3. Escolher os espectros de massa de desconhecidos e combinar os picos destes espectros para as classes de pico definidos como descrito anteriormente.

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Representative Results

As bases de dados construídos desta manifestação teve quatro níveis, maior para o menor nível, incluindo "todos os níveis", "Espécies", "repetição Biológica" e "repetição técnica", respectivamente (Figura 1A). O nível "técnico replicar" continha todos os espectros pré-processado de repetições técnicas. A "repetição Biológica" e os níveis de "espécies" continha o (resumo) espectros composto. "Todos os níveis" continha todos os espectros de repetição técnica, bem como todos os espectros de composto.

Espectro de procedimentos de compactação são mostrados na Figura 1 utilizando picos representativos. Cada espectro de massa membro aparece como uma linha cinza fina. O espectro compósito é representado como uma linha colorida a vermelho. Picos adjacentes está marcado com uma cor diferente para permitir mais fácil a inspecção visual (Figura 1B).

Tabela 1. A maior reprodutibilidade foi de 98,0 ± 1,4 para as espécies de Bacillus B, e o menor reprodutibilidade foi de 89,4 ± 7,8 para as espécies Curvibacter (Tabela 1).

A análise de cluster na visualização do nível de replicação biológica facilitou da estrutura hierárquica nos dados de espectros de massas complexas. Como mostrado na Figura 2, repetições biológicas agrupados juntos, e 15 espécies de bactérias formou 15 agrupamentos. Espécies estreitamente relacionadas, por exemplo, B. sp. A, B, D, e E, tenderam a se agrupar. No entanto, valores aberrantes, por exemplo, B. sp. C e F, também foram observados. Parcelas do MDS com base no espectro de massa no "técnicos e biológicos" níveis são mostrados na Figura 3. MDS plotes produziu uma clara visualização, 3-D das semelhanças entre os espectros destas bactérias. Ambos repetições e repetições técnicas biológicas mostraram um agrupamento semelhante (Figura 3 A e B).

Correspondência de picos foi utilizada para distinguir conjuntos de picos no espectro de massa. Parâmetros relacionados Peak, incluindo tolerância constante (pontos sobre o eixo-x), a tolerância linear (ppm) e taxa de detecção de pico precisa ser especificado pelo usuário. Tolerância constante e tolerância linear são os fatores utilizados para calcular a tolerância de posição dos picos usando a equação: tolerância de posição = tolerância constante + tolerância linear × m / z. Com o aumento de m / z, a importância da tolerância constante diminui. Taxa de detecção de pico significa que apenas se for encontrado um pico nessa posição por mais do que a taxa definida dos espectros, uma classe de pico é feita. Um pico em um ou mais padrões representa uma classe de pico. Por exemplo, se a equa taxa de detecção de picols 10%, uma classe de pico pode ser feita somente se houver mais de 10% dos espectros têm picos na posição. Isto exclui picos de baixa prevalência (geralmente picos de ruído) em um conjunto com repetições técnicas. Se o conjunto é baseado no espectro compósito de réplicas biológicas, este número pode precisar de ser menor que os picos de baixa prevalência já foram filtrados durante a criação dos espectros de compósito. Nesta demonstração, correspondente pico foi realizada utilizando espectros de massa no nível "replicar técnicos" e os valores desses parâmetros foram de 1,9, 550 e 10%, respectivamente. Com base em parâmetros seleccionados, os picos foram considerados correspondentes ou não correspondência, resultando em diferentes grupos de pico. Um exemplo de resultados correspondentes de pico é mostrado na Figura 4, utilizando 30 repetições de um único isolado (A) espécies Bacillus. Os resultados correspondentes foram visualizados como uma tabela na qual as intensidades em bruto estão presentes como corantes. Azul indica baixa intensidade e vermelho indica alta intensity. Com base nos resultados de pico correspondentes, os usuários podem definir classes de pico, que facilitam as análises de acompanhamento.

Tanto a análise de componentes principais (PCA) (Figura Suplementar 1) e bidireccional aglomeração pode ser utilizado para analisar as classes de complexos de pico. Um resultado de agrupamento de duas vias representante usando espectros de massas a nível "replicar Técnico" é mostrado na Figura 5. Dois dendrogramas são mostrados. Uma está próximo dos valores m / z e o outro está acima das entradas de bactérias (Figura 5). Intensidade do pico foi representada por cores em que verde indica baixa intensidade e vermelho indica alta intensidade. Por exemplo, B. sp. A e F compartilhar muito poucas aulas de pico com B. sp. B e D (Figura 5). Um exame detalhado mostrou que B. sp. B e D também têm conjuntos de classes de pico específicos da espécie (Figura 5). Estes resultados indicam que os conjuntos de picos específicos partilha cert ain características podem ser definidas como espécies de nível potenciais biomarcadores. Por exemplo, conjuntos de pico treze pertencente a B. sp. D foram selecionados e definidos como classes de pico (de potenciais biomarcadores) de B. sp. D, incluindo 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1 e 7849,1 (Tabela 2). Aulas de pico de diferentes isolados podem ser mostrados em cores diferentes (Figura Suplementar 2). Classes específicas de pico de cada isolado foram tabulados na Tabela 2. Classes de picos definidos foram verificados mais manualmente para garantir que apareceu em todas as repetições técnicos com uma intensidade mínima de 100 au Além disso, subconjuntos de classes de pico pode também ser armazenada para facilitar a caracterização de bactérias as subespécies e / ou níveis de tensão, por exemplo, para distinguir as estirpes patogénicas de estirpes não patogénicas e / ou para examinar antibiótico resistência / sensibilidade.

ent "> No que diz respeito à identificação, os espectros de massa dos isolados cegos codificados foram recolhidas e pré-processados ​​da mesma maneira como os espectros de massa na base de dados de referência. Para fins de identificação com base na comparação dos coeficientes de similaridade, os valores dos parâmetros foram especificados, incluindo a máxima semelhança a 95,0% e a similaridade média em 87%. similaridade mínima não foi especificado (isto é, não for controlada). Os valores mínimos foram ajustados da diferença 5 para ambas a semelhança e a semelhança máxima média. Estes valores podem precisar de ser optimizadas para aumentar a taxa de identificação correcto. A Figura 6 mostra os resultados de identificação com base em comparações de coeficientes de similaridade (Figura 6). O resultado correspondente sugerido que esta bactéria cego codificados era mais provável B. sp. A. Este projecto de identificação com base na comparação de coeficiente de similaridade foi ainda validado pela validação cruzada (Figura Suplementar 3 (Figura Suplementar 3). Curiosamente, validação cruzada para projetos de identificação com base na comparação entre as classes de pico é muito mais rápido do que aqueles com base na comparação do coeficiente de similaridade.

Identificação também pode ser preenchido com base na correspondência de classe pico (Figura Suplementar 4). No entanto descasamentos de picos foram observados (Figura Suplementar 4). Os desemparelhamentos pode ser devido a um deslocamento de massa resultante de trocas de aminoácidos nas proteínas respectivas. Os picos não sendo correspondida também poderia ser picos que não são discriminativo em nível de espécie, mas são específicos para esta estirpe ou isolar. Tomados em conjunto, our resultados sugerem que ambos os métodos de identificação - coeficiente de similaridade e à base de biomarcadores - pode facilmente identificar bactérias em nível de espécie a partir de ambientes cársticos usando a preparação de amostras, aquisição de espectro, e fluxo de trabalho de análise de dados descrito aqui.

Figura 1
Figura 1. construção de banco de dados e sumarização espectros de massa Estrutura de bases de dados construídos nesta demonstração (A).; Ilustração de pico sumarização usando picos de 10 repetições técnicos de Aminobacter espécies A (B).

Figura 2
Figura 2. O dendrograma do compósitoespectros de massas a nível réplica biológica. O conjunto de dados contém espectros de 15 espécies diferentes, com três espectros composta para cada espécie. Cada espécie foi codificado com uma cor.

Figura 3
Figura 3. escalonamento multidimensional (MDS) representações de espectros de massas a nível repetição técnica com 30 espectros para cada espécie (A) e nível réplica biológica com três espectros composta para cada espécie (B). Colors foram codificadas como as mesmas cores como usado na Figura 2.

Figura 4
Figura 4. Uma ilustração de mesa pico correspondente. Table foi gerado com base no espectro de massa de espécies Bacillus A no leve replicar técnicol. Os valores dos parâmetros de correspondência de pico foram de 1,9 para a tolerância constante, 550 para a tolerância linear e 10% para a taxa de detecção de pico, respectivamente. Azul indica baixa intensidade de pico e vermelho indica alta intensidade de pico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Figura 5
Figura 5. Uma ilustração de mão dupla clustering. Figura foi gerado utilizando espectros de massas a nível replicar técnico. Cores de isolados foram codificadas como as mesmas cores que usou na Figura 2. Intensidade Peak é representada por cores verde significado baixa intensidade e significado vermelho de alta intensidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.


Figura identificação 6. Bactéria com base na comparação do coeficiente de similaridade usando banco de dados personalizado.

ID um Fonte B / Filo / Class parente mais próximo Adesão # (parente mais próximo b) % De Similaridade Chave BioNumerics A reprodutibilidade (%)
D2 Espeleotemas Dry Bacillus sp. E-257 / Firmicutes FJ764776.1 98.8 Uma espécie de Bacillus 94,9 ± 4,0
D7 Speleot Drybainha Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes FJ348039.1 99.0 As espécies de Bacillus B 98,0 ± 1,4
F1 Fluxo de pedra Bacillus niacina estirpe M27 / Firmicutes KC315764.1 99,2 As espécies de Bacillus C 96,5 ± 2,4
F4 Fluxo de pedra Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes FJ348046.1 99.1 As espécies de Bacillus D 89,8 ± 8,8
F9 Fluxo de pedra Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes EU124558.1 99,4 As espécies de Bacillus E 96,5 ± 1,9
R10 Gotejamento Estalactite Bacillus sp. K1 / Firmicutes GU968734.1 99,8 As espécies de Bacillus F 95,4 ± 3,9
D11 Espeleotemas Dry Brevibacillus brevis estirpe IMAU80218 / Firmicutes GU125635.1 99,5 Espécies Brevibacillus 94,3 ± 5,8
F14 Fluxo de pedra Sp Exiguobacterium. ZWU0009 / Firmicutes JX292087.1 99.3 Espécies Exiguobacterium 96,5 ± 2,5
M7 Espeleotemas Moist Brevibacterium sp. N78 / Actinobacteria HQ188605 97,6 Brevibacterium espécies A 97,5 ± 2,0
M14 Espeleotemas Moist Kocuria rhizophila estirpe Ag09 / Actinobacteria EU554435.1 100 Espécies Kocuria 95,2 ± 4,1
M15 Espeleotemas Moist Brevibacterium sp. MN3-3 / Actinobacteria JQ396535.1 99,5 Brevibacterium espécies B 92,1 ± 4,9
R4 Gotejamento Estalactite Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria FJ711220.1 99,9 Aminobacter espécies A 95,4 ± 2,7
F5 Fluxo de pedra Comamonas estirpe testosteroni NBRC 12047 / β-Proteobacteria AB680219 100 Espécies Comamonas 96,4 ± 2,6
R8 Gotejamento Estalactite Delicados Curvibacter / β-Proteobacteria AB680705 97,0 Curvibacter </ em> espécies 89,4 ± 7,8
F8 Fluxo de pedra Moraxella sp. 19,2 KSS / γ-Proteobacteria HE575924.1 99,9 Espécies Moraxella 92,6 ± 4,9

uma bactéria foram isoladas de Kartchner Caverns, AZ, EUA e identificados utilizando 16S rDNA. Dois primers, 27F (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') e 1492r (5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'), foram utilizados para obter cerca de 1.400 bp-length seqüências de genes 16S rRNA.
b Com base em uma pesquisa BLAST do banco de dados NCBI.
c Os valores apresentados são os coeficientes de correlação de média de 30 repetições (três réplicas biológicas cada um com 10 repetições técnicas) ± desvio padrão.

Tabela 1. As bactérias isolados utilizados na demonstração.

Chave BioNumerics Aulas de pico / biomarcadores potenciais (Da)
Uma espécie de Bacillus 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3
As espécies de Bacillus B 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2
As espécies de Bacillus C 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3
As espécies de Bacillus D 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1
As espécies de Bacillus E 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2
As espécies de Bacillus F 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9
Espécies Brevibacillus 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2
Espécies Exiguobacterium 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2
Brevibacterium espécies A 3053,3, 6104,8, 6146,5
Espécies Kocuria 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7
Brevibacterium espécies B 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3
Aminobacter espécies A 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4
Espécies Comamonas 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6
Espécies Curvibacter 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7
Espécies Moraxella 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6

Tabela 2. aulas de pico (de potenciais biomarcadores) (Da) definidos para cada espécie.

Figura 1. Análise Suplementar Princípio componente (PCA) do espectro de massa no thnível técnico e repetição (A) e as classes de pico (B). As cores foram codificados como as mesmas cores como utilizado na Figura 2.

Figura 2. Uma ilustração suplementar das classes dos picos seleccionados com base na bidireccional aglomeração. Classes de pico com a mesma etiqueta são coloridos com a mesma cor.

Figura Suplementar 3. Resultados Cross-validação do projeto de identificação com base nos bancos de dados personalizados em BioNumerics.

Figura Suplementar identificação 4. Bactéria baseado na correspondência pico usando bancos de dados personalizados.

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Discussion

Esta demonstração mostrou procedimentos detalhados de caracterização e identificação de bactérias que utilizam MALDI-TOF MS e um banco de dados personalizado. Em comparação com os métodos tradicionais moleculares, por exemplo, métodos de impressão digital de 16S rDNA, baseados em MS MALDI-TOF facilitar a identificação mais rápida de diversas bactérias. Devido à sua robustez, esta técnica é muito utilizada para caracterizar bactérias, vírus, fungos e leveduras do ambiente e em ambientes clínicos 1,14-16. Além disso, MALDI-TOF MS tem sido relatado para se obter, em alguns casos, mais elevada resolução taxonómica 1. Por exemplo, B. sp. A, B, D, e E, embora com tendência a agrupar-se em conjunto (Figura 2), foram claramente separadas e a semelhança entre os espectros de diferente B. sp. era menos de 80% (Figura 2). Em contraste, as sequências de rADN 16S destes isolados teve alta similaridade, o que não poderia ser utilizado para diferenciar estes isoladosem nível de espécie. As seqüências 16S rDNA de B. sp. B e D têm 99% de semelhança com base em análise de alinhamento múltiplo, enquanto que as sequências de B. sp. A e E mostram 95% e 96% de semelhança, respectivamente, para as sequências de B. sp. B e D. Outliers também foram observados. Por exemplo, B. sp. C e F agrupados para longe de outras B. sp. (Figura 2). O aparecimento de isolados outlier indica que a análise de agrupamento de espectros de massa não necessariamente estabelecer relações filogenéticas. O ambiente a partir do qual os isolados foram obtidos também podem afetar agrupamento espectro de massa. Por exemplo, Brevibacterium espécies B e espécies Kocuria que foram isoladas de espeleotemas úmido e B. sp. F que foi isolada de estalactite gotejamento tenderam a se agrupar (Tabela 1, Figura 2), mas são necessárias mais pesquisas para determinar se esse é observado em um conjunto maior de isoladorates.

Esta técnica baseada em bibliotecas também tem algumas limitações. Caracterização é geralmente baseada em bancos de dados. Bancos de dados comerciais atuais são compostas principalmente de cepas bacterianas, particularmente os patogênicos. Esses bancos de dados comerciais são mais úteis em ambientes de laboratório de microbiologia clínica. Para caracterizar isolados ambientais, bem como vírus, fungos e leveduras, bancos de dados personalizados precisam ser construídos usando coleções de grande deformação. Os parâmetros utilizados nas análises de acompanhamento também pode precisar de ser otimizado para aumentar a resolução taxonômica, especialmente nas subespécies e níveis de tensão. Por exemplo, a S: N utilizado para detecção de pico nesta demonstração foi 10. Este valor é apropriado para a identificação nível de espécie, mas para a estirpe identificação nível, este valor pode necessitar de ser reduzido. Uma vez que estes parâmetros de processamento, bem como processamento de dados de fluxos de trabalho são, por vezes, definido pelo usuário em muitos pacotes de software, por exemplo, ClinProTools e BionumeRICS, uma otimização de valores de parâmetros e seleção de fluxos de trabalho adequadas provavelmente será necessária para otimizar a análise de dados. Nesta demonstração, os parâmetros correspondentes de pico, os limiares utilizados no projeto de identificação e validação cruzada todos necessários otimização para melhorar as taxas de identificação corretos. Para encontrar um método e / ou procedimento para optimizar estes parâmetros é de grande interesse para o nosso laboratório. Por exemplo, uma abordagem pode envolver fatorial estatístico, o que foi usado recentemente para otimizar MALDI-TOF automatizado de aquisição de dados 17. Futuras aplicações adicionais e aumento de fingerprinting microbiana baseado no MS MALDI-TOF incluem a construção de amplamente disponível, bancos de dados maiores de bactérias ambientais e / ou micro-organismos não-bacteriana, bem como a caracterização de culturas mistas e 18 comunidades microbianas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid ACROS Organics 163440050 ≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software Bruker Daltonics version 3.0
Bruker FlexAnalysis software Bruker Daltonics version 3.0
Bionumerics software Applied Maths version 7.1

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References

  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32, (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68, (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57, (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7, (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8, (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33, (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48, (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18, (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30, (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79, (2), 654-658 (2007).
  11. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4, (5), 732-742 (2009).
  12. Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55, (1), 40-46 (2012).
  13. Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80, (6), 2026-2034 (2008).
  14. Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36, (2), 379-387 (2013).
  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75, (11), 3314-3330 (2012).
  16. Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831, (4), 872-879 (2013).
  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9, (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48, (5), 1584-1591 (2010).

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